COBAS TaqMan MTB Test

COBAS TaqMan MTB Test IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. COBAS TaqMan MTB Test CTM MTB 48 Tests P/N: 04803531 190 AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit RSP PREP 100 Tests P/N: 20756903 122 ART: 07 5690 3 US: 83267 MEGJEGYZÉS A termék megvásárlása a vevő számára nukleinsav-szekvenciák amplifikálását és kimutatását teszi lehetővé polimeráz láncreakció (PCR) és rokon eljárások révén humán in vitro diagnosztikai célból. A termék megvásárlásával a vevő a konkrét használati jogon túl semmilyen általános szabadalmi jogot vagy egyéb engedélyt nem kap. FELHASZNÁLÁS MÓDJA A COBAS TaqMan MTB teszt egy in vitro nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a Mycobacteria tuberculosis (MTB) komplex DNS kvalitatív kimutatására elfolyósított, dekontaminált és koncentrált humán légúti mintákban, pl. köpetben és bronchoalveoláris lavázsban (BAL). A vizsgálat a manuális minta-előkészítést az AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit segítségével végzi, az automatikus amplifikáláshoz és kimutatáshoz pedig a COBAS TaqMan 48 analizátort alkalmazza. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A Mycobacterium nemzetség tagjai saválló, nem mozgó, pálcika alakú aerob baktériumok, amelyek nem képeznek spórát. Számos emberi kórokozó faj található közöttük. Sok mycobacterium faj talajban és vízben élő szaprofita. Az elsődleges humán patogének a következő fajok: M. tuberculosis komplex (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum és M. microti) és M. leprae. A M. tuberculosis a legfontosabb kórokozó mycobacterium, és csak emberekben található meg. A tuberkulózis (TBC) ragályos megbetegedés. A közönséges náthához hasonlóan a levegőn keresztül terjed. Csak a tüdő-tbc-ben szenvedő emberek fertőznek. A fertőző személyek köhögés, tüsszentés, beszéd vagy köpetürítés alkalmával TBC baktériumokat juttatnak a levegőbe. A fertőződéshez csak kis csíraszám belégzése szükséges. Összességében jelenleg a Föld lakosságának egyharmada fertőzött TBC bacilussal. A TBC bacilussal fertőzött emberek 5-10%-a betegszik meg vagy válik fertőzővé valamikor élete során. Becslések szerint 2004-ben mintegy 1,7 millióan haltak meg TBC-ben. A becsült legmagasabb számú haláleset a délkelet-ázsiai régióban van, ahol a megbetegedések száma is a legmagasabb, ugyanakkor az egy főre jutó mortalitás az afrikai régióban a legnagyobb, ahol a HIV a TBC előfordulásának és a TBC-s megbetegedettek elhalálozási valószínűségének gyors növekedéséhez vezetett. A WHO célkitűzései, ahogy azokat az Egészségügyi Világszervezet közgyűlése 1991-ben ratifikálta, a következők: az új TBC-fertőzések 70%-ának kimutatása, és a kimutatott fertőzések 85%-ának meggyógyítása 2005-re. Tizennyolc ország fogadta el ezeket a célkitűzéseket 2002-re 1-5. A betegség terjedési kockázata, a gyógyszerrezisztens törzsek felbukkanásának lehetősége és a HIV-1 fertőzöttek betegségének súlyossága következtében a M. tuberculosis komplex gyors diagnózisa rendkívül fontos. A tuberkulózis definitív diagnózisához a M. tuberculosis komplex egy organizmusának az izolálása szükséges. A rutintenyésztések időigényesek, és akár nyolc hétig is eltarthatnak. A mycobacteriumok kimutatásának leggyorsabb módszere a saválló kenetek mikroszkópos vizsgálata, de az nem elég érzékeny, és nem specifikus. Az immunológiai és szerológiai technikák korlátozottak, általában a gyenge érzékenységnek és/vagy specificitásnak köszönhetően 6,7. A mycobacteriumokra specifikus PCR-alapú vizsgálatok fejlesztése tovább javítja a tuberkulózis gyors diagnosztikáját azáltal, hogy lehetővé teszi a mycobacteriumok közvetlen kimutatását klinikai mintákban 8-14. AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A COBAS TaqMan MTB teszt két fő lépésből épül fel: (1) manuális minta-előkészítés az MTB DNS izolálására; (2) target DNS szimultán PCR-amplifikálása komplementer primerek segítségével, és a target DNS kimutatása fluoreszcensen kettősen jelölt oligonukleotid próbák hasítása révén 15,16. Ezek a folyamatok együttesen lehetővé teszik az MTB target amplifikált termék (amplikon) és a (mintával egyidejűleg amplifikált és detektált) MTB belső kontroll DNS kimutatását. A master mix reagens egy primer párt tartalmaz, amely a kromoszóma nemzetségspecifikus régiójának amplifikálására szolgál, és a M. tuberculosis komplex (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum és M. microti) fajokra való specificitást egy kettősen jelölt target kimutatási próba biztosítja. A belső kontroll DNS amplifikálása ugyanazzal a primer párral történik. Az amplifikált DNS kimutatása targetspecifikus és belsőkontroll-specifikus kettősen jelölt oligonukleotid próbák segítségével történik, amelyek lehetővé teszik az MTB amplikon és a mycobacterium belső kontroll amplikon független azonosítását. A Dokumentum verzióinformációi rész a dokumentum végén található. 05174988001-07HU 1 Doc Rev. 7.0

