IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A

TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE... 4 1. BEVEZETÉS......5 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...7 2.1. A diabetes mellitus és felosztása...... 7 2.1.1. Primer diabetesek...... 7 2.1.1.1 Egyes típusú diabetes mellitus.....7 2.1.1.2 Kettes típusú diabetes mellitus.....8 2.1.1.3 Gesztációs diabetes mellitus (GDM)....8 2.1.2 Szekunder diabetesek (a diabetes egyéb típusai)....9 2.2. A diabetes mellitus késoi szövodményei............9 2.2.1. Szív- és érrendszeri szövodmények......10 2.2.2. Szemészeti szövodmények......11 2.2.3. Veseszövodmények......12 2.2.4. Idegrendszeri szövodmények.... 12 2.3. A cukorbetegség terápiás vonatkozásai...12 2.4. Mechanizmusok a diabetes késoi szövodményeinek kialakulásában.....14 2.4.1. A szénhidrát-anyagcsere egyensúly szerepe.......15 2.4.2. A poliol anyagcsere út.......15 2.4.3. A fehérjék nem enzimatikus glikációja, glükóz autoxidáció és protein karboniláció...16 2.5. Szabadgyökök, oxidatív stressz és cukorbetegség......20 2.5.1. Szabadgyökök az élo szervezetben.. 20 2.5.1.1. Reaktív oxigén speciesek.....21 2.5.1.2. A nitrogén monoxid és a peroxinitrit anion.......23 2.5.2. Redox homeosztázis és oxidatív stressz... 26 2.5.3. Az oxidatív stressz és a szabadgyökök szerepe a diabetes szövodményeinek kialakulásában....27 2.6. Kísérleti állatmodellek a diabetes vizsgálatában....31 3. CÉLKITUZÉSEK...33 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK. 34 4.1. Szabadgyökök idobeni alakulásával kapcsolatos kísérletekben alkalmazott módszerek... 34 4.1.1. Állatmodell.........34 1

4.1.2. Elektron spin rezonancia (ESR) spektroszkópia.35 4.1.2.1. Stacioner szabadgyök koncentráció meghatározása szövetben..37 4.1.2.2. Nitrogén monoxid gyök meghatározása szövetben 38 4.1.2.3. Oxigén-centrumú gyökök mérése szövetben..38 4.1.3. Peroxinitrit anion és reakciótermékeinek kemilu mineszcenciás meghatározása 38 4.1.3.1. A peroxinitrit képzodés reakciójának modellezése számítógépes szimulációval 39 4.1.4. Protein karboniláció mérése spektrofotometriásan..41 4.1.5. Szövettani vizsgálatok.. 42 4.2. Az aminoguanidin és inzulin kezeléssel kapcsolatos kísérletekben alkalmazott módszerek...... 43 4.2.1. Állatmodell....43 4.2.2. A szénhidrát-anyagcserére jellemzo paraméterek meghatározása: szérum glükóz, HbA1c és fruktózamin.....43 4.2.3. Nitrogén monoxid mérése ESR spektroszkópiával..43 4.2.4. Peroxinitrit anion és reakciótermékei meghatározása kemiluminométerrel...44 4.2.5. Szívhipertrófia vizsgálata. 44 4.3. Reagensek, vegyszerek.....44 4.4. Az eredmények értékelése, statisztikai analízis.......45 5. EREDMÉNYEK... 46 5.1. Szabadgyökök megjelenése és idobeli alakulása streptozotocin-indukált diabetes korai fázisában patkányban....46 5.1.1. Szabadgyökök stacioner koncentrációja a diabeteses szervekben....46 5.1.2. Nitrogén monoxid képzodése és idobeni alakulása diabeteses patkány szerveiben...48 5.1.3. Oxigén-centrumú gyökök képzodése diabetesben. A c-proxyl spinpróbavegyülettel kapott eredmények.51 5.1.4. Peroxinitrit anion és reakciótermékeinek ex vivo meghatározása diabeteses patkányok aortájából...55 5.1.4.1. A peroxinitrit reakcióinak kémiai modellezése, számítógépes szimuláció... 58 5.1.5. Protein karboniláció a diabetes korai fázisában...59 5.1.6. Kórszövettani eredmények......60 5.2. Az aminoguanidin- és inzulinkezeléssel kapcsolatos kísérle tek eredményei...62 5.2.1. Szénhidrát-anyagcsere paraméterek alakulása..... 63 5.2.2. Nitrogén monoxid termelodésének változása a kezelések hatására.. 64 2

5.2.3. Aminoguanidin- és inzulinkezelés hatása a peroxinitrit termelodésére diabeteses érfalban...66 5.2.4. Szívhipertrófia kialakulása diabetesben és az alkalmazott kezelések hatása......67 5.2.5. Protein karboniláció befolyásolása a kezelésekkel......68 6. MEGBESZÉLÉS.....70 6.1. Szabadgyökök idobeli megjelenése streptozotocin-indukált diabetes korai fázisában patkányban....... 70 6.2. Aminoguanidin- és inzulinkezelés hatása a kísérletes diabetesben zajló oxidatív folyamatokra patkányban...75 7. TÉZISEK.......80 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.....82 9. IRODALOMJEGYZÉK.....83 10. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE.. 93 ÖSSZEFOGLALÓ...95 SUMMARY...96 3

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AGE késoi glikációs végtermékek (advanced glycation end products) cgmp ciklikus guanozin-monofoszfát c-proxyl 3-karbamoil-proxil DETC dietil-ditiokarbamát DMPO 5,5 -dimetil-1-pirrolin-n-oxid DNPH 2,4-dinitro-fenil-hidrazin ESR elektron spin rezonancia spektroszkópia G Gauss, a mágneses tér erossége HbA1c hemoglobin A1c LDL low density lipoprotein L-NIL L-N-(1-iminoetil)-lizin L-NMMA N G -monometil-l-arginin Me n, Me n+1 tetszoleges fémion ( metal )? NO nitrogén monoxid gyök NOS nitrogén monoxid szintáz cnos konstitutív nitrogén monoxid szintáz enos endothelialis nitrogén monoxid szintáz inos indukálható nitrogén monoxid szintáz ONOO - peroxinitrit anion ROS reaktív oxigén species SOD szuperoxid diszmutáz 4

