Rekombináns gyógyszerek fejlesztése c. előadás írásos változata

Rekombináns gyógyszerek fejlesztése c. előadás írásos változata Készítette: Ballagi András, Biotechnológia osztályvezető, Richter Gedeon NyRt. Készült az Innovatív Gyógyszerek Kutatására Irányuló Nemzeti Technológiai Platform Gyógyszer hatásossági munkaértekezletére 2008. november 26. szerda BM Duna Palota Széchenyi terem 1051 Budapest, Zrínyi u. 5. Tartalom: 1 A REKOMBINÁNS BIOGYÓGYSZEREK HELYE A GYÓGYSZERIPARBAN.... 2 2 A REKOMBINÁNS BIOGYÓGYSZEREK JELENTŐSÉGE A GYÓGYSZERIPARBAN... 2 3 EGY HETEROGÉN TERMÉKCSOPORT MÉGIS MI JELLEMZŐ RÁJUK?... 3 4 ÉRTÉKLÁNC A GYÓGYSZERIPARBAN... 4 5 A REKOMBINÁNS GYÓGYSZERGYÁRTÓ TECHNOLÓGIA FŐ LÉPÉSEI... 5 6 A TERMÉKEK MINŐSÉGVIZSGÁLATA, AZON BELÜL A SZERKEZETMEGHATÁROZÁS DILEMMÁI... 5 7 TRENDEK A BIOGYÓGYSZERGYÁRTÁSBAN... 6 8 MILYEN TECHNOLÓGIAI JELLEGŰ KOCKÁZATOKKAL KELL SZÁMOLNI?... 7 9 KELL-E MAGYARORSZÁGON REKOMBINÁNS BIOGYÓGYSZERGYÁRTÁS?... 8 10 HOGYAN LEHET ELŐSEGÍTENI A REKOMBINÁNS BIOGYÓGYSZERGYÁRTÁS MEGERŐSÖDÉSÉT MAGYARORSZÁGON?... 8 Budapest, 2009-01-27 1

1 A rekombináns biogyógyszerek helye a gyógyszeriparban. A gyógyszeriparban már régóta alkalmaznak olyan eljárásokat, amelyekben biotechnológiai úton állítanak elő hatóanyagokat. Elég csak az antibiotikumokra, vagy a mikroorganizmusok által végrehajtott szteroid konverziókra gondolni. További példák lehet a vaccina előállítása is. A rekombináns biogyógyszerek előállítási technológiái abban különböznek az említett technikáktól, hogy olyan mikroorganizmusokat használnak, amelyeket előzőleg molekuláris biológiai módszerekkel tettek alkalmassá feladatuk ellátására. A kiindulásként használt mikroorganizmusok (baktériumok, élesztők, emlős sejtek) eredetileg nem képesek előállítani pl. humán fehérjéket, de ha megfelelő géneket helyezünk a DNS állományukba, képességet kaphatnak erre. Maga a rekombináció azt a folyamatot, vagy történést jelenti, amikor két duplaszálú DNS molekula (általában) azonos helyen felhasad, és a szálak átcserélödnek, azaz rekombinálódnak. Ha ugyanez kicsit távolabb is megtörténik ugyanezzel a két molekulával, akkor praktikusan DNS darabot cseréltek. Ha ez a DNS darab akkora, hogy egy egész gént tartalmaz, akkor a két molekula tk. tulajdonságot cserélt, vagy ami még gyakoribb, hogy az egyik molekula íly módon felveszi a tulajdonságot, a másik meg lebomlik. (Hogy miért pont ott hasadnak fel, ahol felhasadnak, és hogyan tudjuk ezt laborban irányítani, szakmai részletkérdés.) Ilyen folyamat (azaz rekombináció) révén lehet pl. humán gént bevinni baktériumba vagy más gazdaszervezetbe és ott előállítani a génben kódolt fehérjét. A rekombináns szót használjuk jelzőként is, így pl. az ilyen módon előállított fehérje rekombináns fehérje vagy rekombináns termék, míg az őt előállító gazdaszervezet a rekombináns mikroorganizmus, rekombináns baktérium, rekombináns sejt stb. 2 A rekombináns biogyógyszerek jelentősége a gyógyszeriparban. Eddig az Európában 276, míg az Egyesült Államokban 284 biogyógyszeripari terméket regisztráltak forgalmazásra. A jelenlegi becslések szerint kb. 2100 biotechnológiai ipar által gyártandó termék van klinikai kipróbálás alatt, ugyanakkor kb. 3600 van preklinikai fejlesztés alatt. Nyilván ennél is több azoknak a molekuláknak a száma, amelyek a proof-of-concept állapotában vannak, és arra várnak, hogy hasznosságukat tudományos kísérletekkel bizonyítsák. A biotechnológiai úton előállított biogyógyszerek 2007-ben 44 milliárd dollárt tettek ki csak az USA piacon, ez megfelel a teljes gyógyszergyártás 20%-ának. Világviszonylatban ez a szám 75 milliárd dollár, és az összforgalom 12,5 %-a. Az Ernst&Young riportja szerint a tőzsdén jegyzett biotechnológiai gyógyszergyárak 2006 és 2007 között 11%-al emelték a forgalmukat 58.6-ról 65,2 milliárd dollárra. 2