A minta előkészítése NALC/NaOH 17 módszerrel elfolyósított, dekontaminált köpet és BAL minták mosása légúti minta mosóoldattal történik. Az organizmusok roncsolása légúti minta roncsoló reagensben való inkubálással történik, és a minta légúti minta semlegesítő reagens hozzáadását követően lesz amplifikálásra kész. PCR-amplifikáció A targetszekvencia kiválasztása A Mycobacterium genom tartalmaz egy megközelítőleg 1500 nukleotid hosszúságú, nagy fokban konzervált régiót, amely a 16S rrns génjét kódolja. A COBAS TaqMan MTB teszt Mycobacterium nemzetségre specifikus primereket használ a régión belüli szekvenciák meghatározásához 18. Targetamplifikáció A PCR-amplifikáció K-csövekben vagy K-tálcákon történik, melyekben az előkészített mintákat az amplifikáló elegyhez adják. Az kettős szálú DNS denaturálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett a reakcióelegyet fel kell melegíteni. Az elegy kihűlésével a primerek a targetszekvenciáikhoz kötnek. A Z05 DNS-polimeráz Mg 2+ és feleslegben lévő dezoxinukleotid-trifoszfátok (dntp-k) jelenlétében a kötött primereket a targettemplátok mentén meghosszabbítva egy kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak neveznek. A COBAS TaqMan 48 analizátor a folyamatot adott számú cikluson keresztül automatikusan ismétli, hogy az amplikon DNS-mennyisége ciklusonként megduplázódjon. A szükséges számú ciklus a COBAS TaqMan 48 analizátorba előre be van programozva. Az amplifikálás az MTB genomnak csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes MTB genom nem amplifikálódik. Belső kontroll amplifikálása Az enzimreakción alapuló amplifikálási műveletek során, amilyen a PCR is, a klinikai mintákban jelen lehetnek gátlóanyagok, amelyek csökkenthetik a hatékonyságot. A belső kontroll lehetővé teszi az olyan előkészített minták azonosítását, amelyekben a PCR-amplifikációt esetleg zavaró anyagok vannak jelen. A Mycobacterium belső kontroll egy nem fertőző, rekombináns, linearizált plazmid DNS a M. tuberculosis targetszekvenciával identikus primerkötő helyekkel, a M. tuberculosis targetszekvenciához hasonló hosszúságú és bázisösszetételű random belső szekvenciával, és egy egyedi próba kötő régióval, amely elkülöníti a Mycobacterium belső kontrollt a target amplikontól. Ezeket a jellemzőket azért választották ki, hogy biztosítsák mind a Mycobacterium belső kontroll, mind a M. tuberculosis target DNS ekvivalens amplifikálását. A COBAS TaqMan MTB teszt tartalmazza a Mycobacterium belső kontroll reagenst, és a reagens a klinikai mintából származó MTB DNS-sel való egyidejű amplifikálás céljából minden egyes amplifikálási reakcióhoz hozzáadandó. A Mycobacterium belső kontrollt az MTB targetszekvencia amplifikálását és kimutatását gátló anyagokat tartalmazó minták azonosítására tervezték. Szelektív amplifikálás A COBAS TaqMan MTB teszt a targetnukleinsav szelektív amplifikálását a mintából az AmpErase (uracil- N-glikoziláz) enzim 19 és dezoxiuridin-trifoszfát (dutp) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja a dezoxiuridin tartalmú DNS-szálak megsemmisítését, a timidint tartalmazó DNS-ét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, mivel a master mix reagens a dntp-ok egyikeként dezoxiuridin-trifoszfátot használ; így csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. Bármilyen nem specifikus terméket, amely a master mix magnézium okozta kezdeti aktiválódása után képződik, az AmpErase enzim lebont. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben a master mix reagens bázikus ph-ján az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, így nem bontja le az amplifikálás során képződött target amplikont. PCR-termékek kimutatása COBAS TaqMan vizsgálat során A COBAS TaqMan MTB teszt valós idejű PCR-technológiát alkalmaz. A kettősen jelölt fluoreszcens próbák használata lehetővé teszi a PCR-termék halmozódásának valós idejű detektálását az amplifikálási folyamat során felszabaduló fluoreszcens jelzőfestékek emissziós intenzitásának monitorozása révén. Az MTB-re és a Mycobacterium belső kontrollra specifikus oligonukleotidokból álló próbák egy jelző (reporter) és egy blokkoló (quencher) festékkel jelöltek. A COBAS TaqMan MTB teszt során az MTB és Mycobacterium belső kontroll próbák különböző fluoreszcens jelzőfestékkel vannak jelölve. Amíg a fluoreszcens festékkel kettősen jelölt próbák érintetlenek, a jelzőfesték fluoreszcenciája a Förster-féle energiatranszfer jelenség révén a blokkoló festék közelsége miatt gátolt. A PCR során a próba egy targetszekvenciához hibridizál, és az 5'-3' exonukleáz aktivitású hőstabil Z05 DNS-polimeráz hasítja. Amikor a jelző és blokkoló festékek felszabadulnak és különválnak, megszűnik a blokkolás, és a jelzőfesték fluoreszcens aktivitása megnő. Az MTB DNS és a Mycobacterium belső kontroll DNS amplifikációjának mérése egymástól függetlenül, különböző hullámhosszokon történik. Ez a folyamat adott számú cikluson keresztül ismétlődik, minden ciklusban jelentősen megnövelve az egyes jelzőfestékek emissziós intenzitását, ezáltal lehetővé téve az MTB DNS és a belső kontroll DNS független azonosítását. 05174988001-07HU 2 Doc Rev. 7.0

REAGENSEK AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit RSP PREP AMPLICOR légúti minta előkészítő készlet (P/N: 20756903 122; ART: 07 5690 3; US: 83267) RW (légúti minta mosófolyadék) tris-hcl puffer < 1% szolubilizáló szer EDTA 0,05% nátrium-azid RL (légúti minta roncsoló reagens) 0,2% nátrium-hidroxid < 1% szolubilizáló szer EDTA 0,05% nátrium-azid RN (légúti minta semlegesítő reagens) trisz-hcl puffer magnézium-klorid 0,05% nátrium-azid COBAS TaqMan MTB Test CTM MTB (P/N: 04803531 190) Kontrollreagensek MYCO IC (Mycobacterium belső kontroll) trisz-hcl puffer < 0,001% nem fertőző plazmid (mikrobiális) DNS, amely Mycobacterium primer kötő szekvenciákat és egy egyedi próba kötő régiót tartalmaz < 0,005% poli-ra RNS (szintetikus) EDTA amarántvörös festék 0,05% nátrium-azid MTB (+) C [M. tuberculosis pozitív kontroll] trisz-hcl puffer < 0,001% nem fertőző plazmid DNS (mikrobiális), amely MTB-szekvenciát tartalmaz < 0,005% poli-ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid MYCO ( ) C [Mycobacterium negatív kontroll] trisz-hcl puffer < 0,005% poli-ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid 100 teszt 2 x 25 ml 3 x 6 ml 2 x 5 ml 48 teszt 4 x 0,1 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 05174988001-07HU 3 Doc Rev. 7.0

Amplifikációs és kimutatási reagensek MTB MMX (COBAS TaqMan MTB Master Mix) 4 x 12 teszt tricin puffer 4 x 0,46 ml kálium-acetát kálium-hidroxid dimetil-szulfoxid glicerin < 0,001% datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001% MTB primerek < 0,001% fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próba, amely specifikus MTB-ra és a Mycobacterium belső kontrollra < 0,001% oligonukleotid aptamer < 0,05% Z05 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,09% nátrium-azid MYCO Mg 2+ (Mycobacterium magnézium reagens) 4 x 12 teszt <1,0% magnézium-acetát 4 x 0,2 ml 0,09% nátrium-azid FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. B. Ez az eljárás csak NALC-NaOH 17 módszerekkel elfolyósított, dekontaminált és koncentrált köpet vagy BAL minták vizsgálatára használható. C. Ne pipettázzon szájjal. D. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és tesztreagensek kezelése közben. A minták és tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. E. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális szennyezését. F. Steril, egyszer használatos pipetták és pipettahegyek használata javasolt. G. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. H. Ne keverje a különböző készletekből származó reagenseket. I. A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. J. Ne használja a készletet a lejárati idő után. K. Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetők a helyi Roche irodában. L. A mintákat és kontrollokat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 és az CLSI Document M29-A3 21 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. MEGJEGYZÉS: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő felel meg 0,5%- os nátrium-hipoklorit oldatnak. M. Az RW, RL, RN, MTB MMX, MYCO Mg 2+, MYCO IC, MTB (+) C és MYCO ( ) C nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatot önt ki a laboratóriumi mosogatóba, nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót az azidlerakódás megakadályozására. N. A minták kifröccsenését és a keresztszennyeződését megelőzendő a minta- és kontrollelőkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket. O. Viseljen szemvédőt, védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt bármely reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal öblítse le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égető érzés jelentkezhet. Ezen reagenseket kiömlés esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa. P. Ha egy K-cső vagy K-tálca amplifikáció után kinyílna, kezelje a K-hordozót, a lyukakat és a kijutott folyadékot egy éjszakán át hipóval (a hatékony koncentráció 5000 ppm; 0,5%), hogy a kijutott amplikont elroncsolja. 05174988001-07HU 4 Doc Rev. 7.0

TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A reagenseket és kontrollokat tilos lefagyasztani. A. Az RW, RL és RN 2 25 C-on tárolandó. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati időn belül stabilak. Felbontást követően ezek a reagensek 2 25 C-on stabilak 30 napig vagy a lejárati időig, amelyik előbb következik. B. Az MTB MMX, MYCO Mg 2+, MYCO IC, MTB (+) C és MYCO ( ) C 2 8 C-on tárolandó. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati időn belül stabilak. C. A részben felhasznált MTB (+) C és MYCO ( ) C 2 8 C-on tárolandó két gépi ciklus között. Használat előtt ellenőrizze a felnyitott kontrollok lejárati idejét. Az MTB (+) C és MYCO ( ) C legfeljebb négy alkalommal használható fel. Felbontást követően az MTB (+) C és MYCO ( ) C 4 héten vagy a lejárat időn belül stabil, amelyik előbb következik. D. Az MTB MMX, MYCO Mg 2+ és MYCO IC egyszer használatos, 12 reakcióra elegendő csövekben vannak. Minden fel nem használt anyagot ki kell dobni. E. A master mix munkareagens (mely a MYCO Mg 2+ és MYCO IC MTB MMX-hez való hozzáadásával készül) 2 8 C-on sötétben, legfeljebb 2 órán át tárolható. F. Az előkészített mintákat és kontrollokat szobahőmérsékleten tárolva 4 órán belül, 2-8 C-on tárolva 4 napon belül, -80 C-on tárolva pedig 6 hónapon belül hozzá kell adni a master mix munkareagenshez. G. Az amplifikálást a minták és a kontrollok master mix munkareagenshez való hozzáadásától számított 90 percen belül meg kell kezdeni. A KÉSZLET TARTALMA Minta-előkészítő reagensek A. AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit AMPLICOR légúti minta előkészítő készlet (P/N: 20756903 122; ART: 07 5690 3; US: 83267) RW (légúti minta mosófolyadék) RL (légúti minta roncsoló reagens) RN (légúti minta semlegesítő reagens) Amplifikációs és kimutatási reagensek B. COBAS TaqMan MTB Test (P/N: 04803531 190) MYCO IC (Mycobacterium belső kontroll) MTB (+) C [M. tuberculosis pozitív kontroll] MYCO ( ) C [Mycobacterium negatív kontroll] MTB MMX (COBAS TaqMan MTB Master Mix) MYCO Mg 2+ (Mycobacterium magnézium reagens) RSP PREP CTM MTB 05174988001-07HU 5 Doc Rev. 7.0

SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Műszerezettség és szoftver COBAS TaqMan 48 analizátor AMPLILINK szoftver, 3.3-as verziójú sorozat Az AMPLILINK szoftverhez készült adatállomás A COBAS TaqMan 48 analizátor felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.2-es és 3.3- as verziójú sorozatának alkalmazási kézikönyvével való együttes használatra Az AMPLILINK szoftver 3.3-as verziójú sorozatának alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülékkel, a COBAS TaqMan analizátorral, a COBAS TaqMan 48 analizátorral, a COBAS AMPLICOR analizátorral, valamint a cobas p 630 készülékkel való együttes használatra Vizsgálatdefiníciós fájl (Test Definition File, TDF). A TDF neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. K-cső kupakrögzítő (P/N: 03516539001) K-tálca kupakozó eszköz (P/N: 03339904001) COBAS TaqMan 48 analizátor K-hordozó (P/N: 28150397001) COBAS TaqMan 48 analizátor K-tálca hordozó (P/N: 03341488001) Egyszer használatos anyagok K-csövek (P/N: 03137082001) COBAS TaqMan 48 analizátor K-tálcák (P/N: 03343146001) EGYÉB SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Vortex keverő Pipetta segédeszköz: Drummond (P/N: 4-000-100) vagy ekvivalens 1,5 ml polipropilén csavarókupakos csövek, steril, nem szilikonozott, kúpos (Sarstedt 72.692.105 vagy ekvivalens)** Csőtartó állványok (Sarstedt 93.1428 vagy ekvivalens) Pipettorok (50 μl, 100 μl, 200 μl, 250 μl, 500 μl és 1000 μl térfogatú)* aeroszol barrieres (szűrős) vagy pozitív kiszorításos (dugattyús) hegyekkel Steril, finomhegyű transzferpipetták Mikrocentrifuga (max. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, vagy ekvivalens 60 C ± 2 C fűtőblokk Hőmérő Szűrőpapír Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Negatív nyomású biztonsági fülke * A pipetták pontossága a megadott térfogathoz képest 3%-on belül legyen. Szűrős vagy dugattyús DNáz-mentes (illetve nukleáz-mentes) pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető a minta és az amplikon keresztszennyeződésének megelőzése. ** A minta és a kontroll előkészítéséhez csavarókupakos csöveket kell használni, megelőzendő a minták és kontrollok kifröccsenését és az esetleges keresztszennyeződést. Ne használjon pattintókupakos csöveket. A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát és kontrollt fertőző ágensek átvitelére alkalmasként kell kezelni. A. Minta levétele Az elfogadható légúti minták csak az expektorált, az indukált köpet, illetve a BAL. A mintát el kell folyósítani, dekontaminálni és koncentrálni a NALC-NaOH 17 módszerek segítségével. B. Minta transzportja A dekontaminált mintákat 2 25 C között kell a laboratóriumba szállítani a levételtől számított 24 órán belül. Amennyiben a mintákat nem szállítják 24 órán belül a laborba, -70 C-on kell tárolni és szállítani azokat. A minták szállítása meg kell, hogy feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó valamennyi országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásnak 22. C. Minta tárolása A dekontaminált minták -20 C-on legfeljebb 2 hétig tárolhatóak. 05174988001-07HU 6 Doc Rev. 7.0

HASZNÁLATI UTASÍTÁS MEGJEGYZÉS: A részletes üzemeltetési utasításokért, a lehetséges konfigurációk részletes leírásáért, az eredmények kinyomtatásáért és a jelzők, megjegyzések és hibaüzenetek értelmezéséért forduljon a következő kézikönyvekhez: (1) COBAS TaqMan 48 Analizátor felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.2 és 3.3 verziójú sorozatainak alkalmazási kézikönyvével való használathoz; (2) az AMPLILINK szoftver 3.3 verziójú sorozatának alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülék, COBAS TaqMan analizátor, COBAS TaqMan 48 analizátor, COBAS AMPLICOR analizátor és cobas p 630 készülék használatához. MEGJEGYZÉS: Ha a minta-előkészítés, amplifikálás és kimutatás egyetlen munkanapon történik, kövesse az alábbiakban leírt vizsgálati eljárást. Ha a minta-előkészítés más napon történik, mint az amplifikálás és a kimutatás, a reagens-előkészítést végezze azonos napon az amplifikálással és a kimutatással. MEGJEGYZÉS: Valamennyi amplifikációs és kimutatási reagensnek használat előtt környezeti hőmérsékletűnek kell lennie; legalább 30 perccel használat előtt vegye ki azokat a tároló 2 8 C-ról. MEGJEGYZÉS: A mintákat ki kell olvasztani (ha fagyottak), 15 30 percig egyenletes környezeti hőmérsékletűre hozni és összekeverni felhasználás előtt. MEGJEGYZÉS: Ahol előírt, használjon szűrős vagy dugattyús hegyeket a pipettákhoz. A szennyeződés elkerülésének érdekében rendkívüli gondossággal járjon el. Futtatási mennyiség: Valamennyi COBAS TaqMan MTB teszt készlet négy darab 12 mintás futtatáshoz elegendő reagenst tartalmaz, amelyek külön-külön vagy párhuzamosan is kivitelezhetők. Egy MYCO ( ) C és egy MTB (+) C szükséges minden egyes, legfeljebb 22 mintát tartalmazó K-hordozóhoz (lásd a Minőség-ellenőrzés részt). Az amplifikációs és kimutatási reagensek 12 tesztre elegendő, egyszer használatos fiolákban vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat a 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni. A. Minta és kontroll előkészítése Munkaterület: Preamplifikálás - minta és kontroll előkészítő terület 1. Határozza meg a vizsgálandó minták és kontrollok számát, és rendezze el a szükséges 1,5 ml-es polipropilén csavarókupakos csöveket a munkaterületen úgy, hogy minden egyes mintára és kontrollra jusson egy-egy cső. Ne használjon pattintókupakos csöveket. Nézze meg a Figyelmeztetések és óvintézkedések részt. Jelöljön meg minden minta előkészítő csövet a minta azonosító számával. 2. Mérjen be 500 μl RW-t minden minta csőbe. 3. Pipettázon szűrös pipettahegyet használva 100 μl elfolyósított, dekontaminált és koncentrált légúti mintát a megfelelően jelölt, RW-t tartalmazó csövekbe. Minden mintához új szűrős pipettahegyet használjon. Csavarja a csövekre a kupakot, és vortexeljen 5 másodpercig. 4. Centrifugálja 12 500 g-n 10 percen át. 5. Finomhegyű transzferpipettával szívja le a felülúszót, és adjon 100 μl RL-t a sejtüledékhez, minden minta esetén új szűrős pipettahegyet használva. Reszuszpendálja az üledéket 5 másodperces vortexeléssel. 6. Készítse el a kontroll munkaoldatokat a következők szerint: MEGJEGYZÉS: A kontroll munkareagenseket a vizsgálat napján frissen kell elkészíteni, és a nap végén kidobni. MEGJEGYZÉS: A COBAS TaqMan MTB teszt készletben lévő MTB (+) C és MYCO ( ) C reagenseket az MTB (+) és MYCO ( ) kontroll munkaoldatok készítéséhez legfeljebb négy alkalommal való felhasználásra tervezték. A felbontást követően az MTB (+) C és MYCO ( ) C 4 héten vagy a lejárati időn belül stabil, amelyik előbb következik. a. Vortexelje a MYCO ( ) C csövet 5 másodpercig. Mérjen 50 μl MYCO ( ) C kontrollt egy 1,5 ml-es polipropilén csavarókupakos csőbe szűrős heggyel ellátott pipetta segítségével. Mérjen hozzá 200 μl RL-t. Vortexelje 5 másodpercig. Ez a Mycobacterium ( ) kontroll munkaoldat. b. Vortexelje a MTB (+) C csövet 5 másodpercig. Mérjen 50 μl MTB (+) C kontrollt egy 1,5 ml-es polipropilén csavarókupakos csőbe szűrős heggyel ellátott pipetta segítségével. Mérjen hozzá 200 μl RL-t. Vortexelje 5 másodpercig. Ez a M. tuberculosis (+) kontroll munkaoldat. 05174988001-07HU 7 Doc Rev. 7.0