1. BEVEZETÉS A cukorbetegség (diabetes mellitus) egyike azoknak a kórképeknek, amelyek napjainkban fontos egészségügyi problémának számítanak, különös tekintettel a fejlett országokra. A diabetológia fontosságát támasztják alá azok a statisztikák, melyek szerint a cukorbetegek száma világszerte emelkedik. Az emelkedés mértéke a fejlett és a fejlodo országokban azonos, a népesség megoszlásának eltérései miatt azonban a növekedés döntoen a fejlodo országokban várható. A trópusokon szinte ismeretlen betegség. Az ismert cukorbetegek számát Magyarországon ma már legalább félmillióra becsüljük: ez azt jelenti, hogy az utóbbi húsz évben a betegek száma megkétszerezodött. Ma már a betegek életminoségét és életkilátásaikat elsosorban nem maga a cukorbetegség és az orvos által esetlegesen rosszul beállított szénhidrát-anyagcsere miatt fellépo hipo-, vagy hiperglikémia veszélyezteti, hanem a hosszú évek alatt kialakuló késoi szövodmények. Ezek közé tartoznak elsosorban a különbözo szív- és érrendszeri szövodmények, pl. a szívhipertrófia, az érelmeszesedés, a mikrovaszkulatúra muködésének romlása miatt bekövetkezo retinopathia, cataracta, nephropathia, valamint az autonóm neuropathia és a gasztrointesztinális rendszer különbözo fekélyei (1). Az utóbbi évtizedben számos kísérleti eredmény utal arra, hogy a szénhidrát-anyagcsere zavara során oxidatív stressz alakul ki (2). A szervezetben fiziológiásan is állandóan muködo és fontos szerepet játszó szabadgyökös folyamatok egyensúlya, az élo szervezet gyökháztartása felborul. Napjainkban a kutatások eloterébe kerültek a különbözo patológiás állapotokban felszaporodó reaktív speciesek és a szabadgyökös reakciók. Egyre több betegségben bizonyosodik be szerepük jelentosége. Bizonyítottnak tunik részvételük a cukorbetegség progressziójában (3), de a késoi szövodmények kialakulásában szerepük a mai napig vitatott. A diabetes mellitushoz kapcsolódó szabadgyökös folyamatokat az elmúlt években sokrétuen tanulmányozták a diabetes szövodményeinek vonatkozásában mind in vitro rendszerekben, mind állatkísérletekben vagy cukorbetegekben (4,5,6). A hangsúly általában az úgynevezett reaktív oxigén speciesekre (ROS) és reakcióikra helyezodött. Furcsa módon, a nitrogén-centrumú reaktív molekulákkal, gyökökkel és magával a nitrozatív stresszel jóval kevesebb tanulmány foglalkozik, pedig a nitrogén monoxid mint az érfalban fontos élettani szereppel bíró szabadgyök, szoros kapcsolatban lehet pl. a diabetes során kialakuló 5

endothel diszfunkcióval, érfalkárosodással. A fentiek ellenére, bár számos cukorbetegben és kísérleti állatban mért adat áll rendelkezésünkre, amelyek egyértelmuen a szövodmények kialakulásának szabadgyökös folyamataira utalnak, még mindig akad megválaszolatlan, bizonytalan kérdés a tématerületen. Nem világos például, hogy a gyökök a komplikációk okozói vagy következményei. Fontos kérdés lehet a különbözo gyökök idobeni megjelenése egyes a szövodmények által érintett szervekben, különösen a betegség korai szakaszában, még a szövodmények kialakulása elott. Doktori munkámmal a diabetes késoi szövodményei és a szabadgyökös reakciók között valószínusített ok-okozati összefüggés feltárásához kívántam közelebb jutni és új adatokkal szolgálni. Külön hangsúlyt igyekeztem fektetni a nitrogén monoxidra és annak szerepére, a szövodményekkel kapcsolatos lehetséges hatásaira és hatásmechanizmusára, tekintettel az úgynevezett nitrozatív stressz diabetesben még feltáratlan voltára. 6

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. A diabetes mellitus és felosztása A diabetes mellitus olyan betegség, amelyet krónikus hiperglikémia, a szénhidrát-, a zsír-, és a fehérjeanyagcsere egyéb rendellenességei jellemeznek, s amelyet sokszor kísérnek specifikus mikrovaszkuláris szövodmények és károsodások. A cukorbetegséget eleinte egységes kórformának tartották, bár már korai megfigyelésekben is említést tesznek arról, hogy a betegek közt vannak sovány, a fiatal korosztályhoz tartozó egyének, akiknél a betegség heves tünetekkel indul, és idosebb, sokszor elhízott betegek, ahol a betegség kezdete tünetszegény. Ez az egységes elmélet az endogén inzulinmeghatározás létrejöttével megdolt, s a WHO 1979-ben megalkotta a betegség felosztását (7). A diabetes tehát nem egységes kórkép, hanem mindazon betegségek összefoglaló neve, amelyekben fennáll a hiperglikémia, és amelyeknek közös jellemzoje az abszolút vagy relatív inzulinhiány. A cukorbetegség felosztása azóta kisebb-nagyobb változtatásokon esett át, a jelenleg érvényes a következo (8). 2.1.1 Primer diabetesek A primer diabeteses esetek az összes cukorbetegek kb. 95%-át teszik ki (9). 2.1.1.1 Egyes típusú diabetes mellitus A pankreász? -sejtjei autoimmun folyamatok következtében elpusztulnak, ezért a folyamatot teljes inzulinhiány kialakulása jellemzi. Elsosorban fiatal korban (30 év alatt) jelentkezik, ezért fiatalkori diabetes mellitusnak is nevezik. Az inzulinkezelés ennél a típusnál elkerülhetetlen. Kialakulásában a genetikus tényezoknek és a környezeti hatásoknak fokozott szerepet tulajdonítanak. Nem egységes kórforma. Két altípusa a klasszikus (immunmediált), illetve a lassan kialakuló (idiopathias) egyes típusú diabetes, utóbbi inkább a késobbi életkorban (30-45 év között) alakul ki. 7

2.1.1.2 Kettes típusú diabetes mellitus Az iparosodott országokban, így hazánkban is, a cukorbetegek legnagyobb része (90%) ebbe a kategóriába tartozik. E betegségcsoport közös jellemzoje, hogy az inzulinszekréció nem képes a normoglikémia fenntartására. A betegség kifejlodése során kóros éhomi vércukor, csökkent szénhidráttolerancia, majd kettes típusú cukorbetegség alakul ki. Ennek oka elsosorban periferiás inzulinrezisztencia kialakulása, melynek hátterében posztreceptor hiba, esetleg genetikailag rendellenes proinzulin, inzulin vagy inzulinreceptor mutáció áll (8,10). Fontosabb típusai: - Típusos 2-es típusú diabetes - 2-es típusú diabetes zárt etnikai csoportokban - EOD (early onset diabetes) forma - Primer lipidémiához csatlakozó kettes típusú diabetes - Ifjúkori kettes típusú diabetes. 2.1.1.3. Gesztációs diabetes mellitus (GDM) A terhes nok kb. 2-3? -ánál, újabb adatok szerint 10%-ánál alakul ki rendszerint a terhesség második felében (9). A legfontosabb patogenetikai tényezo, hogy a fiziológiás terhesség során is csökken a szövetek inzulin iránti érzékenysége és inzulinrezisztencia alakul ki. Az inzulinrezisztencia létrejöttében a placenta által termelt diabetogén hatású hormonoknak, foként a progeszteronnak, az ösztrogénnek és a humán placentáris laktogénnek tulajdonítanak elsodleges szerepet. Azokban alakul ki gesztációs diabetes, akiknél a fiziológiás kompenzáló hiperinzulinémia nem elegendo a szénhidrát-anyagcsere egyensúlyának fenntartásához. 2.1.2. Szekunder diabetesek (a diabetes egyéb típusai) Az esetek kevesebb, mint 5? -a tartozik ebbe a csoportba. Különbözo inzulin szekréciót gátló folyamatok következtében alakul ki diabetes (9). Ide tartozik például a 8

gyógyszerek és a fertozések okozta, különbözo genetikai vagy egyéb szindrómákhoz társuló, vagy pl. a pankreatitisz következtében kialakuló diabetes, és az inzulinreceptorabnormalitások miatt kialakuló diabetes is (8). Említést kell tennünk még arról a tényrol, hogy a WHO felosztása a diabetes külön csoportjaiként említi meg azokat az eseteket, amikor maga a cukorbetegség még nem fejlodött ki, de kialakulásának fokozott a veszélye. Ilyenek: az IGT (impaired glucose tolerance vagy kóros glükóztolerancia), a Prev AGT (previous abnormality of glucose tolerance vagy elozetesen kóros glükóztolerancia), és a Pot AGT (potential abnormality of glucose tolerance vagy a glükóztolerancia lehetséges zavara). 2.2. A diabetes mellitus késoi szövodményei A cukorbetegség idotartamának növekedésével, a kor elorehaladtával számos szervben tapasztalhatunk egyre nagyobb mértéku károsodásokat és ezzel járó diszfunkciókat. Az ilyen krónikus szövodmények amellett, hogy közvetlenül is veszélyeztetik a beteg életét, az életminoség romlását is okozhatják. A szövodményeket szokás micro- és macroangiopathias szövodményekre osztani. Az 1-es típusú diabetesre elsosorban a korai microangiopathias, a 2-es típusú diabetesre elsosorban a macroangiopathias szövodmények jellemzoek (13). Melyek tehát azok az elváltozások, amelyek a késoi szövodmények közé sorolhatóak? - Szív-, és érrendszeri szövodmények (érelmeszesedés, szív-, ill. balkamra hipertrófia, magas vérnyomás) - Diabeteses szemészeti szövodmények (cataracta, retinopathia) - Nephropathia - Neuropathia - Fekélyek és borbetegségek, pl. diabeteses láb - Autoimmun vegetatív neuropathia - Fog- és szájtünetek - Izületi megbetegedések - Hemosztázis-zavarok 9

