A Molekuláris Biológia Technológiai Arzenálja-II GENOMIKA: TÖBBFÉLE MAKROMOLEKULA VIZSGÁLATA EGYIDŐBEN Strukturális genomika a genomika azon területe, mely a genom, a DNS szerkezetével foglalkozik. Eszköztára: Genomkönyvtárak, DNS szekvenálás; a vizsgálat tárgyai különféle polimorfizmusok és a DNS-t alkotó bázisok sorrendjének megállapítása. 1 A genomkönyvtár készítése (plazmid vektor használatával): a DNS-t restrikciós enzimekkel feldarabolják, vagy fizikai módszerekkel kis fragmensekre tördelik. A kapott DNS darabokat klónozzuk: a méretük befogadására alkalmas plazmidba ligáljuk, majd E. coli baktériumba transzformáljuk; a rekombináns DNS-t tartalmazó sejteket a megfelelő kezelés után lefagyasztva tartjuk fenn. A DNS könyvtárban található DNS szegmenseket fluoreszcens festékkel, vagy radioaktívan jelölt próbákkal azonosítjuk a Southern blot módszerrel. Génkönyvtárak (1) Genomkönyvtár: (DNS könyvtár, génkönyvtár, génbank, DNS klóntár) olyan klóngyűjtemény, amelyben megtalálható az adott organizmus genetikai anyagának minden DNS fragmense. A genomkönyvtárak megkönnyítik egy bizonyos gén megkeresését, izolálását, valamint a klónok felhasználhatók DNS szekvenáláshoz templátként. (2) cdns könyvtár: egy adott organizmus transzkriptumát reprezentálja. A klónozás, és a DNS-könyvtár készítés azon esete, amikor a plazmidba, vagy egyéb klónozó vektorba a genom (protein) kódoló részeit szelektálják. Felhasználása pl. génszerkezet megállapítása (intron-mentes gének). (3) EST könyvtár (Expressed Sequence Tag): Az EST-k olyan rövid (néhány 100 bp) szekvenciák, melyeket a cdns megszekvenálásával nyernek. Az EST könyvtár ilyen rövid szekvenciák klóntára, mely tehát a cdns könyvtárhoz hasonlóan a transzkriptumot képviseli, azonban a cdnseknek csak kis darabjait tartalmazza. Felhasználása: egy sejttípus vagy szövettípus transzkriptomának gyors vizsgálata, azaz annak meghatározása, hogy milyen gének fejeződnek ki adott a sejt-, vagy szövettípusban. Az aktív genom (a genom proteinkódoló része) gyors szekvenálására is használható. cdns készítés: A mrns-ek kinyerését követően, azokat reverz transzrkiptáz enzim cdns-sé (c = complementer) írja vissza, a kapott egyszálú cdns-t kétszálúvá alakítjuk. A cdns könyvtárkészítéskor a kétszálú cdns-eket klónozó vektorba építjük. Az elkészült klónok összességét nevezzük cdns könyvtárnak. DNS szekvenálás: az összes genom program alapjául szolgáló technika. Az eljárás során meghatározzák egy adott DNS szakaszt alkotó bázisok sorrendjét. A Frederick Sanger (2x-es Nobel-díjas) által kidolgozott technológia a mai napig igen elterjedt. A Sanger-féle láncterminációs (dideoxi-nukleotid) módszer: Sanger módszere in vitro DNS szintézis, amely során izotóppal jelölik a keletkező új szálat. Előállítják a templát DNS egyes szálát, majd radioaktívan jelölt primert hibridizálnak hozzá. Ezután négyfelé osztják az elegyet és kiegészítő szálat szintetizálnak az eredeti lánchoz dntp-k (dezoxiribonukleotid-trifoszfát) jelenlétében (DNS polimeráz segítségével), minden esetben
úgy, hogy a reakcióelegyekben egy-egy dideoxi-nukleotid (ddntp) is jelen van. A DNS polimeráz hatására megindul a radioaktív kiegészítő DNS lánc szintézise, de bizonyos esetekben, amikor a dideoxi analóg épül be, akkor a szintézis nem tud folytatódni, hanem megáll. ddntp bekötődésekor a cukor-foszfát láncról hiányzik egy hidroxil csoport, tehát a következő dntp nem tud hova kötni. Mivel a ddntp-k kapcsolódása a DNS szálhoz véletlenszerűen történik, az egyes reakciók véletlenszerűen állnak le. A kapott DNS fragmenteket poliakrilamid géleken megfuttatjuk, majd autoradiográfiával meghatározzuk a helyzetüket. Az autoradiogramon alulról felfelé olvasva megkapjuk a vizsgált oligonukleotid szekvenciájának komplementerét. A szekvenálás az 80-as évek végéig manuálisan történt. 