KÓROKI MUTÁCIÓK AZONOSÍTÁSA ÖRÖKLETES ANGIOÖDÉMÁBAN ÉS A C1-INH GÉN MUTÁCIÓS ADATBÁZISÁNAK LÉTREHOZÁSA

KÓROKI MUTÁCIÓK AZONOSÍTÁSA ÖRÖKLETES ANGIOÖDÉMÁBAN ÉS A C1-INH GÉN MUTÁCIÓS ADATBÁZISÁNAK LÉTREHOZÁSA Szerző: Kalmár Lajos Ph.D. hallgató, Semmelweis Egyetem Budapest Témavezető: Dr. Tordai Attila Országos Gyógyintézeti Központ Hematológiai és Immunológiai Intézet Budapest, 2005. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Molekuláris orvostudományok tudományág, Elméleti és Klinikai Immunológia program. Bírálók: Dr. Váradi András, Dr. Karcagi Veronika Szigorlati bizottság: Dr. Fekete György, Dr. Béres Judit, Dr. Gál Péter, Dr Vásárhelyi Barna

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE...3 1. BEVEZETÉS...4 1.1. AZ ANGIONEUROTIKUS ÖDÉMA TÖRTÉNETE...4 1.2. AZ ANGIOÖDÉMA KIALAKULÁSÁNAK PATOMECHANIZMUSA...4 1.3. AZ ÖRÖKLETES C1 INHIBITOR DEFICIENCIA...6 1.4. A SZERZETT C1 INHIBITOR HIÁNY...6 1.5. AZ ANGIOÖDÉMA DIAGNOSZTIKÁJÁNAK SZEMPONTJAI...7 1.6. TERÁPIA...11 1.7. AZ ÖRÖKLETES ANGIOÖDÉMA MOLEKULÁRIS HÁTTERE...15 1.8. GENETIKAI ADATBÁZISOK...21 2. CÉLKITŰZÉSEK...23 3. VIZSGÁLT EGYÉNEK...24 4. MÓDSZEREK...25 4.1. KOMPLEMENT VIZSGÁLATOK...25 4.2. MINTAGYŰJTÉS...25 4.3. DNS KIVONÁS...26 4.4. SOUTHERN-BLOT ANALÍZIS...26 4.5. GÉNDÓZIS ANALÍZIS...27 4.6. PRIMER TERVEZÉS...28 4.7. DIREKT DNS SZEKVENÁLÁS...30 4.8. PCR-RFLP ÉS MULTIPLEX ALLÉLSPECIFIKUS PCR...33 4.9. A C1-INH GÉN MUTÁCIÓS ADATBÁZISÁNAK LÉTREHOZÁSA...35 5. EREDMÉNYEK...38 5.1. MOLEKULÁRIS DIAGNOSZTIKAI STRATÉGIA...38 5.2 A MUTÁCIÓSZŰRÉS EREDMÉNYE ANGIOÖDÉMÁS CSALÁDOKBAN....39 5.3. ÖSSZEGYŰJTÖTT MUTÁCIÓS ADATOK A HAEDB-BEN...43 5.4. A HAEDB MŰKÖDÉSE...44 6. MEGBESZÉLÉS...50 6.1. DIAGNOSZTIKAI MÓDSZEREK BEÁLLÍTÁSA...50 6.2. BETEGSÉG OKOZÓ MUTÁCIÓK A C1-INH GÉNBEN...50 6.3. MUTÁCIÓK ELNEVEZÉSE A KUTATÁSBAN ÉS A HAEDB-BEN...52 6.4. A HAEDB HELYE A DIGNOSZTIKÁBAN ÉS A KUTATÁSBAN...52 6.5. NEM PUBLIKÁLT MUTÁCIÓK AZ ADATBÁZISBAN...53 6.6. A HAEDB ÖSSZEVETÉSE AZ IDEÁLIS ADATBÁZISSAL...53 7. ÖSSZEFOGLALÁS...56 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...57 9. IRODALOMJEGYZÉK...58 ÖSSZEFOGLALÓ...65 SUMMARY...66 ÉRTEKEZÉSSEL KAPCSOLATOS PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE...68 2

Rövidítések jegyzéke AANO Szerzett angioneurotikus ödéma (aquired angioneurotic oedema) ACE Angiotenzin konvertáz enzim ANOVA Variancia analízis (analysis of variance) C1 Komplement 1 fehérje C1r Komplement 1 fehérje r alegység C1s Komplement 1 fehérje s alegység C1 inhibitor Komplement 1 észteráz inhibitor (a fehérje jelölése) C1-INH Komplement 1 észteráz inhibitor (a gén jelölése) C2 Komplement 2 fehérje C4 Komplement 4 fehérje CCM Kémai úton történő heteroduplex hasítás (chemical cleavage of mismatch) cdns Reverz transzkripcióval készült komplement DNS szál CDS Kódoló DNS szekvencia CG, CpG Citozin-guanin dinukleotid Cp Crossing point DGGE Denaturáló gradiens gélelektroforézis (denaturing gradient gel electrophoresis) DHPLC Denaturáló nagynyomású folyadék kromatográfia (denaturing high performance liquid chromatography) DNS Dezoxiribonukleinsav dntp Dezoxinukleotid-trifoszfát keverék (datp, dctp, dgtp, dttp) E Egység (gyógyszernél, készítménynél) EACA Epszilon-amino kapronsav EDTA Etiléndiamin-tetraecetsav ELISA Enzimhez kapcsolt immunoszorbens assay (Enzyme linked immunosorbent assay) HA Heteroduplex analízis HAE Örökletes angioödéma (hereditary angioedema, nemzetközileg alkalmazott elnevezés) HANO Herediter angioneurotikus oedema (Magyarországon klinikumban használt elnevezés) HGMD The Human Gene Mutation Database HGVS Human Genome Variation Society HIV Emberi immundeficiencia vírus (Human immundeficiency virus) HUGO Human Genome Organisation LSDB Locusspecific Database mrns Messenger ribonukleinsav OMIM Online Mendelian Inheritance In Man PCR Polimeráz lánc reakció PDF Portable document format PHP Pre hypertext processor POP6 Performance optimized polymer 6 RFLP Restrikciós fragmens hossz polimorfozmus SSCP Szimpla szálú konformációs eltérés (single strand conformational polimorphysm) TE Tris-EDTA 3

