Gyógyszerhatóanyagok azonosítása és kioldódási vizsgálata tablettából ELTE TTK Szerves Kémiai Tanszék 2015 1
I. Elméleti bevezető 1.1. Gyógyszerkönyv A Magyar gyógyszerkönyv (Pharmacopoea Hungarica) első kiadása 1871-ben jelent meg, amely még a gyógyszertári gyógyszerkészítést és ellenőrzést szabályozta; azóta számos bővítésen esett át. 2006- ban fogadták el a VIII. Magyar gyógyszerkönyvet ez ma is érvényes amely a gyógyszerkészítés, a gyógyszerminőség, a gyógyszerellenőrzés és a gyógyszerminősítés általános szakmai szabályait, valamint az egyes gyógyszerek minőségét és összetételét tartalmazó hivatalos kiadvány. E kiadványban 1 egy adott gyógyszerhatóanyag definíciója (elnevezés), sajátosságai (küllem, oldhatóság) találhatóak meg. Részletesen megadja az azonosítására vonatkozó követelményeket (pl. olvadáspont, UV és IR mérési paraméterek, kimutatási reakciók); az elválasztást a rokon vegyületektől; a megengedett szennyezők mértékét (pl. nehézfémek, szintézis során keletkező melléktermékek); a tartalmi meghatározást valamint az eltarthatóságot. Az 1964. évtől létezik az Európai gyógyszerkönyv (European Pharmacopoeia), amelyben egységesítették az egyes gyógyszerkönyveket; hetedik kiadása 2010-ben jelent meg. Célja a közös minőségi előírás a több forrásból származó, és néha eltérő célra szánt gyógyszeranyagokra, készítményekre. A hivatalos szöveg angolul és franciául jelenik meg, amelyet az Európai Gyógyszerkönyvi Bizottság felügyel és szerkeszt. Ennek a bizottságnak Magyarország 1999-től teljes jogú tagja. 1.2. Hatóanyagok: koffein és paracetamol Hatóanyagnak nevezzük a gyógyszerkészítmény minden olyan kémiailag jól definiált összetevőjét, amelyet valamely betegség diagnózisában, kezelésében vagy megelőzésében farmakológiai hatás kifejtésére, vagy az emberi, ill. állati szervezet felépítésének vagy működésének farmakológiai úton történő befolyásolására szánunk. A laborgyakorlaton az alábbi két, jól ismert hatóanyaggal foglalkozunk (1. ábra). 1. ábra 1 http://lib.njutcm.edu.cn/yaodian/ep/ep501e/16_monographs/18_monographs_l-p/paracetamol/0049e.pdf 2
A koffein (1,3,7-trimetil-3,7-dihidro-1H-purin-2,6-dion) a xantin-származékok közül a tea, a kávé és a kóladió alkaloidja (M W = 194,2 g/mol). Keserű ízű, fehér kristályos anyag. Vízben mérsékelten, forrásban lévő vízben jól oldódik. Szublimálásra hajlamos. A gyógyászatban alkoholmérgezés és kimerültség kezelésére, élénkítő szerként, valamint fájdalomcsillapító és megfázás elleni gyógyszerek gyártásához alkalmazzák. A koffein erősen izgatja a központi idegrendszert, ezáltal fokozza az izomműködést és a teljesítőképességet, serkenti a gondolattársítást, ítéletalkotást és megfigyelőképességet. Gátolja a fáradtságérzetet és elősegíti a simaizmok relaxációját. Mellékhatásként émelygés, heves szívdobogás, érzékenyeknél ritmuszavar, hasmenés, fokozott vizelési inger jelentkezhet, továbbá fokozza az emésztőrendszerben a sósav és az emésztőnedvek termelődését. Kimutatására a xantin-származékokra jellemző murexid reakciót használják. A paracetamol (N-(4-hidroxifenil(acetamid)) fehér, kristályos anyag (M W = 151,2 g/mol). Vízben mérsékelten, alkoholban kiválóan oldódik. Számos