Az elektromágneses spektrum 400 nm 750 nm
Hőmérsékleti sugárzás 1 Minden test anyagi minőségétől független, csak a test hőmérséklete által meghatározott spektrumú elektromágneses sugárzást bocsát ki, melyet hőmérsékleti sugárzásnak nevezünk. Kirchhoff sugárzási törvénye: M M λ, i λ, j α = α λ, i λ, j M λ,i - az i test által λ hullámhosszon kisugárzott teljesítmény α λ,i az i test abszorpciós tényezője (a test által enyelt és a testre eső összes sugárzási energia hányadosa Ha egy test adott hullámhosszon erősebben sugároz, akkor az abszorpciója is nagyobb. Azt a testet, melynek abszorpciós tényezője α=1 (tehát a ráeső összes sugárzást elnyeli), abszolút fekete testnek nevezzük. M α λ, i λ, i = M α λ, fekete λ, fekete = M λ, fekete 1 = M λ, fekete Ezért az abszolút fekete test sugárzási törvényének ismeretében a hőmérsékleti sugárzás spektruma tetszőleges testre meghatározható az abszorpciós tényező ismeretében.
Hőmérsékleti sugárzás 2 6x10-17 Stefan-Boltzmann törvény: Intenzitás 4x10-17 2x10-17 2000K M fekete 4 ( T ) = σt Wien-féle eltolódási törvény: 0 1000K 0 10 14 2x10 14 3x10 14 4x10 14 Frekvencia λmaxt = állandó = 2.9 10 A spektrum magyarázata: 3 m K 2x10-17 2x10-17 Rayleigh-Jeans e - e - f 1 f 2 A testben levő elektronok oszcillációja idézi elő a hőmérsékleti sugárzást. Intenzitás 10-17 5x10-18 0 Planck 0 10 14 2x10 14 3x10 14 Frekvencia Két ellentétes törvényszerűség játszik szerepet: 1. a frekvencia növelésével növekszik az Rayleigh-Jeans oszcillátor állapotainak (módusainak) törvény: a frekvencia száma növelésével minden módusra azonos (kt) energia arányosan nő az esik (ekvipartíció tétele) intenzitás 2. az oszcillátorok energiája csak hf kvantumokkal változhat minél magasabb az oszcillátor energiája (frekvenciája), annál alacsonyabb az állapot betöltöttsége (Boltzmann eloszlás) 1+2 Planck-féle sugárzási törvény
Heisenberg-féle bizonytalansági reláció Egy részecske helye (x) és impulzusa (p x ) csak korlátozott pontossággal határozható meg egyszerre. x p x h ad. 2 Hasonló összefüggés vonatkozik az energia-idő párra is: egy állapot energiája és élettartama egyszerre nem határozható meg tetszőleges pontossággal. E t h A Heisenberg-féle bizonytalansági reláció a részecske hullám/kvantum természetének következménye. Egy vizsgált paraméter meghatározásának hibaforrásai: Werner Heisenberg (1901-1976) 1. Heisenberg-féle határozatlansági reláció 2. a mérés során a mérőműszer megváltoztatja a vizsgált rendszert Mérési hiba. Nincs 3. a mérőműszer tökéletlensége összefüggésben a Heisenbergféle határozatlansági relációval. A I=? Mivel az árammérő ellenállása nem nulla, a mért áramerősség nem azonos azzal, ami az árammérő nélkül fennállt. A Heisenberg-féle bizonytalansági reláció egyik következménye, hogy a kvantumvilág nem determinisztikusan, hanem statisztikusan működik (pl. az interferencia-mintát pontosan meg lehet jósolni, de azt, hogy az egyes fotonok pontosan milyen úton mennek, azt nem). Ezt az ún. koppenhágai értelmezést Einstein nem fogadta el ( I cannot believe that God would choose to play dice with the universe ).