1. Bevezetés 1.1. Az angioneurotikus ödéma története 1876-ban elsőként J. L. Milton számolt be részletesen egy feltehetően angioödémás betegről, a szindrómát gigantikus ödéma -ként jellemezve. 78 Az angioödémára jellemző akut subcutan ödéma első teljes klinikai leírását 1882-ben közölte Heinrich Quincke. 93 1888-ban Sir William Osler írta le a betegség klinikai tüneteit, és megfigyelései alapján a kórképet az angioneurotikus ödéma örökletes formájának nevezte. 86 Egy 24 éves nőbeteg kórtörténetét mutatta be, akinek krónikus recidiváló ödémás rohamai voltak, és akinek a családjában öt generáción keresztül hasonló tüneteket figyelt meg. 1917-ben Crowder mutatott rá arra, hogy a betegség autoszomális domináns öröklésmenetű. 41 Levy és Lepow 1959-ben írták le a klasszikus komplement kaszkád első komponensének inhibitorát, majd 1961-ben Pensky és munkatársai azonosították a C1 észteráz inhibitor (C1 inhibitor) fehérjét. 75,90 A következő évben Landerman, majd 1963-ban Donaldson és Evans közölték, hogy a herediter angioneurotikus ödéma oka a C1 inhibitor fehérje deficienciája. 71,49 A C1 inhibitor fehérjével és a herediter angioneurotikus ödémával foglalkozó kutatások azóta feltárták a betegség biokémiáját, genetikáját és patomechanizmusát. A pontos biokémiai mechanizmus ismeretében a neurotikus jelző egyre ritkábban szerepel az elnevezésben, általában a betegség örökletes illetve szerzett angioödémaként ismert. Értekezésemben a továbbiakban én is az angioödéma elnevezést használom. 1.2. Az angioödéma kialakulásának patomechanizmusa A C1 inhibitor fehérje a szerpin típusú szérum proteáz inhibitorok csoportjába tartozik, amelyet elsősorban a májsejtek, kisebb részben a monocyták és a fibroblasztok is szintetizálnak. A fehérje fő funkciója bizonyos véralvadási és kinin-felszabadító enzimek gátlása, valamint szerepe van a veleszületett immunitás egyik fontos effektorrendszerének, a komplementrendszer működésének szabályozásában. 43 A C1 inhibitor célproteázai a C1-komplex két alegysége (C1r és C1s), valamint a kallikrein, a plazmin, a XIIa (Hageman faktor) és a XIa faktor fehérjék. A plazma C1 inhibitor deficienciájának következtében (csökkent fehérje mennyiség, csökkent fehérje 4

aktivitás, vagy fehérje ellenes ellenanyag jelenléte) a komplement kaszkád klasszikus útjának autoaktivációja jön létre, amelynek eredményeként csökken a plazma C2 és C4 szintje. A kontrollálatlan komplement aktiválódás során keletkezett C2 fragmentumok vazoaktív, kininszerű mediátorok (C2-kinin) felszabadulását váltják ki. Másfelől, ha szövetkárosodás jön létre, a Hageman faktor hatására a prekallikreinből kallikrein, a nagy molekulatömegű kininogénből bradykinin szabadul fel. Ezen anyagok tehetők felelőssé az angioödéma jellegzetes tüneteiért. 8,31,76,81,98 1. ábra. A C1 inhibitor hiány következtében kialakuló angioödéma patomechanizmusának vázlata. Az ábrán a C1 inhibitor gátló hatásának támadáspontjai láthatók piros ponttal jelölve. C1 inhibitor hiány esetén, az ábrán feltüntetett rendszerek aktiválódása vazoaktív mediátorok (bradykinin, C2 kinin) felszabadulásához, és így ödéma képződéséhez vezet. A fekete nyilak a rendszeren belüli átalakulásokat, míg a kék nyilak a rendszerek közötti aktivációs utakat jelölik. A C1 inhibitor deficiencia etiológiáját tekintve lehet örökletes, illetve szerzett, a két típus klinikai tüneteit illetően nem különbözik egymástól. 5

1.3. Az örökletes C1 inhibitor deficiencia Az örökletes angioödéma ritkán előforduló betegség, gyakorisága az európai populációkban 1:10000-1:50000 között van. 43 Az említett gyakorisági adatok alapján Magyarországon mintegy 200-1000 beteg valószínűsíthető. Mivel értekezésem egyik célja, a genetikai háttér bemutatása, ezért a betegség örökletes formájával és a háttérben álló genetikai eltérésekkel a későbbiekben részletesen foglalkozom. 1.4. A szerzett C1 inhibitor hiány A szerzett C1inhibitor hiány esetén az angioödémás epizódok a negyvenes életévekben kezdődnek, negatív családi anamnézis mellett. 1969-ben Constanzi, Donaldson és munkatársai közöltek egy esetismertetést, amelyben a C1 inhibitor deficiencia cryoglobulinaemiához társult. 38 1972-ben Caldwell és munkatársai egy lymphoproliferativ betegségben szenvedő beteg angioödémáinak hátterében diagnosztizálták a C1 inhibitor deficienciát. 28 Azóta több közlemény jelent meg, amelyekben a fehérje deficienciája különféle betegségekhez társult. Ilyenek a benignus és malignus lymphoprolíferatív betegségek, a monoklonális gammopathia cryoglobulinaemiával, a Churg-Strauss vasculitis, a rectum-, és gyomor carcinoma, a hepatitis B és C, az Echinococcus és a Helicobacter pylori fertőzés, a xanthomatosis, valamint a szisztémás lupus erythematosus. 61,62,30,89,37,88,68,80 A szerzett C1 inhibitor deficienciában a C4 és a C1 inhibitor fehérjék csökkent koncentrációja és aktivitása mellett jellegzetes a csökkent C1 hemolítikus aktivitás, amely differenciál diagnosztikai jelentőségű az örökletes és a szerzett forma elkülönítésében, mivel örökletes angioödémában ez az érték mindig normális. 1986-ban a C1 inhibitor deficiencia új típusáról számoltak be, amelyet II. típusú szerzett angioneurotikus ödémának (AANO) neveztek el, és amelyben a C1 inhibitor elleni autoantitesteket mutattak ki. 5 Az oligoklonális vagy monoklonális jellegű C1 inhibitor fehérje elleni autoantitestek mellett a csökkent C4 és C1 inhibitor aktivitás jellemzi az AANO-t. Ezt az autoimmun típusú C1 inhibitor deficienciát azokban a betegekben feltételezték, akikben nem tudtak háttérbetegséget kimutatni. 6

Cicardi és munkatársai vizsgálatai azonban ezt a feltételezést nem támasztották alá, mivel lymphoproliferativ kórképekhez társuló angioödémákban is detektáltak C1 inhibitor elleni antitesteket. 32 1.5. Az angioödéma diagnosztikájának szempontjai 1.5.1. Családi anamnézis A C1 inhibitor deficiencia örökletes típusában a családi anamnézis pontos és részletes felvétele mellett szükséges a családtagok szűrése is. A betegek 75%-ában a közvetlen családtagoknál is felismerhető a kórkép, a fennmaradó 25%-ban újonnan kialakult mutáció áll a betegség hátterében (sporadikus esetek). 48 1.5.2. Klinikai tünetek A C1 inhibitor hiány klinikai tünetei az ödéma lokalizációjától függően rendkívül sokfélék lehetnek, és az alábbi két nagyobb csoportra oszthatók: Subcutan ödémák: A subcutan ödémák, amelyek leggyakrabban a végtagokon, az arcon, a nyakon, a törzsön, a gluteális tájon, a nemi szerveken jelentkeznek, nem fájdalmasak, nem gyulladásos jellegűek, és nem okoznak viszketést. Néha urticariához hasonló jellegű, esetleg erythemás szélű lehet a bőrön lévő elváltozás. A periorbitális és a periorális megjelenés ritka, de ha a szájnyálkahártya ödémája kifejezett, akkor az alsó- és felsőajak nagyfokú duzzanata alakulhat ki. 2 Submucosus ödémák: A submucosus ödéma érintheti a felső légutak nyálkahártyáját (száj, garat, gége, uvula), melynek során néhány órán belül olyan súlyos gégeödéma jöhet létre, ami fulladásos halált is okozhat. Külső megjelenési formáját tekintve nem különíthető el egyéb, pl. allergiás ödémáktól. A betegség mortalitása az intenzív terápia illetve a speciális kezelések bevezetése előtt 25-30% volt, a halálozás felét gégeödéma által okozott fulladás idézte elő. Az angioödémás betegek a szokásos szteroid, adrenalin, antihisztamin kezelésre 7

