Sipos Ferenc Új PS oligomerek és P-királis mononukleotidok szintézise és szerkezetvizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés Témavezető: Sági Gyula, C.Sc. MTA Kémiai Kutatóközpont, Bioekuláris Kémiai Intézet ELTE-TTK Kémia Doktori Iskola Vezető: Inzelt György, D.Sc. Szintetikus kémia, anyagtudomány, bioekuláris kémia program Programvezető: orváth István Tamás, D.Sc. 2009
Köszönetnyilvánítás Doktori értekezésemet az MTA Kémiai Kutatóközpont, Bioekuláris Kémiai Intézetben készítettem el. Témavezetőm Dr. Sági Gyula volt. Köszönöm az értékes segítségét, melyet a kémiai munkám során, valamint a publikációs, pályázati dokumentumok elkészítésében nyújtott. Köszönöm továbbá türelmét, amivel munkámat mindvégig támogatta. Köszönöm Dr. Pálinkás Gábornak az MTA Kémiai Kutatóközpont főigazgatójának és Dr. ajós Györgynek a Bioekuláris Kémiai Intézet Igazgatójának, hogy a Magyar Tudományos Akadémia Kémiai Kutatóközpontjában készíthettem el doktori munkámat. A műszeres mérésekért Dr. Gács-Baitz Eszternek, Lejtoviczné Dr. Egyed rsolyának, Dr. Tőke rsolyának, Dr. Szabó Pálnak és Dr. Pollreisz Ferencnek tartozom köszönettel. Köszönöm az alábbi szervezeteknek, hogy anyagi támogatásukkal lehetőséget teremtettek eredményeim bemutatására nemzetközi konferenciákon: Alapítvány a Magyar Peptid és Fehérjekutatásért Richter Gedeon Centenáriumi Alapítvány KFP MediChem2 (1/A/005/04) Center of Excellence (QLK2-CT-2002-90436) Köszönettel tartozom a következő személyeknek a szeretetükért és segítségükért, amellyel körülvettek és a munkám eredményességéhez hozzájárultak: Sendula Róbert, Baraczka Balázsné, Braun Andrásné, Sipos Szabolcs, Jablonkai István, Kőhalmy Krisztina, Szabó Bernadett. Szeretném megköszönni volt általános iskolai, középiskolai és egyetemi tanáraimnak, hogy munkájukkal megalapozták bennem a kémia iránti szeretetet. Köszönöm továbbá szüleimnek és az egész családomnak, hogy végig biztosították a nyugodt hátteret a munka sikeres elvégzéséhez és a disszertáció megírásához. 2
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények Gacs-Baitz, E.; Sipos, F.; Egyed, E.; Sagi G.: Synthesis and structural study of variously oxidized diastereomeric 5 -dimethoxytrityl-thymidine-3 --[-(2-cyanoethyl)-,diisopropyl]-phosphoramidite derivatives. Comparison of the effects of the P=, P=S, and P=Se Functions on the MR spectral and Chromatographic Properties Chirality 2008, 21(7). 663-685. Sipos, F.; Sagi, G.: Synthesis of new, base-modified PA monomers ucleosides, ucleotides and ucleic Acids 2007, 26 (6-7), 681-685. Sipos, F.; Sagi, G.: Synthesis of 5-substituted-uracil PA monomers by Pd-catalyzed cross-couplings Journal of Peptide Science 12: 137-137 Suppl. S 2006 Egyéb közlemények Gunduz,.; Sipos, F.; Spagnolo, B.; Kocsis, L.; Magyar, A.; rosz, G.; Borsodi, A.; Calo, G.; Benyhe, S.: "In vitro binding and functional studies of Ac-RYYRIKol and its derivatives, novel partial agonists of the nociceptin/orphanin F/Q receptor" eurosignals 2006, 15, 91-101. 3
Rövidítések jegyzéke A szövegben leggyakrabban alkalmazott rövidítések az alábbiak voltak: Boc BSA CA DCC DCE DCM DIC DIEA DMAP DME DMF DMS DMT DS EDA EDTA EtAc Bt PLC MBA mrs MS MP MR D Su PCR PS PMB RS terc-butiloxikarbonil,-bisz-trimetilszilil-acetamid cérium(iv) ammónium nitrát, -diciklohexilkarbodiimid diklóretán diklórmetán, -diizopropilkarbodiimid,-diizopropil-etil-amin 4-dimetilamino-piridin dimetoxi-etán,-dimetilformamid dimetilszulfoxid dimetoxi-tritil dezoxiribonukleinsav etilén-diamin etiléndiamin-tetraecetsav etilacetát benzotriazol-1-ol-hidrát nagy hatékonyságú folyadék kromatográfia metilbenzhidrilamin-gyanta messenger RS spektrometria -metil-pirrolidon mágneses magrezonancia spektroszkópia oligodezoxinukleotid -szukcinimidil polimeráz láncreakció peptid-nukleinsav para-metoxi-benzil ribonukleinsav 4
RP TBTU T-CED TEA TEAA TFA TFMSA TMS VRK Z fordított fázis -(Benzotriazol-1-il)-,,','-tetrametilurónium tetrafluoroborát 5 -dimetoxitritil-timidin-3 --[-(2-cianoetil)-,-diisopropil]- foszforamidit trietil-amin trietilammónium acetá trifluorecetsav trifluorometánszulfonsav trimetilszilil vékonyréteg kromatográfia benziloxikarbonil 5
Tartalomjegyzék Köszönetnyilvánítás... 2 Az értekezés alapjául szolgáló közlemények... 3 Rövidítések jegyzéke... 4 Tartalomjegyzék... 6 1. Bevezetés... 10 1.1. DS bázis-módosítások... 10 1.2. A peptid-nukleinsavak... 11 1.3. Keresztkapcsolási reakciók... 14 1.4. Szilárd fázisú peptidszintézis... 15 1.4.1 A Boc és az Fmoc technika... 16 1.4.2. A szilárdfázisú PS szintézis... 17 1.5. A P-királis mononukleotidok szintézise és MR analízise... 18 2. Célkitűzések... 20 3. Eredmények... 22 3.1. Boc-gerinc szintézise... 22 3.2. 5-jód-uracil PS monomer szintézise... 23 3.3. Stille kapcsolások... 25 3.4. A 3-PMB-5-jód-uracil PS monomer szintézise... 28 3.5. Sonogashira kapcsolások... 29 3.6. Suzuki kapcsolások... 31 3.6.1. Suzuki kapcsolások in situ laktám védelem melett... 33 3.7. PS T monomer előállítása... 35 3.8. PS C monomer szintézise... 36 3.9. ligomer szintézis... 37 3.9.1. PS oligomer szintézise... 37 3.9.2. A komplementer DS oligomer szintézise... 38 3.10. Stabilitás vizsgálatok... 40 3.11. P-királis mononukleotidok szintézise... 42 3.11.1. Szintézis... 43 3.11.2. MR vizsgálatok... 45 3.11.3. PLC analízisek... 49 4. Összefoglalás... 51 6
5. Kísérleti rész... 55 5.1. Vékonyréteg-kromatográfia... 55 5.1.1. Előhívó reagensek:... 55 5.1.1.1. Klór-tolidin... 55 5.1.1.2. inhidrin... 55 5.2. PLC vizsgálat... 55 5.3. A gyanta kapacitásának meghatározása... 56 5.3.1. Kvantitatív pikrinsavas teszt... 56 5.3.2. Kaiser (ninhidrin) teszt... 57 5.4. Boc-gerinc szintézis... 58 5.4.1. Boc-etilén-diamin előállítása... 58 5.4.2. -(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter (Boc-gerinc) szintézise... 59 5.5. 5-jód-uracil PS monomer szintézis... 60 5.5.1. (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav terc-butil észter előállítása... 60 5.5.2. (5-jód-uracil-1-il)-ecetsav előállítása... 61 5.5.3. -(5-jód-uracil-1-il)-acetil--(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter (5-jód-uracil PS monomer) szintézise... 61 5.6. Stille-kapcsolások... 63 5.6.1. -[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil--(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise... 63 5.6.2. -[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil--(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter előállítása... 64 5.6.3. -(5-fenil-uracil-1-il)-acetil--(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise 65 5.6.4. -[5-(2-furanil)-uracil-1-il]-acetil--(2-(Boc-aminoetil)-glicin szintézise... 66 5.6.5. -[5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil--(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter előállítása... 67 5.6.6. -[5-(2-fenil)-uracil-1-il]-acetil--(2-(Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise... 68 5.7. 3-PMB-5-jód-uracil PS monomer szintézise... 69 5.7.1. [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav terc-butil észter előállítása... 69 5.7.2. [3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-ecetsav előállítása... 70 5.7.3. -[3-(4-metoxibenzil)-5-jód-uracil-1-il]-acetil--(2-Boc-aminoetil)-glicinetilészter (3-PMB-5-jód-uracil PS monomer) szintézise... 71 5.8. Sonogashira-kapcsolások... 72 7