2 Automatizált festék-terminációs módszer: a technika a Sanger-féle módszeren alapszik. Az eljárás során a négyféle ddntp-hez négyféle fluoreszcens anyagot kapcsolnak, és négyféle reakcióelegyben végzik el a DNS polimeráz által katalizált reakciót (DNS szintézist). A reakcióelegyet ezután egyetlen mintakamrába helyezik és elvégzik az elektroforézist. Megfelelő gerjesztő fény alkalmazásakor a fluoreszcencia színe fogja jelenteni az adott nukleotidot, mely megfelel a beépült ddntp-nek. Ezeket automata méri, így napi 10 000 bázisnyi szekvencia is meghatározható. Egyetlen ilyen automata készülék alkalmazása esetén a teljes humán genom szekvenciájának meghatározása 1000 évet venne igénybe. Robotok alkalmazása gyorsítja a szekvenálást. Humán Genom Projekt (HGP): 1990-ben indult azzal a céllal, hogy az emberi genomot alkotó kb. 3milliárd bp nukleotid sorrendjét megfejtsék. Az akkori tervek szerint, a kor szekvenálási technológiáit alapul véve úgy becsülték, hogy évente 100ezer bázis megfejtése lehetséges, melynek költsége 1000 USD/bázis. A program egy nemzetközi összefogás eredményeként jött létre International Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC) néven, az amerikai National Institute of Health (NIH) és a Department of Energy, az angol Welcome Trust Institute mellett német, francia, japán és kínai kutatóintézetek részvételével. A kutatás koordinálása érdekében létrehozták a Human Genome Organization-t (HUGO). A HGP első igazgatója a DNS kettős spirál felfedezője James Watson volt, őt Francis Collins követte. A kezdetben nehézkesnek tűnő projekt 1998-ban nagyobb sebességre kapcsolt. Ez a szekvenálási technológiák hatalmas fejlődésén túl annak volt köszönhető, hogy a HGP mellett, J. Craig Venter vezérletével beszállt a genomprogram versenyébe a magánszférát képviselő Celera Genomics, akik azt ígérték, hogy három év alatt elkészülnek azzal a munkával, amit a HGP csaknem egy évtizede folytatott. A teljes kromoszóma szekvenálás kivitelezése 500-1000 bp-os szériákban történik, a humán genomot tehát ekkora darabokra kellett bontani, s e kis fragmenteket megszekvenálni, majd összeilleszteni. A Celera egész más módszert alkalmazott, mint a HGP. A 2 csoport közt komoly verseny alakult ki, de végül 2000. június 26-án a Fehér Házban közösen jelentették be az emberi géntérkép nyers változatának elkészültét. Az HGP és a Celera közt számos szerződés köttetett, az egyik nyomán 2001 februárjában jelentették be, hogy a Celera a térképét bizonyos etikai cenzúrákkal a Science tudományos lapban közli, ellenben a HGP a Nature c. folyóiratban teszi közzé humán térképét, egy az egyben. A Celera lehetővé tette, hogy kutatók - bizonyos korlátozásokkal - az interneten keresztül letöltsék génadatbázisát, míg a mai napig korlátozás nélkül használható a HGP adatbázis, naponta frissülő, új eredményekkel. Az HGP (IHGSC) módszere - a hierarchikus szekvenálás (föntről lefelé, azaz top-down térképező): az 1980-as években kifejlesztett, rendkívül időigényes szekvenálási technika; lényege, hogy a megszekvenálandó genomot egyre kisebb alegységekre bontják. Első lépésként nagyméretű (átlag 200 kb-ig terjedő) kromoszómarészleteket BAC vektorokba klónozzák, majd a végeiket megszekvenálják, s az átfedő részek alapján a kapott BAC könyvtár tagjait sorba állítják. Ezután az egyes, a kromoszómán már ismert hellyel rendelkező BACkönyvtár tagokat darabolják tovább, s ezt a folyamatot addig ismétlik, míg olyan kis (500-1000 bp-os) darabokat nem kapnak, hogy azokat már teljes egészében meg lehet szekvenálni. Celera a shotgun (sörét) technika: a genomot egyből apró fragmentekre vágták fel, majd a fragmentek mindkét végét megszekvenálták. A kapott szekvencia összerakásához bonyolult számítógépes programokat alkalmaztak.
