PSA ELISA készlet. Bevezetés. Kód: EK-81

Átírás

1 PSA ELISA készlet Kód: EK-81 Az PSA ELISA készlet humán szérum Prosztata Specifikus Antigén (PSA) tartalmának direkt meghatározására szolgál. A készlet 96 meghatározásra elegendo reagenst tartalmaz, amellyel egyszeri standardizálás esetén két párhuzamossal mérve 42 minta PSA koncentrációja határozható meg, a 0 50 ng/ml mérési tartományban. Tartalom oldal Bevezetés 1 A mérés elve 2 A készlet tartalma 2 A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök 2 A mérendo minták gyujtése és tárolása 3 A reagensek elokészítése 3 A meghatározás menete 3 Az eredmények számítása 4 Minoségi jellemzok 5 Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások 6 Egyéb tudnivalók 6 Biztonsági óvórendszabályok 6 Bevezetés A PSA (Prostate Specific Antigen) körülbelül 30 kda molekulatömegu, 237 aminosavból álló egyláncú glikoprotein. Szerkezete hasonló a tripszinszeru kallikreinekhez, enzimaktivitását tekintve a kimotripszinnel analóg szerin-proteáz. Keletkezése szövet-specifikus, a prosztata termeli, az ondó nagy koncentrációban tartalmazza. Proteáz-aktivitásának az ondó elfolyósításában funkcionális szerepet tulajdonítanak. A vérben lévo PSA %-a α 1 -antikimotripszinhez kötött formában van jelen. Mind malignus prosztata karcinóma, mind benignus prosztata hiperplazia esetében a vér PSA szintje megno, de malignus prosztata karcinóma esetében a komplex, míg benignus prosztata hiperplazia esetében a szabad PSA szint emelkedése figyelheto meg a vérben. A PSA meghatározás egységes módszertanának kialakulását, elfogadását mindmáig megnehezítik a kétféle molekuláris formából következo mérési, standardizálási nehézségek. A PSA szabad/komplex formáinak aránya egyedrol egyedre változik, így a mért látszólagos total PSA tartalom jelentosen eltérhet attól függoen, hogy az adott immunoassay rendszer milyen immunreaktivitást mutat a kétféle molekuláris formára. Ideális esetnek tekintheto, ha a mérorendszer nem tesz különbséget a szabad és a komplex forma között (ekvimoláris PSA assay), az ettol való eltérés pedig annak mértékétol függoen torzíthatja a látszólagos total PSA tartalmat. Analitikai szempontból további korlát a nemzetközi referencia-anyag hiánya, amely miatt a különbözo készítményekkel mért PSA koncentrációk igen tág határok között változnak. A total PSA koncentrációjának meghatározása nélkülözhetetlen módszer a prosztata karcinóma diagnosztikájában, a stádium meghatározásában és a terápia-követésben. IZOTÓP INTÉZET KFT, BUDAPEST