5.8.1. -[3-(4-metoxibenzil)-5-feniletinil-uracil-1-il]-acetil--(2-Boc-aminoetil)- glicin-etilészter szintézise... 72 5.8.2. -[3-(4-metoxibenzil)- 5-(hex-1-inil)-uracil-1-il]-acetil--(2-Boc-aminoetil)- glicin-etilészter előállítása... 73 5.8.3. -[3-(4-metoxibenzil)- 5-(prop-1-inil)-uracil-1-il]-acetil--(2-Boc-aminoetil)- glicin-etilészter szintézise... 74 5.9. Suzuki-kapcsolások... 75 5.9.1. -[3-(4-metoxibenzil)- 5-(2-tienil)-uracil-1-il]-acetil--(2-Boc-aminoetil)- glicin-etilészter előállítása... 75 5.9.2. -[3-(4-metoxibenzil)- 5-(bifenil-4-il)-uracil-1-il]-acetil--(2-Boc-aminoetil)- glicin-etilészter szintézise... 76 5.9.3. -[3-(4-metoxibenzil)- 5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]-acetil--(2-Bocaminoetil)-glicin-etilészter előállítása... 77 5.9.4. -[3-(4-metoxibenzil)- (5-(4-dimetilamino)fenil)-uracil-1-il]-acetil--(2-Bocaminoetil)-glicin-etilészter szintézise... 78 5.10. In situ szilezés Suzuki kapcsolás során... 79 5.10.1. [5-(2-tienil)-uracil-1-il]-ecetsav terc-butil észter előállítása... 79 5.10.2. [5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]ecetsav t-butil észter... 81 5.10.3. -[5-(2-tienil)-uracil-1-il]acetil--[2-(Boc-amino)etil]-glicin-etilészter előállítása... 82 5.10.4. -[5-(benzo[b]tiofén-2-il)-uracil-1-il]acetil--[2-(Boc-amino)etil]-glicin etilészter... 83 5.11. Timin PS monomer szintézise... 84 5.11.1. timin-1-il-ecetsav... 84 5.11.2. -(timin-1-il)-acetil--(2-(boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise... 85 5.11.3. -(timin-1-il)-acetil--(2-(boc-aminoetil)-glicin (Timin PS monomer) előállítása... 86 5.12. Citozin PS monomer szintézise... 87 5.12.1. Uracil-1-il-ecetsav terc-butil észter előállítása... 87 5.12.2. (2-xo-4-[1,2,4]triazol-1-il-2-pirimidin-1-il)-ecetsav-terc.butil észter... 88 5.12.3. Citozin-1-il-ecetsav-terc.butil észter előállítása... 89 5.12.4. (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav-terc.butil észter szintézise... 90 5.12.5. (4-Z-citozin-1-il)-ecetsav előállítása... 90 5.12.6. -(4-Z-citozin-1-il)-acetil--(2-Boc-aminoetil)-glicin-etilészter szintézise.. 92 8
5.12.7. -(4-Z-citozin-1-il)-acetil--(2-Boc-aminoetil)-glicin előállítása... 93 5.13. ligomer szintézisek... 94 5.13.1. A PS oligomerek szintézise... 94 5.13.2. A komplementer D szintézise... 94 5.14. 5 -dimetoxitritil-timidin-3 --[-(2-cianoetil)-,-diizopropil]-foszforamidit származékok szintézise... 95 5.14.1. A D P -(R P )- és az L P -(S P )-5 -dimetoxitritil-timidin-3 --[-(2-cianoetil)-,diizopropil]-foszforamidit szintézise... 95 5.14.2. A D P -(S P )- és az L P -(R P )-5 -dimetoxitritil-timidin-3 --[-(2-cianoetil)-,diizopropil]-foszforamidát előállítása... 96 5.14.3. A D P -(S P )- és az L P -(R P )-5 --dimetoxitritil-timidin-3 --[-(2-cianoetil)-,-diizopropil]-foszforamidotioát szintézise... 98 5.14.4. A D P -(S P )- és az L P -(R P )-5 --dimetoxitritil-timidin-3 --[-(2-cianoetil)-,-diizopropil]-foszforamidoszelenoát előállítása... 99 6. Irodalomjegyzék... 101 Összefoglalás... 105 Summary... 106 9
1. Bevezetés 1.1. DS bázis-módosítások Minden természetes nukleotid három összetevőből áll: egy heterociklusos bázisból, (pirimidin- vagy purin-bázis); egy cukorból (ribóz vagy 2 -dezoxiribóz) és végül egy foszfátcsoportból. Ebből következik, hogy a DS módosítások lehetséges helyei: a cukorrész, a foszfát-csoport és a bázis, illetve lehetőség van extra részek beépítésére (interkaláció) és a cukor-foszfát gerinc részleges vagy teljes átalakítására (peptidnukleinsav) is. A módosítások célja leggyakrabban az olvadáspont (T m ), a Dáz rezisztencia vagy a sejtpenetráció növelése. 1. T m pont meghatározása A DS elméleti olvadáspontja alatt a hőmérséklet növekedés és a fényelnyelés mértéke által alkotott görbe inflexiós pontját (1. ábra) értjük. Ez a jelenség csak analóg folyamat, de közel sem azonos az olvadással. A T m függ a G és C bázispárok arányától, ugyanis ezeket a bázisokat három hidrogénkötés kapcsolja össze, így a G és C bázispárok százalékos arányának növelésével nő a duplex olvadáspontja. Rövid oligodezoxinukleotid modellvegyületeken végzett korábbi tanulmányok 1 2 szerint az uracil bázis 5-heteroaril ill. alkinil szubsztitúciója T m /módosítás = +0,3 - +2,2 C mértékben növeli a 3 -végen 5 módosított bázist tartalmazó 15-mer D-RS duplexek stabilitását. A pirimidin bázis és a különböző aromás gyűrűk π elektronjainak delokalizációja folytán a nukleozidok UV spektrumaiban λ max = +35 - +58 nm-es 10
vöröseltolódás észlelhető a timidinhez viszonyítva ( λ max = 262 nm), ami ugyancsak a pirimidin és a megfelelő heteroaromás gyűrűk koplanáris orientációjára utal. A stacking ezzel együtt a T m még nagyobb mértékben növelhető, ha a pirimidin bázis 4,5 azaz [d] helyzetben benzoxazin ill. benzotiazin kondenzált gyűrűket tartalmaz. Az így kapott triciklusos fenoxazin ill. fenotiazin módosított bázisok beépítése a DS-be T m /módosítás = +4 - +5 C-kal növeli a megfelelő DS-RS duplexek stabilitását amennyiben a szóban forgó módosított egységek egymás mellett helyezkednek el. 3 1.2. A peptid-nukleinsavak A peptid-nukleinsav (PS) ekula egy szintetikus nukleotid analóg 4,5, melyet a génterápiás eljárásokban és a ekuláris diagnosztikában alkalmaznak. 2. A DS és PS szerkezete A PS ekulában két funkcionális egységet különítünk el: a cukorfoszfát gerincet kiváltó, poli[-(2-aminoetil)glicin] vázat, melyben az építőelemek peptidkötéssel kapcsolódnak egymáshoz, valamint a nukleobázisokat tartalmazó oldalláncokat. A nukleobázisok egy-egy acetilcsoporton keresztül kapcsolódnak a vázhoz. (2. ábra) A peptid-nukleinsavak, annak ellenére, hogy akirális és semleges vázat tartalmaznak, rendelkeznek a natív nukleinsavak bázispárosodási képességével 6. A PS:DS és különösen a PS:RS duplexek jóval stabilabbak, mint a megfelelő DS hasonmások 7. Ezenkívül a PS teljesen rezisztens peptidázokkal és proteázokkal szemben. 3. A PS és a királis PS szerkezete 11
