Lord, I fall upon my knees and pray that all my syntheses may no longer be inferior to those conducted by Bacteria (ZENEA Bio Products and Fine hemicals, Billingham, UK) 2.Enzimes és mikrobiális biokonverziók (alapfolyamatok) A mikroorganizmusok (valamint a mesterségesen tenyésztett növényi és állati sejtek, szövetek) bioszintetikus aktivitásukat technológiai célra két különbözo módon fejthetik ki: De novo szintézisek: megfelelo tápoldaton(-ban) elszaporítva az anyagcsere során az egyszeru tápanyagok felhasználásával a legváltozatosabb intra- és extracelluláris anyagcseretermékeket képesek eloállítani. E kategóriába sorolhatók az úgynevezett fermentációs eljárások a legegyszerubb primer anyagcseretermékek eloállításától a bonyolultabb szekunder anyagcseretermékeken át a modern géntechnikai eljárásokkal eloállított sejtekkel operáló fermentációs eljárásokig. Ezekben az esetekben a sejtek teljes biokémiai potenciálját használjuk ki, a sejtek mintegy a növekedés/szaporodás "melléktermékeként" állítják elo a számunkra hasznos terméket. Sémával ábrázolva: szaporodó sejtek tápanyagok termékek A másik esetben ezzel szemben a nem szaporodó sejtek vagy azok részei, alkalmasint csak egy-egy sejtbol kipreparált enzim, mintegy katalizátorként, alakítanak át egy jól definiált vegyületet egy másikká. Ez a biotranszformáció, amelynek sémája A anyag sejt, sejtalkotórész, enzim B anyag E fejezetben az utóbbi típusú, foként mikrooganizmusok vagy enzimeik által katalizált átalakításokkal foglalkozunk, zömmel olyanokkal, amelyeknek van vagy lehet ipari jelentoségük is. Az utóbbi évtizedekben hallatlanul megnott az ilyen transzformációk száma, mivel sok elonnyel rendelkeznek a tisztán szerves kémiai szintézisekkel 121
szemben, illetve rájöttek arra, hogy a mikrobiológiai illetve enzimes transzformációk egy új eszköztárat jelentenek a szerves kémikusok kezében. A biotranszformációk gyakorlatilag lefedik a legfontosabb reakciótípusokat ("majdnem mindent meg lehet csinálni" mikrobákkal vagy enzimeikkel), errol összefoglaló képet nyújt a 15.Táblázat. 15.Táblázat Mikrobákkal végezheto kémiai átalakítások xidációk Redukciók idrolízis idroxilálás,epoxidálás, - kötés dehidrogénezése, alkoholok és aldehidek oxidációja, alkil-, karboxialkil-, ketoalkil láncok oxidatív lebontása, subsztituensek oxidatív eltávolítása, oxidatív dezaminálás, oxidatív gyurufelnyitás, stb Szerves savak, aldehidek, ketonok redukciója, = kettoskötés hidrogénezése, heterofunkciós csoportok redukálása, dehidroxilezés, szubsztituensek reduktív eliminálása, stb. észterek, aminok, amidok, laktonok,éterek, laktámok,stb hidrolízise. Kondenzáció dehidratálás, -ésn-acilezés, glikozilezés, észterezés, laktonizáció, aminálás. Izomerizáció kettos kötés és oxigén tartalmú csoport áthelyezés, racemizálás, átrendezodés Új kötés -, -, -P, -N kötések kialakítása létrehozása A biotranszformációk az enzimes reakciók általános tulajdonságaival jellemezhetok: --Reakcióspecifitás: a katalitikus aktivitás rendszerint csak egy meghatározott reakció típusra korlátozódik, ami azt jelenti, hogy mellékreakciók általában nincsenek (legalábbis ha egy enzim van csak jelen). --Régióspecifitás: a szubsztrát molekulának rendszerint egy meghatározott helyén történik az enzimes támadás (l.késobb, a Bertrand szabályt). --Sztereospecifitás: Az enzim aktív centruma asszimetrikus környezetet biztosít a szubsztrát kapcsolódáshoz, ami lehetové teszi számára az enantiomerek felismerését, azaz egy adott enzim csak az adott enantiomer átalakítását végzi el, vagy új királis centrum létrehozása esetén csak az egyik enantiomer fog keletkezni. ( A kirotechnológia a szerves kémikusoknak optikailag aktív tiszta enantiomerek eloállítására felhasználható eszköztárának egyike, mintegy 122
kiegészítoje az asszimetrikus szintézisnek és a természetbol történo tiszta enantiomer izolálásnak.) --Enyhe reakciókörülmények: Az aktiválási energiát az enzim nagymértékben csökkenti (ez az enzimhatás alapja), így a reakció viszonylag alacsony homérsékleten (az esetek többségében 40 o alatt) is nagy sebességgel megy végbe. Ugyanakkor az optimális p is a semleges, enyhén savas vagy enyhén lúgos tartományba esik. Következésképpen még labilis, könnyen bomló molekulák reakciói is levezethetoek. A biotranszformációk több mint felét proteázokkal, észterázokkal és lipázokkal hajtják végre, aminek egyrészt az az oka, hogy ezek a legkönnyebben hozzáférheto olcsó, iparilag eloállított enzimek, másrészt nincs kofaktor igényük. Utóbbi igen nagy elony, hiszen a oxidációs/redukciós biotranszformációk esetén rendszerint NAD ill. NADP mint kofaktorok szerepelnek, és ezeknek a regenerálásáról is gondoskodni kell. Noha ma már ez - mint látni fogjuk - megvalósítható, mégis ez az oka annak, hogy az oxidációs redukciós átalakítások zömét ma még teljes sejtes (fermentációs illetve nyugvó sejtes ) körülmények között végzik. Ugyanígy az oxigén illetve hidroxil-csoport bevitel hasonló okokból foképp teljes sejtes rendszerekben megy végbe. A biotranszformációk végrehajtásakor az átalakítást végzo enzim lehet a sejt része, avagy kinyert tisztított enzim is. E szerint a következo, technikai kivitel és bonyolultság, valamint nem utólsó sorban költségek tekintetében eltéro rendszereket használják: --Biotranszformáció növekedo sejtekkel: ez tulajdonképpen speciális fermentációs technika, ahol