3 Egy heterogén termékcsoport mégis mi jellemző rájuk? A rekombináns biogyógyszerek az alábbi csoportokba oszthatók: Név Peptidek Proteinek Nukleinsavak Egész sejt Vírus részecskék Példa Petid hormonok kiegészítő proteinek, monoklónális antitestek DNS, RNS vaccinák vaccinák A kis peptidek 2500-3500 Da nagyságúak; A kiegészítő fehérjék 4000-8000 Da (pl inzulin 5700 Da); A monoklónális antitestek kb. 150 000 Da-osak, Míg a vaccinák 1 000 000 Da felettiek, akárcsak a DNS és RNS molekulák. Az atomi tömegegység, vagy "dalton", tömeg-mértékegység az atomok és molekulák világára. Megállapodás szerint a 12 C atom (a szén legstabilabb izotópja) tömegének egy tizenketted része. A biokémia és a molekuláris biológia (különösen a proteinekkel kapcsolatban) a "dalton" megnevezést használja az atomi tömegegységre, "Da" rövidítéssel. Mivel a proteinek nagy molekulák, még tipikusabb a kilodalton nagyságrend használata, amelynek rövidítése "kda". Ezek a tömegek igen nagynak számítanak a szintetikus molekulákhoz képest, amelyek 500 Da körüliek. Ennek megfelelően a biomolekulák nagyon komplexek, valamint az őket szennyező molekulák is azok. Véráramba kerülve a célmolekula is, és a szennyező molekulák is kiválthatnak immunreakciókat, amely a vaccinák esetében fő cél, más esetekben viszont kifejezetten problémát jelenthet az engedélyezésnél és a felhasználásnál. Előállításuk ritkán történik szintetikus úton. Még a néhány aminósavas peptideket is gazdaságosabb arra alkalmassá tett sejtekkel (rekombináns gazdaszervezetekkel) termeltetni. Ilyen gazdaszervezetek lehetnek baktériumok (E.coli), élesztők (P. pastoris), fonalas gombák (A. niger), rovar, emlős és növényi sejtek. Ezek a gazdaszervezetek az említett sorrendben egyre összetettebbek, ennek megfelelően egyre összetettebb fehérjék előállítására alkalmasak. Például, az E.coli baktérium alkalmas a viszonylag egyszerű proinzulin molekula előállítására, de monoklónális antitestekhez már emlős sejttenyészetre van szükség. 3

4 Értéklánc a gyógyszeriparban A biogyógyszerek fejlesztése és gyártása hosszú, körülményes és költséges folyamat, akárcsak a kismolekulás gyógyszerek esetében. A fenti ábra a kutatás, majd a klinikai vizsgálatokat, a folyamat végén pedig a regisztrációt illusztrálja. Látható, hogy a kutatási és technológia fejlesztési szakasz még viszonylag alacsony költségekkel futhat, míg a klinikai vizsgálatok 3. fázisánál, már egy közepes vállalat számára is komoly költségekkel kell számolni. Biogyógyszerek esetében ezért fordul elő gyakran, hogy a kockázatok megosztása érdekében szövetségek jönnek létre gyógyszervállalatok között. Mint látható a siker valószínűsége egyre nagyobb a vizsgálatok előrehaladtával, de nem 100%, így az óvatosság indokolt. 4

