AFP ELISA készlet. Bevezetés. A mérés elve. Kód: EK-80

Átírás

1 AFP ELISA készlet Kód: EK-80 Az AFP ELISA készlet humán szérum alfa-fetoprotein (AFP) tartalmának direkt meghatározására szolgál. A készlet 96 meghatározásra elegendo reagenst tartalmaz, amellyel egyszeri standardizálás esetén két párhuzamossal mérve 42 minta AFP koncentrációja határozható meg, a IU/ml mérési tartományban. Tartalom oldal Bevezetés 1 A mérés elve 1 A készlet tartalma 2 A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök 2 A mérendo minták gyujtése és tárolása 2 A reagensek elokészítése 3 A meghatározás menete 3 Az eredmények számítása 4 Minoségi jellemzok 4 Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások 5 Egyéb tudnivalók 6 Biztonsági óvórendszabályok 6 Bevezetés Az AFP (alfa-fetoprotein) egy kb. 65 kda molekulatömegu glikoprotein, amelyet a magzati máj sejtjei választanak ki. Az anyai szérum AFP szintje folyamatosan emelkedik a terhesség 30. hetéig, majd ezután hirtelen lecsökken. Nyitott gerincuség (spina bifida) és placentális rendellenességek esetén az anyai szérum AFP koncentrációja erosen megnövekszik, míg a magzat kromoszómális elváltozása (pl. Down-szindróma) csökkent AFP szinttel társul. Máj karcinóma, here és petefészek teratokarcinómák esetében nagyon gyakran megemelkedik a szérum AFP koncentrációja (>200 IU/ml), míg gyomor, tüdo, prosztata stb. tumoroknál ritkábban. A szérum AFP koncentráció növekedését eredményezhetik egyéb megbetegedések is (pl. hepatitisz stb.). A mérés elve A készlet muködése a szilárd fázisú immunometrikus assay elvén alapul. Ehhez két olyan monoklonális antitest szükséges, amelyek a molekula két különbözo epitopját ismerik fel. A két antitest egyike jelzett (jelzo antitest), a másik jelöletlen (ún. befogó, vagy "capture" antitest). Az immunokémiai folyamatban a standardokban, illetve a mintákban lévo hormon mindkét antitesttel reagálva immunkomplexet ("szendvics") képez, amely szilárd fázison kötodik, és mennyisége arányos a hormon koncentrációjával. Jelen készletben a szilárd fázis szerepét szabványos, 8x12-es mikrotiter plate látja el, amely 12 db. egysoros egységbol áll. Az immunreakció 37 o C-on 2 óra alatt játszódik le, és a jelzo funkciót torma-peroxidáz (HRPO) enzim látja el, amely peroxid és tetrametilbenzidin (TMB), szubsztrát kromogén, eleggyel reagálva 450 nmen detektálható jelet hoz létre. A szilárd fázison a jelet (optikai denzitást) szabványos ELISAfotométeren (ELISA-reader) mérjük, a mért jel intenzitása egye- IZOTÓP INTÉZET KFT, BUDAPEST

