Elektroforézs történet fejlődése Cklodextrnek, mnt králs szelektorok alkalmazása a CE-ben Varga Erzsébet 1, Ivány óbert 1 1 CycloLab &D. Lab., -1097, Budapest, Illatos út 7. 1925-1930 Tselus (1948 kéma Nóbel díj : folyadék fázsú elektroforézs készülék fehérjék elválasztására 1950-1960: - szntetkus polmerek (polakrlamd gélek bevezetése - készülékek, segédberendezések fejlesztése 1980: elérhetővé válnak a ks átmérőjű kvarckapllársok Jorgenson és Lukacs elkészítk az első kapllárs elektroforézs készüléket 1990: kapllárs elektroforézs (elektrokromatográfás módszerek fejlesztése Kapllárs elektroforetkus módszer I. CE készülék vázlatos felépítése elektromos térben az oldott anyagok különbözı sebeséggel vándorolnak (q/m vékony (25-75µm kapllárs elektroozmotkus áramlás (EOF jelenlétében elektroozmotkus áramlás (EOF lehetıvé tesz anonok és katonok egydejő meghatározását EOF kalakulása
Kapllárs elektroforetkus módszer II. Áramlás profl: CE vs. PLC Az áramlásprofl keresztmetszete Elektroozmotkus Áramlás (CE EOF + Detector response + + + - - - Az áramlásprofl keresztmetszete drodnamkus Áramlás (PLC Nyomás Tme Módszer Kapllárs zónaelektroforézs (CZE Mcellárs elektroknetkus kromatográfa (MEKC Kapllárs gélelektroforézs (CGE Kapllárs zoelektromos fókuszálás (CIEF Kapllárs zotachoforézs (CITP Kapllárs elektrokromatográfa (CEC Elektroforézsen alapuló eljárások összefoglalása Kapllárs módosított / nem módosított nem módosított módosított és töltött módosított / nem módosított nem módosított töltött kapllársok Az elválasztás alapja onmozgékonyság az elektrolt és a mcellák között megoszlás a részecskék elektroforetkus vándorlása és a közeg molekulaszűrő hatása zoelektromos pont onmozgékonyság elsősorban az állófázssal történő kölcsönhatások Alkalmazás lehetőségek sokrétű alkalmazás sokrétű alkalmazás fehérjék molekulaméret szernt elválasztása amfoter sajátságú anyagok elválasztása híg oldatok dúsítása a CZE-t megelőzően általában megegyezk a PLC-nél smertekkel Ksmérető onok: zervetlen anonok és katonok zerves anonok és katonok Alkoholok, fenolok, szénhdrátok Amnosavak, peptdek, olgopeptdek Nukleozdok, nukleotdok Vtamnok, toxnok Növényvédőszerek, gyógyszerhatóanyagok A kapllárs elektroforézs analtka kéma alkalmazása Nagymérető onok: Fehérjék Nuklensavak és fragmentjek Vírusok és sejtek Nanorészecskék
nagy felbontóképesség (N > 10 5 10 6 Kapllárs elektroforézs rövd analízs dı (ált. 30, de akár 5 alatt széles körben változtatható paraméterek (p, c(puffer, adalékok, onerısség, T, U gyors módszerfejlesztés (kond.: 2-10' egyszerő mntaelıkészítés kcsny mntagény (njektálva 1-50 nl hdrodnamkus és elektroknetkus njektálás vzes vagy nemvzes puffer magas szntő automatzáltság (replenshment Gyors, Egyszerő, Olcsó UV detektálás kapllársban (v. ndrekt, F, LIF, Amp., Vez.kép., M, Králs kapllárs elektroforézs (vagy elektroknetkus kromatográfa fa Gyors, egyszerű és olcsó analtka módszer. Králs szelektorok: cklodextrnek, koronaéterek, makrocklusos antbotkumok, fehérjék, mcellák A cklodextrnek és származékak a leggyakrabban alkalmazott králs puffer adalékok. Több mnt 1300 publkácó alkalmaz cklodextrneket kapllárs elektroforézsben (utóbb 15-20 év. Nagy és növekvő számú KIÁLI ZELEKTOOK Enantomerarány és králs nyomszennyezés meghatározás Enantomersorrend megváltoztatás A králs kapllárs elektroforézs alkalmazás területe Enantomerek elválasztása fontos különböző bológa aktvtásuk matt Az enantomerek szelektív elválasztására folyamatosan növekszk az gény a tudomány és az par területén: természetes králs anyagok analtkája enantoszelektív szntézsek analtkája gyógyszerhatóanyagok (pl. profének, béta-blokkerek farmakoknetka vzsgálatok agrokéma anyagok (pl. herbcdek C(6 C(3 C(2 (O n (O n (O n Cklodextrnek, mnt králs szelektorok cklkus, nem-redukáló olgoszachardok α-, β- ll. γcd-ket különböztetünk meg molekula két peremének hdrofl jellege matt a CD-k jól oldódnak vízben (kvéve a βcd O O O O O n=6(α;7(β;8(γ