2 Jelen ELISA-készlet kiemelkedo tulajdonsága, hogy a szabad PSA PSA-ACT molekuláris formákat ekvimolárisan méri. A mérés elve A készlet muködése a szilárd fázisú immunometrikus assay elvén alapul. Ehhez két olyan monoklonális antitest szükséges, amelyek a molekula két különbözo epitopját ismerik fel. A két antitest egyike jelzett (jelzo antitest), a másik jelöletlen (ún. befogó, vagy "capture" antitest). Az immunokémiai folyamatban a standardokban, illetve a mintákban lévo hormon mindkét antitesttel reagálva immunkomplexet ("szendvics") képez, amely szilárd fázison kötodik, és mennyisége arányos a hormon koncentrációjával. Jelen készletben a szilárd fázis szerepét szabványos, 8x12-es mikrotiter plate látja el, amely 12 db. egysoros egységbol áll. Az immunreakció 37 o C-on 2 óra alatt játszódik le, és a jelzo funkciót torma-peroxidáz (HRPO) enzim látja el, amely peroxid és tetrametilbenzidin (TMB), szubsztrát kromogén, eleggyel reagálva 450 nmen detektálható jelet hoz létre. A szilárd fázison a jelet (optikai denzitást) szabványos ELISAfotométeren (ELISA-reader) mérjük, a mért jel intenzitása egyenesen arányos a rendszerben lévo hormon koncentrációjával. Az ismert koncentrációjú standardok kötési értékei alapján szerkesztett kalibrációs görbérol az ismeretlen minták koncentrációit kötési értékeik alapján visszaolvassuk. A készlet tartalma 1 üveg TRACER, felhasználásra kész. 12 ml pufferes oldat 0,01 % mertiolát és 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. 5 üveg STANDARD (0-4), felhasználásra kész. 5*1 ml szérum-oldat, 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval, koncentrációjuk O (S 0), 4 (S 1 ), 10 (S 2 ), 25 (S 3 ), 50 (S 4 ) ng/ml. 1 üveg ELLENORZO SZÉRUM, felhasználásra kész. 1 ml szérum 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. Várható értékét a mellékelt minoségi bizonylat tartalmazza. 1 db MIKROTITER PLATE, 12 db. stripet tartalmaz szabványos keretben, záró-fóliával. 1 üveg TMB SZUBSZTRÁT, 25 ml felhasználásra kész oldat, sötét muanyag flakonban. Fénytol védve tartandó. 1 üveg MOSÓPUFFER KONCENTRÁTUM 20 ml puffer, 0,01 % mertiolát tartósítóval. Rekonstituálandó 600 ml desztillált vízzel 1 üveg STOP REAGENS 6 ml 1 M kénsav 1 db Plate térkép Minoségellenorzési bizonylat Használati utasítás A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök muanyag kémcsövek és kémcsotartó adagoló pipetták, 100, 200 és 300 µl-es eldobható muanyag hegyekkel örvénykevero (vortex) - 2 -

3 desztillált víz ELISA reagens-tálkák ELISA - termosztát ELISA - fotométer (450 nm hullámhosszra) Ajánlott: 8-csatornás adagoló pipetta orbitális kevero ELISA mosó-automata A mérendo minták gyujtése és tárolása A vizsgálandó szérummintákat a más, ugyancsak szérumot igénylo laboratóriumi vizsgálatoknál követett módon készítjük el. Amennyiben az PSA-meghatározás a mintavételt követo 1-2 napon belül megtörténik, a mintákat C-on, késobbi felhasználás esetén -18 C-on mélyhutve tartjuk. A fagyasztott mintákat hagyjuk felolvadni, és felhasználás elott alaposan homogenizáljuk. Kerüljük az ismételt visszafagyasztást. Lipémiás, hemolizált, vagy más szempontból rendellenes szérumot ne használjunk mérésre. A legmagasabb standard értéknél magasabb koncentrációjú mintákat hígítás után ismételten mérjük meg. Hígításhoz fiziológiás sóoldat használható fel. A reagensek elokészítése A mérés megkezdése elott engedjük szobahomérsékletre melegedni a reagens oldatokat, beleértve a mérendo mintákat is. A mosó puffer koncentrátumot öntsük hozzá 600 ml desztillált vízhez, így 620 ml hígított mosópuffert kapunk. A kihígított mosóoldatot késobbi felhasználásra C-on tároljuk. A meghatározás menete (ld. folyamatábra, 1. táblázat) 1) Készítsük elo a mérendo mintákat, vegyük elo a készletbol a standardokat, az ellenorzo szérumot, a tracert, valamint az ELISA-platet, és hagyjunk mindent szobahomérsékletre melegedni. 2) Jelöljük meg külön plate térképen az alábbi minták pozícióját, 2-2 párhuzamosban: - standardok (S 0-4 )(S 0 =NSB) - ellenorzo szérum (C) - vizsgálandó minták (M x ) 3) Felhasználás elott a mintákat és az összes reagenst alaposan homogenizáljuk, de kerüljük el a habzást. Öntsük ki a tracert ELISA tálkába. 4) Mérjünk 100 µl Standardot (S 0-4 ), 100 µl Ellenorzo szérumot (C), és 100 µl szérummintát (Mx) a megfelelo wellekbe. Az adagolást egy-csatornás pipettával végezzük, és minden reagenshez új pipetta-hegyet használjunk. 5) Mérjünk minden wellbe 100 µl Tracer oldatot a 8-csatornás pipettával. Lásd még Megjegyzések 1. 6) Rögzítsük a zárófóliát, és helyezzük az ELISA-termosztátba. 7) Inkubáljuk a platet 2 órán keresztül 37 C homérsékleten. 8) Vegyük ki a platet a termosztátból, vegyük le a zárófóliát, és öntsük ki a wellek tartalmát. 8-csatornás ismétlo pipettával - 3 -