nem reagálnak, ezért a betegség korai diagnosztizálásának elmaradása miatt gyakran esnek át sürgős tracheotomián. 2,55 A gyomor-bél traktus falát érintő submucosus ödéma gyakran akut hasi tüneteket utánozhat. Görcsös hasi fájdalom, pseudoobstruktio, a rohamokat követően vizes hasmenés jelentkezhet. Ennek oka a fokozott folyadék-beáramlás a bélcsatorna lumenébe az ödémás bélfalból. Jellemző tünet a hányinger, hányás is, amely olyan nagyfokú folyadékvesztéssel járhat, hogy hypovolémiás sokkot idézhet elő. Differenciáldiagnosztikai szempontból lényeges, hogy az abdominális roham alatt láz, leukocytosis nincs, bár előfordulhat fehérvérsejtszám emelkedés az intravasculáris dehidratációval párhuzamosan. A hasi ultrahang vizsgálat során néha jól megfigyelhető az ödémás, megvastagodott bélfal és a szabad hasűri folyadék. Az ascites kimutatása és annak terápiát követő felszívódása döntő fontosságú lehet. 108 A megfigyelések szerint az angioödémábanban szenvedő betegek körében lényegesen gyakoribb a hyperaciditás ill. a fekélybetegség. Ez a megállapítás azért lényeges, mert ha a beteg hasi fájdalmai az adekvát kezelést követően is fennmaradnak, gastroscopia és aciditás-vizsgálat indokolt. 42 Extraabdominális tünetek is jelentkezhetnek, pl. nehézlégzés, mellkasi feszülés érzése. A törzsön megjelenő ödéma során a pleura ill. a pericardium is érintett lehet. Amennyiben az ödéma a központi idegrendszert érinti, átmeneti fejfájás, aphasia, hemiplegia, epileptiform görcsök léphetnek fel. 1.5.3. A tünetek jelentkezési ideje, fennállása, gyakorisága Az örökletes angioödéma tünetei újszülötteken ritkán észlelhetők, inkább kisiskolás-, serdülő-, valamint fiatal felnőttkorban alakulnak ki. Az időskori megjelenés főleg a szerzett formára jellemző. Az ödéma okozta tünetek rohamszerűen jelentkeznek, általában 24-72 óráig állnak fenn, de extrém esetben 4 órától akár egy hétig is fennmaradhatnak. Általában spontán megszűnnek. Megjelenésük gyakorisága változó, lehet hetente, havonta 1-2 alkalommal, de előfordulhat, hogy évekig nem jelentkeznek. 2 8

1.5.4. Kiváltó tényezők A betegség kialakulásának hátterében egyértelműen a fizikai vagy szellemi stressz áll. A rohamok kialakulását egyaránt provokálhatják kisebb nagyobb mechanikai sérülések, hosszantartó rossz közérzet, vagy komolyabb lelki trauma. Megfigyelték, hogy egyes nőbetegeknél a menstruációval függtek össze a rohamok. Menses előtt a tünetek megjelenhetnek, illetve kifejezettebbé válhatnak. A terhesség ideje alatt a rohamok sűrűbben ismétlődhetnek, azonban teljes tünetmentesség is előfordulhat. 22,82 A fogamzásgátló tabletták egyértelműen rontják a betegség lefolyását. 6,117 A betegek egy része a rohamok előtt különös panaszokról számol be, pl. az izmokban érzett feszülésről. A kiváltó tényezők közül a pszichés stressz és a mechanikai trauma - amely lehet igen csekély mértékű is - a leggyakoribb. Triviális dolgok, pl. gyermekek esetében az írás, különböző játékok folyamatos használata, felnőttek esetében gépírás, kerti munka, a lovaglás, nem ritkán a nemi aktus is kiválthat ödémát. Bizonyos ételek fogyasztása után is kialakulhat ödéma. Szöveti mechanikai traumával járó műtéti, diagnosztikai, fogászati, gégészeti, aneszteziológiai beavatkozások, endoszkópos eljárások (szájüreg-gége, nyak, nyelőcső területén) szintén provokálhatnak súlyos ödémát. Az örökletes angioödémában szenvedő betegek esetében a fentiekben említett terápiás és diagnosztikai beavatkozások különleges körültekintést és megfelelő előkészítést igényelnek, mivel a betegek az esetleges gégeödéma miatt rövid időn belül súlyos, életveszélyes állapotba kerülhetnek. 2 1.5.5. Társulás más betegségekkel A kivizsgálás során figyelembe kell venni, hogy az örökletes angioödémában szenvedő betegek körében gyakoribbak az autoimmun betegségek, mint az átlag népességben. Beszámoltak szisztémás lupus erythematosushoz, rheumatoid arthritishez, Sjögren- syndromához, membrano-proliferatív glomerulonephritishez társuló örökletes angiödémáról is. 50,65 Az autoimmun kórképekkel való gyakoribb társulás pontos hatásmechanizmusa még nem ismert, valószínűleg a komplement rendszer klasszikus útjának kóros aktivációja vezet az abnormális immunregulációhoz. A C4 és C2 fehérjék csökkent mennyisége miatt az immunprecipitátumok feloldásának kapacitása csökken. 42,79 9

1.5.6. Laboratóriumi vizsgálatok A C1 inhibitor hiány miatt fellépő angioödéma potenciálisan életveszélyes állapotot idézhet elő, de kezelhető, ezért fontos a diagnózis korai felállítása. A családi anamnézis, a tünetek megjelenési formája, gyakorisága felvetheti az örökletes angioödéma gyanúját, de a betegség pontos azonosítása csak a komplement faktorok meghatározásával lehetséges. A komplement rendszer laboratóriumi vizsgálatával elkülöníthető az örökletes angioödémás betegek mintegy 85%-át kitevő I. típusú (HAE I, csökkent C1 inhibitor fehérje szint), illetve a fennmaradó 15%-ot kitevő II. típusú (HAE II, normális vagy emelkedett fehérje szint, kóros fehérje funkció) rendellenesség. 26,120 A C1 inhibitor koncentráció tehát - ha nagyon alacsony, vagy ha a normál értéknél magasabb - diagnosztikus értékű. Rohamok alatt mindkét örökletes típus esetén a C2 és C4 fehérjék plazmaszintje a normál érték alá csökken a C1s kontrollálatlan működése miatt. Az alacsony C4 plazmaszint az egyik legérzékenyebb mutatója a betegségnek. Tünetmentes periódusban lehet közel normál értékű, de a roham alatt szintje mindig csökken, így a betegség aktivitásának jó indikátora (a terápiás effektus mérésére is alkalmas). A megfelelő profilaxisban részesített betegek C4-szintje szignifikánsan emelkedik, sőt normális is lehet. A szerzett forma esetén a C1 inhibitor koncentráció normális vagy csökkent, a C1 inhibitor aktivitás, valamint a C2 és C4 plazmaszint egyaránt csökkent. Jellemző paraméter a csökkent C1 hemolítikus aktivitás (amely a normál érték körülbelül 10%-a), valamint egyes esetekben a C1 inhibitor elleni autoantitestek jelenléte (1. táblázat). 1. táblázat. A szérum komplement faktorok jellegzetes változásai C1 inhibitor deficienciában. C1 inh. hiány C1 inh. C1 inh. anti-c1-inhibitor C1 C4 C3 típusa koncentráció aktivitás autoantitest HAE I N N HAE II N vagy N N Szerzett típus N vagy N +/- : csökkent; : emelkedett; N: normális 10