A peptid-nukleinsav akirális tulajdonsága miatt a PS oligomerek egyaránt képezhetnek jobb és bal menetes hélixet 8. A preferált irányultság kialakulását elősegíti az oligomer C terminálisához kötődő királis aminosav (pl L- vagy D-lizin) 9. Királis információ bevitelére egy másik lehetőség az ha a PS monomerben a glicint különböző L- ill. D-aminosavakkal helyettesítjük (3. ábra), amely azonban az aminosav oldalláncok sztérikus gátló hatása miatt duplex destabilizációhoz vezet 10. Ugyanakkor a hidrofób (leucin, valin stb.) és különösen az oldalláncban negatív töltést hordozó (glutaminsav) aminosavaktól eltérően a lizin egységek láncvégi aminocsoportja ionos kötést tud kialakítani a komplementer DS vagy RS foszfátcsoportjaival ezáltal optimális esetben duplex stabilizáló hatást fejt ki 11. Az említett két ellentétes hatás eredője kismértékben ugyan de pozitív és többek között függ a két lánc orientációjától is. árom szeparált D- lizin tartalmú PS egység beépítése a megfelelő antiparallel PS-DS duplexet, míg az ugyanilyen L-lizines egységek beépítése a parallel duplexet stabilizálja ~ T m /módosítás = +1 C mértékben. Ugyanakkor, ha ugyanez a 3 D-lizin-PS egység a szekvencia közepén egy blokkban 12 helyezkedik el akkor ez 7 C-os T m csökkenést eredményez ( T m /módosítás = -2.3 C) a megfelelő akirális (glicin-ps egységeket tartalmazó) PS- DS duplex T m -jéhez viszonyítva 13. Másfelől viszont rendkívül figyelemreméltó az említett királis blokk mismatch felismerő tulajdonsága. Amennyiben a target DS-ben a téves bázis (mismatch) a királis blokk középső D-lizin-PS-t egységével szemben helyezkedik el akkor ez teljesen destabilizálja a duplexet, míg ha a mismatch a királis blokk valamelyik szélső egységével szemben áll ez is jelentős ( T m = -12-(-22) C) T m csökkenéshez vezet 13. Mivel a PS-DS de különösen a PS-RS duplexek stabilitása nagyobb, mint a megfelelő DS hasonmásoké így a DS-ben már kipróbált valamint a még ismeretlen hatású 5-heteroaril ill. alkinil szubsztituensek beépítése homogén PS-be várhatólag hasonló vagy még nagyobb mértékű T m növekedést eredményezhet. A PS-t terápiás felhasználásra a duplexképző tulajdonságai teszik különösen alkalmassá. Antigénként és antiszenszként is egyaránt felhasználható. Az előbbi esetén a különböző kórokozók homopurin DS szakaszaival komplementer PS-ek a stabil inváziós triplex képzés alapján gátolják a transzkripciót. Erre a célra PS-peptid ill. más, a sejtmagba történő bejutást megkönnyítő, konjugátumokat kell alkalmazni. Utóbbi során a kórokozók megfelelően kiválasztott, hozzáférhető szakaszait célzó PS-ek gátolják a 12
transzlációt. A jobb sejtpenetráció biztosítása céljából itt is különböző kimérákat ill. konjugátumokat célszerű alkalmazni. A diagnosztikai alkalmazások közül legjelentősebbek a PS fluoreszcens in situ hibridizációs (FIS) próbák, a polimeráz láncreakció (PCR) blokkolása PS-el és PS mikrochipek. A FIS során a fluoreszcens festékkel jelzett nukleinsav elegyből a keresett DS vagy RS ismert szekvenciájú szakasza nagy affinitással és szelektivitással kötődik a vele komplementer, immobilizált PS-hez. A nem kötődő nukleinsavak lemosása után a fluoreszcencia intenzitás mérése alapján meghatározható a megkötött target nukleinsav mennyisége. Főbb alkalmazások: rák-diagnosztika a telomer próbák alapján, baktériumok kimutatása a rájuk jellemző riboszomális RS hibridizációja alapján, kromoszóma hibák kimutatása. Mivel az alapvető szerkezeti különbségek miatt a PS nem használható PCR primerként így alkalmas arra, hogy egy primer kötőhelyre célzott PS egy vad típusú vagy mutáns gén nem kívánt amplifikációját megakadályozza. Ez a módszer lehetővé teszi a viszonylag kis mennyiségben előforduló génmutációk kimutatását is. A PS mikrochipek szilárd hordozóhoz kötött PS oligomerek, amelyek a nagyon erős és szelektív hibridizáció alapján megkötik a velük komplementer, többnyire fluoreszcens jelzett DS vagy RS szekvenciákat, ami a DS és RS szekvenálását is lehetővé teszi. 13
1.3. Keresztkapcsolási reakciók A σ-kötésű átmenetifém-organikus vegyületek legelterjedtebb alkalmazásai az új szén-szén kötés kialakításával járó keresztkapcsolási reakciókban való részvételükre épülnek. A reakciót általában palládium(0) vagy nikkel(0) katalizálja. A folyamat lépéseit a 4. ábra mutatja be. R-R' reduktiv elimináció ML n RX oxidativ addició RML n R' izomerizáció RMR' L n RMX L n M'X R'M' transzmetallálás ML n : Pd(0), Pd(II), i(0) X : I, Br, Cl, M' : B() 2, SnR 3, Cu, ZnX, MgX 4. A keresztkapcsolási reakciók általános mechanizmusa Az első lépés egy szerves halogén tartalmú vegyület oxidatív addíciója az alacsony oxidációs állapotú átmenetifémre, azaz az átmeneti fém beékelődik egy szén-heteroatom kötésbe. Az átmeneti fémek közül a palládium és a nikkel emelkedik ki, illetve a telítetlen szerves halogenidek az elsődleges reagensek. Alkilhalogenidek alkalmazását befolyásolja, hogy a képződő alkil-átmenetifém-halogenid könnyen elbomlik β-eliminációval. A szerves halogenidek reaktivitása I>Br>>Cl sorrendben változik. Gyakorlati szempontból az olcsó és stabil klórvegyületek alkalmazása lenne a leginkább megfelelő, azonban az oxidatív addiciós készségük olyan csekély, hogy csak ritkán alkalmazhatóak. A keresztkapcsolási reakció második lépése a transzmetallálás, amely során a kapcsolni kívánt másik szerves ekularészlet kerül az átmenetifémre. Ennek az egyensúlyi folyamatnak a hajtóereje általában az újonnan kialakuló fém-halogén kötés termodinamikai stabilitása. A szerves részlethez kapcsolódó átmenetifém elektronokban gazdagabbá válik a folyamat során. Általában ez a lépés a ciklusban a sebességmeghatározó. 14