Ki az, akinek megismertük a genomját: egy önkéntes, anonim, etnikailag diverz donorcsoportról van szó. Az, hogy az adományozók közül aktuálisan kinek a genomrészletét szekvenálták meg, pusztán technikai tényezőkön múlt. Tehát nem tudható, hogy kinek a DNS szekvenciája vált elsőként ismertté, s valójában csak a haploid kromoszómaállományt és a mitokondriális DNS-t szekvenálták meg. Az HGP több mint 50, különböző etnikumú és nemű donor mintáit használta kiindulásként. Kezdeti génkönyvtárai mindkét nem genomrészleteit tartalmazták, azonban végül csak 8, kizárólag férfiakból származó adatot használtak. Mivel a mintákat véletlenszerűen választották, így nem lehet tudni, hogy milyen etnikai csoportokból kerültek ki a donorok. A Celera viszont mind a négy rasszból, s mindkét nemből legalább egy-egy donor mintáját felhasználta. A kezdeti, 21-es mintaszámot 5-re csökkentették: 2 férfi és 3 nő, 1 afrikai, 1 ázsiai, 1 latin-amerikai és 2 kaukázusi (fehér) ember genom-kombinációja vált ismertté a Celera által 2001-ben. Ez azonban csak a nyers változat volt. Az első teljes emberi genomot 2003. áprilisban hozta nyilvánosságra a HGP. A program hivatalosan 2006-ban zárult, amikor a génkönyvtárat kiegészítették, a legnagyobb emberi kromoszóma (DNS állományunk kb. 8%-a), az 1-es számú bázissorrendjével. 2007-ben tették közzé az első két diploid humán genom szekvenciáját: Craig Venterét és James Watsonét. Mivel mindketten az europid nagyrassz képviselői, ezért a humán genom könyvtár teljesebbé tételéhez szükség volt azt a többi nagyrasszokból származó géntérképekkel bővíteni. 2008- ban egy han nemzetiségű kínai és egy joruba-etnikumú, nigériai férfi teljes genetikai állományát határozták meg. 3 További genom projektek: (1) HapMap projekt: (2002): SNP-k feltérképezése; (2) 1000 genom projekt (2008): 1000 ember genetikai variabilitásának összehasonlítása; (3) Humán Variom projekt (2008): az új generációs (nagy-volumenű, large-scale, high-throughput) szekvenálási stratégiák: nagy teljesítmény, alacsony költségvetés. Ez a téma a gyakorlatokon lesz tárgyalva. 2013-ra a 100$/humán genom 15 perc alatt történő megvalósítása a cél. Genetikai markerek (1) STR (2) VNTR (3) SNP (4) RFLP STR és VNTR analízis: (1) STR (Short Tandem Repeat, rövid tandem ismétlődés) mikroszatellit DNS Ezek néhány bp-ból álló, ismétlődő sorozatok (a kutatók között nincs egységes álláspont, 2-5, 2-13, 2-20 bp ismétlődéseiről beszélünk). Egyesek megkülönböztetik a 2 nukleotidos egységek ismétlődést is, ezt VNDR-nek (Variable Number of Dinucleotide Repeats) nevezik. Az ismétlődések száma rendkívül változatos, egy diploid sejt adott kromoszómapárjain eltérő hosszúságú STR-ek is előfordulhatnak. A különböző hosszúságú ismétlődő szakaszok pedig különböző allélokat jelentenek. Az ismétlődések száma öröklődik. Az STR-ek rendszerint a génmentes DNS szakaszokon helyezkednek el. A STR-ek jól ismert helyeken fordulnak elő, az ismétlődések számát genetikai sajátságok határozzák meg. A mikroszatellitekkel szomszédos DNS régiók egy adott faj egyedein belül konzervatívak. Így az ide tervezett primerekkel kivitelezett PCR-rel a közbeeső szatellit DNS-t amplifikálni tudjuk az adott faj valamennyi genotípusában. Mivel az ismétlődések száma egyénenként változik, a PCR technika bevezetésével a leggyakrabban használt DNS ujjlenyomat markerré vált. (2) VNTR - Variable Number of Tandem Repeats (Változó számú tandem ismétlődés) - miniszatellit DNS. Az eukarióta