megfázás, influenza, fejfájás, ízületi- és izomfájdalom elleni szer alkotórésze. Elsősorban a központi idegrendszeri ciklooxigenáz-gátló hatása következtében csökkenti a lázat, fejfájást, illetve csillapítja a megfázás során kialakuló izom és végtagfájdalmat és a torokfájást. Sok nem szteroid gyulladáscsökkentővel szemben a paracetamol nem okoz gyomorfekélyt, valamint nincs hatása a vérlemezke-aggregációra és a vérzési időre sem. Kimutatására általában az indanilin-reakciót használják, azaz sósavval hevítik majd kálium-dikromát oldattal kezelve ibolyaszínű reakciót ad. E reakció nem alkalmazható pl. acetilszalicilsav jelenlétében szintén rendelkezik hidroxil-csoporttal ilyenkor Fe 3+ -ionokkal történő komplexképzést alkalmaznak. 1.3. UV mérések Az UV-Vis spektroszkópia a molekulák UV (200-400 nm) vagy látható fénnyel (400-800 nm) történő besugárzásával adott molekulapályákat gerjeszt, amelyek közötti elektronátmeneteket vizsgáljuk. A szerves molekulákra a *, az n *, * és n * elektronátmenetek a jellemzőek. A * a legnagyobb energiájú és a távoli UV tartományba esik, amely telített szénhidrogénekre jellemző. Az n * a telített, heteroatomot tartalmazó vegyületekre jellemző, amikor egy magános elektronpár egyik elektronja gerjesztődik lazító pályára. A szerkezetkutatásban az utolsó két említett * és n * átmenet játszik fontos szerepet. Előbbi a telítetlen vegyületekre jellemző, konjugált kötések esetén 250 nm fölé vagy akár a látható tartományba is tolódhat. Az n * átmenet a legnagyobb hullámhosszú átmenet, amely a telítetlen kötésben résztvevő vagy azzal konjugáló heteroatom jelenlétében valósulhat meg (C=O, NO 2 ), azonban ez a sáv kis intenzitású. 3
Az abszorpciós sáv megjelenéséért az ún. kromofor csoport a felelős, amely a molekulán belül egy rendszerint többszörös kötéssel rendelkező, akár konjugációban lévő csoport (C=C, C=O, aromás gyűrű). Ha a molekulában a kromoforhoz kapcsolódik egy olyan atom vagy telített atomcsoport, amelynek a közeli UV-ban van önálló abszorpciós sávja (OH, NH 2, OMe), akkor az növeli az abszorpciós sávok hullámhosszát és intenzitását (auxokróm hatás). Ez ún. batokróm eltolódást idéz elő, ami az abszorpciós sávok hullámhosszának növekedése (red shift). Létezik még hipszokróm eltolódás, ami ennek ellentéte, a hullámhossz csökkenése (blue shift). Az abszorpciós sávok intenzitásának növekedése a hiperkróm, míg csökkenése a hipokróm effektus. Az UV spektroszkópiát lehet kvantitatív meghatározásra is alkalmazni. Ehhez ismerni kell az ún. Lambert-Beer törvényt, amely a mért abszorbancia és az oldat koncentrációja közötti összefüggést írja le: -logt = -log I/I 0 = cd = A ahol a T = I/I 0 az oldat transzmissziója; I 0 a belépő monokromatikus fény intenzitása, míg I a kilépő fény intenzitása; a moláris abszorpciós együttható (dm 3 mol -1 cm -1 ); c az oldat koncentrációja (mol/dm 3 ), d a küvetta rétegvastagásga (cm) és A az oldat abszorbanciája. Egy adott sávot a sáv maximumához tartozó hullámhossz ( max ) és a moláris abszorpciós együttható ( max ) jellemez. A méréseknél figyelembe kell venni a használt oldószerek méréshatárát, azaz jellemző elnyelésüket, pl. víz 190 nm, 96% etanol 205 nm, metanol 205 nm, diklórmetán 235 nm, kloroform 245 nm (1 cm küvettában). A gyakorlaton egy két utas spektrofotométert használunk. A fényforrásból kilépő fényt az optikai rendszer kettéosztja, amely így egyszerre halad át egy referencia és a mérendő oldaton. Így kiküszöbölhetjük az elektronikából és az oldószerből adódó esetleges hibákat. 