A fenti szövodmények közül mindenképpen hangsúlyozottan kiemelnénk a Magyarországon vezeto halálokként számontartott szív- és érrendszeri betegségeket. Népegészségügyi jelentoséget tulajdonítanak még a fenti felsorolásban a másodikötödik helyen említett szövodményeknek. A többi elváltozásról sokkal ritkábban olvashatunk. A késoi szövodmények mind 1-es típusú diabetesben, mind 2-es típusú diabetesben kialakulhatnak, de elofordulásuk, jellegük és klinikai következményeik eltérhetnek a két fo csoportban. Példaként említhetjük meg a vakságot, mely mindkét típusú cukorbetegségben elofordul, de más-más oka lehet az egyikben ill. a másikban. A kardiovaszkuláris szövodményeket szokás inkább a kettes típusú, míg a nephropathiát az egyes típusú diabetes elso helyen álló halálokaként emlegetni (9). A fontosabb szövodményekrol mindenképp érdemes néhány szót ejtenünk bovebben is. Az alábbiakban ezekre térnénk ki, különös tekintettel olyan komplikációkra, melyeket kísérleteinkben mi is vizsgáltunk. 2.2.1. Szív- és érrendszeri szövodmények A diabetes során fellépo komplex anyagcserezavar, amely a lipid- és a fehérjemetabolizmust is érinti, felgyorsult érelmeszesedéshez vezet cukorbetegekben. Ezt a szövodményt tartják az egyik legfontosabbnak, mert cukorbetegekben a halálozási statisztikák élén az érelmeszesedés szervi megnyilvánulásai állnak. A betegség az érfal enyhe gyulladásos folyamataival indul, amit megnövekedett glükózégés és protein C aktiválódás követ. Az aspecifikus gyulladás így fennmarad és különbözo adhéziós molekulák (pl. citokinek), illetve monociták, vérlemezkék, T-limfociták tapadnak le az endothel felszínéhez, valamint szénhidráttartalmú fehérjék rakódnak le a kis- és nagyerek falában. Az extracelluláris mátrix mennyisége megno, a bazális membrán az erekben megvastagodik. No az érfal kollagéntartalma. A mono-, és a limfociták bejuthatnak a vérerek falának simaizomzatába is, így a gyulladás átterjed az endothel alá. LDL (alacsony suruségu zsírfehérjék) oxidációja és glikációja következik be, és a szubendotélben lévo monocitákban felhalmozódik a módosult LDL. A monociták makrofágokká alakulnak, majd a makrofágok habos sejtekké válnak. Simaizom- és endothelhipertrófia észlelheto. Ha a habos sejtek felhalmozódnak, zsírcsíkok képzodnek 10

a szubendotélben, melyek összegyulve lipidmagot alkotnak s az extracelluláris mátrix lévén kialakuló fibrózus sapka létrejöttével kialakul a plakk és a kezdeti érszukület. Funkcionális szempontból jellemzo a korai szakaszban bekövetkezo fokozott vazodilatáció, majd késobb a progresszív lumenszukület és ezzel együtt járva az elégtelen perfúzió (14). 2.2.2. Szemészeti szövodmények A retinopathia fordul elo leggyakrabban, de ezen kívül egyéb szemészeti rendellenességek is gyakoribbak, mint nem diabetesesekben, pl. szürkehályog, homályos látás vagy esetleg zöldhályog is kialakulhat (13). A diabeteses retinopathia legsúlyosabb stádiuma az ún. proliferatív szakasz, amelyet érújraképzodés (neovaszkularizáció) jellemez. A retina kapillárisainak károsodása vérzésekhez, ödémához, új erek megjelenéséhez vezet, melyek a látás romlását, akár elvesztését is okozhatják. Az erek akár az üvegtestbe is belenohetnek. Mivel az érkapillárisok elzáródnak, ezért iszkémia alakul ki. Azt feltételezik, hogy az oxigénhiányos állapot serkenti a vaszkularizációhoz szükséges növekedési faktorok elválasztását, így eredményezi új erek, abnormális kapillárisok képzodését (9). 2.2.3. Veseszövodmények A diabeteses nephropathia elsosorban a veseglomerulus megbetegedésének következménye. A szövodmény jelentoségére utal, hogy dialízist vagy vesetranszplantációt ma már leggyakrabban cukorbetegeken végeznek. A nephropathias szövodmények egyes és kettes típusú diabeteses betegek közti elofordulásáról megoszlanak a vélemények. A nephropathia diabetica mindig retinopathiaval társul. A mikroalbuminuriásokban enyhe, a klinikailag is már vesebetegekben elorehaladott léziókat lehet kimutatni. Súlyos állapotban a glomerulusok teljesen elzáródnak, amelyet foleg jelentos bazális membránvastagodás okoz, majd kialakul a veseelégtelenség. 11

2.2.4. Idegrendszeri szövodmények A diabeteses neuropathia klinikai és prognosztikus jelentoségét hosszú ideig alábecsülték az orvostudományban. Megjelenési formái nagyon változatosak, az egységes diagnosztikus kritériumrendszer kidolgozása jelenleg is folyamatban van. A folyamat során az idegrostok degenerálódnak, számuk csökken, emiatt diszfunkció alakul ki. Beszélhetünk szomatikus vagy autonóm neuropátiáról, attól függoen, hogy az idegrendszer mely részét érinti a betegség. A szomatikus formát általában renyhe reflexek, csökkent vibrációérzet és a végtagokon tapasztalható érzészavar jellemzi. Az autonóm neuropathia - mely inkább hosszabb betegségtartam után mutatkozik - következtében kialakulhat kardiovaszkuláris muködészavar vagy a gasztrointesztinális és az urogenitális rendszer funkcionális rendellenessége is. 2.3. A cukorbetegség terápiás vonatkozásai (11,12) Az elmúlt évtized folyamán jelentos szemléletváltás következett be a diabetes mellitus terápiájában és a társult kóros állapotok együttes kezelésének szükségességében. A WHO újradefiniálta a cukorbetegség diagnosztikai kritériumait is. A kórismézés során vércukormeghatározás indokolt klasszikus diabeteses tünetek (más okkal nem magyarázható fogyás, polyuria, súlyos tudatzavar vagy kóma) esetén, valamint veszélyeztetett egyéneknél (pozitív családi anamnézissel rendelkezok, elhízottak, hiperlipidémiásak, hipertóniásak, kórelozményben kardiovaszkuláris megbetegedés, stb.). Elobbi esetekben egyetlen laboratóriumi vércukor-meghatározás eredménye is alkalmas lehet a diagnózis felállítására. Tünetmentes egyének esetén a diabetes kórisméjének kimondásához azonban legalább egy további, más alkalommal történo, ismételt vizsgálat eredménye is kóros kell, hogy legyen. A diabetes mellitus kezelésében az inzulin felfedezéséig gyakorlatilag egyetlen terápiás lehetoségként szerepelt az étrendi kezelés. A diéta mind az 1-es típusú, mind a 2-es típusú cukorbetegek kezelésében ma is elsorendu fontosságú. A 2-es típusú diabetes felléptekor elsosorban diétával kell kezelni az állapotot és csupán a diéta nem kielégíto hatása esetén szükséges kiegészíteni azt orális antidiabetikumokkal, illetve késobb inzulinnal. A diéta beállításánál fontos az étrend energiatartalma és összetétele 12