Atomi energiaszintek: a Bohr modell A kötött (atomi és molekuláris) elektronnak csak meghatározott energiája lehet: kvantált (diszkrét) energiaszintek atommag teljes energia ionizáció mozgási energia ionizációs energia (kilépési munka) atomi (kötött) elektronok negatív kvantált potenciális energiával szabad (nem kötött) elektronok nulla nem kvantált potenciális energiával abszorpció E foton = hf = Az átmenetek hullámhossza: E 1 E 2 E 3 emisszió E 2 E 1 1 1 1 1 = R cm R Rydberg const. 2 2 λ n n = 1 2
E kin =4.9 ev A kvantált energiaközlés első bizonyítéka: Frank-Hertz kísérlet A higany atom gerjesztési energiája: 4.9 ev 0 katód Hg E foton =4.9eV Ekin <4.9 ev _ + háló -0.5V _ Hg Hg anód (kollektor) Hg Ha az elektron kinetikus energiája kisebb, mint 4.9 ev, az elektron nem veszt energiát. Ha az elektron kinetikus energiája 4.9 ev, a higany gerjesztődik, az elektron kinetikus energiája nullára csökken (megáll). E kin 4.9 ev U=2V U=4.9V U=8V U=2 4.9=9.8V áram 5 V 10 V 15 V katód-háló fesz. távolság
A hidrogén atom spektruma E 6 E 5 kontinuum E 4 E 3 E 2 E 1 Lyman Balmer Paschen emisszió abszorpció ugyanannál a hullámhossznál ATOMOKNÁL, de NEM MOLEKULÁKNÁL abszorpció, gerjesztés relaxáció, emisszió abszorpciós spektrum emissziós spektrum
Molekulák energiaszintjei és spektruma b További energiatárolási lehetőségek b a a. Az atomok vibrációja b. Az egész molekula rotációja Következmény: az elektron energiaszintek mellett vibrációs és rotációs energiaszintek megjelenése. Újabb átmenetek megjelenése a spektrumban. r=4 3 2 1 r=4 3 2 1 0 v=1 0 Az átmenetek nagy száma miatt a molekulaspektrumok összetettek. v=0 r = +1 r = 0 r = 1 Szelekciós szabályok: nem minden átmenet megengedett.
Keskeny vonalakból álló spektrum csak a gázfázisban észlelhető Energiaszintek egyedi, izolált molekula gyenge erős kölcsönhatás kölcsönhatás kölcsönható molekulák Az egyes spektrumvonalak (szürke) helyett a szélesebb vonalakat detektáljuk. Az egyes spektrumvonalak helyett egy összefüggő sávot látunk. Spektrum λ λ λ
Az abszorpció és emisszió (fluoreszcencia) mérése fényforrás monokromátor, prizma v. filter gerjesztő fény emittált fény küvetta fény- nyaláb detektor fotométer fluoriméter monokromátor, prizma v. filter detektor I o I lg = I o I I o L 10 ε = ε c c L ε moláris abszorpciós koefficiens c moláris koncentráció L I
Bevezetés a fluoreszcenciába
Mi a fluoreszcencia? a fluorofór molekula gerjesztett állapotból történő visszatérése foton Abszorpció(1) eredményeként jön létre a folyamat gerjesztett szingulett állapothoz vezet, S 1 S 1 állapotból szubnanoszekundumos relaxáció (2) következik melyet spektrálisan a vörös hullámhossztartomány (3) felé eltolt fényemisszió követ (Stokes féle eltolódás) a Stokes féle eltolódás teszi a fluoreszcenciát érzékeny spektroszkópiás technikává
Jablonski diagram Gerjesztett szingulett állapot Excited Singlet Manifold S1 Belső internal konverzió conversion S2 k -isc k isc Triplett állapot Excited Triplet Manifold T1 S0 k nr k k' f nr fluoreszcencia fluorescence k p phosphorescence foszforeszcencia Singlet szingulett Ground alapállapot State Intersystem crossing Triplett állapot Belső konverzió Kasha szabály Triplett állapot foszforeszcencia; szignifikánsan hosszabb élettartam
Relaxációs lehetőségek Magasabb E és vibrációs állapot Legalacsonyabb E szingulett Abszorpció E Triplett állapotba történő Tiltott átmenet alapállapot fluoreszcencia foszforeszcencia késleltetett fluoreszcencia Az első szingulett gerjesztett állapotból való visszatérésre többféle alternatíva kínálkozik a molekula számára
A különböző relaxációs folyamatok élettartamai
szingulett állapot triplett állapotok
1. gerj. állapot alapállapot Intenzitás Hullámhossz