genom nem kódoló régiójában, a heterokromatikus részekben előforduló DNS szatellitek is felhasználhatóak a PCR technológiák során DNS ujjlenyomat vizsgálatra. A genomban előforduló ismétlődő szatellit szekvenciák az ismétlődések számának különbözősége miatt, mint molekuláris markerek használhatók. A változó számú tandem ismétlődéseket vizsgáló eljárás az ismétlődések határszekvenciáira specifikus primereket alkalmazva PCR reakció során szaporítja fel a különböző fragmentumokat, melyek méretkülönbségei gélen történő elválasztással mutathatók ki. A PCR termék hossza függ a VNTR-ben ismétlődő egység hosszától és a kópiák számától. Az
egység DNS szakasz hosszának ismeretében és a PCR termék mérete alapján meghatározható a kópiák száma. Adott emberre jellemző mintázatot kapunk. Érzékeny technika: egyetlen hajhagyma vagy vércsepp DNS tartalmából elvégezhető a VNTR analízis. (3) SNP (Single Nucleotide Polymorphism, egy nukleotid polimorfizmus) Egyetlen nukleotid (A, T, G, vagy C) cseréje/változása a genomban. A humán genom polimorfizmusainak egyik leggyakoribb formája az SNP. Akkor nevezünk SNP-nek egy polimorfizmust, ha annak gyakorisága egy populáción belül legalább 1%. Az SNP-k 66,6%-ban C T cserét jelentenek. Bár a genom egy adott helyén a 4 nukleotid bázis bármelyike előfordulhatna, általában csak két változat fordul elő. Összességében, az emberiség SNP számát 10 millióra becsülik, vagyis átlagosan minden 300 bázispárra jut egy variáns hely. Az SNP-k nagy része nem okoz funkcionális változást, de közülük néhány befolyásolhatja a gén expresszióját vagy a fehérje működését, sok SNP pedig betegségekkel kapcsolatos. SNP klasszifikáció azok előfordulási helye szerint: nem-kódoló SNP-ről akkor beszélünk, ha az intronban, van, vagy az 5, 3 UTR (untranslated region, nem transzlálódó régió), vagy egyéb intergénikus területen. Az SNP-k azonosításának egyik módja az ASA (allél specifikus amplifikáció), melyhez allél-specifikus primereket alkalmazunk. Ezeket úgy tervezik, hogy 3 végük pontosan az SNP-re essen, s így a nem-egyezés miatt nem megy végbe a PCR. 4 RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism (restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus) Ugyanazon faj, különböző egyedeinek DNS-én a restrikciós hasító helyek számában fellépő különbség. Ha egy mutáció, báziscsere létrehoz vagy megszüntet egy restrikciós enzim felismerési helyet, akkor a hasítás mintázata megváltozik: a PCR során felsokszorozott DNS szakaszok emésztése során keletkező fragmentumok száma és mérete alapján a genotípus meghatározható. Tulajdonképpen a DNS RFLP polimorfizmusa valamely restrikciós hasító hely meglétét, vagy hiányát jelenti a DNS ugyanazon szakaszán. Vagyis adott faj, különböző egyedeiből származó homológ kromoszómák DNS-ének adott pontján valamely restrikciós hely jelen van, vagy sem. Mivel egy adott populációban, adott időben sok génnek sok allélja létezhet, azt állítható, hogy a populáció az adott tulajdonságo(ka)t tekintve polimorf. A különböző nagyságú fragmentek populáción belüli előfordulási aránya különböző. A restrikciós enzim egy adott szekvenciát ismer fel és vágja el a DNS-t, s így restrikciós fragmensek keletkeznek. E DNS szakaszok hossza megegyezik a restrikciós helyek egymástól mért fizikai távolságával. Elkülönítésük gélelektroforézissel történik. A rövidebb fragmentek hosszabb, hosszabbak pedig rövidebb utat tesznek meg a gélben, míg az azonos hosszúságúak egy közös sávot