(egyéni testreszabottság szükséges), az étkezések gyakorisága és szénhidráttartalma. Kerülni kell a vércukorszintet gyorsan emelo ételek, italok fogyasztását. Inzulinra szorulnak kevés kivételtol és néhány idoszaktól eltekintve az 1-es típusú cukorbetegek, valamint inzulin adását kell elkezdeni minden gyermek- és fiatalkorban kezdodo cukorbajban, esetenként 2-es típusú diabetesben is. Az 1-es típusú diabeteses betegek inzulinkezelésében rövidtávú, minimális célkituzés a betegség akut tüneteinek és szövodményeinek megszüntetése és a beteg közérzetének javítása. Hosszútávú cél a normo- vagy euglikémia, az egészséges egyének vércukorszintjét leginkább megközelíto beállítás elérése és fenntartása. Ajánlott kezelési forma a közel normoglikémia fenntartására 1-es típusú cukorbetegségben a napjában többször adagolt inzulinnal végzett intenzív kezelés. Ez az 1-es típusú diabetesben ma már bizonyítottan alkalmas a cukorbetegség késoi szövodményeinek késleltetésére. A 2-es típusú diabetesben szenvedoknél elsosorban orális antidiabetikus kezelés jön szóba, amit akkor indokolt elkezdeni, ha az étrendi és életmódbeli tanácsok (diéta, fokozott fizikai aktivitás) következetes megvalósítása önmagában nem vezet eredményre. A rendelkezésre álló gyógyszerek öt hatástani csoportba sorolhatók: - biguanidok - alfa-glukozidáz-gátlók - szulfonilureák - meglitinid-vegyületek - tiazolidindionok. A választásnál különös jelentoséggel bír, hogy az adott beteg diabetesének hátterében inkább inzulinrezisztencia vagy inzulinszekréciós zavar áll. Minden olyan esetben, amikor a diéta és ketto, esetleg három orális antidiabetikum alkalmazása mellett a vércukor szintje éhgyomorra ismételten meghaladja a 7 mmol/l-t és a HbA1c szintje a 7,5%-ot, feltétlenül tovább kell lépni az inzulinkezelés irányában. A fentiek alapján mindenképpen indokolt újabb és hatásosabb terápiás rendszerek kidolgozása/beállítása, foleg az 1-es típusú diabetes hosszútávú kezelésére. 13

(Megjegyzésként szeretném említeni, hogy dolgozatomban a továbbiakban a legtöbb helyen a diabetes kifejezést használom a cukorbetegség diabetes mellitus rövid megjelölésére). 2.4. Mechanizmusok a diabetes késoi szövodményeinek kialakulásában A diabetes késoi szövodményei kialakulásának megelozésében fontos szerepet játszhatna, ha a háttérben álló - létrejöttükhöz több-kevesebb mértékben hozzájáruló és komplex - biokémiai folyamatokat megismernénk. A komplikációk kialakulása mindig több, egymással összefüggo folyamat eredménye. A cukorbetegség korai szakaszában elsosorban a hiperglikémia okozta akut és reverzibilis intracelluláris változások kapnak szerepet a patofiziológiai eltérések létrejöttében. A nagy vércukorérték elsosorban azon szövetek metabolikus folyamataira van hatással, amelyekben a glükózfelvétel inzulinfüggetlen módon történik. Doktori munkám szemszögébol ezen elváltozások közül a következoket emelném ki: - a szénhidrát-anyagcsere egyensúlyának szerepe, - az úgynevezett poliol anyagcsereút, - a glükóz autoxidációja és a fehérjék nem enzimatikus glikációja, - szabadgyökök, oxidatív stressz szerepe, amely doktori munkám témája is, ezért egy különálló fejezetben ezt részletesen tárgyalom. A fentieken kívül egyéb említést érdemlo tényezok lehetnek még a genetikai háttér vagy esetleges hormonális folyamatok is. 14

2.4.1. A szénhidrát-anyagcsere egyensúly szerepe A szénhidrát-anyagcsere egyensúly kérdése, jelentosége sokat vizsgált terület. Az ún. Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) 1-es típusú diabetesben, valamint a United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS) 2-es típusú diabetesben egyértelmuen bizonyította, hogy minél inkább megközelíti a beteg vércukorértéke az élettani értéket, annál inkább csökken a valószínusége a retino-, nephro- és neuropathia kialakulásának (15,16,17). 2.4.2. A poliol anyagcsereút A glükóz jól ismert energiaszolgáltató lebontásán, a glikolízisen kívül a szervezetben a molekula más metabolizmusa is ismert. Ilyen pl. a poliol anyagcsereút. Ennek muködése során glükózból aldóz-reduktáz enzim segítségével szorbitol keletkezik, az enzim NADPH-t használ kofaktorként (1. ábra). A rendszer akkor aktiválódik, ha a környezet hiperozmotikus. A keletkezo szorbitol egy olyan ozmotikusan aktív, töltéssel nem rendelkezo molekula, amely nehezen jut át a plazmamembránon. Élettani körülmények között is megfigyelték a poliol út muködését, de cukorbetegségben, azokban a szövetekben, ahol a glükóz felvétele inzulinfüggetlen, nagy vércukorszint esetén fokozott aktivitással muködik az aldóz-reduktáz. Ennek oka egyrészt a hiperglikémia miatti ozmotikus stressz, másrészt a túltengo szubsztrátkínálat. Így igen nagy szorbitolkoncentráció alakulhat ki intracellulárisan is, ami ozmotikus károsodást okoz (18). Mindezen felül az aktív poliol anyagcsereút valószínuleg számos más, a szövodmények szempontjából fontos folyamatot is befolyásol. Azokban a szövetekben, ahol a szorbitol NAD + segítségével fruktózzá oxidálódik, NADH keletkezik, ezáltal emelkedik a NADH/NAD + arány, ami kedvez például a késobb tárgyalandó nem-enzimatikus glikációnak is. 15

H H HO H H C O C OH C H C OH C OH CH 2OH NADPH NADP + H H C OH H C OH NAD+ NADH HO C H aldóz-reduktáz H C OH szorbitol-dehidrogenáz H C OH CH2OH H HO H H H C C C C C OH O H OH OH CH2OH D-glükóz szorbitol D-fruktóz 1. ábra. A poliol anyagcsereút 2.4.3. A fehérjék nem enzimatikus glikációja, glükóz autoxidáció és protein karboniláció A cukorbetegség késoi szövodményeinek kialakulásában mind az úgynevezett korai, mind a késoi glikációs termékeknek szerepük van (19). Elobbieket rövidítve EGP- nek (early glycation products), utóbbiakat AGE-nak (advanced glycation endproducts) hívjuk (20,21). A glükóz hajlamos könnyen és gyorsan kötodni fehérjékhez, elsosorban lizin vagy arginin aminosavak aminocsoportjához, megváltoztatva ezzel a fehérjék szerkezetét és muködését. A reakció nyomán egy Schiff bázis szerkezetu molekula keletkezik, melyben a kémiai kötések egy lassú folyamatban átrendezodnek, ketoaminkötés alakul ki, létrehozva az ún. Amadori terméket (2. ábra). 16