4 adjunk mindegyik wellbe 300 µl mosópuffert, majd öntsük le a felülúszót. Lásd még Megjegyzések 2. 9) Ismételjük meg egymás után ötször a 8. lépést. Ha rendelkezésre áll ELISA mosó, a hatszori mosást azzal végezzük. 10) Öntsük ki az TMB-szubsztrátot a tálkájába, majd 8-csatornás pipettával adagoljunk minden wellhez 200 µl-t, és hagyjuk szobahomérsékleten, fénytol védve 30 percig. Lásd még Megjegyzések 3. 11) Adjunk mindegyik wellhez 50 µl stop reagenst, és hagyjuk 5 percig szobahomérsékleten állni. Lásd még Megjegyzések 3. 12) Tegyük a platet a fotométerbe, és végezzük el a mérést 450 nm hullámhosszon. 13) Számítsuk ki az eredményeket a következo fejezet szerint. 1. Táblázat Folyamatábra, Pipettázási kalauz (térfogatok mikroliterben) Well Standard Minta Ellenorzo Reagensek szérum Standard 100 Minta 100 Ellenorzo szérum 100 Tracer Inkubálás 37 o C-on 2 órán át. Mosópuffer Felülúszó leöntése Mosás-leöntés ismétlése 5 további ciklusban TMB szubsztrát Inkubálás szobahomérsékleten 30 percig, fénytol védve. Stop reagens Inkubálás szobahomérsékleten 5 percig. Fotometriás mérés, kiértékelés Az eredmények számítása Kézi számítás A számítás menetét jellemzo mérési adatokkal szemléltetjük. A kapott számadatoknak, és a kalibrációs görbének hasonlítaniuk kell a 2. táblázathoz, illetve az 1. ábrához. Adatfeldolgozó program hiányában a kiértékelést manuálisan az alábbiak szerint végezzük el: 1) Számítsuk ki a párhuzamosok középértékét. 2) Vonjuk ki az NSB-t (azaz az So OD értékét) a standardok, illetve a minták átlagos OD értékeibol (NSB korrekció). 3) Lin-lin papíron ábrázoljuk a standard koncentrációkhoz tartozó NSB-vel korrigált OD értékeket. 4) Olvassuk le a mérendo minták koncentrációit a standard görbérol az NSB-vel korrigált OD értékek alapján. Egyes adat-kiértékelésekhez, rendszerint minoségellenorzési célból, szükség lehet a specifikus kötési értékekre. Erre a B/Bmax értékek használhatók, amelyek számításához szintén a standardok, illetve minták NSB-vel korrigált értékeit osztjuk a maximális standard OD értékével az alábbi egyenlet szerint: S1-4/Mx (AU) -S 0 (AU) B/Bmax (%) = x 100 S4 (AU) - S 0 (AU) Számítógépes adatkiértékelés A korszeru mérokészülékek lehetové teszik a fotometriás mérést követo azonnali ("on-line") számítógépes adatfeldolgozást is. A sokféle feldolgozó program közül jelen készítményhez speciálisan - 4 -

5 immunometrikus assayre kifejlesztett illeszto programok (spline vagy simított négyzetes spline) használatát javasoljuk. Ügyeljünk arra, hogy vannak olyan kiértékelo programok, amelyek a O- standard és az elso standard között is interpolálnak, de a számított koncentrációk közül csak azok tekinthetok valósnak, amelyek értéke magasabb, mint a mérés statisztikailag meghatározott kimutatási határa (ld. ÉRZÉKENYSÉG). 2. táblázat Jellemzo mérési eredmények PSA ng/ml O.D. O.D. O.D. átlag B/Bmax % PSA ng/ml S 0 0 0,054 0,052 0,053 1,888 - S 1 4 0,489 0,503 0,496 16,086 - S ,230 1,014 1,122 38,816 - S ,964 2,004 1,984 70,116 - S ,820 2,794 2, C - 0,529 0,509 0,519 16,921 4,9211 AU, O.D. (NSB korr.) 3 2,8 2,6 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Koncentráció, IU/ml 1. ábra Tipikus standard görbe (Mintameghatározásra nem használható!) Minoségi jellemzok Az assay jellemzo paraméterei Bo/Bmax < 5 % Érzékenység Jelen készlettel az analitikai érzékenység a 0-standarddal 15 párhuzamos mérésbol meghatározva 0,5 ng/ml. Értéke egyenlo a Bo+2*SD kötési értékhez tartozó koncentrációval