1.5.7. Genetikai diagnosztika A fehérjék kimutatására irányuló laboratóriumi vizsgálatok angioödémában a tünetek megjelenése előtt, azaz a korai gyermekkorban még nem elég megbízhatóak. 83 A betegség, illetve a genetikai érintettség korai felismerésében kulcsszerepe van a DNS alapú diagnosztikának. A betegség korai felismerése kiemelkedő fontosságú, hiszen ezáltal a felnövő gyereket fel lehet készíteni arra az életmódra, mellyel később elkerülheti a súlyos ödémás rohamok kialakulását. A pontos és korai diagnózis felállítása segít abban, hogy a beteg már a klinikai tünetek első jelentkezésekor tisztában legyen a teendőkkel, ezáltal elkerülje a felesleges, és sokszor veszélyes, téves orvosi beavatkozásokat. A C1-INH gén instabilitása (később részletezem) a kutatókat és a diagnosztikai laborokat speciális módszerek és stratégiák kidolgozására késztette. 44,109,120 A génen találhatók kiemelten instabil régiók, amelyekben gyakoribbak a betegségokozó mutációk, azonban jellemzően előforduló, ismétlődő mutációt ritkán sikerült a génben azonosítani. Az örökletes angioödéma genetikai diagnosztikája ezért a mutáció keresésre épül. A mutáció keresés klasszikus módszere a restrikciós enzim hasításra épülő Southern-blot technológia, mely manapság már csak a nagy méretű génátrendeződések kimutatására használatos. 35,106 A betegségokozó mutáció kimutatására a legbiztosabb módszer a direkt DNS szekvenálás, ennek költséges kivitelezése miatt azonban több laboratórium használ mutáció szűrő módszereket. Ezek a technológiák a DNS heteroduplex analízisén (HA) alapulnak, ide sorolható a kémiai úton történő heteroduplex hasítás (CCM), a szimpla szálú konformációs polimorfizmus vizsgálat (SSCP), a denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE), és a denaturáló nagynyomású folyadék kromatográfia (DHPLC). 16,20,39,57 Ezek a módszerek bár csökkenthetik a mutáció keresés költségeit, de sokszor hosszadalmas a rendszerek beállítása, és a mutáció találati valószínűség sem 100%-os. 1.6. Terápia Az örökletes angioödémás betegek kezelése az alábbi három módon történik: - Az akut roham kezelése - Rövid távú profilaxis 11

- Hosszú távú profilaxis 1.6.1 Az akut roham kezelése Az akut roham megnyilvánulhat részben gégeödéma, részben a bélfalat érintő ödéma formájában. A gégeödéma külső megjelenésében nem különíthető el egyéb allergiás és gyulladásos mechanizmus alapján kialakuló ödémáktól, de a szokásosan alkalmazott adrenalin, antihisztamin, szteroid terápiára nem reagál. A gégevizenyő progressziója esetén csak az intubáció ill. a tracheotomia a lehetséges kezelés. Az időben alkalmazott szakszerű terápia életmentő lehet, és a beteget megóvhatjuk a felesleges műtéti beavatkozásoktól. Lehetséges alternatíva a kezelésben a friss fagyasztott plazma. 91 Ez a vérkészítmény tartalmazza a hiányzó komplement faktorokat. Veszélye, hogy kockázatot jelent a fertőzések átvitelére ill. alloimmunizációra. A legmegfelelőbb terápiás készítmény a tisztított, liofilizált, hepatitis B-re, C-re illetve HIV-re szűrt C1 inhibitor fehérje koncentrátum. 27 A készítményből 500-1000 E intravénásan adva, 30 perc és 2 óra közötti időtartamon belül megszünteti a tüneteket és a panaszokat. Eddigi alkalmazása során allergiás tüneteket nem észleltek. A terápiás hatás kb. 3-5 napig áll fenn, függően a kezelés előtti plazma C1 inhibitor szinttől, illetve a beadott dózistól. Súlyos esetben ismételt adagok adása válhat szükségessé. A C1 inhibitor koncentrátum alkalmazásának anyagi megfontolásai is vannak, hiszen a készítmény igen drága. Az újabb készítmények 4 C-on 3 évig tarthatók el. 13,114 Valószínűleg a betegség ritka előfordulása miatt viszonylag későn kezdtek el foglalkozni a fehérje rekombináns rendszerekben való előállításával. A rekombináns fehérje előállítását tovább nehezíti, hogy a természetesen előforduló, funkcionális jelentőséggel bíró jelentős mértékű glikozilációt nehéz nem humán rendszerekben reprodukálni. A jelenleg fázis II. kipróbálás alatt lévő egyetlen rekombináns C1 inhibitor fehérjekészítményt transzgenikus nyulak tejéből vonják ki. 85 A C1 inhibitor fehérjekészítmények hátránya, hogy alkalmazásuk intravénás bevitellel történik, ami jelenleg kizárólag orvosi felügyelet mellet történhet meg. Az 12

újabb gyógyszerkutatások során olyan molekulákat igyekeznek kifejleszteni, melyek akár az akut, akár a hosszú távú terápiában orálisan alkalmazható gyógyszerként kerülhetnének forgalomba. Az egyik ilyen molekulacsoport lehet a kallikrein inhibitorok csoportja. Az angioödéma klinikai tüneteinek kialakításában fontos szerepet játszik a vazoaktív bradikinin, mely a kallikrein aktiválódásának eredményeként szabadul fel. A szarvasmarhából kivont aprotonin nevű kallikrein inhibitort már évtizedekkel ezelőtt alkalmazták az angioödéma kezelésére, később azonban betiltották, mivel bizonyos esetekben végzetes kimenetelű anafilaxiás reakciót váltott ki. 77,92 Egy újonnan kifejlesztett kallikrein inhibitor (DX-88, mely egy szintetikus Kunitz domén fehérje) azonban sokkal ígéretesebb lehet a betegség kezelésében, mivel megfelelően magas szelektivitást és affinitást mutat a kallikrein fehérjék szempontjából, ugyanakkor nem vált ki immunreakciót. 60,116 Szintén reménykeltő eredmények születtek fázis II. vizsgálatokban a bradikinin receptor antagonista Icatibant-tal kapcsolatban. Ez a molekula hasonló kémiai szerkezetű a bradikininhez, azonban aminosav összetételének köszönhetően nem aktiválódik a két kulcsfontosságú bradikinin hasító enzim (karboxipeptidáz és ACE) hatására. Az Icatibant a bradikininnel megegyező mértékű affinitást mutat a B2 receptorok iránt, de kötődésével nem aktiválja azt, így hatékonyan gátolhatja a bradikinin érfal-permeabilitást fokozó hatását. 4,110 1.6.3. Rövid távú profilaxis Abban az esetben, ha az örökletes angioödémábanban szenvedő beteg olyan diagnosztikai vagy sebészi beavatkozás előtt áll (elsősorban fej, nyak, gége területén) amely traumás hatása miatt ödémát, vagy akár akut rohamot válthat ki, a rövid távú profilaxis indokolt. A beavatkozások előtt 4-5 nappal 600 mg/nap mennyiségű danazol (vagy nagyobb dózisú stanosolol, tranexámsav illetve epszilon-amino kapronsav [EACA]) adása javasolt. 40,53,73,101 A kiválasztott gyógyszer adása a beavatkozás után még további 4-5 napig szükséges. Amennyiben a beteg előzőleg már hosszú távú profilaxisban részesült, a beavatkozás idejére a fenntartó dózist meg kell emelni. Alkalmazható friss fagyasztott plazma is a beavatkozás előtti napon (2 egység), valamint közvetlenül a manipuláció előtt ugyanekkora mennyiségben. A legbiztonságosabb és leghatásosabb rövid távú prevencióra alkalmas szer a C1 inhibitor koncentrátum. 72,74 13