H H HO H H C C C C C O OH H OH OH CH OH 2 + NH 2 - fehérje K 1 K -1 H H HO H H C C C C C N fehérje OH H OH OH CH OH 2 K 2 K -2 H HO H H H C NH C O C H C OH C OH CH OH 2 fehérje K n AGE D-glükóz Schiff-bázis Amadori-termék 2. ábra. A nem enzimatikus glikáció és az Amadori termék képzodése. K 1, K 2,...K n az egyes reakciók egyensúlyi állandóit jelölik. Ez utóbbi folyamat a sebességmeghatározó lépés és akár heteket is igénybe vehet (22). Fontos, hogy ezek a folyamatok még reverzíbilisek, akkor is, ha nem rövid, hanem hosszú életideju fehérjéken alakulnak ki, de azt is hangsúlyoznunk kell, hogy jó kiindulási pontot, táptalajt szolgáltatnak az AGE-k kialakulásához. A legismertebb ilyen Amadori termék a glikált hemoglobin vagy HbA1c, amely jó markere a szénhidrát-anyagcsere állapotának. Minél nagyobb a glükózszint emelkedése és minél hosszabb ideig tart, annál több ilyen hemoglobin-glükóz összetételu - korai glikációs termék keletkezik. A fehérjék glikációja természetszeruleg megváltoztatja metabolizmusukat és funkciójukat, befolyásolhatja pl. az enzimek aktivitását, szállítóképesség-csökkenést okozhat vagy akár az inzulin is glikálódhat (23), veszítve ezzel biológiai aktivitásából. A kardiovaszkuláris szövodményekben kiemelt szerepe lehet a glikált LDL-nek, mert hajlamos makrofágok scavenger típusú receptoraihoz kötodni és így a habos sejtek képzodését elosegíteni (24). Szeretnénk felhívni a figyelmet arra, hogy a glikáció egészséges szervezetben fiziológiásan is végbemegy és az ilyen termékek felhalmozódásának szerepet tulajdonítanak a természetes öregedésben, gondolva itt nemcsak a szervek öregedésére, hanem pl. egészen konkrét esetet kiragadva, a ráncok kialakulására is. Hosszú életideju fehérjékben, pl. kollagénben, a keletkezett korai glikációs termékek már nem bomlanak el, a folyamat lassan tovább zajlik, az Amadori termékek igen lassú átalakulásokon mennek keresztül. Átrendezodhetnek, egymással oxidatív és nem oxidatív módon összekapcsolódhatnak, dehidratációt szenvedhetnek, 17

keresztkötéseket hozhatnak létre és ily módon irreverzíbilisen megváltoznak, létrehozva a késoi glikációs végtermékeket, az AGE-kat (10). Ilyen jellegzetes termékek pl. az ún. glükofluorofórok, a karboximetil-lizin, vagy a pentozidin. Elofordulhat, hogy az Amadori termékek elhasadnak, így dialdehideket hoznak létre, glioxált, metilglioxált, stb., melyek képesek reagálni aminocsoporttal, glikációs végtermékeket szolgáltatva (25). A létrejött AGE-k igen stabilak és kumulatív jelleggel halmozódnak fel, egymással és az extracelluláris mátrix fehérjéivel kovalens módon keresztkötéseket hozva létre. A mátrix szabályos struktúrája így megváltozik. A stabil keresztkötések miatt ez az átépült mátrix a degradációnak is jobban ellenáll (14). Cukorbetegségben az erek falában, illetve a mikrovaszkulatúrában nagyon eros a plazmafehérjék akkumulációja. Azt találták, hogy ezek a fehérjék, - pl. az LDL is - sokkal szívesebben, nagyobb affinitással kötodnek pl. AGE által módosított kollagénhez vagy a mátrix AGE-ban gazdag részeihez (26). Ha egyszer egy ilyen plazmafehérje kovalensen kapcsolódott egy AGEhoz, ezzel újabb AGE kialakulására ad lehetoséget. A megváltozott, keresztkötésekkel teleszott bazális membrán pórusnagysága így növekszik, növelve a membrán permeabilitását, elosegítve ezzel újabb és újabb fehérjék érpályából való kivándorlását, kitapadását, lumenszukület létrehozását. Ha megszunik a hiperglikémia, az AGE-k már nem bomlanak el. Azt is fontos kiemelni, hogy az AGE-k viszonylag rövid diabetestartam után is kialakulhatnak (26). A keringo termékek a vesén keresztül választódnak ki és, ha a glomerulusfiltráció a cukorbetegben romlik, e termékek kiválasztása is értelemszeruen csökken, és a dialízis egyik formája sem képes ezeket a termékeket eltávolítani. Így nephropátiában jelentos szerepet tulajdonítunk az AGEknek és azt mondhatjuk, hogy a végstádiumú vesebetegek jelentos halálozási arányáért részben ezek a molekulák tehetok felelossé (27). Mindezeken felül a késoi glikációs termékek nemcsak közvetlenül, hanem sejtfelszíni receptorokhoz kötodve is kifejthetik hatásukat, számos receptornál már a hatás is ismert: fokozott citokintermelés, csökkent intracelluláris kalcium-szignál, csökkent trombomodulin-aktivitás, adhéziós molekulák megjelenése az endothelen (28,29,30,31). Azt mondhatjuk tehát, hogy a nem enzimatikus glikációt foképpen a fehérjék struktúrális változásainak szempontjából tartják fontosnak a cukorbetegség szövodményei kapcsán. Van azonban még egy nagyon fontos tény ezen felül: az elmúlt 18

két évtized kutatásai rámutattak arra, hogy a glikáció ok-okozati összefüggésben áll a diabetesben kialakuló oxidatív stresszel és a szabadgyökképzodéssel (32,33). Az irodalomban számos ilyen témájú értekezést találhatunk. A glikált fehérjék molekuláris oxigénnel való reakciója során oxigén-centrumú szabadgyökök képzodnek (34), vagy az enzimes ill. nem enzimatikus glikáció során szuperoxid anion és hidrogén-peroxid keletkezik (35,36). Ezek a reakciók is elosegítik az AGE-k képzodését, így a különbözo késoi glikációs termékek szintjének emelkedését a fokozott oxidatív stressz egyik bizonyítékaként tartják számon (33). Itt érkezünk el ahhoz a ponthoz, ahol meg kell említenünk a glükóz autoxidációs reakcióit. In vitro kísérletek eredményei azt sugallják, hogy a glükóz átmeneti fémek-katalizálta reakcióban oxidálódik, eközben hidrogénperoxid, oxigén- és széncentrumú szabadgyökök, egyéb reaktív termékek képzodnek. Az autoxidációban képzodo szabadgyökök és a hidrogén-peroxid pedig fémionok jelenlétében roncsolhatja a fehérjéket, lipideket. Különösen Wolff és munkatársai foglalkoztak méyrehatóan a tématerülettel (37,38,39,40). Elméletük szerint ilyen oxidációs reakciókban egy aldóz vagy egy ketóz reaktív dikarbonillá alakul, amely képes fehérjékkel reakcióba lépni, és az Amadori-átrendezodéshez hasonló, szerkezetükben rokon, de reaktívabb termékeket létrehozni. Ez a reakció protein karboniláció néven vált közismertté (41). Láthatjuk, hogy mindezen reakciók szoros kapcsolatban állnak a szabadgyök-képzodéssel, a diabetes során fellépo oxidatív stresszel, és doktori munkám központi kérdéséhez vezetnek: milyen szerepük lehet a szabadgyökös reakcióknak a késoi szövodmények kialakulásában és pontosan mely szabadgyökökrol van szó? A cukorbetegség gyakran jár együtt oxidatív stresszel, ami feltételezhetoen nemcsak magának a cukorbetegségnek a patogenezisében, hanem a késoi szövodményeinek kialakulásában is kiemelt szerepet játszik (3,4,5,6). 19