az átalakítandó szubsztrát igen nagy része konvertálódik termékké, miközben a mikrobatömeg is növekedik. Ilyenek az ecetgyártás, szorbóz fermentáció, glükonsav fermentáció, stb. --Konverzió nyugvó sejtekkel: ekkor növekedés nincs, a közeg vagy hiányos tápoldat (például nem tartalmaz nitrogén forrást) vagy csak egy puffer. Ilymódon például a szorbit szorbóz átalakítás is elvégezheto. Speciális esetnek tekintheto az, amikor gomba-konidiospórákkal végeznek transzformációkat (szteroidok, zsírsavak, trigliceridek átalakítása): néha éppen a konídiumok csírázása közben aktiválódnak, szintetizálódnak azok az enzimek, amelyek a kívánt átalakítást katalizálják. --Biokonverziók rögzített sejtekkel. Példaként az almasav eloállítását említjük karragénben rögzített Brevibacteriummal fumársavból, a kortizonnak 123
alginátban rögzített Arthrobacter simplex sejtekkel való átalakítását prednizolonná. --Biotranszformációk tisztított enzimekkel (akár oldott, akár rögzített enzimekkel) --Biotranszformációk fázisrendszerekben (többfázisú rendszerekben) 2.1. xidáció/redukció Biológiai oxidációkban az 2 mint végso elektronakceptor muködhet, vagy közvetlenül belép a szerves molekulába. Az oxigénnel reagálni képes enzimeknek 3 csoportját különböztetjük meg: oxidázok vagy elektrontranszferázok (például glükóz-oxidáz): 2 + 2e - 2 2-22 dioxigenázok vagy oxigéntranszferázok (például triptofán-pirroláz): A + 2 A2 A dioxigenázoknak elsosorban az oxidációs gyurufelnyitási reakcióknál van jelentoségük (pl.a triptofán N-formil-kinurenin triptofán-pirroláz által katalizált reakciónál, amely a Trp lebontás és egyszersmind a NAD szintézis elso lépése). monooxigenázok vagy hidroxilázok (például szteroid hidroxilázok): A + D2 + 2 A + D + 2 Ennél az oxidációnál egy koreduktáns (D2 ) anyagra is szükség van, ami általában a redukált NADP koenzim szokott lenni. 2.1.1. Primer alkoholok oxidációja A nagyszámú átalakítási lehetoség közül itt csak az etanol konverzióját említjük meg ecetsavvá. Bizonyos baktériumok, az un. ecetsavbaktériumok (Acetobacter-ek) az etanolt ecetsavvá képesek oxidálni: 3-2 Acetobacter aceti 2 3- + 2 124
Az Acetobacter-félék két csoportba sorolhatók: az elso csoportba tartozó baktérium törzsek (pl. az Acetobacter peroxydans) a képzodött ecetsavat túloxidálják 2-dá és vizzé. A másik csoport tagjai erre a túloxidációra nem képesek, illetve ez a folyamat elhanyagolhatóan lassú, így ezen baktériumokkal az etanolt jó konverziós hatásfokkal lehet ecetsavvá oxidálni. Ez a reakció az alapja az ipari, (mikro)biológiai ecetsav gyártásának. Az ipari ecetsavgyártásnál a biokonverziót végzo baktériumok egy oszlopban porózus hordozóhoz tapadnak (bükkfa-forgácshoz) és ezen csurgatják keresztül az alkoholt (felhígított állapotban). Ezt az un. generátor eljárást kezdi kiszorítani az ipari gyakorlatból a szubmerz eljárás. A törzsek az optimális oxidációhoz nagymennyiségu oxigént igényelnek. a ez nincs jelen a közegben megfelelo mennyiségben, akkor a sejtek a nagy etanol- és ecetsavkoncentráció miatt elpusztulnak. (5 % összkoncentráció mellett a levegoztetés megszunése után két perccel a baktériumok 34%-a elpusztul; ha az összkoncentráció 12 %, akkor ugyanez az elhalási arány 10-20 s alatt bekövetkezik.) Ezért nem dolgoznak az ecetsavüzemek nagy szubsztrátkoncentrációval és ezért ügyelnek az ilyen üzemben a folyamatos oxigénellátásra fokozott mértékben! 2.1.2. Szekunder alkoholok oxidációja. Gluconobacter suboxydans (régebbi neve Acetobacter suboxydans) a glicerint jó konverziós hatásfokkal (95-96 %) dihidroxi-acetonná (DA) oxidálja szubmerz körülmények között. A DA-t a kozmetikai ipar alkalmazza borbarnító szerként. xigénben dúsított levego befúvatásával a fermentációs idot 33 órára sikerült rövidíteni Gluconobacter melanogenus törzs és 10 %-os glicerinoldat esetén. 2-2 - Acetobacter suboxydans 2 - = + 2 2-2 2-2.1.2.1. Szorbóz fermentáció, aszkorbinsav eloállítás Ugyancsak Gluconobacter suboxydans törzzsel lehet szorbitból szorbózt termelni. Bertrand már 1904-ben megállapította a Gluconobacter-félék specifikusságát a polialkoholok oxidációjánál. Eszerint ezek a baktériumok 125
csak olyan szekunder hidroxil-csoportot képesek oxidálni, amelynek szomszédságában 2 cisz helyzetu alkoholos található. Ez az elso világos megfogalmazása volt a biokémiai oxidációk szigorú specifikusságának. Reichstein 1934-ben hozta nyilvánosságra a szintetikus aszkorbinsav, a - vitamin eloállítási módját, amelyben az L-szorbóz az egyik közbenso termék. Az un. Reichstein szintézis során a 53. ábra értelmében a kiindulási anyag a D- glükóz, amelyet katalitikus hidrogénezéssel redukálnak szorbittá. A modern eljárásokban a valódi alapanyag egy enzimes ( α-amiláz és glükoamiláz) hidrolízissel elbontott keményíto szörp. A következo lépés a D-szorbit régiospecifikus (tehát a Bertrand szabálynak megfelelo) dehidrogénezése, oxidációja L-szorbózzá. Ezt az átalakítást Acetobacter xylinum, Acetobacter (vagy Gluconobacter) suboxydans törzsek képesek elvégezni. A fermentációnál az okozhat problémát, hogy e mikroorganizmusok érzékenyek a tápoldat Ni-tartalmára, a megelozo lépés katalitikus hidrogénezését viszont éppen Raney-nikkel katalizátorral végzik, ezért ma az iparban nikkelhez szoktatott mikróbákkal végzik a szorbit-szorbóz átalakítást. A szorbóz fermentáció ugynevezett rátáplálásos technológia: 10-20 % szorbitot