1.6.2. Hosszú távú profilaxis Hosszú távú gyógyszeres kezeléssel illetve a provokáló tényezők kiiktatásával a betegek nagy részénél kivédhetők az akut rohamok. Ezt a megelőző terápiát abban az esetben alkalmazzák, ha a beteg kórelőzményében már több alkalommal volt életveszélyes állapotot előidéző ödémás roham illetve, ha a tünetek gyakran jelentkeznek (hetente, havonta 1-2 alkalommal). A választható gyógyszeres kezelés típusai a következők: Antifibrinolitikus szerek: Epszilon-aminokapronsav (EACA), illetve tranexámsav. 1966-ban kezdték alkalmazni ezeket a szereket, melyek részben a plazminogént inaktiválják, részben a C1 aktivációját gátolják. A kezdeti jó eredményeket (a rohamok gyakorisága és súlyossága csökkent) követően nem kívánt mellékhatások (izomfájdalom, trombózis, vérnyomás emelkedés) miatt alkalmazásuk kevésbé terjedt el. Főleg gyermekeknél és terheseknél javasolt, akiknél a csökkentett hatású anabolikus szteroidok adása nem ajánlott. 14,56,84 Csökkentett hatású anabolikus szteroidok: 1960-ban Spaulding és munkatársai közölték megfigyelésüket, mely szerint a metil-tesztoszteron alkalmas az örökletes angioödémában kialakuló rohamok kivédésére. 103 Bár a pontos hatásmechanizmus még nem ismert, a metil-tesztoszteron valószínüleg fokozza a C1 inhibitor termelődését a májban, illetve emeli a C4 plazmaszintjét is. A későbbiekben bizonyítást nyert, hogy a csökkentett hatású szintetikus androgén, a danazol növeli a plazma C1 inhibitor szintjét, és ezáltal képes kivédeni a rohamokat. Ugyanakkor a mellékhatások szempontjából kedvezőbb szer, mint a tesztoszteron. Hasonló mechanizmus révén hat a stanosolol is. Lényeges, hogy mindig a legkisebb terápiás dózist alkalmazák, mert így csökkenthetők a nem kívánt mellékhatások (testsúlynövekedés, izomfájdalmak, izomgörcsök, gastrointestinális zavarok, menstruációs zavarok, gyermekeknél fejlődési zavarok, virilizáció, hirsutizmus). Amennyiben a terhes anya danazolt szedett, a születendő leánygyermek maszkulinizácója is előfordulhat. 1,33,34,58,63 14

Ritkán, főleg gyermekeknek és terhes nőknek indokolt esetben heti egy alkalommal a C1 inhibitor koncentrátum is adható folyamatos profilaxisként. 1.6.4. A szerzett C1 inhibitor deficiencia kezelése A betegség szerzett formájának gyógyszeres terápiájáról kevesebb ismeret áll rendelkezésünkre. Legkézenfekvőbb megoldásnak tűnik az alapbetegség feltárása és annak gyógyítása. 12,25,59 A plazmaferezis nem váltotta be a hozzá fűzött reményeket. Hatásos lehet a danazol és tranexamsav maximális dózisban való alkalmazása, másik alternatíva a C1 inhibitor koncentrátum. 1.7. Az örökletes angioödéma molekuláris háttere 1.7.1. A C1 inhibitor fehérje A plazmában található C1 inhibitor fehérje 104 kda tömegű 478 aminosavból álló peptidlánc. A fehérje egy szerkezetileg evolúciósan igen konzervált szerpin (szerinproteáz inhibitor) doménből (365 aminosav), illetve egy - csak a C1 inhibitorra jellemző - N-terminális peptidszakaszból (113 aminosav) áll. A fehérje nagymértékben glikozilált, tömegének közel 30%-át a szénhidrát oldalláncok teszik ki (a glikozilációs helyek nagy része az N-terminális régióban található, szerepük még nem ismert). 21,24 A többi szerpin típusú fehérjéhez hasonlóan, a C1 inhibitor reaktív centrumával a célproteázok aktív centrumához kötődik, és ott fejti ki gátló hatását. A folyamatban először egy reverzibilis enzim-inhibitor komplex alakul ki, majd a C1 inhibitor fehérje konformációs átalakuláson megy keresztül, és az egyik béta-redős szerkezetű része bekötődik a célproteáz aktív centrumába. Ezzel egy stabil enzim-inhibitor komplex alakul ki, így gyakorlatilag csapdába ejti a proteáz fehérjét, miközben a C1 inhibitor fehérje elhasad. A kialakult fehérje komplex annyira stabil, hogy az esetek jelentős részében a komplex specifikus receptoroknak köszönhetően hamarabb eltávolítódik a keringésből, minthogy az inhibitor felszabadulna a komplexből. 45,67,107,115 1.7.2. A C1-INH gén A C1-INH gén a 11. kromoszómán található, 17 kilobázis hosszúságú, 8 exonból áll. Az első exon, a második exon első szaksza és a nyolcadik exon egy jelentős része 15

nem transzlálódó régió. 96,118 A gén molekuláris sajátosságai következtében instabil, ennek tudható be a sporadikus esetek gyakori előfordulása (a betegek 25%-a de novo, negatív családi anamnézisű eset). 29,43,109 A C1-INH gén 17 teljes intragenikus Alu szekvenciát tartalmaz. Az Alu szekvenciák mintegy 300 bázispár hosszúságú jellegzetes bázissorrendű nukleinsav szakaszok, melyeket az Alu restrikciós enzimek hasítani képesek (innen ered az elnevezésük). Szerepük az örökletes angioödéma kialakításában azért fontos, mert ezek a szakaszok asszimetrikus DNS rekombinációban vehetnek részt, amely a C1-INH génben kóros intragenikus átrendeződéshez vezethet. 95 A hibás rekombináció esélyét tovább növeli az a szerkezeti sajátosság, hogy az említett Alu szekvenciák jelentős része ellentétes irányultságú, és ily módon az Alu szekvenciák közötti rekombináció a génen belül is, és nem csak a homológ kromoszómák között jöhet létre. 104 Az aszimmetrikus rekombináció miatt kialakuló molekuláris változások jellemzően nagyobb méretű deléciók (DNS-szakasz kiesések), inszerciók (DNS-szakasz beékelődések), duplikációk (DNS-szakaszok megkettőződése), melyek végeredménye szinte minden esetben az allél működésképtelenné válása (nem megfelelő transzkripció), és ezáltal I. típusú örökletes angioödéma kialakulása. 10,35 A mechanizmus alapján elviekben elképzelhető lenne egy nagyobb méretű inverzió (DNS szakasz megfordulás) kialakulása is, erre azonban nem található példa az irodalomban. A lehetséges génátrendeződésekre példák a 2. ábrán láthatók. 16