c. Pipettázzon 100 μl-t mindegyik kontroll munkaoldatból egy 1,5 ml-es polipropilén csavarókupakos csőbe a klinikai mintákkal való párhuzamos előkészítéshez. 7. Inkubálja a mintákat és kontrollokat 60 C ± 2 C-on 45 percig száraz fűtőblokkban. 8. Vegye ki a csöveket a fűtőblokkból és centrifugában pörgesse le 5 másodpercig azokat, hogy eltávolítsa a kupakból a kondenzátumot. 9. Szűrős hegy használatával pipettázzon 100 μl RN-t minden minta és kontroll csőbe. Vortexelje 5 másodpercig félsebességen. Használjon új szűrős pipettahegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. 10. Vigye át az előkészített betegmintákat és kontrollokat az amplifikálási/kimutatási területre. B. Reagens előkészítése és K-hordozó betöltése Munkaterület: Preamplifikálási - Reagens-előkészítő terület MEGJEGYZÉS: A COBAS TaqMan MTB master mix (MTB MMX), a master mix munkareagens (MMX munkareagens), valamint az előkészített mintákat és kontrollokat tartalmazó MMX munkareagens fényérzékeny. Ezek a reagensek fénytől védve tartandók. MEGJEGYZÉS: A COBAS TaqMan MTB master mixet (MTB MMX), COBAS TaqMan Mycobacterium belső kontrollt (MYCO IC) és COBAS TaqMan Mycobacterium magnézium reagenst (MYCO Mg 2+ ) azonos hőmérsékletűre kell hozni legalább 30 percig szobahőmérsékleten hagyva a master mix munkareagens elkészítése előtt. MEGJEGYZÉS: A MMX munkareagenst a minta és kontroll előkészítés befejeztével készítse el. MEGJEGYZÉS: Az előkészített minták és kontrollok szobahőmérsékleten legfeljebb 4 óráig, 2-8 C-on legfeljebb 4 napig, míg -80 C-on legfeljebb 6 hónapig stabilak a master mix munkareagenshez történő hozzáadás előtt. MEGJEGYZÉS: A MMX munkareagenst 2 8 C-on kell tárolni és elkészítés után 2 órán belül fel kell használni. MEGJEGYZÉS: Ha egyszer az előkészített mintákat és kontrollokat a MMX munkareagenshez hozzámérte, az amplifikálást 90 percen belül meg kell kezdeni. 1. Hagyjon egy fiola MTB MMX, egy fiola MYCO Mg 2+ és egy fiola MYCO IC oldatot legalább 30 percig állni, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet. 2. Helyezzen egy K-hordozót egy K-hordozó tartóba. 3. Helyezzen új K-csöveket a K-hordozóba úgy, hogy ne érjen hozzá a K-csövek falához. MEGJEGYZÉS: Ha 24-nél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 4. Távolítsa el a K-csövek kupakját, ha rendelkezésre áll, a K-cső kupakrögzítő segítségével. Helyezze a kupakokat a K-cső tárolóhelyén a tartóba. 5. Készítse el az MMX munkareagenst a következők szerint: Adjon 200 μl MYCO Mg 2+ és 50 μl MYCO IC oldatot egy cső MTB MMX reagenshez. Csavarja rá a kupakot az csőre, majd 10-szeri átforgatással keverje jól össze. Az MMX munkareagenst ne vortexelje. A master mix munkareagens fénytől védve tartandó, és 2 órán belül fel kell használni. 6. Pipettázzon 50 μl MMX munkareagenst minden K-csőbe, vagy a K-tálca megfelelő lyukaiba. MEGJEGYZÉS: A MMX munkareagens nagyon fényérzékeny. A MMX munkareagenst tartalmazó K-csöveket vagy K-tálcákat minél kevesebb fényhatásnak tegye ki. 7. Mérjen szűrős vagy pozitív dugattyús heggyel ellátott mikropipettával minden egyes előkészített mintából vagy kontrollból 50 μl-t a megfelelő, MMX munkareagenst tartalmazó K-csőbe vagy a K-tálca lyukaiba. Minden mintát és kontrollt mikropipetta segítségével háromszori fel-le pipettázással óvatosan keverjen össze anélkül, hogy buborékokat okozna. 8. Ismételje meg a 7. lépést minden egyes előkészített mintára és előkészített kontrollra, amíg az összeset át nem vitte a K-csövekbe, vagy a K-tálca megfelelő lyukaiba. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Szemmel ellenőrizze, hogy nincsenek-e buborékok, és szükség esetén távolítsa el azokat. Zárja le a K-csöveket/K-tálcát a K-cső kupakrögzítő/k-tálca kupakozó eszköz segítségével. Szemmel ellenőrizze, hogy valóban a megfelelő térfogatok lettek-e összemérve. 9. Ha nem kezdi el azonnal az amplifikálást, a PCR-kész K-hordozót sötétben, 15 30 C között tárolja. Az amplifikálást az előkészített mintáknak és kontrolloknak az MMX munkareagenst tartalmazó K-csövekbe vagy K-tálcákba való bemérésétől számított 90 percen belül meg kell kezdeni. 05174988001-07HU 8 Doc Rev. 7.0