és 0.1-0.5% nitrogénforrást (élesztokivonatot és/vagy kukoricalekvárt) tartalmazó tápoldatot oltanak be a megfelelo Acetobacter törzs 5-10%-nyi oltóanyagával, majd 24 órás intenzív aerob tenyésztés során a szorbit koncentrációt rátáplálással úgy változtatják, hogy a fermentáció végére összesen mintegy 33-35% szorbit kerüljön a reaktorba. (lyan eljárás is ismert, ahol a szorbit végtiter 50% -ra is felmehet) A 30-35 o-on végzett fermentáció hatásfoka igen jó, 95% felett is lehet ( nagyon kis mennyiségben D-fruktóz és 5-keto-D-fruktóz is megjelenik a fermentlében). Iparilag is gazdaságos folytonos szorbóz fermentációs technológiákat is kidolgoztak, valamint az Acetobacterek nem szaporodó (tehát például N- mentes tápközegben tartott) sejtjei (ez az un. "nyugvósejtes" fermentáció) illetve hordozóhoz rögzített szaporodó vagy nemszaporodó sejtjei is alkalmasak a szorbit oxidációjára. A -vitamin gyártás további lépései az 53.ábrán követhetok. Az L-szorbózt Gluconobacter melanogenus szaporodó vagy akár nyugvó sejtjei is képesek L-szorbozonná oxidálni, utóbbit viszont a Pseudomonas putida 80%-os konverzióval oxidálja tovább 2-keto-L-gulonsavvá. Ezen intermedierig tehát egyéb, alternatív, pl. az 54.ábrán látható reakcióúton is eljuthatunk. Ugyanakkor más, foképpen mikrobiológiai átalakításokat felhasználó úton is eljuthatunk a 2-keto-L-gulonsavig pl az 55.ábrán látható módon. Ekkor a 126
kiindulási anyag szintén D-glukóz, de már az elso lépést is fermentációval végzik el: ugyanaz az Acetobacter suboxydans a már ismert módon glükonsavvá képes oxidálni, majd 5-keto-glükonsavvá tovább oxidálja (a következo alfejezetben errol részletesebben szólunk). Ez a fermentáció 25oon 90%-os konverzióval hajtható végre úgy, hogy a keletkezo savat folyamatonosan lekötik a tápoldatba adagolt kalcium-karbonáttal. A képzodött a-5-keto-glükonátot katalitikusan hidrogénezik. Ekkor a a-d-glükonát és a a-l-gulonát 1:1 arányú elegye (lám, a nem enzimes átalakítások nem sztereoszelektívek!) keletkezik, amely keverékbol csak az utóbbit lehet Xanthomonas translucens-szel 2-keto-L-gulonsavvá oxidálni. 2 2 katalitikus hidrogénezés (Ni) Acetobacter suboxydans, Acetobacter xylinum (szorbit-dehidrogenáz) 2 170 200 bar 2 2 NAD NAD 2 glükóz D-szorbit 2 2 2 kémiai átalakitás enolizáció 2 kémiai oxidáció 2 L-szorbóz Aszkorbinsav 2-keto-L-gulonsav 53.ábra Glükózból kiinduló -vitamin szintézis Innen a további eljárás azonos, a 2-keto-L-gulonsavat többlépéses kémiai átalakítással, ugynevezett enolizációval alakítják át aszkorbinsavvá. Ma a világ -vitamin gyártásának, amely 100-120 ezer tonna/év, több mint 80 %-a Kínában valósul meg a klasszikus (itt elso helyen megemlített) módszer egy változatával. A kínai gyártáson kívüli ismert nagy gyártók: BASF/TAKEDA, a DSM és a Merck. 127
A modern törekvések arra irányulnak, hogy a glükózból (vagy galaktózból) egy fermentációs lépésben de novo állítsák elo a c-vitamint. Erre genetikailag módosított S. cerevisiae törzsek bizonyultak alkalmasnak. Megjegyezzük, hogy az aszkorbinsav de novo fermentációval növényi sejtekkel is eloállítható (legalábbis laborszinten eloállították), Rosa rugosa növényi sejtekkel 1-2%-os glükóz, vagy fruktóz vagy galaktóz tartalmú tápoldaton. 2 2 Szorbóz Gluconobacter melanogenus 2 L-szorbozon Pseudomonas putida 54.ábra Alternativ 2-keto-L-gulonsav eloállítás A. 2 2-keto-L-gulonsav a/2 Xanthomonas translucens 2 a/2 2 Acetobacter suboxydans Acetobacter suboxydans 2 glükóz 2 2 D-glükonsav 2 2 a-5-keto-d-glükonát 2 2 Acetobacter suboxydans 2 a-l-gulonát a/2 2 2-keto-L-gulonsav 2 a-d-glükonát 55.ábra Alternativ 2-keto-L-gulonsav eloállítás B. 128
2.1.3. Redukáló cukrok oxidációja Az aldózok közül a glükóz oxidációjának van ipari jelentosége. Noha glükózból glükonsavat kémiai módszerekkel is lehet nyerni (hipokloritos-, elektrokémiai oxidáció), mégis az ipari gyakorlatban a mikrobiológiai módszert alkalmazzák. A glükózt számos mikroorganizmus (Aspergillus niger, Gluconobacter suboxydans, Pseudomonas ovalis stb.) képes glükonsavvá oxidálni. Az Aspergillusok a glükóz glükonsav átalakítást a glükóz-oxidáz enzimjükkel végzik, amely enzim tulajdonképpen nem igazi oxidáz, hanem egy flavoporotein-dehidrogenáz. A reakciónál a levego oxigénje a hidrogénakceptor, pontosabban az elekron akceptor. A reakciónál képzodo toxikus hatású hidrogén-peroxidot a sejt kataláza azonnal vízzé bontja le. A fermentációt szubmerz körülmények között végzik, rendszerint Aspergillus niger törzszsel. Az oxidáció során képzodo glükonsavat semlegesíteni kell pl. a3 adagolással, mert különben a p változás leállítja a folyamatot. Bizonyos gyárak félfolytonos eljárással dolgoznak, azaz a szakaszos fermentációs ciklus befejezése után a tenyészet 1/4-1/5-ét a fermentorban hagyják és friss tápoldattal töltik fel, így kezdenek egy újabb tenyésztési ciklust. (A folyamat 5-10-szer ismételheto.) Más üzemekben a penész 56.ábra Glükonsav fermentáció 129