Fluoreszcencia paraméterek Ahhoz, hogy karakterizáljuk egy ismeretlen molekula rendszer fotoindukált emisszióját, meg kell határoznunk a hullámhossz függvényében az abszorpció és emisszió spektrális eloszlásait, a kvantumhatásfokot a gerjesztett állapot élettartamát az emittált fluoreszcencia polarizáltsági fokát spektrális eloszlás Kibocsájtási (emissziós) spektrum: Gregorio Weber, Meth. Enzym. 278, p. 1 (1997) Rögzített gerjesztési hullámhossz mellett mérjük a fluoreszcencia intenzitás hullámhossz függését Gerjesztési (excitációs) spektrum: Rögzített emissziós hullámhossz mellett mérjük a gerjesztési spektrumot (hullámhossz függvényében) : általában ua. mint az abszorpciós spektrum
1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 Spektrális eloszlás ECFP chromophore 500 nm det. 434 nm exc. Tryptophan 250 300 350 400 450 500 550 600 Hullámhossz Wavelength [nm] [nm] Normalizált fluoreszcencia intenzitás Normalized ill. Abszorbancia Fluo. Intensity
Abszorpciós spektroszkópia abszorbeáló c koncentrációjú közeg úthossz l I = I 010 ε ( λ ) cl Lambert-Beer I T = A = log T = log I 0 Transzmittancia Abszorbancia I I 0 A = log T = ε ( λ )cl
Spektrális eloszlások meghatározása Spektrofotométer fényforrás Monokromátor Minta Detektor Fluoreszcencia emisszió Fluoreszcencia gerjesztés 300 350 400 450 500 550 600 Hullámhossz, nm
Spektrális eloszlások meghatározása Minta Spektrofluoriméter Monokromátor fényforrás Detektor Fluoreszcencia emisszió Fluoreszcencia gerjesztés 300 350 400 450 500 550 600 Hullámhossz, nm
Fontos Fluoreszcencia paraméterek Kvantumhatásfok a festék emissziós képességének jellemzője Q = # emittált foton # abszorbeált foton Q = fluor. átm. v.sz. Q = k + k + # összes átm. v.sz. f ic isc Intenzitás egyenesen arányos az anyag abszorpciós képességével (extinkciós együttható, ε) Kvantumhatásfok, Q ahol I 0 a belépő gerjesztő fény intenzitása, l a gerjesztési úthossz [c] festék (fluorofór) koncentráció F = I 0 ε[ c ]lq teljes fluoreszcencia k f k
Fluoreszcencia élettartamok az összes kompetáló folyamat befolyásolja a mérhető élettartamot. dn dtt = N ( k f + k ic + k isc ) fluoreszcencia intenzitás gerjesztő impulzus N = N 0 e τ int = 1 0 ( k f + k ic + k ( k + k + k ) f Q = ic τ k f isc ) isc
Fluoreszcencia élettartamok Fluoreszcencia élettartam (τ) karakterisztikus idő melyet a fluorofór a gerjesztett állapotban tölt. τ int = 1/( k + k + k f ic isc ) A gerjesztett állapotban töltött idő alatt a molekula a környezetével számos kölcsönhatáson megy át. kollíziós kioltás fluoreszcencia energia transzfer intersystem crossing rotációs mozgás Homogén rendszer esetén (fluorofór + oldat) az élettartam egy komponensből áll Heterogén rendszerek esetén többkomponens mérhető
Fluorofórok Mi az a fluorofór? olyan molekula amelyik fluoreszkál néhány aminosav, különösen Trp, Tyr és Phe
Közönséges fluorofórok Fluorofórok-2 exogén festékek Fluorescein, Rhodamine, Acridine Orange, Ethidium Bromide, Cy endogén fluorofórok - NADH autofluoreszcencia, stb. FLUORESCEIN Molekuláris képlet: C 20 H 12 O 5 Molekula tömeg: 332.31
Fehérjék Flurofórok-3 Phycobiliproteins - phycoerythrin, allophycocyanin Green Fluorescent Protein - GFP Új fehérjék nanokristályok (core/shell quantum dots)
Gyakran használt fluorofórok
Fluorofórok néhány alkalmazása Immunofluoreszcencia ion szenzitív festékek -K +, Na +, Ca 2+ specifikus markerek -ph indikátorok membránpotenciál megnövekedett intracelluláris fluoreszcencia DNS festékek fehérje fluoreszcencia meghatározási módszerek
Fluoreszcencia mérése Spektrofluoriméter excitációs és emissziós spektrum monokromátor oldatok vizsgálata (küvettában) Fluoreszcens mikroszkóp fluoreszcencia eloszlás biológiai rendszerek (sejtek stb.) vizsgálata. optikai szűrők használata
Fluoreszcencia mérése
Fluoreszcencia mérése
Optikai szűrők kibocsátott fény Tipikus filter elrendezés mikroszkópban gerjesztő fény minta
Optikai szűrők
Optikai szűrők - 2
Fényforrások
Optikai szűrők kiválasztása Wild Type GFP Fluorescence Emission Fluorescence Excitation 300 350 400 450 500 550 600 Wavelength, nm Chroma Technology 32000 WTGFP Bandpass Filter Set
Fluoreszcens képalkotás FITC-el (fluorescein isothiocyanate) és Rhodamine-phalloidin-nal jelölt sejt a microtubulusok és az aktin filamentumok látahtóvá tételére.