C. Amplifikálás és kimutatás Munkaterület: Posztamplifikálás Amplifikálási/Kimutatási terület A COBAS TaqMan 48 analizátor betöltése és működtetése 1. Kapcsolja be a számítógépes munkaállomást, majd jelentkezzen be a Windows XP-be a megfelelő felhasználónévvel és jelszóval. 2. Kapcsolja be a COBAS TaqMan 48 analizátort legalább 30 perccel a futás elindítása előtt. Ellenőrizze, hogy a készülék inicializálódik-e és használatra kész-e. Ha az előző futtatásokból K-hordozók maradtak bármelyik PCR-készülékben, távolítsa el azokat a K-hordozó transzporter segítségével. 3. Indítsa el az AMPLILINK szoftvert a számítógépen. A megfelelő felhasználóazonosítóval és jelszóval jelentkezzen be. 4. Hogy megadja a K-hordozó vizsgálandó mintáinak sorrendjét, kattintson az Orders ikonra. Válassza ki a Sample fület, majd kattintson a New gombra és a billentyűzet vagy vonalkódolvasó segítségével vigye be minden minta sorszámát. Válassza ki a COBAS TaqMan MTB teszt vizsgálatdefiníciós fájlját. A TDF-ek neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. Ismételje meg ezt mindegyik minta esetében. Kattintson a Save gombra. MEGJEGYZÉS: Ha 24-nél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 5. A minőség-ellenőrzési adatok beviteléhez kattintson az Orders ablakban a Quality Control fülre. Kattintson a New gombra, és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigye be a készlethez biztosított COBAS TaqMan MTB adatkártyáról a vonatkozó adatokat. Adja meg a COBAS TaqMan MTB Test tételszámot és lejárati dátumot. Kattintson az OK gombra. 6. Az Orders ablakban a K-Carrier fülre kattintva rendeljen a futtatáshoz egy K-hordozó számot. A K-Carrier ablakban kattintson a New gombra. A K-Carrier ID jobb oldalán lévő cellában a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével adja meg a K-hordozón vagy K-tálcán lévő vonalkódból a K-hordozó számát. Válassza ki a COBAS TaqMan MTB teszt vizsgálatdefiníciós fájlját az ablak alsó részén lévő vizsgálati panelből. A TDF-ek neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. 7. A Worklist listában jelölje ki a Type (T) oszlop első sorát. Jelölje ki ezt a mezőt, majd a megjelenő legördülő listából válassza ki a kívánt kontrolltípust. Ezután kattintson duplán ugyanezen sorban a minta azonosító mezőre; a LookUp Control ablak jelenik meg valamennyi lehetséges kontrollt feltüntetve. Amikor a kontrollt kiválasztja, a megfelelő tételszám és lejárati dátum megjelenik a jobb alsó információs mezőben. Ismételje meg ezt a folyamatot valamennyi szükséges kontroll esetén. 8. Ha mintákat akar a Worklist listához adni, kattintson kétszer az első pozícióra (sorra) a minta beviteléhez. Ekkor megjelenik a bevitt minták sorrendjét tartalmazó Lookup Sample ablak. Használja a Shift + Arrow gombokat egynél több sorszám kijelölésére. Ellenőrizze, hogy minden sorszámhoz hozzárendelte-e a COBAS TaqMan MTB teszt vizsgálatdefiníciós fájlt. A TDF-ek neve és verziója a készlethez mellékelt termékinformációs kártyán található. 9. A K-hordozóhoz rendelt sorszámok mentéséhez kattintson a Save gombra. 10. Válassza ki a System fül Systems ikonját; a PCR-készülék kinyitásához kattintson az Open gombra. Mikor a PCR-készülék teteje teljesen nyitva van, és a Systems ablakban a Ready to Load felirat látható, emelje meg és nyissa ki a PCR-készülék fedelét. A K-hordozó transzporter segítségével vigye át a kupakkal lezárt master mix munkareagenst és mintákat, illetve kontrollokat tartalmazó K-csövekkel betöltött K-hordozót a PCR-készülékbe. Csukja le a készülék fedelét. 11. A PCR-készülék tetejének zárásához és a futtatás elindításához kattintson a Start gombra a Systems ablakban a TC ikon alatt. 12. A COBAS TaqMan 48 analizátor az amplifikálást és kimutatást automatikusan elvégzi. 05174988001-07HU 9 Doc Rev. 7.0

EREDMÉNYEK Eredményszámítás az AMPLILINK 3.3-as verziójú sorozatával A COBAS TaqMan 48 analizátor automatikusan meghatározza, hogy kimutatható-e MTB DNS a mintából vagy a kontrollból. A COBAS TaqMan 48 analizátor: Meghatározza az MTB DNS és a Mycobacterium IC DNS ciklus küszöbértékét (Ct). Meghatározza, hogy van-e kimutatható MTB DNS az MTB DNS és a MYCO IC DNS küszöbértékek alapján. Meghatározza az MTB (+) C és a MYCO ( ) C érvényességét. Futtatás validálása Ellenőrizze az AMPLILINK szoftver eredmény ablakában vagy a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes. A futtatás akkor érvényes, ha a COBAS TaqMan MTB kontrollok egyike sem kap jelzőt. Egy értékelhető futtatás az alábbi eredményeket kaphatja: Kontroll Eredmény Magyarázat Negatív kontroll Negative Kontroll a tartományon belül Pozitív kontroll Positive Kontroll a tartományon belül A futtatás nem érvényes, ha a COBAS TaqMan MTB kontrollok az alábbi jelzők bármelyikét kapják: MYCO negatív kontroll: Jelző Eredmény Magyarázat NC_INVALID Invalid Nincs IC-jel vagy az IC-jel a tartományon kívül van MTB pozitív kontroll Jelző Eredmény Magyarázat PC_INVALID Invalid Kontroll a tartományon kívül, nincs targetjel vagy IC-jel Ha bármelyik kontroll érvénytelen (invalid), akkor a futtatás összes mintájára az eredmény INVALID. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Az eredmények értékelése: Érvényes futtatás esetén ellenőrizzen minden egyes mintát, hogy kapott-e jelzőt vagy megjegyzést az eredménylapon. Az alábbiak szerint értelmezze az eredményeket: Egy értékelhető futtatás mind értékelhető, mind nem értékelhető mintaeredményeket is tartalmazhat, az egyes mintákra vonatkozó jelzőktől és/vagy megjegyzésektől függően. 05174988001-07HU 10 Doc Rev. 7.0

A mintaeredmények az alábbiak szerint értelmezendőek: Kontroll- Minta- Jelző- Magyarázat eredmények eredmények megjegyzés(ek) PC_INVALID Érvénytelen Invalid és/vagy A kontroll(ok) nem érvényes(ek), minden eredmény NC_INVALID érvénytelennek van jelölve. M. tuberculosis DNS nem kimutatható. A minta feltételezhetően negatív M. tuberculosis-ra. A negatív Pozitív PC-re ( ) Nincs jelző eredmény nem zárja ki a M. tuberculosis-fertőzés Negatív NC-re jelenlétét, mivel az eredmény a megfelelő mintavételen, a gátlóanyagok hiányán és az elegendő mennyiségű kimutatható DNS jelenlétén is múlik. Pozitív PC-re M. tuberculosis DNS kimutatható. A minta Negatív NC-re MTB Nincs jelző pozitív M. tuberculosis-ra. Pozitív PC-re A mita eredménye érvénytelen. Kattintson a jobb Negatív NC-re Invalid S_INVALID egérgombban a jelző megjegyzésre az egyszerű jelzők megjelenítéséhez. (1) A belső kontroll Ct jele abnormálisan alacsony, a minta eredménye Invalid (érvénytelen). Az eredeti minta egy másik részletével ismételje meg a vizsgálatot. Ha az Pozitív PC-re Invalid QS_INVALID eredeti minta nem elérhető, új mintát kell venni. Negatív NC-re Megjegyzés: Az AMPLILINK v3.3 szoftver az alacsony IC Ct miatti IC hibát QS_INVALID jelzővel jelzi. (1) A jelző megjegyzésekkel és az egyszerű jelzőkkel kapcsolatos további információkat lásd az AMPLILINK szoftver 3.3-as verzió sorozatának alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülékkel, a COBAS TaqMan analizátorral, a COBAS TaqMan 48 analizátorral, a COBAS AMPLICOR analizátorral és a cobas p 630 készülékkel való együttes használatra kézikönyvben. MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Valamennyi futtatásnak kell tartalmaznia egy MYCO ( ) kontrollt és egy MTB (+) kontrollt. Mint minden új laboratóriumi eljárás esetében, a vizsgálatot végző személy fontolja meg további kontrollok használatát minden méréshez, amíg az eljárás kivitelezését nagyfokú biztonsággal el nem képes végezni. Nincs előírás a kontrollok K-hordozóban való elhelyezkedését illetően. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön a futtatás értékelhetőségéről. Negatív kontroll A MYCO ( ) C kontrollnak a Negative eredményt kell kiadnia, azaz az MTB DNS ciklus küszöbértéke a vizsgálati határ fölött volt, vagy pedig az MTB DNS küszöbérték nem lett meghatározva, de a Mycobacterium belső kontroll DNS küszöbértéke igen. Ha a MYCO ( ) C kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta- és kontroll-előkészítés, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha a MYCO ( ) C kontroll következetesen értékelhetetlen, technikai segítségért vegye fel a kapcsolatot a helyi Roche irodával. Pozitív kontroll Az MTB (+) C kontrollhoz tartozó kijelölt tartomány a COBAS TaqMan MTB Test tesztdefiníciós fájljában van meghatározva. Az MTB (+) C kontrollhoz tartozó eredmények csak akkor érvényesek, ha a jelzett tartományba esnek. A helyes eredmény Positive megjelöléssel kerül kiadásra. Ha az MTB (+) C kontrollhoz tartozó eredmény a kijelölt tartományon kívül esik, akkor a pozitív kontroll eredménye Invalid lesz PC_INVALID jelző megjegyzéssel. Ha a pozitív kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha a pozitív kontroll eredménye rendszeresen kívül esik a kijelölt tartományon, kérjen technikai segítséget a helyi Roche irodától. Az MTB (+) kontroll megközelítően 20 kópia/teszt M. tuberculosis plazmid DNS-szekvenciát tartalmaz. Ez körülbelül a vizsgálat Poisson-analízissel meghatározott alsó kimutatási szintjének a négyszerese. Az MTB (+) kontroll amplifikálása és kimutatása biztosítja, hogy az amplifikálás megtörtént. Az MTB (+) kontroll ugyanakkor nem mutatja az amplifikálás hatékonyságát vagy a vizsgálat kimutatási szintjét. 05174988001-07HU 11 Doc Rev. 7.0