Cklodextrn töltése Elválasztható enantomer Cklodextrn származékok semleges onos α-,β-,γ-cd, acetlezett, DIMEB, TIMEB negatív poztív - a stabltás állandó megváltoztatása - a belsı szelektvtás növelése Cklodextrnek és CD származékok csoportosítása onos és semleges onos és semleges A származékolás célja: karbox-alkl, szulfatált, foszfatált amno: pr., szek., terc., kvat. - a mozgékonyság-különbség növelése a szabad és komplexált formák között gazdamolekula + Zárványkomplex-képzés cklodextrnek általában 1:1 arányú (dasztereomer! zárvány-komplexeket képeznek K ass : 10 10000 M -1 K ass : asszcácós állandó K ds : dsszocácós állandó vendégmolekula K ass K ds komplex Kndulás: µ = µ = µ A králs elválasztás követelménye CD típusú szelektor hozzáadásával a mozgékonyság-különbség: [ CD]( µ ( K K µ = µ = 1 + CD Két feltételnek kell teljesülne: cplx [ CD]( K + K + K K [ ] 2 1. - legalább az egyk enantomer esetén legyen: µ µ cplx 2. - a komplex-stabltás állandók különbözzenek: K K m,, : nem komplexált enantomerek mozgékonysága m cplx : komplexált enantomer mozgékonysága m, : enantomerek ektív mozgékonysága K,K : enantomerek stabltás állandó ( µ [ CD] µ Látszólagos komplex-stabltás állandók meghatározása µ = K( µ 1+ K[CD] + µ Lnearzácó (x-recprok módszer: Ábrázolás: = cplx K[CD] + K( µ cplx ( µ versus ( µ [ CD]
[ CD] K ass opt µ = K 1 K [CD] opt 1000 M -1 1 mm 100 M -1 10 mm 10 M -1 100 mm Wren.A.C. és owe.c.: J. Chromatogr. 603 (1992 235-241. A Wren-féle mozgékonyság-különbség elmélet µ (cm 2 *V -1 s -1 2,5E-06 2,0E-06 1,5E-06 1,0E-06 5,0E-07 0,0E+00 A Kmaxmum =10 ; K = eltolódk 11 K =100 ; K = 110 K =1000 ; K = 1100 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 Concentraton of selector (mm K növekszk p kválasztása: - bázs: p 2.5 3 - sav: p > pk a - semleges: p 2.5, 7.2, 9.2 Egyféle CD-t tartalmazó rendszerek: tratéga - a három natív CD (α, β és γ négy-négy koncentrácó pontban (üregméret kölcsönhatás vzsgálatok - a látszólagos stabltás állandók meghatározása néhány új koncentrácó pontban (ha szükséges - semleges CD származékok (P, acetl, metl 1-3 koncentrácó pontban - onzálható CD származékok (CM, amno, szulfát stb. 1-3 konc. pontban Optmalzálás (p, konc., puffer, hőmérséklet stb. CD-ek kombnálása (dual rendszerek vagy másk p-án elölről emleges cklodextrn, mnt králs szelektor Katonos cklodextrn, mnt králs szelektor p=2,5 (15 mm foszfát puffer c CD 75 mm 50 mm s=1.75 s=2.09 40 mm bórsav, 40 mm ecetsav és 40 mm foszforsav puffer 1:2:2 arányban (Brtton-obnson p=5 5 mm DMAβCD (heptaks(2,3-dmethyl-6-amno-6-deoxy-β-cyclodextrn 25 mm 10 mm 5 mm s=1.70 s=1.12 s=0.6 Mandula sav s=2.26 Ketoprofen s=6.49 0 mm vnkadfformn t (perc 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0
Anonos cklodextrn, mnt králs szelektor Duál rendszer alkalmazása 75 mm bórsav p=9.0 30 mm CEβCD semleges+onos cklodextrn együttes alkalmazása mau 7 DAD1 A, g=200,10 ef=off (D:\PCEM\DATA\2006\KI1026A\KI00071.D COO mau 40 DAD1 A, g=200,10 ef=off (D:\PCEM\DATA\MD0509\MD00051.D D-Nateglnde 6 5 4 3 2 EOF treo-beta-metl-trptofán enantomerek N N 2 C 3 35 30 25 20 15 10 3 C C 3 O N O O 40 mm Na2PO4 / NaO, p 7.2, +17.5kV 30 mm CMBCD 5 mm AMEB (D~12 s=2,35 L-Nateglnde 5 1 0 0 11 11.5 12 12.5 13 13.5 mn 4.75 5 5.25 5.5 5.75 6 6.25 6.5 6.75 mn