2.5. Szabadgyökök, oxidatív stressz és cukorbetegség 2.5.1. Szabadgyökök az élo szervezetben A szabadgyökök olyan atomok, molekulák, vagy molekulafragmentumok, melyek párosítatlan spinu elektront vagy elektronokat tartalmaznak. Ennél fogva adódik két alapveto tulajdonságuk: rövid életidejuek és ezzel együtt igen reakcióképesek, bár a szervezetben eloforduló gyökök reaktivitása változó (42). Általában rossz molekuláknak tarja oket a köztudat, pedig élettanilag is rendkívül fontos szerepük van. Részt vesznek a homeosztázis fenntartásában, különbözo jelátviteli mechanizmusokban messengerként muködhetnek, szabályozó funkciókat tölthetnek be. Az oxigén vízzé történo redukciójának is köztitermékei (ún. univalens biokémiai út), vagyis a mitokondriumban is mindig van szabadgyök-szivárgás (43). A mikroszomális vegyesfunkciójú oxidázok muködésekor, vagy pl. flavin-dehidrogenázok, xantin-oxidáz enzim hatására is keletkeznek (44). Az immunrendszer polimorfonukleáris leukocitái a betolakodó kórokozók eliminálásának segítésére szintén gyököket termelnek a NADPHoxidáz és mieloperoxidáz enzimek segítégével ( oxidative burst ) (45). Általában szokás nagy csoportokra osztva oxigén-, nitrogén-, kén- és széncentrumú gyökökrol beszélni. Élettani és kórélettani jelentoséguek az oxigéncentrumúak között a:? Szuperoxid anion (O 2? - )? Hidroxil gyök (? OH)? Alkoxi-, alkilperoxi gyökök (RO?, ROO? ). A nitrogén-központú atomot tartalmazó gyökök közül a nitrogén monoxidnak (? NO) van a legnagyobb biológiai jelentosége. A széncentrumú gyökök pedig (pl. a metil gyök,? CH 3 ) inkább csak másodlagos reakciókban keletkeznek a szervezetben. Ha egy szabadgyök más egyéb, nem gyökös jellegu molekulával lép kölcsönhatásba, akkor láncreakciószeruen újabb gyökök keletkeznek (láncfolytató lépés, propagáció). Ha két azonos, vagy különbözo típusú gyök reagál egymással, akkor rekombinálódnak 20

(lánczáró lépés vagy letörés, termináció). A propagáció valószínusége a szervezetben nagyobb, hisz a legtöbb biomolekula nem gyökös jellegu. 2.5.1.1. Reaktív oxigén speciesek Az oxigénbol redukcióval, gerjesztéssel keletkezo reaktív köztitermékek közül nem mindegyik szabadgyök. A nem gyök-jellegu, de nagyon reaktív termékeket összefoglaló néven, a gyökös termékekkel együtt, reaktív oxigén specieseknek (ROS) nevezzük. A gyökökön kívül ide tartozik pl. a hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ), az ózon (O 3 ) vagy a szingulet oxigén (? 1 O 2 vagy? 1 O 2 ) is. Az oxigén négyelektronos redukciója során víz keletkezik, azonban ha egyelektronos, univalens módon redukálódik, akkor olyan reaktív köztitermékek keletkeznek, melyek károsíthatják a biológiai rendszereket? (3. ábra). Ilyenek a fent említett O - 2,? OH, szingulet oxigén, ózon és a H 2 O 2.? 1 O 2? 1 O 2 szigmaszingulet deltaszingulet oxigén oxigén O 2 e - molekuláris oxigén?? - hidroperoxil- HO 2 O 2 szuperoxid anion gyök e - H 2 O 2 hidrogén-peroxid e -? OH hidroxil gyök H 2 O e - víz 3.ábra. Az oxigén redukciója és gerjesztése során keletkezõ reaktív oxigén intermedierek A szuperoxid anion keletkezhet a mitokondriumban, a kloroplasztban, a mikroszómákban zajló reakciókban, termelheti a xantin-oxidáz vagy különbözo molekulák autoxidációja. Kevésbé reakcióképes gyöknek tekintheto. Jelátvivo szerepe is ismert, illetve fontos tulajdonsága még, hogy vazokonstriktor hatású, ez lényeges 21

lehet a diabetesben a glikációs és a thrombotikus folyamatok miatt amúgy is rugalmatlanabbá váló érfalban. Ennél lényegesen agresszívebb a hidroxil gyök, és kezdetben a kutatók ezt a gyököt tartották minden baj forrásának. Késobb bebizonyosodott, hogy nagy reakciókészségébol adódó meglehetosen rövid életideje miatt egy molekula távolságnál tovább nem képes eljutni, csak a közelében lévo molekulákat tudja oxidálni, láncreakciót indítani. A legfontosabb? OH gyököt termelo folyamat az ún. Fenton-Haber-Weiss reakció, amely újabban szintén viták tárgyát képezi (1). A reakcióhoz (4. ábra) fémion katalizáló hatása szükséges, s ilyen fémionok a szervezetben szabad állapotban ritkán inkább szállító-, raktározófehérjékhez kötve fordulnak elo. Meg kell azonban fontolnunk azt, hogy oxidatív stressz állapotában akár a raktározófehérjék is károsodhatnak, elengedve maguktól a fémiont, teret adva az említett reakciónak. O 2?- + Me n+1 Me n + O 2 Me n + H 2 O 2 Me n+1 +? OH + OH - O 2?- + H 2 O 2 O 2 +? OH + OH - 4.ábra. A Fenton és a Haber-Weiss reakció. Az alkoxil- és alkil-peroxil gyökök inkább szekunder módon keletkezo termékek, és jelentoségük a lipid peroxidációnál nagy. A lipidek autoxidációja egy nagyon lassú folyamat a szervezetben, de ha pl. egy szabadgyökkel reagálva lipidgyök keletkezik belolük (R? ), akkor elindul egy láncreakció a molekuláris oxigénnel reagálva. Ekkor különbözo alkil-peroxil (lipid-peroxil, ROO? ) gyökök képzodnek (1). Ez a folyamat a lipid peroxidáció. Az iniciátor lehet pl. hidroxil gyök. Az ilyen peroxidációra foleg a többszörösen telítetlen zsírsavak (PUFA) hajlamosak. A lipid peroxil gyökök átmenetileg stabilizálódhatnak, hidrogént felvéve lipid-hidroperoxidokat adhatnak (ROOH), amelyek spontán bomlásuk során újra hidroxil- és alkoxilgyököket szolgáltatnak. Patológiás körülmények között ez a folyamat felgyorsul és sok 22