képeznek. A sávok helyzete fordítottan arányos a restrikciós fragmentek hosszának logaritmusával. Mivel minden ember genetikailag egyedi kombináció, egyedi RFLP-mintázat jellemző mindenkire, így személyazonosításra (DNS ujjlenyomat vizsgálat, apasági vizsgálatok) kiváló technika. Alkalmazható genetikai eredetű tulajdonságok (betegségek) vizsgálatára, prenatális diagnosztikára, stb. Funkcionális genomika Mikrochipek a genomikában - A chip technológia (microarray): A huszadik század végéig a gének funkcióját és szabályozását egyenként vizsgálták. Köszönhetően annak, hogy egyre több organizmus genomjának szekvenciája vált és válik ismertté, új technikák alakultak ki, melyekkel számos gén kifejeződésének egyidejű tanulmányozása vált lehetővé. A technikák közül az egyik automatizálható módszer a chip technológia, melynek bevezetése (1996) forradalmasította a molekuláris biológiát, a funkcionális genomikát és napjainkban a klinikai diagnosztikai módszereket is. A chipek két típusa, DNS-, ill. fehérje chipek közti alapvető különbség a vizsgálat tárgya: a DNS-chipek a (1) génexpresszió megváltozásának
vizsgálatát, (2) splice variánsok, valamint (3) szabályozó RNS-ek kimutatását teszik lehetővé (tehát a genom és transzkriptom), míg a fehérje chip a proteom (1) kifejeződését, (2) módosulásait, (3) kölcsönhatásait megcélzó vizsgálatok eszköze (Funkcionális genomika). A transzkriptom vizsgálata mellett a DNS-chipekkel lehetőségünk van (1) mutációk, (2) SNP-k, (3) deléciók, (4) inszerciók detektálására, (5) szekvencia megállapítására, (6) metilációs mintázat felderítésére (Strukturális genomika). A DNS-chip nagyszámú gén expressziós mintázatának egyidejű meghatározására szolgál. Egyetlen chip 6-10000 gén szimultán vizsgálatát teszi lehetővé. Működésük alapja a DNS-DNS vagy DNS-RNS hibridizáció. 5 Miből áll, hogyan készül a DNS-chip: egy kis lapocskára, szilárd hordozó felületre (lehet üveg, speciális műanyag) robot segítségével DNS-próbát visznek fel, akár 1 000 000 DNS-szálat. Ismert e DNS próbák szekvenciája (nukleotid sorrendje) és helyzete is. Ez úgy lehetséges, hogy a számítógép "megjegyzi", hogy a kétdimenziós rácson melyik pozícióban, milyen nukleotid szerkezet található. A DNS kovalensen köt a hordozóhoz. Ezt követően ehhez a chiphez adják hozzá a vizsgálandó személy (organizmus) sejtjeiből izolált DNS- (illetve RNS-) darabokat, melyet előzőleg fluoreszcens festékkel megjelöltek. Rövid inkubálás után kimossák a nem kapcsolódó nukleinsav darabokat. Könnyen belátható, hogy a megfelelő színes nukleinsav darabok csak oda kapcsolódnak, ahol az előbb említett nukleotid bázis komplementaritás teljesül. Más szóval, úgy történik meg az inkubálás és az azt követő mosás, hogy csak azok a szálak kössék meg a nekik megfelelő jelzett nukleinsav darabokat, ahol teljes a sorrend azonossága. Ezt követően egy leolvasó (scanning) rendszer leolvassa a színes és sötét pontokból álló mintázatot és már csak az eredmények értékelése van hátra. Ez megint csak a számítógép feladata, hiszen az "tudja", hogy mely pozícióban milyen génszakasz található. Ha például az egyik rácsponton a HIV jellegzetes génszakaszát helyezték el, és ott pozitív reakciót jelez a leolvasó, ez azt jelenti, hogy a beteg mintájában előfordult ez a vírus. A DNS chip-ek a próbák minősége alapján két csoportra különíthetők el: cdns chipek: mrns-ről reverz transzkripció segítségével, in vitro előállítva, illetve oligonukleotid chipek (20-25 