2. ábra. Alu szekvenciák miatt kialakuló deléciók lehetséges mechanizmusa a C1-INH génben. a: aszimmetrikus, interkromoszómális rekombináció, b: intrakromoszomális rekombináció. Az ábrán a téglalapok az exonokat, a nyilak az Alu szekvenciákat (iránnyal) jelölik. Az ilyen típusú génátrendeződéseknek jellemző a kialakulási ideje. A gametogenezis során a meiozis egy meghatározott szakaszában a kromatinállomány oly mértékben összesűrűsödik, és a gének/kromoszómák oly mértékben kerülnek közel egymáshoz, hogy lehetővé válik a rekombináció. Ez a természetben a változatosság és a genetikai alkalmazkodás egyik alapfolyamata, azonban a C1-INH génben, ebben a stádiumban következhet be egy esetleges génátrendeződés. Tehát az említett ok miatt kialakuló de novo mutáció valamelyik szülő ivarsejtjében alakul ki. Genetikai instabilitást okozhatnak a genomban található CG (vagy CpG) dinukleotidok is. Ilyen dinukleotid található a fehérje reaktív centrumában lévő 444. arginin aminosavat kódoló kodonban is (CGC, 8. exon). A CpG dinukleotidok potenciális metilációs helyek a genomban, mely metiláció után a citozin bázis deaminálódhat, és C T (CGC TGC) vagy G A (CGC CAC) tranzíciók jöhetnek létre. 102 Ezek a pontmutációk aminosavcseréhez, és ezáltal (mivel a kodon a fehérje mutációra legérzékenyebb részét, a reaktív centrum egyik aminosavját kódolja) a fehérje kóros működéséhez vezethetnek (3. ábra). A II. típusú örökletes angioödémában az esetek túlnyomó többségében a szóban forgó régió mutációja a kóroki tényező. 3. ábra. Példák a C1-INH gén 8. exonjában található 444. arginin (Arg) kodonjában bázisszubsztitúció révén kialakuló pontmutációkra. A négyzetek felső részén található betűk a DNS bázissorrendet mutatják a leolvasási keretnek megfelelő tripletekbe (kodon) rendezve, míg az alsó részen található három betűs rövidítések a kódolt aminosavakat jelölik. 17

A 444. arginin körüli régióban egy másik érdekes mechanizmus is okozhatja a genetikai struktúra megváltozását, ami azonban nem köthető a metiláció következtében kialakuló deaminálódáshoz. Ebben a régióban több pontmutációt, valamint deléciót és inszerciót is találtak. 11,15,70 A mutációk kialakulásának oka, hogy a DNS-szakasz ezen részén lévő GC gazdag régióban a DNS replikáció során a polimeráz enzim megállhat és ezáltal lehetőség nyílik különböző kisebb-nagyobb hibák kialakulására. Jó példa erre az egymással ellentétes irányú ismétlődések miatt kialakuló úgynevezett hairpin (hajtűkanyarszerű) kitüremkedés. Ilyen esetben az egyik DNS szál a replikáció során önmagával illeszkedik össze, és a polimeráz enzim egyszerűen figyelmen kívül hagyja a hajtű nukleotidjait, és folytatja a másolást (4. ábra). Az ilyen deléciók, inszerciók következménye szinte minden esetben I. típusú angioödéma. 18,54 18

4. ábra. A hajtűkanyar miatt, a replikáció során kialakuló mutációk típusai. Panel I: Deléció kialaklása ellentétes irányú ismétlődések miatt. A. A két komplementer DNS szál a könnyebb elkülönítés miatt eltérő vastagsággal jelölve. A piros színű, ellentétes irányú nyilak az ismétlőső szekvenciarészleteket mutatják. B. A vastagabbik szálon a replikáció során a két szál szétválása után kialakul a hairpin struktúra. C. A félkész DNS szál és a polimeráz enzim időlegesen levállik a templát szálról. D. A szintetizálandó szál újra kötődik a templáthoz, azonban átcsúszva a hairpin struktúra túloldalára. E. A folytatódó polimerizáció kizárja a hairpin struktúra nukleotidjait. Panel II: Inszerció kialakulása ellentétes irányú ismétlődések miatt. A. A két komplementer DNS szál a könnyebb elkülönítés miatt eltérő vastagsággal jelölve. A piros ellentétes irányú nyilak az ismétlőső szekvenciarészleteket mutatják. B. A replikáció rendben végbemegy az ellentétes ismétlődéseket tartalmazó szakaszon. C. A félkész DNS szál és a polimeráz enzim időlegesen leválik a templát szálról, a hairpin struktúra kialakul a félkész szálon. A stuktúra 3 vége anellálódik a templát szál 5 ismétlődésével, ezzel gátolja a temlát szálon a hajtűkanyar kialakulását. D. A folytatódó polimerizáció duplikációhoz vezet. 19 A C1-INH gén három helyen is tartalmaz olyan speciális repetitív szekvenciákat (pl. CAACAACAA), ahol a kettősszálú DNS két szála egymás mellett elcsúszva helytelenül illeszkedhet egymáshoz. Ennek során úgynevezett körte-alakú (cruciform) 19

kitüremkedések keletkezhetnek a nukleinsav láncon, amelyet a javítómechanizmusok általában egyszerűen levágnak (5. ábra). 17 Ezek a hibák a DNS lánc megkettőződésekor jönnek létre, mivel a nukleinsavlánc másolását végző enzim, a DNS-polimeráz, nehezebben képes a repetitív szekvenciák másolására. Ilyen szakaszok replikációjakor sokszor előfordul, hogy az enzim a már megkezdett ismétlődő szekvencia közepén a másolást abbahagyja, és leválik a DNS szálról. Később természetesen újra csatlakozik, közben azonban a félkész másolat elcsúszhat, így egy kis hurok keletkezik, melyet a DNS javító mechanizmusok kivághatnak. 19 A három repetitív szekvencia közül egy a 8. exon nem transzlálódó régiójában található, melynek mutációi nagy valószínűséggel nem járnak funkcionális következménnyel. További két repetitív szekvencia található az 5. exonban, amelyek mutációi mind I. mind II. típusú örökletes angioödéma kialakulásához vezethetnek. A trinukleotid repeat szekvenciákon kialakuló körteformájú replikációs hibák sokszor három nukleotid kieséséhez vezetnek, melyek csak kis változást okoznak (1-2 aminosavat érinthetnek), de a leolvasási keretet nem csúsztatják el. Néha azonban ezekben az esetekben is előfordulhat olyan mutáció mely a leolvasási keret eltolódásához, ezáltal hibás fehérjéhez vezet. 11,112 5. ábra. Körte alakú kitüremkedések a DNS-láncon. Az ábrán olyan szekvencia sajátosságok miatt kialakuló, körtealakú DNS másolási hibák láthatók, melyek a C1-INH génben mutációk (elsősorban inszerciók és deléciók) kialakulásához vezethetnek. 19 20

1.7.3. Betegség okozó mutációk a C1-INH génben Bár az örökletes betegségek előidézésében szerepet játszó mutációk felderítése elsősorban a molekuláris diagnosztika feladata, az angioödéma esetében a C1-INH génen kialakult mutációk a gyógyító orvosokon és betegeken kívül a kutatók számára is szolgálnak értékes információval. Mivel a fehérjét még nem sikerült kristályosítani, így minden újabb megismert mutáció közelebb vihet a szerkezet és funkció összefüggéseinek megismeréséhez. 23 Az örökletes angioödéma nagy fenotípusos szórást mutat, egyes betegek havonta akár több rohamot is átélnek, míg mások akár évekig tünetmentesek maradhatnak. 3,55 A környezeti tényezők mellett ebben szerepe lehet a C1-INH gén mutációk természetének is, jelentős genotípus-fenotípus összehasonlítás eddig azonban még nem született. 111 A betegségokozó mutációkkal kapcsolatos kutatások egyik alapfeltétele a mutációk ismerete, és rendszerezése. Ebben a folyamatban nagy segítséget nyújt egy olyan adatbázis, ahol a leírt mutációkkal kapcsolatban a lehető legtöbb adat naprakészen rendelkezésre áll. 1.8. Genetikai adatbázisok Az Internet fejlődésének és a web-barát adatbázisrendszerek kialakulásának köszönhetően mára jelentős számú mutációs adatbázis áll a kutatók rendelkezésére. 36 A bioinformatikai szolgáltatások ezen ága, bár minőségét tekintve igen tág határok között mozog, mégis nagyon fontos eszköze a keletkező óriási mennyiségű információ rendszerezésének. 1.8.1. Központi mutációs adatbázisok A genom összes génjében leírt mutációk feltüntetésére törekvő adatbázisokat központi adatbázisoknak nevezzük. Az ilyen gigantikus méretű on-line források esetében általában egy non-profit szervezet biztosítja a működési feltételeket, így ezeknél a hozzáférés általában ingyenes. Jó példa a központi mutációs adatbázisra az OMIM (Online Mendelian Inheritance In Man: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), vagy a HGMD (The Human Gene Mutation Database: http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html). 21