5 A rekombináns gyógyszergyártó technológia fő lépései A technológiák fejlesztése a gén és a gazdaszervezet kiválasztásával történik. A gén beklónozásra kerül a gazdaszervezetbe, esetleg a gén kópiaszámát megsokszorozzák a jobb termelés érdekében. A végső szelekció után elkészülhetnek a Sejtbankok. (Research, Master és Working) Ezek előállítása hosszú és igényes analitikai mérések, valamint azok dokumentálásának sorozata. A tulajdonképpeni gyártás, amely ismétlődik minden sarzs esetében a kék nyíl utáni szakasz. Fontos kiemelni a gyártásközi ellenőrzés (IPC) és a felszabadító (release) analitika jelentőségét. 6 A termékek minőségvizsgálata, azon belül a szerkezetmeghatározás dilemmái. A rekombináns biotermékek tehát nagy molekulák, több ezer atomot tartalmazhatnak. Előállításuk során a gazdaszervezetek nem teljesen homogén terméket hoznak létre, az egyes módosulatok nagyon kis eltérést mutatnak, így a rendelkezésre álló preparáló technikákkal a legtöbb esetben nem elválaszthatók. Kis molekulák esetében a szerkezetmeghatározás az 5

összes atomra kiterjed, és el is végezhető. A nagy biomolekulák esetében viszont túl sok atom helyzetével kellene elszámolni, majd ezen felül az aminósavsorrendel, a glikozilációval, a diszulfid hidakkal (ezek a primer szerkezetek), a fehérjeláncok hajlataival (szekunder szerkezet), valamint ez utóbbiak felcsavarodásával (tercier szerkezet) kell foglalkozni. Ha több ilyen felcsavarodott fehérje kapcsolódik össze, akkor azok viszonyát is meg kell határozni (quaterner szerkezet). Az aminósav analízis ma inkább a proteolitikus fragmensek analízisén alapszik (peptide maping). Ez történhet HPLC készülékkel UV detektálással (retenciós idők összehasonlítása, vagy újabban tömegspektrometriás (MS) detektálással (pontos tömegek alapján). További lehetőség az MS/MS módszer, amely két tömegspektrometriás mérésen alapszik, a nagyobb fragmenseket szétbombázzuk, és az így keletkező egységek tömegét is vizsgáljuk. Idő, munka és készülékigényes, de a teljes primer szerkezet felderíthető. Fontos a fehérjék N terminális végének változatlansága. Ezt Edman szekvenálással vizsgálják. Az említett módszerek még csak a primer szerkezetek felderítésére szolgálnak. Még ez után következik a magasabb rendű szerkezetek vizsgálata, és a biológiai aktivitás mérése élő sejtkultúrával, vagy más biomolekulákkal való reakció alapján. Hely hiányában ezek itt nem kerülnek ismertetésre. 7 Trendek a biogyógyszergyártásban a. Az eredeti molekulák mellett, a szabadalom lejártával, a rekombináns biogyógyszereknél is megjelentek az utángyártott készítmények. Ezeket Európában biosimilar termékeknek, az USA-ban follow-on biologics -nak nevezik. Magyarországon a bioszimiláris kifejezés terjedt el. Itt is léteznek az un. stand-alone készítmények, amelyek a nem akarnak mindenben hasonlítani az originális készítményre, hanem valamely jobbított tulajdonsággal rendelkeznek. b. A Process Analytical Technology egy viszonylag új törekvés, amelyet az FDA vezetett be. Ez egy olyan szabályzó rendszer, amely a folyamat tervezésétől kezdve él, a tervezés után a termelést követi és elemzi abból a célból, hogy biztosítsa a végső termékminőséget. Ennek elérésére az egész folyamatban (alapanyagok, gyártásközi anyagok, maga a gyártás) figyeli a kritikus minőségi és mennyiségi paramétereket. Ehhez modern módszereket használ, u.m. statisztikai és szimulációs módszerek, folyamat analizátorok (lehetőleg on-line), folyamatirányítási eszközök, tudásbázis építés. A PAT elsődleges előnye a biztos és nagyhatékonyságú minőségbiztosítás, a variabilitás csökkenése, a hibák gyors feltárása és a kiküszöbölése. További nagy előny a technológusok számára, hogy az FDA által egyszer már elfogadott technológiában megenged változtatásokat, amennyiben a kulcs paraméterek nem változnak. c. Egyszerhasználatos készülékek alkalmazása. A fehérjetermékek döntő többsége intravénásan esetleg izomba vagy bőr alá fecskendezve használatosak. Gyártásuk során éppen ezért különösen fontos a termék tisztasága, ezzel együtt az alkalmazott készülékek tisztasága. A tiszta állapotot ellenőrizni és igazolni kell, a tisztítási módszert pedig előzetesen validálni. Ezeket a momentumokat lehet kiváltani egyszerhasználatos készülékek alkalmazásával. Készülnek ilyen jellegű tartályok keverővel és a nélkül, bioreaktorok, szűrők, sőt újabban centrifugabetétek is. A legnagyobb jelenleg forgalomban lévő bioreaktor 1000 liter, tartály pedig 3000 literes léptékben is beszerezhető. A nagyobb térfogatokhoz acél héj tartozik, amelyben az eldobható zacskó kerül, míg kisebb térfogatok önhordók is lehetnek. Gazdasági számítások támasztják alá, hogy az 6