A következő lépésben az átmenetifém körüli átrendeződés történik meg, azaz a transz elhelyezkedésű csoportok egy gyors izomerizációs lépés eredményeképp cisz-helyzetbe kerülnek. A záró reduktív eliminációs lépés eredményeképp leszakad a kapcsolt termék és a katalitikus ciklus bezárul az alacsonyabb oxidációs állapotú átmenetifém újraképződésével. Az alkalmazott átmenetifém általában komplex formában jelenlévő nikkel(0) vagy palládium(0), ligandumként leggyakrabban a trifenilfoszfin származékok jöhetnek szóba. A kapcsoló partner, amely a transzmetallálással kerül az átmeneti fémre valamilyen fémorganikus reagens. A palládium által katalizált keresztkapcsolási reakciók előnye, hogy olyan kevéssé poláris elemorganikus vegyületek is kiválóan használhatóak (boronsavak, ón-, réz, és szilícium reagensek) melyek számos funkciós csoport jelenlétét tolerálják a ekulában. A keresztkapcsolási reakciókat az alkalmazott fémorganikus reagensek típusától függően különböző néven szokás említeni. A boronsavakat alkalmazó palládium katalizálta reakciókat Suzuki kapcsolásnak, az ón-reagenseket használót Stille kapcsolásnak nevezzük. A egishi-reakcióban cinkorganikus vegyületet, a Karaschreakcióban Grinard reagenst, míg a Sonogashira kapcsolásokban rézorganikus reakció partnert alkalmaznak. 1.4. Szilárd fázisú peptidszintézis A szilárd fázisú szintéziseket gyakran alkalmazzák nagyobb ekulák előállítása során. A különböző oligomerek (peptid, DS, PS) szintézise ezen a módon sokkal egyszerűbb és hatékonyabb, mint folyadékfázisban. Ezt a módszert Merrifield 1963-ban publikálta, segítségével egy tetrapeptidet állított elő 14 15. Később néhány apróbb technikai fejlesztés után a peptidkémikusok rutinszerűen alkalmazták az eljárást 16. 15
5. A szilárdfázisú peptidszintézis A módszer elve igen egyszerű: az első aminosavat a szilárd hordozóhoz kötjük, és ezt építjük tovább ciklusosan, olyan módon, hogy a peptidlánc és a gyanta közötti kovalens kötés stabil maradjon (5. ábra). A reagensek nagy feleslegben alkalmazhatóak, a felesleget többszöri mosással és szűréssel könnyen eltávolíthatjuk. Ezáltal az egyes reakciólépések kitermelése közel 100 % és így jó minőségű nyerstermék állítható elő. A kapcsolások sikerét kvalitatív és kvantitatív módon is vizsgálhatjuk 17. A szintézis végén a kész terméket lehasítjuk a gyantáról és PLC-vel tisztíthatjuk. Az ismétlődő lépések miatt a módszer automatizálható. 1.4.1 A Boc és az Fmoc technika A peptidek felépítésében az aminosavak -amino- és -karboxilcsoportjai vesznek részt. A peptidlánc a C terminálistól az terminális felé haladva épül fel a szilárd fázisú szintézis során. Ebből adódik, hogy a beépülő aminosavban a karboxilcsoport mindig szabad, és az aminocsoportot ideiglenes védelemmel látják el, mely a kapcsolás után minden ciklusban könnyen lehasítható. A standard Merrifield módszer a -tercbutiloxikarbonil (Boc) amino-védőcsoportot használja, mely szerves (pl. TFA) és szervetlen (pl. Cl) savakra hasad 18. Atherton és Sheppard dolgozta ki a -9- fluorenilmetiloxikarbonil (Fmoc) védőcsoporton alapuló technikát 19. Az aminocsoport védelmére szolgáló Fmoc csoport szerves, szekunder aminokkal hasítható. 16
1.4.2. A szilárdfázisú PS szintézis A peptidnukleinsav oligomerek szintézise is megvalósítható szilárd fázison, a peptid szintézis protokolljának kisebb változtatásával. A Boc- 20 és az Fmoc- 21 technika egyaránt alkalmazható. A szilárdfázisú szintézis során alkalmazott pirimidin bázisokat tartalmazó védett PS monomerek szerkezetét a 6. és a 7. ábra szemlélteti. 6. Boc-timin és a Boc/Z-citozin PS momomer 7. Fmoc-védett timin és citozin PS monomer Az Fmoc-stratégia előnye, hogy az egyes kapcsolások hozama spektrofotometriásan mérhető. agy hátránya viszont az 3 6 acilvándorlás és az -terminális egység eliminációjával járó két mellékreakció (8. ábra). A Boc/Z módszer előnye, hogy a védőcsoport eltávolítása után az terminális protonált formában nem képes nukleofil támadásra, így nincsenek mellékreakciók. A hasítás során alkalmazott TFA gátolja a növekvõ láncok interekuláris aggregációját is. A szilárd fázisú szintézis manuális úton is biztonsággal végezhető. 17
8. Mellékreakciók az Fmoc-csoport hasítása során 1.5. A P-királis mononukleotidok szintézise és MR analízise Lankhorst és mtsai. természetes dinukleotidok MR adatainak analízise során többek között megállapították, hogy a C3-3 kötés körüli konformációs egyensúly jól jellemezhető a 3 J (P, C4 ) és a 3 J (P, C2 ) vicinális csatolási állandókkal 22. Ebből kiindulva az MTA Kémiai Kutatóközpont MR és ukleotidkémiai Kutatócsoportjai közötti együttműködés eredményeként számos új P-sztereokémiailag egységes P-királis mono- és dinukleotid szintézisére és hasonló MR vizsgálatára került sor 23 24 25 26 27 28 29 30 31. Ennek során kiderült, hogy a P-izomerek esetében az említett csatolási állandók különbsége nevezetesen a J = 3 J (P, C4 ) 3 J (P, C2 ) érték egyértelműen korrelál a transz vagy a gauche konformerek dominanciájával az adott konformációs egyensúlyi elegyben. A pozitív J értékek az ε t (transz) míg a negatív értékek az ε - (gauche - ) konformer túlsúlyát jelzik. Ezenfelül a P-diasztereomerek J értékei minden vizsgált esetben jellemzőek voltak az abszolút P-konfigurációra is, amelyet E mérések is alátámasztottak. Az előállított vegyületek MR paramétereinek elemzéséből több fontos következtetés vonható le így pl.: 1, Az -glikozidos kötés körüli konformációra vonatkozólag megállapítható, hogy a torziós szögek valamint a 1 és a 6 protonok nagyon hasonló kémiai eltolódásai minden izomer pár esetében a nukleobázisnak a cukorhoz viszonyított anti konformációját igazolják. 2, A C3-3 kötés körüli konformációs egyensúlyt, ezáltal a J értékeket több funkciós csoport is befolyásolja, így pl. az 5 -DMT védőcsoport 27 valamint a foszfátrészen lévő ugyancsak nagy térkitöltésű izopropil vagy terc-butil csoportok 29 jelenléte növeli a P-diasztereomerek J értékei közötti különbséget. 3, Az 5 -DMT védett nukleozidok esetében a hőmérséklet 18
növelésével nő az ε t (transz) konformer aránya az egyensúlyi elegyben 28 29. 4, Ugyanez tapasztalható akkor is, ha a spektrumokat CDCl 3 helyett C 6 6 -ban vesszük fel. Ez utóbbi jelenség az aromás gyűrű és a nukleobázisok között valószínűleg létrejövő stacking kölcsönhatással magyarázható, amely ezek szerint ugyancsak hatással van a konformációs egyensúlyra 25 28 29 30. 19