1.4. Kioldódás vizsgálatok A hatóanyag kioldódási kinetika a szilárd gyógyszerkészítmények fontos sajátsága. Egyes készítmények esetében célszerű minél nagyobb kioldódási sebességet biztosítani. Más esetekben cél a tartós hatást biztosító lassú kioldódás, azaz célszerű a hatóanyag kioldódását késleltetni. 4
2. ábra A bevett tabletták az emésztőrendszerbe jutnak, melynek adott pontján a tabletta a hatóanyag-tartalmát előre meghatározott módon leadja (2. ábra). Normál hatóanyag leadású tabletták esetében a tabletta az emésztőrendszer adott pontján szétesik, és hatóanyag tartalma viszonylag rövid időn belül felszívódik (pl. láz- és fájdalomcsillapítók). Retard tabletták kialakításuknál fogva hatóanyag-tartalmukat időben elhúzódó módon adják le lassabb, folyamatos felszívódást biztosítva. Mindez lehetővé teszi a hosszabb hatást, valamint biztosítja a hatóanyag egyenletesebb vérkoncentrációját, így növelve a hatékonyságot és csökkentve a mellékhatásokat (pl. gyulladás gátlók, béta-blokkolók, C-vitamin). Szabályozott hatóanyag leadású tabletták a hatóanyag-tartalmukat időben előre meghatározott módon adják le (pl. antiepileptikumok). Fontos különbség a retard tablettáktól az, hogy a leadás kinetikája pontosan ismert általában nulladrendű kinetika. Ez azt jelenti, hogy a gyógyszer-felszabadulás a tablettából független a még fel nem szabadult hatóanyag mennyiségétől, valamint adott időegység alatt mindig ugyanakkora mennyiségű hatóanyag szabadul fel. A kioldódás vizsgálatokhoz legtöbb esetben vizes közeget alkalmaznak, melynek összetételét úgy kell megválasztani, hogy az megfeleljen a gyógyszer alkalmazását követő szervezeten belüli körülményeknek. Ezért fontos a kioldófolyadék ph-ja (általában ph 1-8 tartományba esik) és ionerőssége. A gyakorlaton vizsgált hatóanyagok mindegyike gyorsan felszívódik a gyomor-bélrendszerből, így a kioldódásukat 0,1M HCl oldatban ph = 1 (gyomor) vizsgáljuk. 5
II. Gyakorlat leírása 2.1. Hatóanyagok azonosítása és kinyerése különböző gyógyszerkészítményekből 2.1.1. Az egyes komponensek kimutatása Paracetamol: Az elporított tabletta kis részletét (50 mg) kb. 10x hígított vas-(iii)-kloriddal megcseppentve kékesibolya szín keletkezik. Másik részletét porcelán tálkán 25%-os salétromsavval megcseppentve sárga-narancs-barna színátmenet figyelhető meg. Koffein: 5 ml víz, 2 ml hígított (2M) NaOH és 2 ml kloroform elegyével a porkeverékből kis részletet (50 mg) kirázunk. A kloroformos fázist koncentráljuk és 0,5 ml cc. H 2 O 2 és 1,5 ml cc. HCl oldatot adunk hozzá, majd vízfürdőn szárazra pároljuk. A sárgásbarna maradékhoz 1 csepp hígított ammóniaoldatot cseppentünk, melynek hatására ibolyaszínt kapunk. C-vitamin: Az elporított tabletta 50 mg-ját feloldjuk 1 ml vízben, majd szűrjük. A szűrlethez 25 mg NaHCO 3 -ot adunk, majd 10 mg vas(ii)-szulfátot. Ibolyaszínű oldat keletkezik. 