AFP ELISA készlet Kód: EK-80 Az AFP ELISA készlet humán szérum alfa-fetoprotein (AFP) tartalmának direkt meghatározására szolgál. A készlet 96 meghatározásra elegendo reagenst tartalmaz, amellyel egyszeri standardizálás esetén két párhuzamossal mérve 42 minta AFP koncentrációja határozható meg, a 0 100 IU/ml mérési tartományban. Tartalom oldal Bevezetés 1 A mérés elve 1 A készlet tartalma 2 A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök 2 A mérendo minták gyujtése és tárolása 2 A reagensek elokészítése 3 A meghatározás menete 3 Az eredmények számítása 4 Minoségi jellemzok 4 Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások 5 Egyéb tudnivalók 6 Biztonsági óvórendszabályok 6 Bevezetés Az AFP (alfa-fetoprotein) egy kb. 65 kda molekulatömegu glikoprotein, amelyet a magzati máj sejtjei választanak ki. Az anyai szérum AFP szintje folyamatosan emelkedik a terhesség 30. hetéig, majd ezután hirtelen lecsökken. Nyitott gerincuség (spina bifida) és placentális rendellenességek esetén az anyai szérum AFP koncentrációja erosen megnövekszik, míg a magzat kromoszómális elváltozása (pl. Down-szindróma) csökkent AFP szinttel társul. Máj karcinóma, here és petefészek teratokarcinómák esetében nagyon gyakran megemelkedik a szérum AFP koncentrációja (>200 IU/ml), míg gyomor, tüdo, prosztata stb. tumoroknál ritkábban. A szérum AFP koncentráció növekedését eredményezhetik egyéb megbetegedések is (pl. hepatitisz stb.). A mérés elve A készlet muködése a szilárd fázisú immunometrikus assay elvén alapul. Ehhez két olyan monoklonális antitest szükséges, amelyek a molekula két különbözo epitopját ismerik fel. A két antitest egyike jelzett (jelzo antitest), a másik jelöletlen (ún. befogó, vagy "capture" antitest). Az immunokémiai folyamatban a standardokban, illetve a mintákban lévo hormon mindkét antitesttel reagálva immunkomplexet ("szendvics") képez, amely szilárd fázison kötodik, és mennyisége arányos a hormon koncentrációjával. Jelen készletben a szilárd fázis szerepét szabványos, 8x12-es mikrotiter plate látja el, amely 12 db. egysoros egységbol áll. Az immunreakció 37 o C-on 2 óra alatt játszódik le, és a jelzo funkciót torma-peroxidáz (HRPO) enzim látja el, amely peroxid és tetrametilbenzidin (TMB), szubsztrát kromogén, eleggyel reagálva 450 nmen detektálható jelet hoz létre. A szilárd fázison a jelet (optikai denzitást) szabványos ELISAfotométeren (ELISA-reader) mérjük, a mért jel intenzitása egye- IZOTÓP INTÉZET KFT, BUDAPEST
nesen arányos a rendszerben lévo hormon koncentrációjával. Az ismert koncentrációjú standardok kötési értékei alapján szerkesztett kalibrációs görbérol az ismeretlen minták koncentrációit kötési értékeik alapján visszaolvassuk. A készlet tartalma 1 üveg TRACER, felhasználásra kész. 12 ml pufferes oldat 0,01 % mertiolát és 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. 5 üveg STANDARD (0-4), felhasználásra kész. 5*1 ml szérum-oldat, 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval, koncentrációjuk O (S 0), 10 (S 1 ), 25 (S 2 ), 50 (S 3 ), 100 (S 4 ) IU/ml. Kalibrálva a 1 st IS 72/225 WHO preparátumra. 1 üveg ELLENORZO SZÉRUM, felhasználásra kész. 1 ml szérum 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. Várható értékét a mellékelt minoségi bizonylat tartalmazza. 1 db MIKROTITER PLATE, 12 stripet tartalmaz szabványos keretben. 1 üveg TMB SZUBSZTRÁT, 25 ml felhasználásra kész oldat, sötét muanyag flakonban. Fénytol védve tartandó. 