2. Célkitűzések Az MTA Kémiai Kutatóközpont ukleotidkémiai Laboratóriumában folyó szintetikus kémiai kutatásokba 2003-ban kapcsolódtam be. Doktori kutatásaim során új, 5- szubsztituált uracil bázisokat tartalmazó, PS monomerek szintézisét tűztem ki célul (9. ábra). Az alkinil és aril analógok szintézisét palládium katalizálta keresztkapcsolási reakciókkal kívántam megvalósítani. 9. Tervezett PS monomerek A bevezetésben idézett irodalmi adatok alapján nagyrészt olyan 5-aril ill. 5-alkinil szubsztituensek beépítését terveztem, amelyek eddig még DS módosításként sem fordultak elő. Ugyanakkor néhány már ismert, DS-ben kipróbált, és eltérő T m növelő hatással rendelkező analóg (5-(1-propinil)-, 5-(2-tienil)-uracil) beépítése is indokolt a korábbi DS próbákkal történő összehasonlítás miatt annak kiderítése céljából, hogy ezek a PS-ben is hasonló mértékű vagy esetleg eltérő T m /módosítás értékeket adnak-e. A propinil és feniletinil szubsztitúciók hatásának összehasonlítása ugyancsak informatív lehet a hármas kötésen keresztül kapcsolódó aromás gyűrű konjugációját és esetleges extra stabilizáló hatását illetően. Az említett módosított PS monomereket a PS szintézisre optimalizált Boc protokoll alkalmazásával a -t c c c t t t c t t t-d-lys- 2 11-mer modell szekvenciába terveztem 20
beépíteni az aláhúzott 3 középső t egység helyére. A komplementer DS szál szintézisét követően vizsgálni kívántam a PS:DS duplexek stabilitását. A PS oligomer szintéziséhez szükséges timin és citozin monomerek előállításának irodalomból ismert körülményeit is optimalizálni kívántam. Munkám során P-királis mononukleotidok szintézisébe is bekapcsolódtam. A bevezetésben említett korábbi munkák folytatásaként és kiterjesztéseként az MR vizsgálatok célja az volt, hogy megvizsgáljuk különböző, a P-atomhoz kettős kötéssel kapcsolódó heteroatomok (, S, és Se) (10. ábra) hatását a konformációs egyensúlyra. Mivel az említett heteroatomok mérete és elektronegativitása jelentős mértékben különbözik, ez várhatólag befolyásolja az egyes izomerek J értékei közötti különbséget is. Az említett MR paraméterek tanulmányozásán kívül a P-izomerek kromatográfiás (normál és reverz fázisú PLC) tulajdonságait is vizsgáltam az abszolút P-konfiguráció és a t R értékek közötti esetleges korreláció megállapítása céljából. 10. Tervezett oxidált timidin foszforamidit (T-CED) származékok 21
3. Eredmények 3.1. Boc-gerinc szintézise A peptidnukleinsav monomerek két szerkezeti egységből épülnek fel: az -(2- aminoetil)-glicin gerincből és a hozzá karboxi-metilén linkeren keresztül kapcsolódó bázisból. A védett PS monomer retroszintetikus analízissel így két kisebb részre bontható (11. ábra). Az etil -(2-(terc-butoxikarbonilamino)etil glicinát (Boc-gerinc) és az alkilezett bázis a peptidkémiában közismert módon kapcsolható. 11. Timin PS monomer retroszintetikus analízise A Boc-gerinc első szintézisét Dueholm és munkatársai írták le 1993-ban 32. A 3-amino- 1,2-propándiol aminocsoportját Boc-védőcsoporttal látták el, és oxidáció során Bocaminoacetaldehidet állítottak elő, melyet glicin-észterrel reduktív aminálásnak vetettek alá és végül katalitikus hidrogénezéssel jutottak a védett gerinchez 46 %-os bruttó termeléssel. udson kutatócsoportja Boc-etilén-diaminból (Boc-EDA) etil-glioxilát hidráttal állította elő a megfelelő imint, az utolsó lépés ebben az esetben is katalitikus hidrogénezés volt 33. Az irodalomban ismert az aminoacetonitrilből kiinduló háromlépéses szintézis út is 34. Ezek az eljárások alacsony termeléssel eredményezik a Boc-gerincet és olyan módszereket is alkalmaznak, melyek nem minden laboratóriumban hozzáférhetőek (pl. katalitikus hidrogénezés). 12. Boc-gerinc szintézise 22
A Boc-gerinc szintézisére új módszert dolgoztam ki (12. ábra) amely során első lépésben az etilén-diamint (EDA) (1) di-t-butil-dikarbonáttal reagáltattam diklórmetánban, az EDA felesleget vizes extrakcióval eltávolítottam, majd a Boc-etilén-diamint (Boc-EDA) (2) izolálás nélkül bróm-ecetsav-etilészterrel alkileztem trietilamin jelenlétében. Ilyen körülmények között a védett Boc-gerincet (3) elfogadható termeléssel (60 %) állítottam elő, azonban a melléktermékek (di-boc-eda és dialkil származék) jelenléte megnehezítette a tisztítást és rontotta a reakció hozamát. A tiszta Boc-gerinc csak oszlopkromatográfia alkalmazásával nyerhető ki. Ezt az eljárást módosítottam az oldószer megváltoztatásával és a Boc-etilén-diamin izolálásával 35 20 36. Az első lépést dioxánban végeztem, és nagy felesleg etilén-diamint használtam. Ezáltal főleg Boc-EDA keletkezik. A dioxán bepárlása után a maradékot vízben oldottam és ekkor a minimálisan keletkező di- Boc-etilén-diamin csapadékként, szűréssel eltávolítható. Diklórmetánnal extrahálva a termék a szerves fázisba vihető, míg az etilén-diamin feleslege a vizes fázisban marad. A nyersterméket végül vákuumdesztilláltam. A tiszta Boc-EDA-t vízmentes DMF-ben alkileztem bróm-ecetsav-etilészterrel trietilamin jelenlétében. A dialkil származék képződését az által szorítottam vissza, hogy a bróm-ecetsav-etilésztert minimális feleslegben és lassan adagoltam a reakcióelegyhez. Az oldószer eltávolítása után a maradékot DCM-ben oldottam, majd az elegy vizes mosását és szárítását követően bepárlással jutottam a nyerstermékhez, melyet oszlopkromatográfiával tisztítottam. A megfelelő frakciók bepárlása után sűrű áttetsző olajként sikerült a Boc-gerincet előállítanom. A Boc-EDA izolálása és az ezáltal kevesebb szennyezést tartalmazó reakcióelegy kromatográfiás tisztítása sokkal egyszerűbb volt és a két lépés bruttó termelése is növekedett (75 %). Ezen az úton a Boc-gerinc egyszerűbben és hatékonyabban állítható elő, mint az irodalomban leírt eljárásokban. 3.2. 5-jód-uracil PS monomer szintézise Az 5-szubsztituált uracil származékok szintézise során azt a koncepciót terveztem, hogy az analogonokat keresztkapcsolási reakciók (Stille, Suzuki, Sonogashira, stb ) alkalmazásával állítom elő. Ehhez szükséges volt az 5-jód-uracil PS monomer szintézise, melyet három lépésben valósítottam meg az irodalomból ismert reakcióút módosításával 37. Az eredeti recept két lépésben írja le a monomer szintézisét. Az első az 5-jód-uracil káliumhidroxiddal történő deprotonálását követő alkilezés klórecetsavval, majd ezt követi a karbonsav Boc-gerinchez kapcsolása. Utóbbi reakció a peptidkémiában általánosan 23