micéliumot kiszurik és ezt használják fel újra- és újra a glükóz glükonsav transzformációhoz. (Ebben az esetben valódi transzformációról és nem növekedéssel kapcsolatos fermentációról van szó.) a a glükóz oxidációját Gluconobacter suboxydans baktériummal végzik, akkor az átalakítást NAD-függo dehidrogenáz enzimek végzik és a képzodött glükonsav- a Bertrand szabálynak megfeleloen - tovább oxidálódik 5-ketoglükonsavvá. A konszekutív reakció második lépését a reakció körülményeinek szabályozásával vissza lehet szorítani (semleges p, 37 o) ill. elo lehet segíteni (savanyú p, 25-30 o, a3 adagolás; az 5-keto-aglükonát ugyanis csaknem oldhatatlan, így az egyensúly erosen jobbra tolódik). Ma már nagyipari glükonsav technológiát is üzemeltetnek enzimes biokonverzióval (ARGNNE,USA), amelynek során rögzített glükózoxidáz enzimet használnak. A keletkezett savat nem semlegesítik klasszikus módszerekkel, hanem un. elektrodeionizálási muvelettel, amelyet az enzimes reaktorba integrálnak, folyamatosan eltávolítják a rendszerbol. A glükóz-oxidáz enzimet nagy szubsztrátfajlagossága alkalmassá teszi a glükóz enzimes meghatározására. Glükóz-oxidáz enzimelektródokat is forgalomba hoztak. Az enzimet nemcsak analitikai célra használják, hanem biológiai anyagokban lévo glükóz ill. lezárt palackok oxigéntartalmának eltávolítására is. A glükonsavat a gyógyszeripar ill. a gyógyászat a kis toxicitása miatt szivesen és általánosan alkalmazza, elsosorban Fe, u, a és egyéb elemnyomok szervezetbe való bevitelénél. Nagyobb mennyiségu glükonsavat ill. glükono-δ -laktont használ fel a tisztítószeripar (üvegek és fémtárgyak tisztítására) és a muanyagipar. A glükono-δ -laktont a húsiparban páclevek p-jának beállítására is alkalmazzák. A kristályos glükonsav elôállítása nehéz, ezért a savat 50 %-os koncentrátum formájában hozzák forgalomba. ldatban a sav- és a laktonforma egyensúlyban van. A δ-lakton a keverékbol könnyen kikristályosítható. 2.1.4.Egyéb oxidációs/redukciós átalakítások Ketonoknak NAD(P) függo dehidrogenázok által történo redukálása során egy sztereokémiai szempontból jelentos tény, hogy csupán az egyik királis vegyület képzodik, az esetek nagy többségében az úgynevezett Prelogszabálynak megfeleloen. Ez azt jelenti, hogy ha a 57.ábra szerint tekintjük a 130
ketont, az úgy fog alkoholos hidroxil csoporttá alakulni hidrid ion felvételével a koenzimrol, hogy a nagy szubsztituens a jobboldalán, a kis szubsztituens pedig a bal oldalán legyen a hidroxil csoportnak. K kis N nagy szubsztituens PRELG alkohol-dehidrogenáz K N K N NAD(P) NAD(P) + KEN ZIMREGENERÁLÁS K ANTI-PRELG 57.ábra Sztereoszelektív redukció (Prelog-szabály) N Sokáig szinte kizárólag olyan dehidrogenázokat találtak (például a lómájból származó alkohol dehidrogenáz és a Thermobacterium brockii alkohol dehidrogenáza ilyen), amelyek követik a Prelog szabályt. Manapság azonban érdekes módon találtak olyan enzimeket is, amelyek az anti-prelog szabályt követik, azaz éppen a fordított orientációjú tiszta optikailag aktiv szekunder alkoholt állítják elo. Vagyis ma már a szerves kémikus ígénye szerint mód van a Prelog vagy az anti-prelog szabály szerint képzodo tetszoleges optikai izomér szekunder alkohol ketonból történo eloállítására. Az ábrán utalunk a szükséges koenzim regenerálási lépésre is, errol részletesebben a 2.9 fejezetben szólunk. 131
2.2. Szteroid vegyületek biotranszformációja Sok szteroid vegyületet - különösen hormonhatásuk következtében - gyógyszerként alkalmaznak. A természetben található szteroidok átalakítása során mikroorganizmusokkal illetve azokból nyert enzimekkel egy sor olyan transzformációt lehet elvégezni, amelyek szerves szintetikus módszerekkel egyáltalán nem vagy csak igen bonyolultan lennének elvégezhetoek. A 16. Táblázat vázlatosan összefoglalja a legfontosabb szteroid átalakításokat a biokonverzió reakció típusa szempontjából, a 17. Táblázatban pedig iparilag jelentos ilyen átalakításokat mutatunk be. 1 2 10 3 5 4 11 12 13 17 16 14 15 9 8 6 7 KLESZTERIN Az elso mikrobiológiai szteroid oxidáció 1948-ban két magyar kutató, Krámli és orváth nevéhez fuzodik, ok a Proactinomyces roseum fonalas baktérium segítségével koleszterint alakítottak át 7-hidroxi-koleszterinné. Proactinomyces roseum 7 koleszterin 7--koleszterin 132
16.Táblázat Szteroidok mikrobiális transzformációinak reakciótípusai transzformáció oxidáció redukció hidrolízis észterezés mechanizmus szekunder alkohol oxidációja ketonná primer csoport bevitele oldalláncra szekunder csoport bevitele a szteroid magra tercier csoport rávitele a szteroid magra A-gyuru 1,2 és 4,5 helyzetu dehidrogénezése A-gyuru aromássá tétele Metilén csoport keto csoporttá oxidálása a pregnán oldallánc eltávolítása ketová oxidációval, 17 helyen a pregnán oldallánc eltávolítás 17-nél és D-gyuru felnyitás tesztololakton képzéssel szteroid oldallánc eltávolítás és karboxil csoporttá alakítás pregnán oldallánc (17) eltávolítása és szekunder alkohollá alakítás epoxid-képzés dekarboxilezés keton redukció szekunder alkohollá aldehid redukció primer alkohollá az A-gyuru 1,2 helyén kettoskötés hidrogénezése az A gyuru 4,5 és a B-gyuru 5,6 kettoskötéseinek hidrogénezése szekunder alkohol eliminálása szteroid észterek elszappanosítása acetilezés Sajnos kevés figyelmet szenteltek ennek az eredménynek és noha mások is értek el eredményeket mikrobás illetve enzimes szteroid-átalakítással, az igazi áttörést az elso iparilag is jelentos transzformáció jelentette. Az Upjohn o. kutatói, Murray és Petersen Rhisopus nigricans-szal progeszteront 90% feletti konverzióval alakítottak át 11α--progeszteronná: 133