1 üveg MOSÓPUFFER KONCENTRÁTUM 20 ml puffer, 0,01 % mertiolát tartósítóval. Rekonstituálandó 600 ml desztillált vízzel 1 üveg STOP REAGENS 6 ml 1 M kénsav 1 db Plate térkép Minoségellenorzési bizonylat Használati utasítás A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök muanyag kémcsövek és kémcsotartó adagoló pipetták, 100, 200 és 300 µl-es eldobható muanyag hegyekkel örvénykevero (vortex) desztillált víz ELISA reagens-tálkák ELISA - termosztát ELISA - fotométer (450 nm hullámhosszra) Ajánlott: 8-csatornás adagoló pipetta orbitális kevero ELISA mosó-automata A mérendo minták gyujtése és tárolása A vizsgálandó szérummintákat a más, ugyancsak szérumot igénylo laboratóriumi vizsgálatoknál követett módon készítjük el. Amennyiben az AFP-meghatározás a mintavételt követo 1-2 napon belül megtörténik, a mintákat +2 - +8 C-on, késobbi felhasználás esetén -18 C-on mélyhutve tartjuk. A fagyasztott mintákat hagyjuk felolvadni, és felhasználás elott alaposan homogenizáljuk. Kerüljük az ismételt visszafagyasztást. Lipémiás, hemolizált, vagy más szempontból rendellenes szérumot ne használjunk mérésre. A legmagasabb standard értéknél magasabb koncentrációjú mintákat hígítás után ismételten mérjük meg. Hígításhoz fiziológiás sóoldat használható fel. - 2 -
A reagensek elokészítése A mérés megkezdése elott engedjük szobahomérsékletre melegedni a reagens oldatokat, beleértve a mérendo mintákat is. A mosó puffer koncentrátumot öntsük hozzá 600 ml desztillált vízhez, így 620 ml hígított mosópuffert kapunk. A kihígított mosóoldatot késobbi felhasználásra +2 - +8 C-on tároljuk. A meghatározás menete (ld. folyamatábra, 1. táblázat) 1) Készítsük elo a mérendo mintákat, vegyük elo a készletbol a standardokat, az ellenorzo szérumot, a tracert, valamint az ELISA-platet, és hagyjunk mindent szobahomérsékletre melegedni. 2) Jelöljük meg külön plate térképen az alábbi minták pozícióját, 2-2 párhuzamosban: - standardok (S 0-4 )(S 0 =NSB) - ellenorzo szérum (C) - vizsgálandó minták (M x ) 3) Felhasználás elott a mintákat és az összes reagenst alaposan homogenizáljuk, de kerüljük el a habzást. Öntsük ki a tracert ELISA tálkába. 4) Mérjünk 100 µl Standardot (S 0-4 ), 100 µl Ellenorzo szérumot (C), és 100 µl szérummintát (Mx) a megfelelo wellekbe. Az adagolást egy-csatornás pipettával végezzük, és minden reagenshez új pipetta-hegyet használjunk. 5) Mérjünk minden wellbe 100 µl Tracer oldatot a 8-csatornás pipettával. Lásd még Megjegyzések 1. 6) Rögzítsük a zárófóliát, és helyezzük az ELISA-termosztátba. 7) Inkubáljuk a platet 2 órán keresztül 37 C homérsékleten. - 3-8) Vegyük ki a platet a termosztátból, vegyük le a zárófóliát, és öntsük ki a wellek tartalmát. 8-csatornás ismétlo pipettával adjunk mindegyik wellbe 300 µl mosópuffert, majd öntsük le a felülúszót. Lásd még Megjegyzések 2. 9) Ismételjük meg egymás után ötször a 8. lépést. Ha rendelkezésre áll ELISA mosó, a hatszori mosást azzal végezzük. 10) Öntsük ki az TMB-szubsztrátot a tálkájába, majd 8-csatornás pipettával adagoljunk minden wellhez 200 µl-t, és hagyjuk szobahomérsékleten, fénytol védve 30 percig. Lásd még Megjegyzések 3. 11) Adjunk mindegyik wellhez 50 µl stop reagenst, és hagyjuk 5 percig szobahomérsékleten állni. Lásd még Megjegyzések 3. 12) Tegyük a platet a fotométerbe, és végezzük el a mérést 450 nm hullámhosszon. 13) Számítsuk ki az eredményeket a következo fejezet szerint. Az eredmények számítása Kézi számítás A számítás menetét jellemzo mérési adatokkal szemléltetjük. A kapott számadatoknak, és a kalibrációs görbének hasonlítaniuk kell a 2. táblázathoz, illetve az 1. ábrához. Adatfeldolgozó program hiányában a kiértékelést manuálisan az alábbiak szerint végezzük el: 1) Számítsuk ki a párhuzamosok középértékét. 2) Vonjuk ki az NSB-t (azaz az So OD értékét) a standardok, illetve a minták átlagos OD értékeibol (NSB korrekció). 3) Lin-lin papíron ábrázoljuk a standard koncentrációkhoz tartozó NSB-vel korrigált OD értékeket. 4) Olvassuk le a mérendo minták koncentrációit a standard görbérol az NSB-vel korrigált OD értékek alapján.