Belső kontroll A belső kontroll feladata a polimerázinhibitorokat tartalmazó minták azonosítása. A belső kontroll használata ugyanakkor nem zár ki minden álnegatív vizsgálati eredményt. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat magas analitikai érzékenysége miatt rendkívüli gondossággal kell ügyelni a reagensek, illetve az amplifikálási elegyek tisztaságának megőrzésére. Minden reagens tisztaságát szorosan monitorozni kell. Dobjon ki bármilyen gyanús reagenst. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1. Ez a vizsgálat kizárólag NALC-NaOH módszerrel elfolyósított, dekontaminált és koncentrált expektorált és indukált köpet és BAL minták felhasználására lett validálva. Más típusú minták vizsgálata álnegatív vagy álpozitív eredményhez vezethet. 2. A M. tuberculosis kimutatása függ a mintában jelen lévő organizmusok számától, ezért a mintalevételi módszerek, betegfaktorok (azaz kor, tünetek megléte) és/vagy a M. tuberculosis fertőzés stádiuma befolyásolhatja azt. 3. Álnegatív eredmények polimerázgátlás miatt is előfordulhatnak. A Mycobacterium belső kontroll azért lett hozzáadva a COBAS TaqMan MTB teszthez, hogy lehetővé tegye az olyan feldolgozott minták azonosítása, amelyekben a 20 kópia/tesztnél nagyobb PCR-amplifikációt esetleg zavaró anyagok vannak jelen. 4. Álnegatív eredményt okozhat az egyéb, M. tuberculosis (MTB) komplextől eltérő Mycobacterium fajok magas csíraszámú jelenléte, amikor az MTB alacsonyabb csíraszámban fordul elő, mint a zavaró Mycobacterium faj. 5. A megbízható eredmény a mintalevételen, -transzporton, -tároláson és -feldolgozáson múlik. A tárolásból származó eltéréseket nem határozták meg maradéktalanul. 6. Az AmpErase enzim hozzáadása a master mixhez lehetővé teszi a target DNS szelektív amplifikálását; ugyanakkor a reagensek szennyeződésének elkerüléséhez helyes laboratóriumi gyakorlat és ezen Használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartása szükséges. 7. A vizsgálat segítségével terápiás siker vagy kudarc nem határozható meg. 8. Mint minden diagnosztikus vizsgálat esetén, a COBAS TaqMan MTB teszt eredményeinek értékelését a klinikai és laboratóriumi leletekkel együtt kell megtenni. 9. A terméket a PCR-technikák terén képzett személy használhatja. 10. A COBAS TaqMan MTB teszt minőségi eredményeket szolgáltat. Semmilyen korreláció nem állítható fel egy pozitív COBAS TaqMan MTB teszt könyökértéke és egy fertőzött mintában lévő M. tuberculosis sejtek száma között. 11. Ez a termék csak a COBAS TaqMan 48 analizátorral használható. 12. PCR-inhibitorok jelenléte álnegatív vagy nem értékelhető eredményeket okozhat. 13. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a vizsgálat primerei és/vagy próbája által lefedett bakteriális genom nagyfokban konzervált régiójában bekövetkezett mutációk következtében a baktérium kimutatása sikertelen lesz. 14. A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség minősíthető legyen. 05174988001-07HU 12 Doc Rev. 7.0

NEM KLINIKAI ÉRTÉKELÉS Analitikai specificitás A COBAS TaqMan MTB teszt analitikai specificitását az alábbi baktériumok, vírusok és gombák vizsgálatával értékelték, amelyek közül sok a légutak normál flórájának a tagja vagy gyakori kórokozója. Az alább felsorolt organizmusok közül egy sem mutatott reaktivitást a COBAS TaqMan MTB teszttel. Mycobacterium fajok Mycobacterium abscessus Mycobacterium neoaurum Mycobacterium asiaticum Mycobacterium nonchromogenicum Mycobacterium avium Mycobacterium phlei Mycobacterium chelonae Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium chitae Mycobacterium senegalens Mycobacterium fallax Mycobacterium shimoidei Mycobacterium flavescens Mycobacterium simiae Mycobacterium fortuitum Mycobacterium smegmatis Mycobacterium gastri Mycobacterium sphagni Mycobacterium gordonae Mycobacterium szulgai Mycobacterium intracellulare Mycobacterium terriae Mycobacterium kansasii Mycobacterium thermoresistibile Mycobacterium komassense Mycobacterium triviale Mycobacterium malmoense Mycobacterium vaccae Mycobacterium marinum Mycobacterium xenopi Nem mycobacterium fajok Acinetobacter calcoaceticus Corynebacterium xerosis Actinomadura madurae Cryptococcus neoformans Actinomyces pyogenes Deinococcus radiodurans Actinoplanes italicus Dermatophilus congolensis Aeromonas hydrophila Derxia gummosa Arthrobacter oxydans Eikenella corrodens Bacillus subtilis Enterobacter aerogenes Bacteroides fragilis Enterobacter cloacae Blastomyces dermatitidis Enterococcus faecalis Bordetella parapertussis Enterococcus faecium Bordetella pertussis Escherichia coli Branhamella (Moraxella) catarrhalis Fusobacterium nucleatum Brevibacterium linens Gordona sputi Campylobacter jejuni Haemophilus influenzae Candida albicans Herpes simplex virus type 1 Chlamydia trachomatis Histoplasma capsulatum Chromobacterium violaceum Human adenovirus Citrobacter freundii Human cytomegalovirus Clostridium perfringens Human enterovirus Coccidioides immitis Human rhinovirus 14 Corynebacterium aquaticum Influenza virus B Corynebacterium diphtheriae Klebsiella pneumoniae Corynebacterium flavescens Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Corynebacterium glutamicum Lactobacillus casei Corynebacterium jeikeium Legionella micdadei Corynebacterium minutissimum Legionella pneumophila Corynebacterium pseudodiphtheriticum Mycoplasma hominis Corynebacterium pseudotuberculosis Mycoplasma pneumoniae Corynebacterium renale Neisseria gonorrhoeae Corynebacterium striatum Neisseria lactamica Neisseria meningitidis Respiratory syncytial virus Nocardia asteroides Rhodococcus aichiensis Nocardia brasiliensis Rhodococcus chubuensis Nocardia farcinica (W5218) Rhodococcus equi Nocardia nova (W5194) Salmonellacholeraesus subsp Choleraesuis Nocardia otitidiscaviarum Serratia marcescens Nocardia transvalensi Staphylococcus aureus Oerskovia turbata Staphylococcus epidermidis Parainfluenza 2 virus Streptococcus agalactiae Peptococcus niger Streptococcus gordonii 05174988001-07HU 13 Doc Rev. 7.0

Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus magnus Porphyromonas asaccharolytica Porphyromonas gingivalis Prevotella melaninogenica Propionibacterium acnes Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptomyces griseinus Veillonella atypica Veillonella parvula Vibrio parahaemolyticus Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica Analitikai érzékenység: M. tuberculosis sejtek A COBAS TaqMan MTB teszt kimutatási határát úgy állapították meg, hogy meghatározták a M. tuberculosis azon legkisebb telepképző egységeinek (CFU) számát, amely még reprodukálhatóan kimutatható ( 95%-os pozitív eredmény) a COBAS TaqMan MTB teszttel. Egy dekontaminált MTB tenyészetet mostak bele a NALC/NaOH-val elfolyósított negatív köpetbe, hogy kiadjon egy olyan 7 szintű panelt, mely 10, 5, 1, 0,5, 0,25, 0,1 és 0 MTB CFU/PCR egységet tartalmaz. Ezt a panelt külön-külön, három napon át minden egyes nap elkészítették. Mindegyik panel szintet ötvennégyszer ismételve vizsgálták három, különböző tétel COBAS TaqMan MTB teszt reagenssel. A probit analízis eredmények alapján (1. táblázat) a COBAS TaqMan MTB teszt kimutatási határa köpetmintákban 0,46 CFU/PCR, illetve megközelítőleg 18 CFU/ml. 1. táblázat A COBAS TaqMan MTB teszt kimutatási határa (LOD) M. tuberculosis sejtekre Tenyészet Névleges CFU/PCR bevitel Értékelhetetlenek száma Értékelhetők száma Pozitívak száma Kísérletek száma % találat 95% Cl 1 10 0 54 54 54 100,0% 94,6 100% 2 5 0 54 54 54 100,0% 94,6 100% 3 1 0 54 54 54 100,0% 94,6 100% 4 0,5 0 54 51 54 94,4% 84,6 98,8% 5 0,25 0 54 46 54 85,2% 72,9 93,4% 6 0,1 0 54 33 54 61,1% 46,9 74,0% 7 0 0 54 0 54 0,0% 0,0 5,4% 95% LOD (PROBIT) = 0,46 CFU/PCR 95% konfidenciaintervallum = 0,33 0,83 CFU/PCR Inkluzivitás A COBAS TaqMan MTB teszt az MTB komplexben előforduló valamennyi Mycobacterium fajjal (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, és M. africanum) értékelve lett. Adott mennyiségű genomi DNS preparátumot (10 kópia/pcr) és baktériumtenyészetet vizsgáltak. A 10 kópia/pcr beviteli szintnél az MTB komplex mind a 4 tagja pozitívként lett felismerve. Ezen felül, az MTB komplex fajok 169 tenyészetét (M. tuberculosis = 159, M. bovis = 6, M. microti = 3 és M. africanum = 1) elemezték a COBAS TaqMan MTB teszt segítségével. A M. microti egy tenyészete és a M. tuberculosis egy tenyészete negatívnak bizonyult, így a teljes inkluzivitás 99%-os volt. 05174988001-07HU 14 Doc Rev. 7.0

Reprodukálhatóság A COBAS TaqMan MTB teszt reprodukálhatóságának kiszámítása az eredmények naponkénti, tételenkénti és vizsgálónkénti értékelésével történt. A naponkénti vizsgálatot (2. táblázat) egy vizsgáló vezette egy tételből származó COBAS TaqMan MTB teszt reagenssel 15 napon át, a MYCO negatív kontrollt (NC), az MTB pozitív kontrollt (PC), illetve az MTB pozitív kontroll negatív kontrollal való hígítását (1/2 PC) használva. A tételenkénti vizsgálatot (3. táblázat) egy vizsgáló végezte egy napon három különböző tétel COBAS TaqMan MTB teszt reagenssel, a MYCO negatív kontrollt (NC), az MTB pozitív kontrollt (PC), illetve az MTB pozitív kontroll negatív kontrollal való hígítását (1/4 PC és 1/2 PC) használva. A vizsgálónkénti vizsgálatot (4. táblázat) három vizsgáló végezte három különböző napon azonos tétel COBAS TaqMan MTB teszt reagenssel, a MYCO negatív kontrollt (NC), az MTB pozitív kontrollt (PC), illetve az MTB pozitív kontroll negatív kontrollal való hígítását (1/2 PC) használva. A három vizsgálatból származó 720 eredményt a 2-4. táblázat foglalja össze. A 132 NC mérése 100%-ban negatív eredményt adott. Mind az 588 pozitív, 20 és 5 között változó MTB target/pcr kópiaszámú minta mérése pozitív eredményt adott. Mindhárom vizsgálatban a %CV értéke 2,4 vagy annál kisebb volt, ez azt mutatja, hogy a minőségi eredmények jól reprodukálhatóak a teszttel. 2. táblázat A COBAS TaqMan MTB teszt naponkénti reprodukálhatóságának eredményei MTB target NC (0 c/pcr) PC (~20 c/pcr) 1/2 PC (~10 c/pcr) értékelhető mérések teljes száma 60 60 60 pozitív eredmények %-a 0% 100% 100% átlag MTB könyök N/A 39,4 41,1 minimumérték N/A 38,3 39,9 maximumérték N/A 40,8 42,8 szórás N/A 0,5 0,7 variációs koefficiens N/A 1,3% 1,7% 3. táblázat A COBAS TaqMan MTB tételenkénti reprodukálhatóságának eredményei MTB target értékelhető mérések teljes száma NC (0 c/pcr) PC (~20 c/pcr) 1/2 PC (~10 c/pcr) 1/4 PC (~5 c/pcr) 36 36 36 324 pozitív eredmények %-a 0% 100% 100% 100% átlag MTB könyök N/A 39,6 40,7 41,6 minimumérték N/A 38,5 39,1 39,5 maximumérték N/A 41,3 42,3 48,0 szórás N/A 0,8 0,7 1,0 variációs koefficiens N/A 1,9% 1,7% 2,4% 05174988001-07HU 15 Doc Rev. 7.0

4. táblázat A COBAS TaqMan MTB vizsgálónkénti reprodukálhatóságának eredményei MTB target NC (0 c/pcr) PC (~20 c/pcr) 1/2 PC (~10 c/pcr) értékelhető mérések teljes száma 36 36 36 pozitív eredmények %-a 0% 100% 100% átlag MTB könyök N/A 39,6 40,8 minimumérték N/A 38,4 39,2 maximumérték N/A 41,5 42,6 szórás N/A 0,8 0,8 variációs koefficiens N/A 1,9% 2,0% Korreláció A korrelációs tanulmányt a COBAS TaqMan MTB teszt és a COBAS AMPLICOR MTB teszt összehasonlítására végezték el. A tanulmányban összesen 769 köpetmintát és 186 bronchoalveoláris lavázs (BAL) mintát vizsgáltak meg. Fagyasztva tárolt archív mintákat és frissen levett fagyasztott mintákat is beválogattak. Három egyedi tétel COBAS TaqMan MTB teszt reagenst használtak a tanulmány során. A köpetmintákat vizsgálva a pozitív korreláció (5. táblázat) 96,2%, a negatív korreláció 99,1%, a teljes megfelelési arány pedig 98,3% volt a COBAS TaqMan MTB teszt és a COBAS AMPLICOR MTB teszt között. A BAL mintákat vizsgálva a pozitív korreláció (6. táblázat) 97,1%, a negatív korreláció 99,3%, a teljes megfelelési arány pedig 98,9% volt a COBAS TaqMan MTB teszt és a COBAS AMPLICOR MTB teszt között. 5. táblázat Korreláció a COBAS TaqMan MTB teszt és a COBAS AMPLICOR MTB teszt között Köpetvizsgálat eredményei köpet eredmények N = 769 COBAS TaqMan MTB teszt COBAS AMPLICOR MTB teszt összesen + + 207 5 212 8 549 557 összesen 215 554 769 arány megfelelés %-a 95% konfidenciaintervallum pozitív megfelelési arány 207/215 96,2% 92,8 98,4 negatív megfelelési arány 549/554 99,1% 97,9 99,7 teljes megfelelés 756/769 98,3% 97,1 99,1 05174988001-07HU 16 Doc Rev. 7.0