3 3 Rhizopus nigricans 11 progeszteron 11α hidroxi-progeszteron Ennek az átalakításnak forradalmasító hatása volt, ugyanis a 11-es szénatomon történo hidroxilezésnek az a jelentosége, hogy az összes szteroid alapú gyulladásgátló illetve -csökkento szerek ilyen helyzetu -csoportot tartalmaznak. Ezzel az egyszeru reakcióval sok biológiailag értékes vegyület, gyógyszer részleges- illetve totálszintézisének komplikált lépéseit lehetett egyszerusíteni. Egy lehetséges hidrokortizon eloállítást mutat a következo reakció, amelyet a urvularia lunata katalizál: 2 -A 2 urvularia lunata 2 11 2 -Ac REISTEIN-S-acetát NADP+ + NADP + a az átalakítás alapanyagául a REISTEIN-S vegyületet választjuk, akkor a 11-es helyzetben hidroxilezett foterméken kívül 14-es helyzetben hidroxilezett melléktermék is keletkezik. a a kiindulási anyag a REISTEIN-S 17-acetil származéka, akkor csak a 11-es helyen hidroxilezett termék keletkezik. A 17- acetoxi csoport ugyanis sztérikusan módosítja a 14-es szénatom közvetlen környezetét, az átalakításért felelos enzim "nem fér oda". Ez jó példa az enzimek és egyben a mikrobiológiai transzformációk ugynevezett régióspecifikusságára. xidációs példaként álljon még itt a kettos kötés létrehozását jelento dehidrogénezés. Ennek elso leírása is KRÁMLI és RVÁT nevéhez fuzodik. Nagy jelentoségu a szteroid váz 1,2 kettoskötésének létrehozása, ugyanis így a hidrokortizonból kedvezobb biológiai hatású prednizolon 134
állítható elo (nagyobb gyulladáscsökkento hatás és kisebb sóretenció jellemzi ezt a vegyületet). 2 2-2 11 2 1 A szteroid átalakításoknál a kiindulási anyag koncentrációja a tápoldatban 0.05-0.1% között van de az oldhatóságuk ennél jóval kisebb. A mikroba természetesen csak az oldott anyagokat képes átalakítani, vagyis az ilyen un. "pszeudo kristály fermentáció", amikor látszólag oldódás nélkül alakul egyik anyag a másikká, valójában azt jelenti, hogy a csekély oldhatóságú anyag oldatban alakul át de azonnal ki is válik a termék. A gyulladásgátló anyagokon kívül a szteroid-készítményeknek egy sor egyéb gyógyszeripari felhasználása is van : férfi és noi nemi hormonok, fogamzásgátlók, anabolikumok, rákellenes szerek, altatók stb. készülnek belolük, ma a piacon évi egymilliárd dolláron felüli a szteroid készítmények forgalma. Ehhez többezer tonna alapanyagra van szükség, amelynek jó része növényi (szitoszterin dioszgenin, szolaszodin stb.), kisebb része állati (koleszterin, stb) eredetu. ogy a szteroid transzformációk sokféleségét érzékeltessük, az 58.ábrán bemutatjuk az egyik tipikus alapanyag, a progeszteron egy sor átalakítási lehetoségét. 135
17.Táblázat Néhány kereskedelmileg jelentos szteroid átalakítás REAKIÓ SZUBSZTRÁT TERMÉK MIKRRGANIZMUS 11α-hidroxilálás progeszteron 11α-hidroxiprogeszteron Rhizopus nigricans 11β-hidroxilálás Reichstein S hidrokortizon urvularia lunata 16α-hidroxilálás 9α-fluoro-kortizol 9α-fluoro-16αhidroxi-kortizol Streptomyces roseochromogenus (triamcinolon) 1-dehidrogénezés hidrokortizon prednizolon Arthrobacter simplex diéndiol triéndiol Septomyxa affinis 1-dehidrogénezés, progeszteron 1-dehidrotesztololakton ylindrocarpon oldallánc lebontás, radicicola D-gyuru expanzió (tesztolakton) ldallánc eltávolítás β-szitoszterin androsztadién-dion Mycobacterium sp. és/vagy androszténdion 136
1-dehidro-tesztololakton tesztololakton 6β hidroxi-androszt-4-én-3,17-dion ylindrocarpon rudicicola 3 11α-hidroxi-progeszteron Aspergillus sp. Penicillium sp. Gliocladium catenulatum 1,4 androsztadién-3,17-dion 3 Dactylium dendroides Aspergillus sp,rhizopus sp. Mucorales, Aspergillus sp Dactylium dendroides 3 Streptomyces lavendulae Fusarium sp Gliocladium,Aspergillus 4-androsztén-3,17-dion 11α,17α-dihidroxi-progeszteron Rhizopus nigricans progeszteron Streptomyces lavendulae 3 3 Rhizopus sp. Mucorales Actinomycetes 20β-hidroxi-pregn-4-én-3-on 6β,11α-dihidroxi-progeszteron 3 11α-hidroxiallo-pregnán-3,20-dion 3 14α-hidroxi-progeszteron 3 16α-hidroxipregnán-3,20-dion 58.ábra Progeszteron mikrobiológiai átalakításai 137
2.3. Transzglikozilálás Általánosított egyenlete a következo: R 1 - - R 2 + R 3 R 1 - - R 3 + R 2 - glikozil donor akceptor termék mellétermék Glikozil donor lehet: hexóz-foszfát, di-, tri-... poliszaharid. Akceptor lehet: alkohol, mono-, di-...poliszaharid. Termék lehet: glikozid, di-, tri-... poliszaharid. Az elso transzglikozilálási reakció, amelyet leírtak, a szaharóz képzôdése volt: Pseudomonas glükóz - 1 - P + fruktóz szaharóz + Pi Ez alapján a reakció alapján feltételezték, hogy a sikeres transzglikozilálási reakcióhoz szükséges nagy energiatartalmú foszfátkötés jelenléte. Késobb kimutatták, hogy ez nem elengedhetetlen és pl. Aspergillus niger maltózból transzglikozilálással egy triszaharidot képez: 2 2 2 maltóz+maltóz Aspergillus glükóz (1 6) glükóz (1 4) glükóz + glükóz niger A fentiekhez hasonló transzglikozilálási reakciókkal egyszeruen lehet glikozidkötéseket létrehozni és így különbözo di-, tri- és magasabb polimerizációs fokú oligoszaharidokat eloállítani Kb. 6 éves munka során 138