1. Táblázat Folyamatábra, Pipettázási kalauz (térfogatok mikroliterben) Well Standard Minta Ellenorzo Reagensek szérum Standard 100 Minta 100 Ellenorzo szérum 100 Tracer 100 100 100 Inkubálás 37 o C-on 2 órán át. Mosópuffer 300 300 300 Felülúszó leöntése Mosás-leöntés ismétlése 5 további ciklusban TMB szubsztrát 200 200 200 Inkubálás szobahomérsékleten 30 percig, fénytol védve. Stop reagens 50 50 50 Inkubálás szobahomérsékleten 5 percig. Fotometriás mérés, kiértékelés Egyes adat-kiértékelésekhez, rendszerint minoségellenorzési célból, szükség lehet a specifikus kötési értékekre. Erre a B/Bmax értékek használhatók, amelyek számításához szintén a standardok, illetve minták NSB-vel korrigált értékeit osztjuk a maximális standard OD értékével az alábbi egyenlet szerint: S1-4/Mx (AU) -S 0 (AU) B/Bmax (%) = x 100 S4 (AU) - S 0 (AU) Számítógépes adatkiértékelés A korszeru mérokészülékek lehetové teszik a fotometriás mérést követo azonnali ("on-line") számítógépes adatfeldolgozást is. A sokféle feldolgozó program közül jelen készítményhez speciálisan immunometrikus assayre kifejlesztett illeszto programok (spline vagy simított négyzetes spline) használatát javasoljuk. Ügyeljünk arra, hogy vannak olyan kiértékelo programok, amelyek a O- - 4 - standard és az elso standard között is interpolálnak, de a számított koncentrációk közül csak azok tekinthetok valósnak, amelyek értéke magasabb, mint a mérés statisztikailag meghatározott kimutatási határa (ld. ÉRZÉKENYSÉG). 2. táblázat Jellemzo mérési eredmények AFP IU/ml O.D. O.D. O.D. átlag B/Bmax % AFP IU/ml S 0 0 0,057 0,048 0,053 2,50 - S 1 10 0,214 0,231 0,223 8,212 - S 2 25 0,574 0,628 0,601 26,471 - S 3 50 1,091 1,133 1,112 51,155 - S 4 100 2,159 2,088 2,124 100 - C - 1,089 1,000 1,045 30,88 46,367 Minoségi jellemzok Az assay jellemzo paraméterei Bo/Bmax < 5 % Érzékenység Jelen készlettel az analitikai érzékenység a 0-standarddal 15 párhuzamos mérésbol meghatározva 0,8 IU/ml. Értéke egyenlo a Bo+2*SD kötési értékhez tartozó koncentrációval. Specificitás Az assay-ben felhasznált antitestek human szérum albuminnal nem keresztreagálnak.