biomolekulát károsít. Jelentosége cukorbetegségben, hogy a lipid peroxidációs folyamatok (különösen az LDL oxidációja) feltételezhetoen hozzájárulnak az érelmeszesedés kialakulásához (46). 2.5.1.2. A nitrogén monoxid (? NO) és a peroxinitrit anion (ONOO ) Akárcsak a szuperoxid anion, a nitrogén monoxid is a viszonylag lassú, a kevésbé reaktív gyökök közé tartozik. A kutatások középpontjában áll, mióta bebizonyosodott, hogy fontos élettani hatással bír a vazodilatációra (47): a korábban endothel-derived releasing factor -ként (EDRF) nevezett molekula maga az? NO. Számos jótékony és kevésbé jótékony hatására derült azóta fény. A szervezetben L- argininbol keletkezik a nitrogén monoxid szintáz enzimek segítségével, melyeknek mind konstitutív (cnos), mind indukálható (inos vagy NOS II) formája ismert. Az enzimeket szokás még aszerint besorolni, hogy az adott izoformát hol fedezték fel eloször, vagyis endotheliális (enos) és neuronális (nnos) monoxid szintázról beszélni. Az? NO a vérerek falának simaizomzatába diffundálva aktiválja a guanilátcikláz enzimet, ami cgmp szint növekedést, ezáltal vazodilatációt okoz. Másik lehetoség, hogy a vérben methemoglobinhoz kötodik, végül a vesén át nitrát formájában ürül ki (5. ábra). 23

O 2 L Arg NOS? NO + L citrullin Hgb MetHgb - reduktáz MetHgb + NO 3? diffúzió a vérben diffúzió a simaizomban Guanilát - cikláz kiürülés a vesén át cgmp szint no vazodilatáció 5. ábra. A nitrogén monoxid keletkezése és útja a szervezetben. Megszámlálhatatlanul sok tanulmány foglalkozik az? NO különbözo betegségekben betöltött lehetséges szerepével. Élettani szerepe miatt elosorban a kardiovaszkuláris megbetegedések vannak a kutatások eloterében. Másodsorban különbözo gyulladással járó betegségeket vizsgálnak, mert az indukálható NOS aktivitása gyulladásos folyamatokban megno (48,49). Szokás ezt nitrozatív stressznek is nevezni. Tipikusan Janus-arcú gyök. Az erekre gyakorolt jótékony hatása és idegrendszeri jelátvivo funkciója mellett, túltermelodésekor pozitív hatását elnyomhatják káros reakciói. Ezek közül különösen fontos az, hogy szuperoxid anionnal egy nagyon gyors, szinte csak diffúziókontrollált reakcióban reagál, és peroxinitrit aniont képez (6. ábra) (50). 24

? NO + O 2?? k = 6,7 * 10 9 1/Msec ONOO? 6. ábra. A peroxinitrit képzodése. Bebizonyosodott az is, hogy nem a hidroxilgyök, hanem elsosorban a peroxinitrit anion teheto felelossé a fehérjék, lipidek, nukleinsavak károsodásáért, mert anionként messzebre eljuthat, mint egy szabadgyök, és pl. aminosav-oldalláncokat vagy eloszeretettel tirozint nitrálhat (51), károsíthatja az LDL-t (52), illetve gátolhatja a kalcium-függo káliumcsatornák muködését (53), míg pl. a szuperoxid gyök erre nem képes. A peroxinitrit fiziológiás ph-n nem túl stabil, protonálódik, majd végül nitrit és nitrát formájában távozik. A NOS enzimek muködésében fontos kofaktor a tetrahidrobiopterin (röviden BH 4 ), melynek hiányában, bizonyos patológiás esetekben a NOS enzimek is szuperoxid aniont termelhetnek (54). A NOS enzim izoformái gátolhatók akár együttesen, nem specifikusan, akár specifikusan, így különbözo patológiás elváltozásokban is meghatározható, hogy elsosorban melyik enzim játssza a foszerepet az? NO termelésében. A legáltalánosabban használható tesztvegyület a metilénkék (55,56). Az indukálható NOS-t viszonylag nagy specificitással gátolja az L-N-monometil-arginin (L-NMMA), vagy az L-N6-(1- iminoetil)-lizin (L-NIL) (1), közepesen szelektív gátlóként pedig nagyon gyakran alkalmazott és kedvelt az aminoguanidin (57,58), amivel kutatómunkámban én is foglalkoztam. Az enzim konstitutív formái (enos és nnos) kalciumfüggoek, míg az inos nem, ezért ez utóbbi Ca 2+ -kelátorokkal, pl. EGTA-val szelektíven gátolható, míg Ca 2+ -ionofórok alkalmazásával valamelyest stimulálható (59). Mind az? NO, mind az ONOO biológiai rendszerekbol származó mintákban is viszonylag jól mérheto, közvetlenül a szövetbol is. Munkámban az? NO meghatározására elektron spin rezonancia (ESR) spektroszkópiát, az ONOO mérésére egy kemilumineszcenciás technikát használtam. 25

2.5.2. Redox homeosztázis és oxidatív stressz Élettani esetben egyensúly áll fenn a szabadgyökök keletkezése és az antioxidáns rendszer között, vagyis a szervezet redox homeosztázisa biztosított. A szabadgyökös reakciókat enzimes és nem enzimatikus antioxidáns védekezorendszerek tartják kordában. Elobbiekhez tartoznak a zsír-, illetve vízoldékony vitaminok (különösen az E és C vitamin, melyek szinergikus hatása ismert), a táplálkozással felvett antioxidáns jellegu anyagok (flavonoidok, polifenolok, stb.) és az intracelluláris térben a legfontosabb vízoldható rendszer, a redukált/oxidált glutation (GSH/GSSG), valamint a hozzá kapcsolódó enzimek. Az enzimes védekezorendszer egyéb fontos elemei a szuperoxid-diszmutáz (SOD), a kataláz és a peroxidáz család enzimei. A SOD a szuperoxid aniont, a kataláz csak a hidrogén-peroxidot (H 2 O 2 ), a peroxidázok pedig más egyéb peroxil, alkoxilgyököket képesek semlegesíteni (7. ábra). SOD: O 2?? + 2 H + H 2 O 2 + O 2 kataláz: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 peroxidáz: H 2 O 2 + RH 2 2 H 2 O + R 7. ábra. Oxidatív folyamatok elleni enzimes védekezorendszer a szervezetben. R egy tetszoleges oldalláncot jelképez. Az antioxidáns enzimek általában indukálhatóak, tehát aktivitásuk a szabadgyökös reakciók növekedésével bizonyos határokig fokozható. Oxidatív stresszrol akkor beszélünk, ha az egyensúly a szabadgyökös reakciók irányában tolódik el, s a szabályzó- és védekezorendszerek nem képesek már kordában tartani a szabadgyökös folyamatokat (60). A képzodo reaktív gyökök reakcióba lépnek a környezetükben lévo egyéb molekulákkal, pl. lipidekkel, fehérjékkel, nukleinsavakkal, a kötoszövet makromolekuláival, és így rendellenes muködést, patológiás elváltozásokat, esetleg apoptózist okoznak, pl. diabetes mellitus esetén is (8. ábra). 26