eldobható eszközök alacsonyabb beruházási igénnyel jelentkeznek, ugyanakkor az üzemeltetésük drágább. Ha viszont hozzávesszük, hogy elmarad a tisztítás, annak ellenőrzése, és néhány kiesett sarzs a hibás tisztítás miatt, akkor az eldobhatók felé billen a gazdaságossági mérleg. d. Módosított formulálás és pharmakodinamika. E módszer végcélja, hogy stabilizálja a biogyógyszer terméket a tárolás során és a páciensben is. Ez utóbbi hatására nem kell naponta csak hetente, esetleg havonta beadni a készítményt, mert a molekula féléletideje megnő a szervezetben. Ilyen hatást vált ki a pegylálás (polyetilénglikol PEG), vagy Humán Szérum Albumin (HSA) molekulához való kapcsolása. e. Előnyösebb bevitel: injekció vagy infúzió helyett szájon át, bőrön át, vagy inhalációval bevitt készítmények. Minden szempontból kényelmesebb az alkalmazásuk, megvalósításuk azonban még kezdeti fázisban van, csak néhány molekulára működik. 8 Milyen technológiai jellegű kockázatokkal kell számolni? A termékfejlesztés, regisztráció, gyártás és forgalmazás során sokféle kockázattal kell számolni. Itt most csak a technológiai kockázatok kerülnek említésre. a. A labortechnológia fejlesztésénél a kismolekulákhoz hasonlóan kockázatot rejt a minőség, a várható előállítási költség (cost of goods), a szabadalmi kérdések (Intellectual Property) és a molekula stabilitása. Ez utóbbi speciálisan nehéz kérdés a fehérjék, a DNS-ek és RNS-ek esetében, mert pufferben tárolva a környezetben jelenlévő enzimek támadhatják őket, aggregálódhatnak, oxidálódhatnak. Ugyanakkor 7