bp). Több szín, fluoreszcens festék alkalmazása lehetővé teszi, hogy ugyanazon fajta chip-ből az egyiket egy kezelt pl. piros festékkel jelzett, a másikat pedig egy kezeletlen minta zöld festékkel jelölt DNS-mintájával inkubálják Ebben az esetben a két mintából származó RNS-t reverz transzkripcióval cdns-sé írunk át. A cdns-t felépítő nukleotidokat fluoreszcensen jelöljük: a két RNS populáció átírására szolgáló nukleotidok jelöléséhez tehát két, spektrális tulajdonságaiban egymástól különböző festéket használunk (a példában a kontroll mintából származó RNS-ek átírásához zöld festékkel jelölt nukleotidokat használunk, míg a kezelt esetben piros festéket) pirosan és zölden fluoreszkáló cdns-eket kapunk, amelyeket egy DNS-chipen hibridizálva, majd egy nagyfelbontású lézerszkenneres leolvasás után meghatározhatjuk az egyes gének relatív kifejeződése. A gén aktivitása az adott pontban detektálható fluoreszcens jel intenzitásával arányos. Ha egy adott pontban a kezeletlen mintából származó fluoreszcens jel erősebb, az azt jelenti, hogy a kezelés hatására az adott gén aktivitása lecsökkent. A rendkívül nagyszámú mintakapcsolás kiértékelése bonyolult programokkal és igen fejlett számítógépes technikával történik. A számítógép a leolvasás után egymásra képes vetíteni a leolvasott mintázatokat. Ott, ahol mindkét esetben (kezelt-kezeletlen, vagy beteg-egészséges, stb.) azonos a gén (illetve az ennek megfelelő DNS-darab) szerkezete, a zöld és a piros egymásra vetülve sárga színt ad. Ahol hiányzik a kezelt mintából a megfelelő DNS-szakasz, a zöld szín jelenik meg, ahol csak a kezeltben van valamely DNS-szerkezet, ott a piros szín dominál. Így, mintegy
kivonható egymásból a két eredmény és a különbségre génszinten derül fény. Az eljárással képet kaphatunk egyes gének túl-, illetve alul expresszálódásáról. Kromatin immunprecipitáció (ChIP): A ChIP módszer (nem keverendő a mikrochipekkel!) egy adott fehérje (transzkripciós faktor vagy hiszton) genomiális DNS-hez való kötődési mintázatának vizsgálatára alkalmas. Abban különbözik a gél retardációs és footprint analízis technikáktól, hogy nem kisebb DNS szakaszokat, hanem a teljes genomot vizsgáljuk; nem in vitro, hanem sejtekben végezzük a vizsgálatokat. A ChIP módszer azon alapul, hogy a DNS-kötő fehérjét keresztkötések kialakulását okozó szerekkel (pl. formaldehid) a DNS-hez rögzítjük, majd a DNS-t 200 1000 bázispárnyi darabokra törjük szonikációval (ultrahang alkalmazásával). Ezt követően a vizsgált fehérje elleni antitesteket adunk a rendszerhez, majd megtisztítjuk az antitest-fehérje-dns komplexet. Az antitestek alkalmazása biztosítja azt, hogy csak azokat a DNS szekvenciákat izoláljuk, amelyekhez az általunk vizsgált fehérje kötődik. A metodika következő lépéseként, hővel elválasztjuk a komponenseket egymástól, majd plazmid vektorba építjük a DNS fragmenseket, s végül megszekvenáljuk. Az utóbbi időben egyszerűbb és gyorsabb ChIP technikákat dolgoztak ki (DNS microarray, ChIP szekvenálás), elkerülvén az időigényes klónozásos lépéseket. A ChIP technikával kapcsolatos fogalom a cisztrom (ne keverjük a cisztronnal!), amely a genom azon cisz elemeinek (itt DNS kötőhely) az összessége, amelyhez egy adott transz elem (pl.transzkripciós faktor) kötődik. 