elfogadott módszerrel történt, azonban az alkalmazott kapcsolószer (DCC) erősen allergén hatású, ezért ennek kiváltása ajánlott. Említést érdemel, hogy mindkét lépés csak közepes hozammal eredményezi a terméket, így a bruttó termelés elég alacsonynak mondható. Ezen okok miatt szükséges volt a reakcióút módosítása, optimalizálása. 13. 5-jód-uracil PS monomer szintézise A szintézis során először az 5-jód uracilt (4) brómecetsav-terc-butilészterrel alkileztem kálium-karbonát jelenlétében. A reakció során főleg 1 -alkil uracil származék keletkezik, de kismértékben az 3 -alkil és az 1, 3 -dialkil vegyületek is képződnek. Utóbbi képződése kis feleslegben alkalmazott és lassan adagolt alkilező reagens felhasználásával visszaszorítható. A termék átkristályosítással könnyen és jó termeléssel tisztítható, az anyalúgból oszlopkromatográfia alkalmazásával minimális mennyiség izolálható. A második lépésben az észtert (5) diklórmetánban TFA-val hasítottam. A reakció 4 óra alatt végbemegy. Az oldószert bepároltam, a maradékot metanolban szuszpendáltam és szűrtem. A karbonsav (6) kvantitatív hozammal nyerhető ki. Végeztem olyan kísérletet, amely során az első lépésben brómecetsav-etilészterrel alkileztem az 5-jód-uracilt, majd az észtert lúggal hidrolizáltam. Ez esetben azonban bizonyos mértékű dejódozódás figyelhető meg, ugyanis a szén-jód kötés ilyen körülmények között nem stabil. Ez alapján az észter savas közegben történő hasítása a megfelelő módszer és így előnyösebb a brómecetsav-t-butilészter alkalmazása. armadik lépésben a karbonsavat a védett Boc-gerinchez kötöttem egy, a peptidkémiában megszokott kapcsolási módszer alkalmazásával. A karbonsavat egy benzotriazol származékkal (TBTU) aktiváltam, majd a Boc-gerinc vízmentes DMF-es oldatához adtam, végül trietilamint adagoltam az elegyhez. A reakció szobahőmérsékleten három óra alatt végbemegy. A termék oszlopkromatográfiával tisztítható. Ezáltal az irodalomból ismertnél jobb bruttó hozammal (78 %) állítottam elő az 5-jód-uracil PS monomert (7) (13. ábra) amely a keresztkapcsolási reakciók kiindulási vegyülete. 24
3.3. Stille kapcsolások A keresztkapcsolási eljárások egyik legelterjedtebb képviselője a Stille nevével fémjelzett reakció 38. A folyamatban a transzmetallálás ónorganikus reagensről történik a palládiumra. A különböző szerves csoportok átvitele az ónról palládiumra jelentősen eltérő sebességgel történik, a leggyakrabban a megfelelő tributil-ón származékokat használják. Az ón bórhoz viszonyított kisebb elekronegativítása, és ezáltal erősebb fémes karaktere miatt az aril-trialkil-sztanánnok jobb aril-csoport donorok, mint a megfelelő arilboronsavak. Az irodalomban több olyan szintézisút ismert, mely során trialkil-vegyületek alkalmazásával állítottak elő nukleotid származékokat. Yamamoto és munkatársai ariltributil-sztannán reagensekkel Pd(0) katalizátor jelenlétében 10 B jelzett nukleozidokat szintetizáltak 39. Az 5-(2-tienil)-uridin származékok antivirális hatással is rendelkeznek 40. Farina és kutatócsoportja számos 5-szubsztituált uracil és uridin analóg szintézisét írta le 41. Crisp és munkatársai számos uridin és 2 -dezoxiuridin származékot állítottak elő Stille kapcsolás alkalmazásával 42 43 44 45. Az 5-jód-uracil PS monomer és a kereskedelmi forgalomban kapható ónvegyületek (2-tienil-tributilsztannán, 2-furanil-tributilsztannán és fenil-tributilsztannán) felhasználásával végeztem el a Stille-reakciókat. A reakció során vízmentes dioxánt és argon védőgázt alkalmaztam. 1,50 ekvivalens ónvegyület és 2-5 % Pd(PPh 3 ) 4 katalizátor hozzáadásával 90 o C-on a reakció 5-8 óra alatt végbemegy. A termékek (8 a-c) oszlopkromatográfiával tisztán, jó termeléssel (60-73 %) izolálhatók. Az 5-fenil-uracil PS monomer (8c) és az 5-jód-uracil vegyület nagyon hasonló kromatográfiás tulajdonságokkal rendelkezik, azaz a termék és a kiindulási anyag nem választható el. Ebben az esetben szükséges volt a maradék kiindulási anyag uracil származékká történő redukciója. A nyersterméket vízmentes etilalkoholban oldottam és cink por jelenlétében 3 órán keresztül forraltam az elegyet. Ezt követően az uracil PS monomer és az 5-fenil származék már könnyen elválasztható oszlopkromatográfiával. Az észtereket dioxán és 1 a oldat elegyében lúgosan hidrolizáltam 4 órán keresztül. A dioxán eltávolítása után a nyersterméket etil-acetátban oldottam, és 1 M as 4 oldattal extraháltam, majd az oldószer bepárlása után etilalkoholban szuszpendáltam, végül kiszűrtem és megszárítottam. Ezáltal jó termeléssel állítottam elő az 5-(2-tienil), az 5-(2-furanil) és az 5-fenil analogonokat (9 a-c) (14. ábra), melyek a szilárd fázisú oligomer szintézisben felhasználhatóak. 25
14. Stille-kapcsolások az 5-jód uracil PS monomeren, Lehetséges reakció út az ún. inverz -Stille kapcsolás 46, mely során az uracil PS monomer trialkil sztannán származékát terveztem előállítani, majd ezt a vegyületet kapcsolási reakcióba vinni különböző aromás halogén vegyületekkel. (15. ábra). 15. Az Inverz -Stille kapcsolás alkalmazása Az első lépés a trialkil-sztannil csoport kialakítása. Az 5-jód-uracil PS monomert hexabutil- és hexametil-disztannánnal reagáltattam Pd(PPh 3 ) 4 katalizátor jelenlétében dioxánban 80 o C-on, argon védőgáz alkalmazása mellett. Terméket (10) csupán az utóbbi esetben izoláltam 16 órás reakcióidő után oszlopkromatográfiával, mindössze 35 %-os hozammal. Ezt a vegyületet dioxánban palládium katalizátor hozzáadásával 2-brómtiofénnel és 2-bróm-1,3-tiazollal reagáltattam 80 o C-on. A várt termékeket (11 a-b) mindkét esetben sikerült izolálni, de nagyon alacsony (28 és 19 %) hozammal. A két lépés bruttó termelése messze elmarad a Stille kapcsolások hozamától. Egy másik lehetőség az 5-szubsztituált uracil PS monomerek előállítására az ún. dupla Stille kapcsolás 47. A one pot reakció során az 5-jód-uracil PS monomer és aromás halogenidek kapcsolása valósítható meg hexabutil-disztannán alkalmazásával. Először a brómvegyületet (2-bróm-tiofén és 2-bróm-1,3-tiazol) reagáltattam az ónreagennsel Pd(0) katalizátor jelenlétében vízmentes dioxánban 80 o C-on. Miután 26
képződött a tributil-sztannil származék (12) hozzáadtam az elegyhez az 5-jód-uracil PS monomert (7) és folytattam a reagáltatást 4 órán keresztül. Az 5-(2-tienil)-uracil PS monomer (8 a) 56 %-os hozammal izolálható a kromatográfiás tisztítás után. (16. ábra) Sn Sn Pd(PPh 3 ) 4 dioxán S Sn S Br 12 12 + Boc I Pd(PPh 3 ) 4 dioxán Boc S 7 8 a 16. A dupla Stille kapcsolás alkalmazása A másik reakció során azonban a várt termék helyett az 1,3-tiazol dimerje keletkezett (17. ábra). Az első lépésben keletkező aril-tributil-sztannil vegyület (13) a még jelenlevő el nem reagált brómvegyülettel is reakcióba lép amennyiben az ónvegyület képződése nem elég gyors, és ezáltal homodimer (14) keletkezik. 17. omodimer képződés dupla Stille kapcsolás során 27