6. táblázat Korreláció a COBAS TaqMan MTB teszt és a COBAS AMPLICOR MTB teszt között BAL-vizsgálat eredményei BAL eredmények N = 186 COBAS TaqMan MTB teszt COBAS AMPLICOR MTB teszt összesen + + 34 1 35 1 150 151 összesen 35 151 186 arány megfelelés %-a 95% konfidenciaintervallum pozitív megfelelési arány 34/35 97,1% 85,1 99,9 negatív megfelelési arány 150/151 99,3% 96,4 99,9 teljes megfelelés 184/186 98,9% 98,9 99,9 Teljes rendszerhiba A COBAS TaqMan MTB teszt teljes rendszerhibáját úgy határozták meg, hogy 100 olyan negatív köpet százalékos pozitív eredményét vizsgálták, melyeket 60 CFU/ml végkoncentrációra, illetve a kimutatási határ ~3-szorosának megfelelő csíraszámú MTB tenyészettel oltottak be (lásd fentebb a Kimutatási határ c. részt). Pozitív eredményt 100 mérésből 99 esetben kaptak, eszerint a COBAS TaqMan MTB teszt teljes rendszerhibája 1,0%, a rendszer megbízhatósága pedig 99%. Zavarás Az endogén hemoglobin jelenlétének COBAS TaqMan MTB tesztre gyakorolt zavaró hatását úgy vizsgálták, hogy negatív köpetet oltottak be MTB pozitív kontrollal (25 kópia/pcr) és hemoglobinnal 0,52-től 5,2 mg/ml koncentrációig. Egyik bevitt hemoglobin szintnél sem volt a COBAS TaqMan MTB teszt zavarása tapasztalható. Vizsgálták a terápiában gyakran alkalmazott hat antituberkulotikus hatóanyag COBAS TaqMan MTB tesztre gyakorolt zavaró hatását. A hat hatóanyagot (7. táblázat) 1 x C Max és 3 x C Max végkoncentrációkban alkalmazták úgy, hogy a hatóanyagokat az MTB pozitív kontroll plazmidot (~17 kópia/pcr) tartalmazó negatív köpetbe oltották. A COBAS TaqMan MTB teszt működését nem befolyásolta a hat hatóanyag 1 x C Max és 3 x C Max szintű beoltása. 7. táblázat Antituberkulotikus hatóanyagok és C Max szintek C hatóanyag kémiai név rövidítés Max (μg/ml) Isoniazid izonikotinsav-hidrazid INH 5 7 Ethambutol ethambutol-dihidroklorid ETH 1,7 Rifampicin Rifadin, Rimactane RIF 7,99 Pyrazinamid pirazinkarboxamid PZA 30 35 Kanamycin kanamycin-monoszulfát KM 2,0 Streptomycin streptomycin-szulfát só SM 25 30 Gátlás A COBAS TaqMan MTB teszt gátlásának mértékét (nem értékelhető belső kontroll) olyan különböző vizsgálatok elemzésével határozták meg, amelyekben a köpet vagy BAL mintákat és MTB tenyészet panel anyagokat is használtak; 1094 adatot összesítettek. A teljes gátlás értéke a COBAS TaqMan MTB teszt esetében az összes elemzett vizsgálatra (minták és MTB tenyészet panelek) 0,0% volt (0/1094). 05174988001-07HU 17 Doc Rev. 7.0

HIVATKOZÁSOK 1. World Health Organization Fact Sheet N 104 Revised April 2005. 2. Tuberculosis Elimination Revisited: Obstacles, Opportunities, and a Renewed Commitment Advisory Council for the Elimination of Tuberculosis (ACET). Morbidity and Mortality Weekly Reports 1999. (RR09): 1-13. 3. Metchock, B.G., Nolte, F.S. and Wallace, R.J. 1999. Mycobacterium, pp. 339-437: In: Manual of Clinical Microbiology, 7th ed., eds. Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A. et al. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 4. Bloom, B.R. and Murray, C.J.L. 1992. Tuberculosis: commentary on a re-emergent killer. Science 257:1055-1063. 5. Böttger, E.C. 1991. Detection, differentiation, and systematics of bacterial pathogens - the family Mycobacteriaceae. Immunitat und Infection 19:143-152. 6. Daniel, T.M. 1990. The rapid diagnosis of tuberculosis: a selective review. Journal of Laboratory Clinical Medicine 116:277-282. 7. Hermans, P.W.M., Schuitema, A.R.J., Soolingen, D.V. et al. 1990. Specific detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology 28:1204-1213. 8. CDC. Nucleic Acid Amplification tests for Tuberculosis. MMWR 2000:49. 9. Pfyffer, G.E., Kissling, P., Jahn, E.M.I. et al. 1996. Diagnostic performance of amplified Mycobacterium tuberculosis direct test with cerebrospinal fluid, other nonrespiratory, and respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology 34:834-841. 10. Miller, N., Hernandez, S.G. and Cleary, T.J. 1994. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and PCR for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology 32:393-397. 11. Bergmann, J.S., Keating W.E., Woods G.L. 2000. Clinical evaluation of the BDProbeTec ET system for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 38:863-865. 12. Yuen, K., Yam, W., Wong, L. et al. 1997. Comparison of two automated DNA amplification systems with a manual one-tube nested PCR assay for diagnosis of pulmonary tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 35:1385-1389. 13. J. C. Palomino. 2005. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis: feasibility and applicability in the field. European Respiratory Journal 26:339-350. 14. Ichiyama, S., Iinuma, Y., Tawada, Y. et al. 1996. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and Roche PCR-microwell plate hybridization method (AMPLICOR Mycobacterium) for direct detection of mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology 34:130-133. 15. Saiki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich, and N. Arnheim. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230:1350-1354. 16. Mullis, K. B. and F. A. Faloona. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, 155:335-350. 17. Kent, P.T. and Kubica, G.P. 1985. US DHHS. Public Health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Atlanta, GA. 18. Böddinghaus, B., Rogall, T., Flohr, T. et al. 1990. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rrna. Journal of Clinical Microbiology 28:1751-1759. 19. Longo, M. C., M. S. Berninger, and J. L. Hartley. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene, 93:125-128. 20. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 21. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005. 22. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp. 05174988001-07HU 18 Doc Rev. 7.0

Dokumentum verzióinformációi Doc Rev. 7.0 06/2014 A TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A jelű szakaszába belekerült a felbontott palack stabilitásáról szóló információ. A használati utasítás végén frissítve lettek a harmonizált szimbólumoldal leírásai. Esetleges kérdésével forduljon a Roche helyi képviselőjéhez. 05174988001-07HU 19 Doc Rev. 7.0

" A COBAS TaqMan MTB teszt gyártója: Roche Molecular Systems, Inc. 1080 US Highway 202 South Branchburg, NJ, 08876 USA Distributed by Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 2, Avenue du Vercors 6343 Rotkreuz, Switzerland 38240 Meylan, France Roche Diagnostics GmbH Distributore in Italia: Sandhofer Straße 116 Roche Diagnostics S.p.A. 68305 Mannheim, Germany Viale G. B. Stucchi 110 20052 Monza, Milano, Italy Roche Diagnostics, SL Distribuidor em Portugal: Avda. Generalitat, 171-173 Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. E-08174 Sant Cugat del Vallès Estrada Nacional, 249-1 Barcelona, Spain 2720-413 Amadora, Portugal Roche Diagnostics Roche Diagnostica Brasil Ltda. 201, boulevard Armand-Frappier Av. Engenheiro Billings, 1729 H7V 4A2 Laval, Québec, Canada Jaguaré, Building 10 (For Technical Assistance call: 05321-010 São Paulo, SP Brazil Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273-3433) Az AMPLICOR, az AMPERASE, az AMPLILINK, az AMPLIPREP, a COBAS, a COBAS P és a TAQMAN a Roche védjegye. A MICROSOFT és a WINDOWS XP a Microsoft Corporation védjegye az Egyesült Államokban és/vagy más országokban. 2014 Roche Molecular Systems, Inc. 06/2014 (04803566001-09ENGL) Doc Rev. 7.0 05174988001-07 05174988001-07HU 20 Doc Rev. 7.0