6 Funkcionális érzékenység A készlet funkcionális érzékenysége 1 ng/ml. Meghatározása alacsony PSA tartalmú minták 15 független méréssorozatban kapott inter-assay imprecíziós profiljából történt, értéke egyenlo egyenlo az imprecíziós görbe 22 %-os metszéspontjához tartozó PSA koncentrációval. Specificitás Az assay-ben felhasznált antitestek keresztreakciója human PAP-re (prosztata specifikus savas foszfatáz), illetve human kallikreinre vizsgálva kisebb, mint 0,04%. Nagy-dózisú Hook effektus Az effektus 2000 ng/ml alatti koncentrációban nem jelentkezik. Pontosság és reprodukálhatóság Az intra-assay pontosságot 15 párhuzamossal egy sorozaton belül, az inter-assay pontosságot 2 párhuzamossal, 15 független mérésben értékelve, 6 mintára az alábbi adatokat kaptuk. Várható referens tartomány: Egészséges felnottekben a refrens tartomány: 4 ng/ml. Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások 1) A standardok, ellenorzo minta, szérum minták, valamint a tracer bemérése után a reakcióelegy homogenizálása céljából a plate-t a termosztát keverteto programjával, vagy - ha ez nem áll rendelkezésre - akkor egy keverogép alacsony fordulatszámú használatával kb. 5 másodpercig kevertessük. A kevertetésnél ügyeljünk arra, hogy a wellek tartalma ne fröccsenjen ki. 2) Ha nem áll rendelkezésünkre ELISA mosó akkor kézi mosást kell végrehajtanunk, ami a reakcióelegy leöntésébol és 6 db. mosópuffer adagolás - leöntés ciklusból áll. A leöntéseket mindig a plate hirtelen lefordításával végezzük, majd csapkodjuk ki a wellek-ben maradt cseppeket egy nedvszívó papírra. A gyors kiöntésnek elsosorban a reakcióelegy eltávolítása esetén van nagy jelentosége, hiszen ellenkezo esetben a wellek tartalma elszennyezheti egymást, ami meghamisítja a mérést. Intra-assay Inter-assay átlag (ng/ml) CV % átlag (ng/ml) CV % 1,03 8,91 1,17 19,71 3,81 6,83 4,67 14,27 9,66 7,75 12,11 10,04 23,16 11,81 23,83 10,36 31,66 7,53 26,48 11,65 44,19 6,57 42,61 9,87 3) Ha rendelkezésünkre áll olyan ELISA inkubátor, vagy rázógép, amellyel a plate - a reagensek kifröccsenésének veszélye nélkül - rázatható, akkor a szubsztrát reakciók (pnpp, TMB) elején, valamint a stop reagens adagolása után ajánlott egy kb. 10 másodperces óvatos rázatás. Egyéb tudnivalók - 6 -

7 Tárolás A készlet komponensei -felbontott reagensek is- 2-8 C között tárolhatók a lejárati idon belül. A készlet lejárati ideje A készlet a gyártástól számítva általában legalább 16 hétig használható. A pontos lejárati ido a kíséro bizonylaton és a dobozcímkén van feltüntetve. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a különbözo gyártási számú készletek egyes komponensei nem helyettesíthetok sem egymással, sem más gyártó PSA készletének komponenseivel. Biztonsági óvórendszabályok Fertozésveszély A kitben lévo humán szérumot tartalmazó komponensek eloállításához felhasznált szérum HIV-Ab és HBsAg vizsgálatra negatív eredményt adott. Ennek ellenére a humán szérumot tartalmazó komponenseket potenciálisan fertozoként kell kezelni, és az erre vonatkozó általános laboratóriumi higiénés szabályokat be kell tartani

8 IZOTÓP INTÉZET Kft Budapest, Pf.: 851. Tel.: Fax: HONLAP: Technikai Kereskedelmi EK81m/2. verzió/