mikrobiológiai transzglikozilálási módszerrel több mint 30 oligoszaharidot ill. származékot szintetizáltak. Ez a szám megközelíti az E.Fischer óta kémiai módszerekkel nyert vegyületek számát. A mikrobiológiai transzglikozilálási reakciók közül a mikrobiológiai eredetu poliszaharidoknak van ipari jelentosége, ezek közül is elsosorban a dextránnak. Nagyszámú mikroorganizmus képes növekedése során extracelluláris (sejtenkívüli) dextrán szintézisre. A dextrán olyan elágazó láncú glükózpolimer, amely a lineáris láncban a-1,6-, az elágazásban a-1,4- és a-1,3-glikozidkötéseket tartalmaz. A dextránt klinikai célra vérplazmapótlóként használják, de jelentos a dextrán azért is, mivel az ipari gélszurok eloállításának egyik legfontosabb alapanyaga. A dextrán ipari termelésénél csaknem kizárólag heterofermentatív tejsav baktériumokat használnak (Leuconostoc mesenteroides törzset). A dextránszintézis menete a következo: a transzglikozilálásnál az akceptormolekula szaharóz és a donor molekula is szaharóz: szaharóz + n szaharóz L.mesenteroides dextrán-szaharáz dextrán + n fruktóz A képzodött dextránmolekula végén egy szaharóz-egység van és ehhez kapcsolódnak a donor szaharóz molekulából a glükózegységek. A szaharóz fruktóz része melléktermékként halmozódik fel. A transzglikozilálást nem elozi meg hidrolizis - amely a kötési nergia elvesztését jelentené - hanem a polimerizációnál a glükóz rész transzglikozilálási mechanizmussal adódik át az akceptor molekulára az enzim donor akceptor komplexben. A transzglikozilálás után a fruktóz (aglükon rész) az enzim-komplexrol leválik. A nyers dextrán a fermentlébol alkohollal kicsapható, ezután az oldatban visszamaradó fruktózt is ki lehet nyerni. A polimer lineáris hosszabbodásáért a dextrán-szaharáz enzim felelos, az elágazást egy másik enzim segíti elo. Az elágazások gyakoriságát (tehát a képzodött dextrán jellegét) a két enzim aktivitásának aránya szabja meg, amelyet viszont a reakció körülményekkel (p, o stb.) lehet elsosorban befolyásolni. 139
2.4. Kondenzáció a a szaporodó pékélesztô tenyészethez lassú ütemben benzaldehidet adagolunk, akkor acetil-fenil-karbinol képzodik. A biokondenzáció mechanizmusa a következo: a tápoldatban lévo glükózt a Saccharomyces cervisiae glikolitikus enzimrendszerével lebontja acetaldehidig. A glikolizis során képzodo nascens acetaldehid a benzaldehiddel kondenzál. Az izolált aciloin reduktív metilaminálással könnyen konvertálható L-efedrinné. Ez hatékony szimpatikus-ideg izgatószer. Az acetil-fenil-karbinol képzodést a piroszolosav adagolás elosegíti. a az adagolt benzaldehid szubsztituált, akkor efedrin-származékot kapunk. élesztõ + 3 --3 --3 N-3 acetil-fenil-karbinol efedrin 2.5. Izomerizálás A glükóz izomerizációja fruktózzá az egyik legnagyobb volumenben végrehajtott ipari enzimes átalakítás, tekintve, hogy a fruktóz édesebb, mint a glükóz (utóbbi édessége csak mintegy 70-75%-a a szaharózénak míg a fruktóz készer olyan édes mint a szaharóz). Továbbá a fruktóz lassabban szívódik fel és nem befolyásolja a vércukor szintet, ílymódon a keményítobol eloállított kisebb élvezeti értéku glükózt jobban hasznosítható és egészségesebb cukorrá lehet átalakítani. Ma is nagy már ennek az eljárásnak az ipari jelentôsége, de az egyre növekedni fog. Segítségével az USA-ban 1975-ben 900 millió kg glükózfruktóz szirupot gyártottak, ez az érték 1977-ben már elérte a 2000 millió kg-ot. 1980-ban az USA-ban az édesítoszer-igény mintegy 30 %-át izosziruppal fedezték. 140
2 - vagy glükóz-izomeráz 2 2 D-glükóz D-fruktóz Az ábra szerinti átalakulás molekulán belüli átrendezodés, izomerizáció, amelynek során az aldohexóz glükózból egyensúlyra vezeto reakcióban ketohexóz fruktóz képzodik. Ezt az átalakítást egy sor enzim képes katalizálni: -Glükóz-foszfát-izomeráz (E 5.3.1.9. D-glucose-6-phosphate-ketolisomerase), amely enzimet Escherichia intermedia, Aerobacter aerogenes, Aerobacter cloaceae mikrobák képesek eloállítani. Az ilyen eredetu enzimek azonban arzenátot (és természetesen foszforilezett glükózt) igényelnek az átalakítási reakcióhoz aktivátorként, ezért ipari (élelmiszeripari) célra nem alkalmasak. -Glükóz-izomeráz (E 5.3.1.18. D-glucose-ketol-isomerase), amelyet egy sor heterofermentativ tejsavbaktérium képes termelni, de alacsony muködési hofok optimuma miatt nem alkalmazzák a gyakorlatban. -Az iparban egyedül alkalmazott ilyen enzim a D-xylóz-izomeráz (E 5.3.1.5. D-xylose-ketol-isomerase), amelynek az ipari felhasználást lehetové tevo elonyös tulajdonságai a következok: -alacsony p optimuma van, amely fontos a mellékreakciók elkerülése szempontjából (pszikóz képzodés nagy p-n), -nagy a fajlagos aktivitása (azaz kis fehérjetartalom nagy katalitikus aktivitást hordoz), -a nagy homérsékleti optimum (80 o) a reaktorok befertozodésének elkerülése miatt jelentos, -muködéséhez nincs szükség koszubsztrátokra. Ilyen enzimet sok mikroorganizmus termel xylózzal történt indukció hatására, például Bacillus coagulans (NV cég evvel termel), Arthrobacter sp. (II), 141
Actinoplanes missouriensis (GIST-BRADES), Streptomyces albus (Miles- Laboratories). Ipari célra az enzimet nem nyerik ki a sejtekbol, hanem a tenyésztés és az azt követo sejthomogenizálás(=sejtfeltárás!) után a sejteket keresztkötés létesítéssel rögzítik és az így létrejött un. whole-cell glükózizomeráz készítményt ( SWEETZYME ) porlaszva szárított enzim-por, fagyasztva szárított enzim-pelyhek vagy extrudált enzim-rudacskák formájában használják fel. Az immobilizált teljes sejteket mind szakaszos üzemu mind fixágyas töltött oszlop reaktorokban felhasználhatják a konverzióra. A 18. táblázat a szakaszos és a folytonos eljárás néhány jellemzojét veti össze.. A glükóz-izomeráz enzim optimális muködéséhez Mg2+ és o2+ fémionokra van szükség, ugyanakkor például a a2+ ionok mérgezik, ezért az alapanyag glükózoldatot ioncserével kalcium-mentesíteni kell 1 mg/dm3 koncentráció érték alá. A 19. táblázatban két ipari készítmény tulajdonságait hasonlítjuk össze. Az invertcukor, izoszörp, FS (amely 70-71% sz.a. tartalmú és amelyben 42% a fruktóz és 53% a glükóz) valamint a nagy fruktóztartalmú termékek részletes eloállítási technológájával más tárgyak során ismerkednek meg. 18.Táblázat Szakaszos és folytonos FS (high fructose syrup) eloállítás néhány paraméterének összehasonlítása PARAMÉTER Reaktor térfogat m3 1-50 Enzimfogyás tonna/év 17-20 Ionigény MgS4.72 t os4.72 t SZAKASZS ELJÁRÁS FLYTNS ELJÁRÁS 4.3 2.2 2.2 - Színanyagtermelés % 0.05-0.1 0.0-0.02 Pszikóz melléktermék % 0.1 0.1 142