2 nesen arányos a rendszerben lévo hormon koncentrációjával. Az ismert koncentrációjú standardok kötési értékei alapján szerkesztett kalibrációs görbérol az ismeretlen minták koncentrációit kötési értékeik alapján visszaolvassuk. A készlet tartalma 1 üveg TRACER, felhasználásra kész. 12 ml pufferes oldat 0,01 % mertiolát és 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. 5 üveg STANDARD (0-4), felhasználásra kész. 5*1 ml szérum-oldat, 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval, koncentrációjuk O (S 0), 10 (S 1 ), 25 (S 2 ), 50 (S 3 ), 100 (S 4 ) IU/ml. Kalibrálva a 1 st IS 72/225 WHO preparátumra. 1 üveg ELLENORZO SZÉRUM, felhasználásra kész. 1 ml szérum 2 mg/ml klóracetamid (CAA) tartósítóval. Várható értékét a mellékelt minoségi bizonylat tartalmazza. 1 db MIKROTITER PLATE, 12 stripet tartalmaz szabványos keretben. 1 üveg TMB SZUBSZTRÁT, 25 ml felhasználásra kész oldat, sötét muanyag flakonban. Fénytol védve tartandó. 1 üveg MOSÓPUFFER KONCENTRÁTUM 20 ml puffer, 0,01 % mertiolát tartósítóval. Rekonstituálandó 600 ml desztillált vízzel 1 üveg STOP REAGENS 6 ml 1 M kénsav 1 db Plate térkép Minoségellenorzési bizonylat Használati utasítás A készlet felhasználásához szükséges anyagok és eszközök muanyag kémcsövek és kémcsotartó adagoló pipetták, 100, 200 és 300 µl-es eldobható muanyag hegyekkel örvénykevero (vortex) desztillált víz ELISA reagens-tálkák ELISA - termosztát ELISA - fotométer (450 nm hullámhosszra) Ajánlott: 8-csatornás adagoló pipetta orbitális kevero ELISA mosó-automata A mérendo minták gyujtése és tárolása A vizsgálandó szérummintákat a más, ugyancsak szérumot igénylo laboratóriumi vizsgálatoknál követett módon készítjük el. Amennyiben az AFP-meghatározás a mintavételt követo 1-2 napon belül megtörténik, a mintákat C-on, késobbi felhasználás esetén -18 C-on mélyhutve tartjuk. A fagyasztott mintákat hagyjuk felolvadni, és felhasználás elott alaposan homogenizáljuk. Kerüljük az ismételt visszafagyasztást. Lipémiás, hemolizált, vagy más szempontból rendellenes szérumot ne használjunk mérésre. A legmagasabb standard értéknél magasabb koncentrációjú mintákat hígítás után ismételten mérjük meg. Hígításhoz fiziológiás sóoldat használható fel

3 A reagensek elokészítése A mérés megkezdése elott engedjük szobahomérsékletre melegedni a reagens oldatokat, beleértve a mérendo mintákat is. A mosó puffer koncentrátumot öntsük hozzá 600 ml desztillált vízhez, így 620 ml hígított mosópuffert kapunk. A kihígított mosóoldatot késobbi felhasználásra C-on tároljuk. A meghatározás menete (ld. folyamatábra, 1. táblázat) 1) Készítsük elo a mérendo mintákat, vegyük elo a készletbol a standardokat, az ellenorzo szérumot, a tracert, valamint az ELISA-platet, és hagyjunk mindent szobahomérsékletre melegedni. 2) Jelöljük meg külön plate térképen az alábbi minták pozícióját, 2-2 párhuzamosban: - standardok (S 0-4 )(S 0 =NSB) - ellenorzo szérum (C) - vizsgálandó minták (M x ) 3) Felhasználás elott a mintákat és az összes reagenst alaposan homogenizáljuk, de kerüljük el a habzást. Öntsük ki a tracert ELISA tálkába. 4) Mérjünk 100 µl Standardot (S 0-4 ), 100 µl Ellenorzo szérumot (C), és 100 µl szérummintát (Mx) a megfelelo wellekbe. Az adagolást egy-csatornás pipettával végezzük, és minden reagenshez új pipetta-hegyet használjunk. 5) Mérjünk minden wellbe 100 µl Tracer oldatot a 8-csatornás pipettával. Lásd még Megjegyzések 1. 6) Rögzítsük a zárófóliát, és helyezzük az ELISA-termosztátba. 7) Inkubáljuk a platet 2 órán keresztül 37 C homérsékleten ) Vegyük ki a platet a termosztátból, vegyük le a zárófóliát, és öntsük ki a wellek tartalmát. 8-csatornás ismétlo pipettával adjunk mindegyik wellbe 300 µl mosópuffert, majd öntsük le a felülúszót. Lásd még Megjegyzések 2. 9) Ismételjük meg egymás után ötször a 8. lépést. Ha rendelkezésre áll ELISA mosó, a hatszori mosást azzal végezzük. 10) Öntsük ki az TMB-szubsztrátot a tálkájába, majd 8-csatornás pipettával adagoljunk minden wellhez 200 µl-t, és hagyjuk szobahomérsékleten, fénytol védve 30 percig. Lásd még Megjegyzések 3. 11) Adjunk mindegyik wellhez 50 µl stop reagenst, és hagyjuk 5 percig szobahomérsékleten állni. Lásd még Megjegyzések 3. 12) Tegyük a platet a fotométerbe, és végezzük el a mérést 450 nm hullámhosszon. 13) Számítsuk ki az eredményeket a következo fejezet szerint. Az eredmények számítása Kézi számítás A számítás menetét jellemzo mérési adatokkal szemléltetjük. A kapott számadatoknak, és a kalibrációs görbének hasonlítaniuk kell a 2. táblázathoz, illetve az 1. ábrához. Adatfeldolgozó program hiányában a kiértékelést manuálisan az alábbiak szerint végezzük el: 1) Számítsuk ki a párhuzamosok középértékét. 2) Vonjuk ki az NSB-t (azaz az So OD értékét) a standardok, illetve a minták átlagos OD értékeibol (NSB korrekció). 3) Lin-lin papíron ábrázoljuk a standard koncentrációkhoz tartozó NSB-vel korrigált OD értékeket. 4) Olvassuk le a mérendo minták koncentrációit a standard görbérol az NSB-vel korrigált OD értékek alapján.