Ezeknek az adatbázisoknak nagy előnye, hogy az összes gént azonos struktúrában, konzekvensen kezeli, hátránya azonban a robosztussága, mely miatt az újonnan leírt mutációk akár 2-3 év késéssel kerülnek be a rendszerbe. A központi mutációs adatbázisok általában csak az alapinformációt tartalmazzák a mutációkkal kapcsolatban (pozíció, nukleotid/aminosav csere, referencia). 1.8.2. Lókusz specifikus adatbázisok A központi mutációs adatbázisok kiegészítéseként jöttek létre a lókusz specifikus adatbázisok (LSDB), melyek többnyire egy gént, vagy néha egy géncsoportot, esetleg egy betegségtípushoz kapcsolódó géneket tartalmaznak. 64 Ezek az adatbázisok kutatócsoportok, vagy kisebb tudományos társaságok gondozásában vannak, akik általában maguk is végeznek genetikai munkát az érintett területen. A lókusz specifikus adatbázisok előnye a kis méretükből fakad, ezek az on-line információforrások általában naprakész információt tartalmaznak az adott génnel kapcsolatban. Ezen rendszerek nagy előnye még, hogy megfelelő szabályozás mellett a nem publikált mutációkat is tartalmazhatják, nagymértékben növelve a rendelkezésre álló információ mennyiségét. Hátrányuk éppen a sokrétűségükből fakad, hiszen az adatokat a legkülönfélébb formában tálalják. A lókusz specifikus adatbázisokban tárolt mutációs információ mennyisége jelentős szórást mutat, a központi adatbázisokra jellemző alapadat mennyiségtől akár a teljes klinikai, fenotípusos és módszertani hátteret magába foglaló internetes oldalakig. Néhány évvel az első lókusz specifikus adatbázisok megjelenése után már megfogalmazódtak azok az alapelvek, melyek az egységesítést, szolgálnák. Azok az adatok, melyek minimálisan szükségesek egy ilyen adatbázisban, a mutációs rekord részleteiben: - Az allélre jellemző egyedi azonosító - A bekerült adat forrása (publikált cikk, absztrakt, a leíró adatai) - Az alléllel kapcsolatos alapadatok (faj, gén, referencia szekvencia) - Az allél megfelelő interpretációja (megnevezés, típus, nukleotid változás, nevezéktan, stb.) 99,100 A megfelelő nomenklatúrai, adattárolási és interpretációs elvek lefektetése után Claustres és munkatársai tudományos közleményben írták le az ideális lókusz specifikus adatbázis követelményeit. 36 22

2. Célkitűzések Célom volt a rendelkezésemre álló magyarországi örökletes angioödémás betegpopuláció kórokozó mutációinak kimutatása, feltérképezése. A C1-INH gén vizsgálatára alkalmazott technológiák beállításával és pontos dokumentálásával egy olyan diagnosztikai eszközparkot kívántam létrehozni, amely egyszerűen alkalmazható később más betegségek genetikai diagnosztikájában is. A betegségben a kóroki mutációk megismerésével lehetőség nyílik a családon belüli gyors, pontos és korai diagnosztikára. Az újonnan leírt missense mutációk ismerete hozzájárulhat a fehérje szerkezet-funkció összefüggéseinek feltárásához. Az örökletes angioödéma szakterületén folyó európai együttműködés keretében egyértelmű igényként merült fel a C1-INH gén internetes lokusz-specifikus mutációs adatbázisának létrehozása. A nagy mennyiségben keletkező mutációs adat kezelésére modern, a kor követelményeinek megfelelő tároló rendszert kívántam kidolgozni. Ezt a tevékenységet a következő célkitűzésekkel kezdtem meg: - A C1-INH gént érintő valamennyi ismert DNS-szekvencia változás folyamatosan megújuló, legteljesebb gyűjteményének létrehozása - Az összegyűjtött adatok sokoldalú kereshetősége - Az érintett laboratóriumok közötti információ-áramlás elősegítése - Hasznos információ-forrás biztosítása egy-egy új szerkezeti variáns betegség-okozó szerepének eldöntéséhez. 23

3. Vizsgált egyének Az általunk vizsgált örökletes angioödémában szenvedő betegek Dr. Farkas Henriette klinikus szakorvos közreműködésével kerültek hozzánk. A betegek gondozása és szakszerű ellátása a Semmelweis Egyetem Kútvölgyi Klinikai Tömbjében az erre szakosodott Angioödéma Központban történik. A dolgozat készítéséig 26 család (23 I. és 3 II. típusú család, 64 beteg) mintáját dolgoztuk fel a genetikai vizsgálatok elvégzésére. A betegek az ország minden területéről származnak, mivel Magyarországon kizárólag ez a központ foglalkozik gondozásukkal. Az angioödéma központban történik a genetikai tanácsadás is. A diagnózis felállítása minden esetben a klinikai tünetek és a komplement laboratóriumi eredmények együttes értékelése alapján, a diagnosztikai kritériumoknak megfelelően történt. A szükséges populációgenetikai vizsgálatokhoz egy korábbi véradó gyűjtésből származó kontroll populációt használtunk, amelyből véletlenszerűen választottunk ki 50 egyént és azokat anonim módon kezelve végeztünk kontroll vizsgálatokat. 24

4. Módszerek 4.1. Komplement vizsgálatok A C1 inhibitor deficienciával kapcsolatos fehérjevizsgálatok a Semmelweis Egyetem Kútvölgyi Klinikai Tömbjében a Komplement Laboratóriumban történtek. Az általuk használt módszerek rövid áttekintése: - A C3, a C4 és a C1 inhibitor koncentráció mérése egy immunkémiai módszerrel, radiális immundiffúzióval történik. Ez egy antigén- (a vizsgált komplement fehérjék) antitest (agaróz gélre felvitt) kötődési reakció, ahol a sugárirányú diffúzió révén kialakult precipitációs gyűrű átmérője a bemért minta antigén tartalmától függ. Ebből az átmérőből aztán standardok segítségével számítható ki a vizsgált fehérje koncentrációja. - A komplementrendszer aktiválhatóságának vizsgálata során a mintánkhoz ún. aktiváló ágensként birkavörösvérsejtet adnak, amelyet az aktivált komplementrendszer enzimatikus kaszkádja hemolizál. A felszabaduló hemoglobin mennyisége arányos a minta aktiválható összkomplement mennyiségével. - C1 inhibitor aktivitás mérésére két módszer áll rendelkezésre: - Enzimgátlásos módszer (DADE Behring kit): a felhasznált kit tartalmaz C1 észteráz enzimet, és annak egy mesterséges szubsztrátját. Ha a vizsgált minta alacsony aktivitású, vagy kevés aktív C1 inhibitort tartalmaz, nem gátolja a C1 észteráz működését, így az általa hasított szubsztrát mennyisége (spektrofotometriásan mérve) fordítottan arányos lesz az inhibitor aktivitással. - Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) módszer (Quiedel C1 inhibitor ELISA kittel) Ha a fenti diagnosztikai módszerek segítségével igazolható a betegség fennállása, a továbbiakban indokolt az örökletes angioödéma hátterében álló genetikai eltérések feltérképezésére. 4.2. Mintagyűjtés A betegektől genetikai vizsgálatra EDTA-val alvadásgátolt, 10 ml perifériás vért kapunk, melyet fagyasztva szállítanak intézetünkbe. Amennyiben erre lehetőség nyílik, egy családon belül akár az összes beteg családtagtól kérünk vért. A családi 25