2.1.2. Az egyes komponensek kinyerése Paracetamol: Megmérjük a gyógyszerkészítmény tömegét, majd egy dörzsmozsárban elporítjuk. A kapott port 10- szeres mennyiségű vízzel szuszpendáljuk és 1 órát kevertetjük. A kivált fehér anyagot szűrjük (G4 szűrő), és levegőn szárítjuk. Az anyag tisztaságát vékonyréteg kromatográfiával ellenőrizzük. Felvesszük UV spektrumát is. Koffein: Az elporított gyógyszerkészítményt lemérjük, majd 3 ml 2M NaOH oldattal szuszpendáltatjuk. A szuszpenziót kloroformmal extraháljuk. Koncentráljuk. Tömegét meghatározzuk. Az anyag tisztaságát vékonyréteg kromatográfiával ellenőrizzük. Felvesszük UV spektrumát is. Paracetamol és koffein egymás melletti kinyerése: Ha a kapott minta mindkét komponenst tartalmazza a kimutatási próbák alapján, akkor a gyógyszerkészítményt (maradék mennyiségét) 3x mennyiségű 2M NaOH-ban szuszpendáltatjuk, majd 1x térfogatú kloroformmal extraháljuk. A szerves fázist koncentráljuk (koffein kinyerése); a vizes fázist cc. HCl adagolásával savanyítjuk (ph~3-ra) és egy órán át kevertetjük, majd a kivált fehér anyagot leszűrjük (paracetamol kinyerése). Mindkét anyag tömegét lemérjük és tisztaságát VRK-val ellenőrizzük. 6
A kinyert mennyiségek alapján adjuk meg az eredeti tabletta/por hatóanyagtartalmát (mg-ban és %-ban egyaránt)! (A számolásoknál figyelembe kell venni a próbákhoz kivett mennyiségeket és legalább 10%-os veszteséget.) VRK rendszerek: a) Kloroform-96% etanol 9:1 (légtértelítés 25% ammóniával: a futtatókádba 2 db 25 ml-es főzőpohárba 10-10 ml 25% ammónia oldatot helyezünk legalább 30 percre az ammónia gőztér kialakítására) b) DCM-izopropanol-25% ammónia 45:45:10. Előhívás UV, és 5% kénsavas égetés vagy jódgőzös módszerekkel. 2.2. UV mérés A referencia paracetamol és koffein UV spektrumát felvesszük semleges ph-n, metanolos közegben. A paracetamol UV spektrumát 0,1M NaOH és 0,1M HCl oldatban is felvesszük. A spektrumokat a mért max és A max értékekkel jellemezzük, és a mért adatokat röviden magyarázzuk. 2.3. Hatóanyag kioldódás vizsgálata A referencia hatóanyagokból kalibrációs oldatsorozatot készítünk 0,1M HCl oldatban. A legtöményebb oldatok UV spektrumát felvesszük, és leolvassuk az abszorpciós maximumot. A kalibráló oldatok elnyelését a korábban meghatározott abszorpciós maximumokhoz tartozó hullámhosszokon olvassuk le. Csiszolatos Erlenmeyer lombikba (2 párhuzamos) 150 ml HCl oldatot öntünk, majd 30 percig 37 C-on termosztáljuk. Ezután mindkét lombikba 1-1 tablettát teszünk, és lassan kevertetjük (50-100 rpm). 2, 5, 10, 15, 20 és 30 perc elteltével mintát veszünk, és a minták elnyelését mindkét abszorpciós maximumhoz tartozó hullámhosszon megmérjük. A mintákat vékonyréteg kromatográfiával is megvizsgáljuk. A kapott adatokból a Lambert-Beer törvény segítségével kiszámoljuk a kioldódott hatóanyagok mennyiségét, majd a kapott értékeket az idő függvényében ábrázoljuk. (A mintavételek miatti térfogatváltozást figyelembe kell venni.) III. Jegyzőkönyv - rövid leírás az elvégzett kísérletekről (bemérések, tapasztalatok) - a kinyert hatóanyagok mennyisége, jellemzése (spektrum, VRK) - a felvett UV spektrumok különböző ph-n és oldószerben, max, A max magyarázattal - a kioldódott hatóanyagok mennyisége az idő függvényében 7