AU, O.D. (NSB korr.) 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Koncentráció, IU/ml 1. ábra Tipikus standard görbe (Mintameghatározásra nem használható!) Nagy-dózisú Hook effektus Az effektus 5000 IU/ml alatti koncentrációban nem jelentkezik. Ismert mennyiség visszanyerése ( "recovery") Egyéni szérummintákhoz ismert mennyiségu AFP-t adva, a visszanyerés (recovery) 86 ± 7,62 % (középérték ± SD, n= 12). Hígítási teszt ( linearity ) Egyéni szérumminták nulla standarddal végzett sorozat-hígításakor a várt (x) és a mért (y) koncentráció érték között az alábbi lineáris összefüggés adódott: y=0,9737 x 0,2657, R = 0.9538, n= 12 Pontosság és reprodukálhatóság Az intra-assay pontosságot 15 párhuzamossal egy sorozaton belül, az inter-assay pontosságot 2 párhuzamossal, 15 független mérésben értékelve, 6 mintára az alábbi adatokat kaptuk. Intra-assay Inter-assay átlag (IU/ml) CV % átlag (IU/ml) CV % 7,25 7,78 6,72 11,53 15,69 4,83 16,00 5,90 23,65 7,68 23,55 4,88 28,06 7,11 28,74 3,83 43,13 9,83 46,56 4,53 66,25 7,52 67,77 4,89 Várható referens tartomány: Férfiak: 0,47 5,39 IU/ml Nok: 0,37 4,41 IU/ml 16. hetes terhes szérum: 25 IU/ml (1 MoM) Kóros értékek: hepatocarcinoma: 100 IU/ml hepatitis: 100 IU/ml Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások 1) A standardok, ellenorzo minta, szérum minták, valamint a tracer bemérése után a reakcióelegy homogenizálása céljából a plate-t a termosztát keverteto programjával, vagy - ha ez nem áll rendelkezésre - akkor egy keverogép alacsony fordulatszámú használatával kb. 5 másodpercig kevertessük. A kevertetésnél ügyeljünk arra, hogy a wellek tartalma ne fröccsenjen ki. - 5 -
2) Ha nem áll rendelkezésünkre ELISA mosó akkor kézi mosást kell végrehajtanunk, ami a reakcióelegy leöntésébol és 6 db. mosópuffer adagolás - leöntés ciklusból áll. A leöntéseket mindig a plate hirtelen lefordításával végezzük, majd csapkodjuk ki a wellek-ben maradt cseppeket egy nedvszívó papírra. A gyors kiöntésnek elsosorban a reakcióelegy eltávolítása esetén van nagy jelentosége, hiszen ellenkezo esetben a wellek tartalma elszennyezheti egymást, ami meghamisítja a mérést. 3) Ha rendelkezésünkre áll olyan ELISA inkubátor, vagy rázógép, amellyel a plate - a reagensek kifröccsenésének veszélye nélkül - rázatható, akkor a szubsztrát reakciók (pnpp, TMB) elején, valamint a stop reagens adagolása után ajánlott egy kb. 10 másodperces óvatos rázatás. Biztonsági óvórendszabályok Fertozésveszély A kitben lévo humán szérumot tartalmazó komponensek eloállításához felhasznált szérum HIV-Ab és HBsAg vizsgálatra negatív eredményt adott. Ennek ellenére a humán szérumot tartalmazó komponenseket potenciálisan fertozoként kell kezelni, és az erre vonatkozó általános laboratóriumi higiénés szabályokat be kell tartani. Egyéb tudnivalók Tárolás A készlet komponensei -felbontott reagensek is- 2-8 C között tárolhatók a lejárati idon belül. A készlet lejárati ideje A készlet a gyártástól számítva általában legalább 16 hétig használható. A pontos lejárati ido a kíséro bizonylaton és a dobozcímkén van feltüntetve. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a különbözo gyártási számú készletek egyes komponensei nem helyettesíthetok sem egymással, sem más gyártó AFP készletének komponenseivel. - 6 -
IZOTÓP INTÉZET Kft. 1535 Budapest, Pf.: 851. Tel.: 395-2577 Fax: 395-9247 HONLAP: Technikai e-mail: Kereskedelmi e-mail: http://www.izotop.hu immuno@izotop.hu commerce@izotop.hu EK80m/2. verzió/2001.04.12. - 7 -