halmozottságot mutató esetekben a klinikus partnertől részletes családfa információkat is kapunk. Beteg családonként egy személyt vizsgáltunk, és a kapott eredmények függvényében vizsgáltuk tovább a hozzátartozókat. 4.3. DNS kivonás A vizsgálatainkhoz szükséges DNS kivonása a perifériás vérben található fehérvérsejtekből történik. A megfelelő mennyiségű és minőségű DNS-t egy gyári kit segítségével, a Gentra cég által gyártott Puregene DNA Isolation Kit-tel vonjuk ki a gyári protokollban leírtak alapján. A kit első lépésben feloldja a vörösvértesteket. A felszabadult hemoglobint többszöri desztillált vizes mosással távolítjuk el. Ezután a fehérvérsejteket feloldása következik, illetve ha szükséges proteináz-k enzimes emésztéssel segíthető a sejt feltárás. A lizátumból a fehérjét a következő lépésben tömény sóoldatos kicsapással távolítjuk el. A megmaradt, nagyrészt DNS-t tartalmazó oldatból, nyagyobb tisztaságot elérendő propil-alkoholos kicsapást, majd 70%-os etanolos mosást alkalmaz a módszer. A tisztított DNS oldatot Tris-EDTA (TE) oldatban oldottuk be, és hosszútávon -20ºC-on tároltuk. A Southern-blot analízishez szükséges nagyobb mennyiségű DNS előállításához a vegyszer és a vér mennyiségét 3-4-szeresére növeljük. Az elkészült DNS oldat koncentrációját és tisztaságát fotometriás méréssel ellenőrizzük. 4.4. Southern-blot analízis A nagymennyiségű genomiális DNS-t tartalmazó oldatot BclI restrikciós endonukleázzal emésztettük. A keletkezett fragmentumokat Souther-blot technikához speciálisan kifejlesztett agarózból készült gélben (SeakemLE 0,75%-os) méret szerint szeparáltuk. Az elektroforézist követően a DNS-t NaOH-dal denaturáltuk, majd kapilláris transzfer útján nylon membránra vittük át (blottolás). A fixálás után radioaktívan jelölt szondával (A C1-INH gén cdns-ét használva) hibridizáltunk, mely specifikusan csak C1-INH gént kódoló a DNS szakaszhoz kötődik. A cdns szondát bakteriális plazmidba klónozva Mario Tosi franciaországi laboratóriumából kaptuk. A C1-INH gént kívülről határolja két BclI-enzim hasítási hely, míg a génen belül ez az enzim nem hasít. 105 A genomiális DNS-t tehát ezzel az enzimmel emésztve, a 26

keletkezett fragmentumok között a gén (akár normál, akár mutáns) teljes hosszában jelen lesz. Normál esetben ez egy 20 kilobázis hosszúságú DNS szakasz. A hibridizációt követően autoradiográfiával tettük láthatóvá a Southern-blot eredményét. Amennyiben a betegnél az egyik allélon legalább 1 kilobázis nagyságot meghaladó deléció vagy inszerció van, az előhívott filmen megjelenik egy újabb csík (extra fragmens), ami jelzi a mutáns, deléciót vagy inszerciót tartalmazó allél jelenlétét. A 7. ábrán a normál mintázat mellett három általunk talált különböző típusú deléciós mutáns Southern-blot képe látható. 7. ábra. a: A Southern blot analízishez használt BclI enzim emésztési helyei (vastag vonal: a gén teljes szakasza, téglalapok: exonok); b: Southern blot analízis autoradiogramja (1: normál mintázat, 2-4: deléciós mutánsok). A 2. számú mintában körülbelül 9 kilobázisos, míg a 3-4 mintában 2-4 kilobázisos deléció látható. 4.5. Géndózis analízis A Southern-blot technológiával észlelt kisebb kiterjedésű eltérések (3-4 kilobázis) esetében fontos kérdés volt annak bizonyítása, hogy ezek a deléciók érintik-e valamelyik exont (a génben vannak 3-4 kilobázisnál nagyobb intronok), hiszen ebben az esetben tekinthetjük valóban betegség-okozónak a felfedezett mutációt. Mivel autoszomális domináns betegségről van szó, így egy normál gén kópia minden egyénben jelen van, a feladat tehát a betegek esetében az, hogy megkeressük azt az exont vagy exonokat, amelynek mennyisége fele a többi exonhoz képest. A kérdés megválaszolására valós idejű PCR és relatív mennyiségi elemzési technikát alkalmaztunk. Ennek során exon-specifikus PCR-reakciókat végeztünk a 3-8. exonokat amplifikáló primerekkel egy kettős szálú DNS-re specifikus fluoreszcens SybrGreen elnevezésű fluoreszcens festék jelenlétében. Minden esetben egy normál és egy deléció szempontjából pozitív mintát hasonlítottunk össze. A valós idejú PCR-készülékben (LightCycler, Roche) végrehajtott mérés során a készülék minden ciklusban rögzíti az 27

aktuális fluoreszcencia értéket, ami egyenesen arányos az abban az időpillanatban jelenlevő kettős szálú PCR-termék mennyiségével. A készülék által számított, legnagyobb fluoreszcencia-növekedési sebességet mutató ciklusszám, a crossing point (Cp) érték pedig információt ad a kiindulási templát mennyiségére vonatkozóan. A rendszert sikerült úgy optimalizálni, hogy a vizsgálni kívánt kétszeres mennyiségi különbséget is reprodukálhatóan kimutassa. A valós idejű PCR technológián alapoló géndózis mérést a Southern-blot kiegészítéseként használtuk, a jövőben azonban akár kiválthatja a munka- és időigényes tradícionális módszert. 4.6. Primer tervezés A C1-INH gén vizsgálatára saját PCR primereket terveztünk. Korábbi elképzeléseink szerint mi is alkalmaztunk volna mutáció szűrő módszert (single strand conformational polymorphism, SSCP), azonban a nehézkes beállítás, alacsony találati arány, és a direkt szekvenálás optimalizálása után a módszert elvetettük. Az SSCP technológiához tervezett primereknél célunk volt, hogy a teljes kódoló régiót lefedjük olyan oligonukleotidokkal, amelyek maximum 200 bázispáros PCR terméket amplifikálnak, mivel így nagyobb találati arányra számíthattunk volna. A PCR primerek tervezésekor fontos szempont volt, hogy minden oligonukleotid hasonló tulajdonságokkal (a keletkező PCR termék mérete, Tm) rendelkezzen, így nem csak a saját párjával képes amplifikálásra, hanem a különböző primerek egymással könnyebben kombinálhatók. Ennek köszönhetően az eredetileg SSCP-hez tervezett primereket fel tudtuk használni a direkt szekvenáláshoz, a géndózis méréshez és a szükséges populációs vizsgálatokhoz is. A PCR primereket a bárki számára szabadon hozzáférhető Primer3 programmal terveztük (http://www-genome.wi.mit.edu/cgibin/primer/primer3_www.cgi). 97 A felhasznált primerek tulajdonságait és az általuk lefedett szakaszokat a 2. táblázat és a 8. ábra foglalja össze. 28