Fotohalványítás Photobleaching (fading) fotokémiai destrukció fotokémiai reakció (kémai sérülés, kovalens változás) a gerjesztett állapot során a fluorofór irreverzibilisen elveszíti a fluoreszcens tulajdonságát csökken az alapállapotú fluorfórok száma in most cases it is linked to a transition from the excited singlet state to the excited triplet state photobleaching aránya függ az intenzitástól és a gerjesztés idejétıl oxigénkoncentrációtól a fluorofór tulajdonságaitól a gerjesztési és emissziós ciklusok száma fluorofóronként állandó hátránya (pld. Mikroszkópos technikák)
KÉK nucleus (Hoechst 33258; VÖRÖS mitochondria (MitoTracker Red); Zöld actin filaments (Alexa488-phalloidin) http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fluorescenceintro.html
A biológiai alkalmazásoknál használt fluorofórok méretei Nat. Biotechnol., 21, 1387.
Aequorea victoria (jellyfish) Green Fluorescent Protein (GFP) 238 aa; 26.9 kda it was first purified from Aequorea victoria and its properties studied by Osamu Shimomura Douglas Prasher realized the potential of GFP as a tracer molecule; reported the cloning and the nucleotide sequence of wtgfp Roger Y. Tsien is responsible for much of our understanding of how GFP works and for developing new techniques and mutants of GFP Martin Chalfie, Osamu Shimomura and Roger Y. Tsien share the 2008 Nobel Prize in Chemistry for their discovery and development of the green fluorescent protein http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/gfp-ww/gfp-1.htm
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorescentproteins/fluorescentproteinshome.html
http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/gfp-ww/gfp-1.htm
Fluoreszcencia Rezonancia Energia Transzfer (FRET) D* A A* D* Donor és akceptor távol egymástól - No FRET Donor és akceptor közel egymáshoz - FRET fénykibocsátás nélküli (elektromágneses dipólus-dipólus) átmenet a gerjesztett kromofór (donor) felöl a receptor molekula (akceptor) fele. dinamikus Förster transzfer folyamat meglehetősen távolságfüggő 1/R 6 hatékony eszköz molekula asszociációk, fehérje-fehérje, receptor-ligand kölcsönhatások vizsgálatára FRET távolság tartománya: 2-10 nm
FRET Fotofizikai következményei D* A* FRET esetén a donormolekula számára létezik egy alternatív relaxációs lehetőség Energia Transzfer esetén Donor gerjesztett állapotának (D*) élettartama csökken Donor fluor. intenzitása csökken Donor photobleaching (fotohalványítás) sebességi állandója csökken Akceptor fluoreszcencia intenzitása ( ha a donor jelen van) növekszik
Applications of FRET Protease sensor: FRET Calcium sensor: CFP YFP CFP YFP e.g. caspase sensitive linker - Ca 2+ FRET + 4 Ca 2+ CFP CFP no FRET YFP Nature, 388, 882.
Tyrosine phosphorylation sensors: Applications of FRET Nature Biotech., 20, 287.
FRET változás különböző molekulák között akceptor FRET donor D D A A FRET 1. Mindegyik donorakceptor pár közelebb kerül egymáshoz 2. csak néhány donor- A? akceptor pár kerül nagyon közel egymáshoz, míg a D idő többi relatív helyzete nem változik.
FRET detektálása Spektrális változások akceptor fluoreszcencia intenzitása növekszik donor fluoreszcencia csökken Fluoreszcencia élettartam Csökkenő donor oldali élettartam Donor Photobleaching (fotohalványítás) a donor molekulák un. photobleaching sebességi állandója akceptor jelenlétében csökken Akceptor Photobleaching erős, akceptort gerjesztő fényt alkalmazva akceptor mentes terület megnövekedett donor fluoreszcencia
Alkalmas FRET festékpárok kiválasztása Normalized Fluo. Intensity 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 ECFP/EYFP ECFP, ex ECFP, em EYFP, ex. EYFP, em 0 350 400 450 500 550 600 650 Wavelength, nm
A Förster típusú energiatranszfer hatásfok távolságfüggése E R 6 0 = 6 6 R0 + R
Raman szórás (Raman spektroszkópia) A fotonok energiája megváltozik (csökken vagy nő) amiatt, hogy a foton kölcsönhat a molekula vibrációs vagy rotációs energiaszintjeivel. A vibrációs vagy rotációs energiaszinteket a frekvencia megváltozása alapján lehet mérni: f szórt = f 0 ± f f szórt Stokes: f o f = f 0 f foton f o - f foton Anti-Stokes: f szórt = f + f 0 f o f foton f o + f foton A Stokes vonalak sokkal erősebbek.