Megállapítható, hogy ez a kapcsolási módszer nem vezet feltétlenül a várt termékhez és sikeres reakció esetén is elmarad a termelés a normál Stille kapcsolással elérhető hozamtól. Mivel egyrészt kevés aril-trialkilsztannán reagens kapható a kereskedelemben és ezen vegyületek mérgezőek is, másrészt a hexaalkil-disztannán alkalmazhatósága erősen korlátolt, így a további 5-aril-uracil PS monomerek előállítását Suzuki kapcsolással terveztem megvalósítani. 3.4. A 3-PMB-5-jód-uracil PS monomer szintézise Az uracil származékok laktám funkciója bizonyos esetekben mellékreakciókat eredményezhet. A Sonogashira kapcsolások során furano[2,3-d]-pirimidin gyűrűs vegyületek is képződnek az alkinil származékok mellett 48. Ezzel a problémával szembesültem a terminális alkinok és az 5-jód-uracil PS monomer palládium katalizált kapcsolása során. A Suzuki kapcsolásokkal folytatott kísérleteim is eredménytelennek bizonyultak a laktám csoport deprotonálódása miatt. Szükségessé vált egy 3 -védőcsoport bevezetése, mely az 5-jód-uracil PS monomer keresztkapcsolási reakciója után szelektíven távolítható el. Az irodalomban gyakran átmeneti védelemmel látják el a laktámcsoportot. Uridin származékok esetén gyakori a p-metoxi-benzil (PMB) védőcsoportként történő alkalmazása 49 50 51 52 53 54 55. A védelem kialakítására több lehetőség áll rendelkezésre. A p-metoxi-benzil-bromid, -klorid és az -alkohol is alkalmas reagens valamilyen bázis jelenléte mellett. Az eltávolítása oxidatív módon, cérium(iv)-ammónium nitráttal vagy aluminíum-kloriddal valósítható meg. Mivel a Suzuki kapcsolás körülményei között stabil, így első látásra ortogonális védőcsoportnak volt tekinthető. Ezen ismeretek alapján a PMB védőcsoport kialakítása az 5-jód-uracil PS monomeren megvalósíthatónak tűnt. Az 5-jód-uracil PS monomer benzilezését a jelenlétében p-metoxibenzilbromiddal kíséreltem meg, azonban a reakció több terméket eredményezett és a termék nehezen, alacsony hozammal volt izolálható. Ezután az 3 -PMB-5-jód-uracil PS monomer szintézisére új eljárást dolgoztam ki (18. ábra). 28
18. 3-PMB-5-jód-uracil PS monomer szintézise Korábban az 5-jód-uracil PS monomer szintézise során első lépésben az 5-jód uracilt alkileztem brómecetsav-t-butilészterrel. Ezen a vegyület laktámcsoportját sikeresen benzileztem. Az uracil származékot (5) DMF-ben oldottam és nátrium-hidriddel deprotonáltam a laktám-csoportot, majd p-metoxi-benzil-bromidot adtam az elegyhez. A 3- PMB-5-jód-uracil származék (15) a kromatográfiás tisztítás után megfelelő hozammal fehér kristályos formában izolálható. A következő 2 lépés megegyezik az 5-jód-uracil PS monomer esetében alkalmazottakkal. Az észtert TFA-val hasítottam diklórmetánban, majd az oldószer bepárlása után a maradékot metil-alkoholban szuszpendáltam és szűrtem. Így kvantitatív hozammal izolálható a karbonsav (16), melyet ezt követően TBTU aktiválószer és trietil-amin bázis jelenlétében a Boc-gerinchez (3) kapcsoltam. A reakció szobahőmérsékleten 3 óra leforgása alatt teljes mértékben lezajlik, és a termék oszlopkromatográfia alkalmazásával tisztítható. Ezen az úton 3 -PMB-5-jód-uracil PS monomert (17) állítottam elő, melyet sikeresen alkalmaztam a keresztkapcsolási reakciókban. A négy lépés bruttó termelése 58 %. 3.5. Sonogashira kapcsolások A rézorganikus reagensek szintézise és alkalmazása a szerves szintézisben hosszú múltra tekint vissza. Bár reakcióik elektrofilekkel általában spontán is lejátszódnak, több esetben palládium jelenléte gyorsítja a folyamatot. Sonogashira nevéhez fűződik az a felismerés, hogy in situ előállított alkinilréz reagensek palládium jelenlétében kapcsolási reakcióba vihetőek aril- és alkenil-halogenidekkel 56. A folyamat rézre nézve is katalitikussá tehető ekvivalens mennyiségű bázis (általában trietil-amin) alkalmazásával. A folyamat során a réz(i) só és az alkin a bázis hatására a rézorganikus vegyületet adja, amely transzmetallál az aril- vagy alkenil-palládium-halogenidre. A tarnszmetallálás során újra felszabadul a réz(i)só, ezért lehet katalitikus mennyiségben alkalmazni. 29
Az irodalomban számos uridin származék szintézise során alkalmazták már a Sonogashira kapcsolást. Robins és munkatársai 5-szubsztituált uracil és 2 -dezoxiuridin analógokat állítottak elő sikeresen terminális alkinok palládium katalizált kapcsolásával. 48. Sharma és Ma kutatócsoportja 5-etinil-pirimidin nukleozidok szintézisét és biológiai aktivitásuk vizsgálatát végezte el 57 58. asimoto az ikerionos DS szintézise során szintén alkalmazta ezt a módszert 59. Ismert az irodalomban 5-alkinil-uracil PS monomerek szintézise is 37. udson és munkatársai az 5-jód-uracil PS monomert vitték kapcsolási reakciókba alkinokkal és közepes termeléssel izoláltak új analógokat, melyeket sikeresen építettek be oligomerekbe. Az 5-jód-uracil PS monomerrel sikeres Stille kapcsolásokat hajtottam végre és a Sonogashira kapcsolás számára is megfelelő kulcsvegyületnek tűnt. A kapcsolási reakciók során a jódvegyületet 5 % (PPh 3 ) 2 PdCl 2, 5 % CuI és 2,0 ekvivalens trietil-amin jelenlétében terminális alkinekkel reagáltattam szobahőmérsékleten, argon védőgáz alkalmazása mellett. ldószerként vízmentes DMF-et használtam. A kapcsolás pár óra alatt végbement. A DMF eltávolítása után a maradékot DCM-ben oldottam, a réz nyomoktól extrakcióval szabadultam meg 5 %-os EDTA oldat felhasználásával. A termék oszlopkromatográfiával izolálható közepes termeléssel. Ennek oka, hogy jelentős mértékben (30-40 %) gyűrűzárt melléktermék is képződik (19. ábra). A gyűrűzárást szintén a réz(i)só katalizálja. 19. A gyűrűzárt melléktermék szerkezete Ezen tapasztalatok után szükségessé vált az uracil laktám-csoportjának védelme. A 3- PMB-5-jód uracil PS monomert (17) alkalmazva, a fenti körülmények mellett a védett 5- (1-propinil)-, 5-feniletinil- és 5-(1-hexin-1-il)-uracil PS monomereket (18 a-c) állítottam elő közel kvantitatív termeléssel (20. ábra). A termékek kromatográfiás tisztítását nagymértékben megkönnyítette a kezelhetőbb szennyezésprofil. 30