4 1. Táblázat Folyamatábra, Pipettázási kalauz (térfogatok mikroliterben) Well Standard Minta Ellenorzo Reagensek szérum Standard 100 Minta 100 Ellenorzo szérum 100 Tracer Inkubálás 37 o C-on 2 órán át. Mosópuffer Felülúszó leöntése Mosás-leöntés ismétlése 5 további ciklusban TMB szubsztrát Inkubálás szobahomérsékleten 30 percig, fénytol védve. Stop reagens Inkubálás szobahomérsékleten 5 percig. Fotometriás mérés, kiértékelés Egyes adat-kiértékelésekhez, rendszerint minoségellenorzési célból, szükség lehet a specifikus kötési értékekre. Erre a B/Bmax értékek használhatók, amelyek számításához szintén a standardok, illetve minták NSB-vel korrigált értékeit osztjuk a maximális standard OD értékével az alábbi egyenlet szerint: S1-4/Mx (AU) -S 0 (AU) B/Bmax (%) = x 100 S4 (AU) - S 0 (AU) Számítógépes adatkiértékelés A korszeru mérokészülékek lehetové teszik a fotometriás mérést követo azonnali ("on-line") számítógépes adatfeldolgozást is. A sokféle feldolgozó program közül jelen készítményhez speciálisan immunometrikus assayre kifejlesztett illeszto programok (spline vagy simított négyzetes spline) használatát javasoljuk. Ügyeljünk arra, hogy vannak olyan kiértékelo programok, amelyek a O standard és az elso standard között is interpolálnak, de a számított koncentrációk közül csak azok tekinthetok valósnak, amelyek értéke magasabb, mint a mérés statisztikailag meghatározott kimutatási határa (ld. ÉRZÉKENYSÉG). 2. táblázat Jellemzo mérési eredmények AFP IU/ml O.D. O.D. O.D. átlag B/Bmax % AFP IU/ml S 0 0 0,057 0,048 0,053 2,50 - S ,214 0,231 0,223 8,212 - S ,574 0,628 0,601 26,471 - S ,091 1,133 1,112 51,155 - S ,159 2,088 2, C - 1,089 1,000 1,045 30,88 46,367 Minoségi jellemzok Az assay jellemzo paraméterei Bo/Bmax < 5 % Érzékenység Jelen készlettel az analitikai érzékenység a 0-standarddal 15 párhuzamos mérésbol meghatározva 0,8 IU/ml. Értéke egyenlo a Bo+2*SD kötési értékhez tartozó koncentrációval. Specificitás Az assay-ben felhasznált antitestek human szérum albuminnal nem keresztreagálnak.