ENZIMATIKUS REAKCIÓK Lipidek Oxidáció - Elektron transzport O 2 Oxidázok Fehérjék Fragmen- Oxigenázok H 2 O 2 OH Nukleinsavak táció AUTOXIDÁCIÓ ROOH átmeneti fém katalízis Károsodás 8. ábra Az oxidatív stressz kialakulása és hatásai (forrás: 34). A diabeteses betegek fokozott oxidatív stressznek vannak kitéve, ez pedig számos enzimes és nem enzimes reakció, foként a glükóz autoxidáció, protein glikáció és karboniláció következménye (61,62). Ez utóbbi két folyamat elsosorban a nagy vércukorkoncentráció miatt gyorsul fel. Glikáció során a glükóz kapcsolódik egy fehérjéhez enzimes vagy nem-enzimes úton. Karboniláció esetén pedig a glükózból autoxidációs mechanizmusokon keresztül képzodött reaktív dikarbonil termékek támadják meg a fehérjéket. Számos kísérleti adat ellenére sem tisztázott azonban az okokozati összefüggés a szabadgyökös reakciók és a szövodmények kialakulása között. 2.5.3. Az oxidatív stressz és a szabadgyökök szerepe a diabetes szövodményeinek kialakulásában A szabadgyökös mechanizmusok és az oxidatív stressz szerepe a cukorbetegség patogenezisében és szövodményeinek kialakulásában az utóbbi idoben nagyon sokat és rendkívül intenzíven kutatott terület mind in vitro kísérletekben, mind in vivo állatmodellekbol és betegekbol nyert mintákban (4,5,6). Ahogy említettük, az egyik legfontosabb eredménye ezeknek a kutatásoknak, hogy bebizonyosodott a ROS-ok keletkezése által képzodo glikált fehérjék molekuláris oxigénnel történo reakciója (6), illetve az, hogy a nem enzimatikus glikációt kíséro, s végül AGE-k képzodéséhez vezeto biokémiai folyamatok azok, melyek a gyökök fo forrásai diabetesben (61,62). Több kutatócsoport kezdetben különféle, antioxidáns státuszt jellemzo biokémiai paraméterek vizsgálatát tuzte ki célul diabetesben (1,63,64). Megerosítést nyert az, hogy 27

a különbözo szövetekben az antioxidáns enzimek SOD, kataláz, glutation-reduktáz, glutation-peroxidáz, stb. aktivitása megváltozik diabeteses állatmodellekben. Egymásnak ellentmondó eredmények születtek: egyaránt beszámoltak aktivitás növekedésrol és csökkenésrol. A vizsgálatok során rájöttek arra, hogy az ellentmondások oka a kísérleti körülmények sokfélesége: attól függoen, hogy melyik szövetrol vagy enzimrol volt szó, milyen hosszú volt a diabetes és milyen modellt használtak, a kutatók más más eredményre jutottak. Hosszútávú inzulinkezelés egyértelmuen kivédte ezeket a változásokat (65). Kakkar és csoportja számos olyan munkát közölt, ahol idoben követték a diabetes alakulását és az antioxidáns védekezorendszer muködését cukorbeteg patkányok szöveteiben (66,67). A tiobarbitursav reaktív anyagok (TBARS) mennyiségét mely a lipidperoxidáció jellemzo markere, valamint az antioxidáns enzimek aktivitását mérték a diabeteses vesében, májban, szívben és hasnyálmirigyben, korai fázisban (1-7 héttel a diabetes kialakulása után). 3 hét eltelte után szignifikáns változásokat találtak, ami jelezte, hogy az oxidatív stressz már a betegség korai szakaszában jelentkezik Ezek az ún. ujjlenyomat (fingerprint) módszerek jó támpontokat nyújtottak, de nem oldották meg a szabadgyökök és a szövodmények ok-okozati problémáját. Született egy szabadgyökös teória, azonban ez csak a diabetesben fellépo érelmeszesedéssel kapcsolatban volt érvényes (68). Lényege, hogy a gyökös reakciók gátolják a szérumelasztáz-inhibitort és a prosztaciklin-szintáz aktivitást. Az érfal szöveti elasztázai aktiválódnak, az elasztinban lévo keresztkötések elhasadnak, és az erek falában lévo lizin oldalláncok reakcióba lépnek a lipid peroxidáció termékeivel, így okozva károsodást. A prosztaciklin szintézis csökken vagy meg is szunik, ez pedig fokozza a trombociták adhézióját az érfalhoz, az általuk termelt ROS-ok pedig tovább fokozzák a károsodást. Ez az elmélet tulajdonképpen egységes teóriává alakítja az ateroszklerózis trombogén- és lipidteóriáját. Direkt szabadgyök mérések azokban a szervekben, melyek a szövodmények kialakulásában érintettek lehetnek és szövettani vizsgálatok együttesen azonban nem készültek. A nitrogén monoxidnak felfedezése óta fontos szerepet tulajdonítanak cukorbetegségben is, különösen ha az endothelfüggo relaxációban játszott szerepére gondolunk - kardiovaszkuláris területen, a vese- és a retina mikrovaszkulatúrájában (69,70,71). Itt is nagyon sok ellentmondásosnak tuno eredmény születetett: változatlan, 28

megnövekedett és csökkent? NO-mediált endothelfüggo relaxiációt is leírtak. Késobb kiderült, hogy a mért eredmény jelentosen függ a diabetes idotartamától, a használt állatmodelltol, illetve, humán esetben a betegek diabetesének típusától (72). Patkányokban figyelték meg azt, hogy a cukorbetegség nemcsak endothel? diszfunkcióhoz és megnövekedett vaszkuláris O 2 termelodéshez vezetett, de csökkentette az? NO biológiai hozzáférhetoségét, annak ellenére, hogy az endotheliális NOS enzim expressziója nott (69), ami egyértelmu ellentmondás és magyarázatra szorul. A vese mikrokapillárisaiban az enos emelkedett termelodését (up-regulációját) figyelték meg (70). Korai diabetesben leírtak konstitutív NOS enzim szint növekedést is a retinában, ez pl. a retina ereinek diszfunkciójával járt együtt (71). A szuperoxid anion és az? NO reakciójából származó peroxinitrit amellett, hogy nitrálja a tirozint vagy más fontos molekulákat (73), cukorbetegségben vérlemezke károsodást is okoz (74). Úgy tunik tehát, hogy a nitrogén monoxidnak is fontos szerepe lehet akár a nagyobb, akár a kapilláris erek károsodásában, a cukorbetegséghez társuló endothel diszfunkcióban, vagy a kardiovaszkuláris elváltozásokban. Az is lehetséges, hogy az emelkedett? NO szint egyfajta védohatást fejt ki a diabetesben merevebbé váló érfalra. Ám, ha oxidatív stressz is fennáll, a mérleg könnyen átbillenhet az? NO káros reakciói felé. Számos eredmény született különbözo NOS enzim gátlók alkalmazásával, ahol így próbálták kivédeni a patológiásan magas (pl. gyulladásos folyamatokban inos-ból származó)? NO szintet és a káros peroxinitrit képzodést. Az egyik ilyen, inos enzimre közepesen szelektív és állatkísérletekben szívesen alkalmazott inhibitor az aminoguanidin. Az irodalomban sokszor szelektív inhibítornak nevezik az aminoguanidint (75,76), de ez nyilvánvalóan félrevezeto, mivel még senki nem talált igazán szelektív gátlószert egyik NOS izoenzimre sem (77). Szélesköru népszeruségét annak köszönheti, hogy NOS gátló hatása mellett a glikációs folyamatokban képes blokkolni az AGE-k képzodését (78,79). Így diabetes vizsgálatában, ahol elorehaladott glikáció zajlik, különösen elonyös lehet. Hátránya, hogy a máj B 6 vitamin tartalmát csökkenti, illetve fokozza a májban a GOT, GPT enzimek aktivitását is (80). Ennek kivédésére újabban piridoxállal konjugálják az aminoguanidint, mely kombináció új perspektívákat nyithat a diabeteses komplikációk kezelésében (81,82). Az, hogy mikor melyik mechanizmusa NOS-gátló vagy AGE képzodés-blokkoló hatása kerül inkább elotérbe, még nem tisztázott és valószínuleg függ a szövodménytol, az adott szervtol és 29