I R (PPh 3 ) 2 PdCl 2 CuI, TEA DMF R R: Me, Ph, Bu Boc CEt Boc CEt 17 18 a-c 20. Sonogashira kapcsolások a 3-PMB-5-jód-uracil PS monomeren 3.6. Suzuki kapcsolások Az aril-boronsavak és aril- vagy alkenil-halogenidek palládium(0) által katalizált keresztkapcsolási reakciója, az ún. Suzuki-reakció rendkívüli népszerűségre tett szert az elmúlt évtizedekben 60. A folyamat során a halogenidből kialakuló σ-kötésű átmenetifémorganikus vegyület a bórvegyülettel transzmetallálási reakcióban a diorganopalládiumszármazékot adja, amelynek reduktív eliminációjával jutunk a kívánt termékhez. A transzmetallálási lépésben, más keresztkapcsolási reakcióktól eltérően egy ekvivalens bázis jelenlétére van szükség. A szerves bórszármazékok nukleofil jellege nem elég erős, így az organopalládium-halogenid-komplexet kell elektrofilebbé tenni a halogenidet alkoxi- vagy karbonátionra cserélve. A Suzuki kapcsolás nukleotidkémiai alkalmazására több példa található az irodalomban. Casalnuovo és munkatársai az 5-jód-2 -dezoxiuridinnel és az 5-jód-2 - dezoxicitidinnel egyaránt sikeres kapcsolást hajtottak végre 61. Az 5-jód-2 -dezoxiuridin reakcióit pirénszármazékokkal Amann 62, fenilboronsavakkal pedig Western 63 írta le, utóbbi vízoldékony palládium katalizátort alkalmazott a szintézis során. Az irodalmi ismeretek alapján az 5-jód-uracil PS monomert arilboronsavakkal reagáltattam. Többféle palládium katalizátort, (Pd(PPh 3 ) 4, (PPh 2 )Cl 2, Pd(Ac) 2 + dppf) különböző bázisokat (K 2 C 3, Cs 2 C 3, K t Bu, aet) és oldószereket (DMF, 1,2- dimetoxietán, Et) kipróbáltam, de szinte egyáltalán nem tapasztaltam termékképződést (1. táblázat). Ennek oka valószínűleg az, hogy bázikus közegben az uracil laktám csoportja deprotonálódik és a közeli negatív töltés hatására a palládium elekrofil jellege csökken, amely a transzmetallálást nagymértékben gátolja (21. ábra). Minden esetben vízmentes oldószert és argon védőgázt alkalmaztam a reakció során az etilészter hidrolízisének kiküszöbölése céljából. 31
katalizátor bázis boronsav oldószer eredmény Pd(PPh 3 ) 4 Cs 2 C 3 / K 2 C 3 2-tienil- DMF ~ 50 % konverzió Pd(PPh 3 ) 4 Cs 2 C 3 2-tienil- DMF ~ 50 % konverzió (PPh 3 ) 2 PdCl 2 Cs 2 C 3 / K 2 C 3 2-tienil- DMF nincs termék Pd(Ac) 2 + dppf K 2 C 3 2-tienil- DMF nincs termék Pd(PPh 3 ) 4 Cs 2 C 3 / K t Bu 2-tienil- DME kis konverzió Pd(PPh 3 ) 4 Cs 2 C 3 / K 2 C 3 / aet 2-tienil- Et kis konverzió hidrolizis Pd(PPh 3 ) 4 Cs 2 C 3 2-naftil- DME kis konverzió Pd(PPh 3 ) 4 K 2 C 3 2-tienil- DMF > 50 % konverzió 1. táblázat Suzuki kapcsolások körülményei 21. Laktim-laktám tautoméria Az 3 védőcsoport alkalmazása, azaz a laktám funkció védelme ez esetben feltétlenül szükséges a sikeres kapcsolási reakció eléréséhez. Ezen elképzelés alapján a 3-PMB-5-jóduracil PS monomert alkalmaztam a további kísérletekben. Az 5-jód-uracil PS monomeren végzett kapcsolások során szerzett tapasztalatokat figyelembe véve oldószerként vízmentes DMF-et, bázisként kálium-karbonátot használtam. A Pd(PPh 3 ) 4 katalizátor mennyiségét sikerült 2 %-ra csökkenteni. A kapcsolásokat 100 o C-on végeztem 5 órán keresztül. osszabb reakcióidő alkalmazása esetén a mellékreakciók miatt az izolálható termék hozama csökken valamint a preparálása is nehézkesebb. Mivel a kiindulási jódvegyület és a képződő aril származékok kromatográfiás tulajdonságai nagyon hasonlóak mind a reakció követése, mind a termék izolálása kissé nehézkes és az oszlopkromatográfia során a nem megfelelő elválasztás a hozam csökkenését eredményezi. Ez utóbbi probléma a Stille kapcsolással előállított 5-fenil-uracil PS monomer tisztítása során alkalmazott szén-jód kötés redukciójával orvosolható. 32
Különböző boronsavak felhasználásával sikeres Suzuki-reakciókat hajtottam végre, előállítottam az 3 -PMB-védett 5-(2-tienil)-, 5-(4-bifenil)-, 5-(benzo[b]tiofén-2-il)- és az 5-(4-dimetilaminofenil)-uracil PS monomereket (19 a-d) (22. ábra). A reakciók termelése 37-85 % közötti, amelyek kissé elmaradnak a Stille reakciók hozamaitól, de mivel a boronsavak könnyen hozzáférhetőek ezzel a módszerrel számos új analóg előállítható. A boronsavak helyett boronsav-pinakolésztereket alkalmazva a konverzió kb. 10 %-kal növelhető. 22. Suzuki kapcsolások a 3-PMB-5-jód-uracil PS monomeren 3.6.1. Suzuki kapcsolások in situ laktám védelem melett A PMB védőcsoport szelektív eltávolítása nem problémamentes, mivel a CA vizes oldata erősen savas kémhatású, ezáltal a Boc-csoport is lehasad a PMB-vel együtt. Ebből adódóan az uracil laktám csoportját más csoporttal próbáltam védeni a kapcsolási reakciók során. A szililezett természetes nukleobázisoktól eltérően az 5 és 7 kiindulási anyagok 4- SiMe 3 (TMS) származékai a várható igen magas forrpont miatt nem tisztíthatók desztillációval másrészt a TMS csoport extra érzékeny minden protikus oldószerre így a kromatográfiás tisztítás sem jöhet szóba. Ezért a laktám funkciót in situ kellett szilileznem feltételezve, hogy a szililezőszer feleslege nem gátolja a kapcsolási reakciót. Erre a célra a Vorbrüggen féle nukleozid szintézisekben is általánosan alkalmazott,-bisztrimetilszilil-acetamid (BSA), mint igen hatékony szilil donor reagens, tűnt a legjobb választásnak. Előkisérleteim során azt találtam, hogy a diklóretánban (DCE) rosszul oldódó 5 2 ekv. BSA-val 1-1,5 órán át keveretetve teljesen oldatba megy, amely jelzi, hogy a reakció lejátszódott. Mivel a tervezett Suzuki kapcsolásokhoz a dioxán több ok miatt is alkalmasabb oldószer, mint a DCE ezért a szililezéseket eleve ebben végeztem. Boronsav reakciópartnerekként a 2-tienil- és a tianaftén-2-il-boronsavakat választottam, mivel a 33
termékek mindkét esetben fluoreszkálnak, így a reakciók, az 5 és a termékek közötti viszonylag kis R f különbség ellenére is, jól követhetők UV-ben 360 nm-en detektálva. Katalizátorként a Pd(PPh 3 ) 4 mellett a (Ph 3 P) 2 PdCl 2 -t is kipróbáltam, de a fluoreszcens termékek aránya az elegyekben minden esetben kisebb volt, mint a Pd(0) katalizált reakciókban azonos körülmények között. 23. In situ laktám védett 1 -alkil-5-jód-uracil Suzuki kapcsolása 24. In situ laktám védett 5-jód-uracil PS monomer Suzuki kapcsolása Kisérleteim azt mutatták, hogy az 5 kapcsolásai mindkét boronsavval jobb termeléssel (42,2 ill. 51,1%) játszódnak le mint a PS gerincet is tartalmazó 7 reakciói (22,8 ill. 40,4%) annak ellenére, hogy az utóbbi esetekben nagyobb boronsav felesleget és kétszer annyi katalizátort használtunk. Ennek oka a PS monomerek kisebb kémiai stabilitása, a Boc és/vagy az Et észter védőcsoportok részleges lehasadása az adott körülmények között. Erre utal az is, hogy a 7 reakcióinál hosszabb ideig (5-6 óra) tartó melegítés után poláros melléktermékek jelennek meg az elegyekben a főtermékek rovására ezért az optimális reakcióidő itt 2-2,5 óra. Ezzel szemben az 5 kapcsolásainál még 15 óra után sem láttam hasonló bomlástermékeket. 34