csak kis hányaduk alkalmas arra, hogy fagyasztva, vagy liofilezve kerüljenek forgalomba. b. Speciálisan nehéz a rekombináns biomolekulák technológiájának léptéknövelése. A mikroorganizmusok a léptéknövelésből adódó változásokra (keveredési viszonyok, inhomogenitások, oldottoxigénellátottság stb.) úgy reagálhatnak, hogy megváltoznak a szaporodási tulajdonságaik, termelési képességük, vagy a termelt molekula minősége, összetétele, szennyezési profilja. Erre jól ismert példa a Genzyme nevű amerikai cég esete, akik egy monoklonális antitest technológiát fejlesztettek ki 160 literes léptékben, és az így kapott anyaggal végezték el a klinikai vizsgálatokat. A termelést már egy 2000 literes reaktorban kívánták elvégezni, ráadásul egy másik telephelyükön. Az említett változások olyan mértékben változtatták meg az emlős sejtek fiziológiáját, hogy a termék glikozilációja eltért a klinikai mintákban alkalmazottakéitól. Ez alapján az FDA megtagadta az engedélyt és kiegészítő klinikai vizsgálatoktól tette azt függővé, amely komoly idő és pénzveszteséget jelentett a cégnek. c. Ugyanakkor az üzemesítés maga is kockázatokkal jár, különösen nehéz, és különösen Magyarországon ehhez a technológiához értő szakembereket találni. d. Ezekhez jön még a tervezés és a megvalósítás kockázata. Számtalan út létezik a legváltozatosabb technikai megoldásokkal. Ugyanakkor az előírások is gyakran és folyamatosan változnak, és a kockázatok csökkentése érdekében a beruházásnál figyelembe kell venni a trendeket. 9 Kell-e Magyarországon rekombináns biogyógyszergyártás? A válasz egyértelműen igen, mert Magyarország hagyományosan erős gyógyszeriparral rendelkezik. Tekintetbe véve azt, hogy a kismolekulás készítmények mellett egyre nagyobb szerep jut a rekombináns biogyógyszereknek, a magyarországi gyógyszergyárak sem hagyhatják érintetlenül ezt a szegmenst. Ez természetesen bizonyos területeken teljesen új gondolkodásmódot és ismereteket igényel a technológia kifejlesztőitől, üzemeltetőitől, a termékfejlesztőktől, a csomagoláskészítőktől, a minőségbiztosítóktól, és a minőségellenőröktől. Nagyon fontos a megfelelő szakmai háttér támogatása, vagyis, hogy legyenek olyan egyetemi csoportok, kis és nagy iparvállalatok, amelyekkel együtt lehet működni olyan kérdésekben, amelyek házon belül nem megoldhatóak. 10 Hogyan lehet elősegíteni a rekombináns biogyógyszergyártás megerősödését Magyarországon? A minden vonatkozásban felmerülő pénzügyi nehézségek itt is felmerülnek, de sok olyan kérdés is megoldásra vár, amely nem pénz, vagy nem sok pénz kérdése. Évek óta folyik biomérnök (bioengineer) képzés Magyarországon. A rekombináns szervezetek és különösen az emlőssejtek tenyésztésének technikáival mégsem foglalkozik senki egyetemi szinten. Hiányoznak az ezzel kapcsolatos elméleti ismeretek is. 8

Az USA-ban és több nyugateurópai országban nemcsak egyetemen, hanem középiskolában is oktatják a rekombináns szervezetek iparban és gyógyszeriparban való hasznosítását. Beszerezhetők olyan kitek, amelyeket középiskolák és egyetemek számára forgalmaznak. A hallgatók maguk transzformálnak E.coli gazdaszervezetet és fejeznek ki zölden világító fehérjét (Green Fluorescens Protein), amelyet meg is tisztítanak, megismerkedve a technológia szinte minden lépésével. Magyarországon az egyetemekről kikerülő spin-off cégek tevékenységét a kutató munka mellett végzik, legtöbbször az egyetem készülékein. De gyakran nem csak a készülékek, hanem a szemlélet is egyetemi, a szolgáltatás ritkán tartja be a projektekkel szemben támasztott időkorlátokat és technológiai fegyelmet. Különösen nehézkesnek mondhatók az egyetemekkel történő szerződéskötések. Nem ritka, hogy egy-egy szerződés aláírásához fél év szükséges, de volt már több mint egy évig tartó szerződéskötés is. Az egyetemeknek meg kell érteniük, hogy az iparnak nincs ideje, és ha együtt akarnak működni, vagy változtassák meg a szerződéskötések menetét (pl. kevesebb jóváhagyó személy bevonásával) vagy a sok személy gyakrabban ülésezzen. A rekombináns mikroorganizmusokkal való munkavégzés elvileg engedélyhez kötött, az engedélyek kiadása rekombináns munkavégzésre még meglehetősen gyerekcipőben jár. Nincs kialakult gyakorlat, sok vonatkozásban a szakmai hozzáállás sem érte el a nyugati színvonalat. Ez a nehézkes engedélyezés kutatóhelyek és főleg kis és középvállalatok számára nyíltan is és burkoltan is akadályozza felzárkózásunkat ezen a területen. 9