6 Real-time PCR (= qpcr, kvantitatív, kinetikus PCR) & Real-time (RT2) RT-PCR: a Real-time PCR (valós idejű PCR) technika a PCR alapelvein nyugszik. Alapvető funkciója, hogy meghatározott DNS szakaszokat nagy hatékonysággal és nagyfokú specifitással amplifikáljon (szaporítson) fel. Működésének alapja: fluoreszcencia detektálása a PCR reakció mindenegyes ciklusában. A Real-time PCR reakciók során a PCR-nél megismert reakcióösszetevőkön túl szükség van fluoreszcens festék(ek)re, amelyek megfelelő fény hatására a ciklusok végén fényt emittálnak, s e fluoreszcencia intenzitása arányos az adott ciklus végére jelen lévő kópiák számával. A Real-time PCR reakciók végén nincs szükség gélen való kiértékelésre, az analízis szoftver alapú. A Real-Time PCR-rel lehetőségünk van a DNS olvadáspontjának (így specifikusságának) megállapítására (Melting point = olvadáspont analízis). Real-time vs. End-Point PCR: a hagyományos PCR-ek esetén csak a gélben való kiértékeléshez a beállított ciklusok lejárta után van lehetőség, tehát end-point (végpont) analízist végezhetünk csak. A Real-time PCR során azonban lehetőségünk van a kezdeti ciklusok során képződő termékek mennyiségéről információt szerezni, hiszen minden mintából származó fluoreszcens jelet numerikus értékké alakít át a reakció mindenegyes ciklusában. Fogalmak : (1) Real-Time PCR = qpcr (quantitative); (2) RT2-PCR = qrt-pcr; (3)RT-PCR = reverz transzkripciót követő PCR. Real-Time PCR a gyakorlatban: SNP detektálás és génexpresszió vizsgálat. DNS metiláció analízis A DNS metilációs mintázatának meghatározására számos módszer létezik, melyek alapja, hogy a DNS biszulfitos kezelésének hatására a citozin uracillá alakul, kivéve az 5-metilcitozint, mely változatlan marad. A biszulfitos kezelést követően többféle lehetőség van a további analízisre. I. Analízis szekvenálással (MethylC-seq): (1) genomi DNS feldarabolása; (2) 2. a DNS darabokhoz kizárólag metilált citozint tartalmazó adapter ligálása; (3) gélelektroforézis, mely alapján az adott szekvenálási technikának megfelelő méretű DNS darabok kiválogathatók; (4) biszulfitos kezelés (C->U; metc->metc); (5) PCR az adapterekre tervezett primerekkel; (6) Szekvenálás, mely alapján következtethetünk, hogy mely pozíciókban, milyen gyakorisággal fordul elő a metilált C)
II. Real-Time PCR: A genomiális DNS-en biszulfit konverziót követően real-time PCR amplifikációt végzünk, majd a keletkezett termék olvadáspontja alapján a DNS metilációs státusza meghatározható. Az A. ábra részen a metilálatlan templát látható, ebben az esetben az összes CpG citozinja timinné konvertálódik és a PCR termék olvadáspont (Tm) értéke alacsony lesz. A B. ábrarészen a teljesen metilált templát esete látható, az összes CpG citozinja citozin marad és a PCR termék Tm-je magas lesz. A C. ábrarészen egy monoallélos metiláció látható. A metilált allél esetén a citozinok nem konvertálódnak, míg a nem metilált allél esetén timinné konvertálódnak a citozinok. Ennek eredményeként egy alacsony olvadáspontú és egy magas olvadáspontú PCR termék keletkezik. A D. ábrarészen egy metilációs mozaikosság látható. Különböző számú metilált CpG citozinok metiláltak a felamplifikált régióban. A nem metilált citozinok timinre konvertálódnak, a metiláltak pedig citozinok maradnak. Ennek eredményeként köztes Tm értékő PCR termékek keletkeznek. A primerek olyan helyre lettek tervezve, amelyeket nem érint a metiláció, így a metilált illetve nem metilált allélokhoz egyaránt kötődik. A metilált illetve nem metilált allélok olvadáspontja (Tm) között több C különbség van (minden egyes CpG hely metiláltsága kb. 0.5 C-os emelkedést eredményez az olvadási hőmérsékletben). 7