5 AU, O.D. (NSB korr.) 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Koncentráció, IU/ml 1. ábra Tipikus standard görbe (Mintameghatározásra nem használható!) Nagy-dózisú Hook effektus Az effektus 5000 IU/ml alatti koncentrációban nem jelentkezik. Ismert mennyiség visszanyerése ( "recovery") Egyéni szérummintákhoz ismert mennyiségu AFP-t adva, a visszanyerés (recovery) 86 ± 7,62 % (középérték ± SD, n= 12). Hígítási teszt ( linearity ) Egyéni szérumminták nulla standarddal végzett sorozat-hígításakor a várt (x) és a mért (y) koncentráció érték között az alábbi lineáris összefüggés adódott: y=0,9737 x 0,2657, R = , n= 12 Pontosság és reprodukálhatóság Az intra-assay pontosságot 15 párhuzamossal egy sorozaton belül, az inter-assay pontosságot 2 párhuzamossal, 15 független mérésben értékelve, 6 mintára az alábbi adatokat kaptuk. Intra-assay Inter-assay átlag (IU/ml) CV % átlag (IU/ml) CV % 7,25 7,78 6,72 11,53 15,69 4,83 16,00 5,90 23,65 7,68 23,55 4,88 28,06 7,11 28,74 3,83 43,13 9,83 46,56 4,53 66,25 7,52 67,77 4,89 Várható referens tartomány: Férfiak: 0,47 5,39 IU/ml Nok: 0,37 4,41 IU/ml 16. hetes terhes szérum: 25 IU/ml (1 MoM) Kóros értékek: hepatocarcinoma: 100 IU/ml hepatitis: 100 IU/ml Megjegyzések, tanácsok, hibaforrások 1) A standardok, ellenorzo minta, szérum minták, valamint a tracer bemérése után a reakcióelegy homogenizálása céljából a plate-t a termosztát keverteto programjával, vagy - ha ez nem áll rendelkezésre - akkor egy keverogép alacsony fordulatszámú használatával kb. 5 másodpercig kevertessük. A kevertetésnél ügyeljünk arra, hogy a wellek tartalma ne fröccsenjen ki

6 2) Ha nem áll rendelkezésünkre ELISA mosó akkor kézi mosást kell végrehajtanunk, ami a reakcióelegy leöntésébol és 6 db. mosópuffer adagolás - leöntés ciklusból áll. A leöntéseket mindig a plate hirtelen lefordításával végezzük, majd csapkodjuk ki a wellek-ben maradt cseppeket egy nedvszívó papírra. A gyors kiöntésnek elsosorban a reakcióelegy eltávolítása esetén van nagy jelentosége, hiszen ellenkezo esetben a wellek tartalma elszennyezheti egymást, ami meghamisítja a mérést. 3) Ha rendelkezésünkre áll olyan ELISA inkubátor, vagy rázógép, amellyel a plate - a reagensek kifröccsenésének veszélye nélkül - rázatható, akkor a szubsztrát reakciók (pnpp, TMB) elején, valamint a stop reagens adagolása után ajánlott egy kb. 10 másodperces óvatos rázatás. Biztonsági óvórendszabályok Fertozésveszély A kitben lévo humán szérumot tartalmazó komponensek eloállításához felhasznált szérum HIV-Ab és HBsAg vizsgálatra negatív eredményt adott. Ennek ellenére a humán szérumot tartalmazó komponenseket potenciálisan fertozoként kell kezelni, és az erre vonatkozó általános laboratóriumi higiénés szabályokat be kell tartani. Egyéb tudnivalók Tárolás A készlet komponensei -felbontott reagensek is- 2-8 C között tárolhatók a lejárati idon belül. A készlet lejárati ideje A készlet a gyártástól számítva általában legalább 16 hétig használható. A pontos lejárati ido a kíséro bizonylaton és a dobozcímkén van feltüntetve. Felhívjuk a figyelmet arra, hogy a különbözo gyártási számú készletek egyes komponensei nem helyettesíthetok sem egymással, sem más gyártó AFP készletének komponenseivel

7 IZOTÓP INTÉZET Kft Budapest, Pf.: 851. Tel.: Fax: HONLAP: Technikai Kereskedelmi EK80m/2. verzió/