19.Táblázat Két ipari rögzített teljes-sejtes glükóz-izomeráz készítmény tulajdonságai Mérési körülmények B.coagulans(NV) Actinoplanes missouriensis (GIST-BRADES) p 6.5 7.0 puffer 0.25 mol/l 0.02 mol/l foszfát Na/malát So glükóz 5% 180 g/l Mg2+ mmol/l o2+ mmol/l 100 1 3 0.3 homérséklet o 65 70 inkubálási ido min 20 10 mért aktivitás U/g 500 1295 Magyarországon 1978-82 között Szabadegyházán 4 Milliárd forintos beruházással egy évi 140.000 tonna kapacitású kukoricafeldolgozó üzem létesült. Ennek a modern kombinátnak a termelési spektruma a következo: Folyékony cukor 49.500 t sz.a./év Finom szesz 200.000 absz. hl/év Kukoricacsíra 10.000 t/év Glutén 6.300 t/év Takarmány 30.000 T/év Érdemes megjegyezni, hogy ez volt az elso folyékony cukor üzem Európában. 2.6. Reszolválás 2.6.1. Aminosavak reszolválása A reszolválásnak különösen az aminosav kémiában van jelentosége, ill. e helyen az általános problémakörbol foként evvel a kérdéssel foglalkozunk. Az iparilag termelt aminosavakat foként táplálkozásra (élelmiszerként és takarmányként), valamint gyógyszer alapanyagként használják fel. Ezeken a 143
területeken csak a természetes L-forma hasznosul. A szintetikus módszerek viszont racem, D,L-aminosavat eredményeznek, így a racem aminosavak reszolválása kiemelt jelentoségu. Gazdasági szempontból fontos továbbá a D- aminosav átalakítása L-módosulattá. A D,L-aminosavak elválasztásának leggyakrabban alkalmazott módszere az enzimes reszolválás. Az ipari gyakorlatban az enzimes, sztereospecifikus reszolválásnak két módszere terjedt el: az aszimmetrikus szintézis és az aszimmetrikus hidrolizis módszere. Ezeket az enzimes reszolválási módszereket alkalmazzák az i-leucin, lizin, metionin, fenilalanin, triptofán és a valin ipari eloállításánál. Az aszimmetrikus szintézisnél a racém aminosav acilszármazékát anilinnal és papain-enzimmel inkubálják, ekkor acil-l-aminosav-anilid képzodik, amely az oldatból kicsapódik. A nem reagált acil-d-aminosav az anyalúgban oldatban marad. A kristályos acil-l-aminosav-anilidbol savas hidrolizissel szabad L-aminosav nyerheto. R N R' + N 2 papain D,L-acil-aminosav anilin R N N R' L-acil-aminosav-anilid + R N R' D-acil-aminosav SAVAS IDRLÍZIS + LÚGS IDRLÍZIS - R R N 2 N2 L-AMINSAV D,L-AMINSAV Az aszimmetrikus hidrolizises módszerek közül az ipari gyakorlatban a D,Laminosavak acil-derivátumainak specifikus enzimes hidrolizise terjedt el. A racém aminosavból eloször N-acilszármazékot állítanak elo, majd az acil-d,laminosavat aszimmetrikusan hidrolizálják amino-aciláz enzimmel. A reakció során szabad L-aminosav képzodik. Az acil-d-módosulatot az enzim nem képes megtámadni. A két vegyületet ioncserés kromatográfiával vagy szerves oldószeres extrakcióval könnyen el tudják választani egymástól. 144
Az acilszármazékok közül leggyakrabban az acetil-származékokat alkalmazzák. Enzimforrásként különbözo penészek, elsosorban Aspergillus és Penicillium speciesek jöhetnek számításba. A penészekbol származó amino-aciláz enzim széles szubsztrátspektrumú, azaz különbözo alifás és aromás aminosavaknál használható. A reszolválást vagy szakaszos eljárással oldható enzimmel végzik, vagy immobilizált acilázzal. Ez utóbbi folytonosan is üzemeltetheto. Az acetil-d,l-aminosav DEAE-Shephadex-acilázzal töltött oszlopon áramlik át bizonyos áramlási sebességgel. Az oszlopon való áthaladás során az aszimmetrikus hidrolizis végbemegy. Az enzim az oszlopban nagyon stabil és hosszú ideig használható. A folytonos reszolválás hatékonysága (termelt aminosav/enzimmennyiség) így sokkal nagyobb, mint a szakaszos eljárásé, ezenkívül a folyamat tökéletesen automatizálható. A reszolválásnál a kívánt L-módosulat mellett kb. azonos mennyiségu D- aminosav, mint melléktermék is képzôdik. Ezt az "értéktelen" módosulatot racemizálással L-formává alakíthatjuk (pl. lúgos kezeléssel) és a folyamatba visszavezethetjük. Igy egy hatékony ipari eljárásnál a D,L-aminosav szintézis, az optikai reszolválás és a racemizálás szerves technológiai egységet képez.( l. a 59. ábrán bemutatott folyamatábrát) KNTRLPANEL ÁRAMLÁS ph ÕMÉRSÉKLET FLYTNS BEPÁRLÓ KRISTÁLY- SITÓ AETIL- D,L- AMINSAV acetil-daminosav ÕSERÉLÕ ENZIM- SZLP racemizálás FRRÓVIZ szûrõ KRISTÁLYS L-AMINSAV 59.ábra Az asszimetrikus hidrolízis folyamatábrája A szintetikus úton kapott D,L-glutaminsavat elegáns, könnyu módszerrel lehet egy kombinált racemáz+dehidratáz enzimes módszerrel L-glutaminsavvá alakítani. A talajból izoláltak egy nagy L-glutamát-dehidratáz enzimaktivitású Pseudomonas törzset. Ez az enzim az L-glutaminsavat L-pirrolidonkarboxiláttá ciklizálja, de a D-glutamátra hatástalan. Egy másik mikroorganizmus, a Lactobacillus fermenti viszont glutaminsav recemázzal rendelkezik. a ezzel a két mikroorganizmussal ( esetleg a belolük származó 145
enzimekkel) inkubáljuk a racém glutaminsavat, gyorsan, csaknem kvantitatív kitermeléssel lehet belole L-pirrolidon-karboxilátot kapni. Az L-pirrolidonkarbonsav savas hidrolizisével közvetlenül L-glutaminsav nyerheto. 2 2 N 2 D-Glu L.fermenti racemáz D,L-Glu N 2 2 Pseudomonas 2 2 2 L-Glu-dehidratáz N L-Glu L-pirrolidon-karbonsav L-Glu 2.7. idrolízis A biokémiai enzimes hidrolízist a hidrolázok végzik. A hidrolázokhoz nagyszámú enzimcsoport tartozik (észterázok, glikozidázok, proteázok, lipázok, acilázok stb.), mindegyik csoport közös jellemzoje, hogy a szubsztrátból vízfelvétellel képzodnek termékek: X Y + 2 X + Y A 18-val jelzett vízzel végzett hidrolízis fontos szerepet játszik a hidrolízis mechanizmusának vizsgálatában. A fenti reakcióban a víz -ja a szubsztrát Y-komponenséhez kapcsolódott. Elméletileg az az X-komponenshez is kötodhet. A két lehetoséget reakciómechanizmus szempontjából meg kell különböztetnünk. 2.7.1. A keményítô enzimes hidrolízise A keményíto, a felépítésében résztvevo glükózmonomerek tekintetében homopolimer, mégis a glükozidkötések különbözosége révén két eltéro szerkezetu polimerre választható. Az egyik az amilóz, amely α-1,4-glükozidkötésekkel összekapcsolt láncpolimer, amelyben az egy molekulát alkotó 146
glükózegységek száma - a polimerizációs fok - 100-2000 között változhat. A másik keményíto komponens az amilopektin, amely a 95 % α -1,4-kötés mellett 5 % elágazó, α-1,6-kötést is tartalmaz. Az egy elágazásra jutó glükózegységek száma átlagosan tehát 20, polimerizációs foka pedig több 10.000 is lehet. A növényekben képzodo keményítoszemcsék - amelyeket ipari módszerekkel kinyernek - különbözo arányban tartalmazzák az amilózt és az amilopektint. A keményíto enzimes hidrolizise játszódik le a növényi magvak csírázásánál, a magasabbrendu élolényekben az emésztésnél, egyes mikroorganizmusok tápanyagfelvételénél stb. A kötéshasítás minden esetben a 1 - atomok között történik, amit szintén 18 izotóppal bizonyítottak. A hidrolizisnél felvett vízmolekula -része tehát a 1 atomhoz, míg része az atomhoz kapcsolódik. Az csoport kapcsolódása sztereospecifikus, egyik esetben a 1 atomon α, más esetben β-konfigurációjú kapcsolódás jön létre. Ebbol a szempontból csoportosítva a keményíto bontó un. amilolitikus enzimeket, vannak a-amilázok, amelyek α-konfigurációjú lineáris és elágazó dextrineket képeznek a keményíto α-1,4-es kötéseinek hasítása révén. Az α-amilázok extracelluláris és általában induktív enzimek, amelyek a keményítot statisztikusan támadják meg (tehát endoenzimek) és így a reakció eredménye eltéro polimerizációs fokú dextrin. α -amilázokat sok gomba- és baktériumfaj képes termelni. Ezek egymástól keményíto folyósító és/vagy elcukrosító hatásban, továbbá p-, és homérséklet optimumban, valamint stabilitásban különböznek. A legtöbb α -amiláz stabilizátorként kalciumot igényel muködése során. A kereskedelmi forgalomba kerülo α-amiláz készítmények gyártásánál Bacillus subtilis, Aspergillus oryazae törzseket és újabban termostabil Thermomonospora törzseket használnak. A b-amilázok β -konfigurációjú maltózokat képeznek szintén az α-1,4-es kötések hasítása révén. Ezek az enzimek exoamilázok. A β-amilázok jórészt növényi (maláta) eredetuek. Ujabban kimutatták, hogy mikroorganizmusok is képesek ilyen enzimeket szintetizálni. A bakteriális β -amilázok homérsékletoptimuma nagy, ami igen jelentos technológiai elonyt biztosít számunkra (sokkal nagyobb a maltózképzodési sebesség!), továbbá nem igényelnek kalciumot a stabilizálásukhoz és aktivitásukhoz. A glüko-amilázok - vagy γ -amilázok - β-konfigurációjú glükózegységeket hasítanak le, és így a teljes keményíto molekulát glükózzá képesek hidrolizálni (exoenzimek). A maltózt csak nagyon lassan bontják és nem támadják az elágazó láncok 1,6-kötéseit, ezért a glüko-amilázoknak kitett keményíto 147
hasítási termékei a következok: glükóz, maltóz és határdextrinek keverékei. Az enzim eloállítására különbözo Aspergillus és Rhisopus törzseket használnak. A pullulanázok ill. izoamilázok az amilopektin elágazó oldalláncait, α-1,6- kötéseit is képesek hasítani. A keményítohidrolizátumok, így a maltóz-, vagy a glükóztartalmú szirupok (az elcukrosítás után) és a glükóz fruktóz szirupok (az izomerizálás után) az élelmiszeriparban nagy szerepet játszanak mint adalékok. Az édes-, az üdítoital-, a süto, a konzerv- és a mélyhutoiparban alkalmazzák ezeket nagy mennyiségben. A hidrolizátumok eloállításának menete vázlatosan a következo: Bacillus subtilis-ból származó α-amiláz alkalmazása esetén az enzimet már a csirizesítés elott a szuszpenzióhoz adják. Az elfolyósítást a ++ jelenlétében 105-110 o-on ill. ezt követoen 95 o-on végzik. Az elfolyósított keményítooldatot rendszerint szurés után p = 4,5-en és 60 oon cukrosítják el glüko-amiláz enzimmel. Esetenként pullulanáz és izoamiláz enzimeket is adnak az oldathoz. Az enzimek specifitása és az átalakítás körülményei meghatározzák a végtermék összetételét. A keményíto hidrolízisével, a glükózszirup és kristályos glükóz eloállításával a technológiatárgyak boségesen és részletesen foglalkoznak. Az említetteken kívül a keményíto hidrolízisnek még a sör- és szesziparban, valamint a textiliparban az írtelenítésnél van jelentosége. 2.7.2. A pektin enzimes hidrolízise A pektináz vagy poligalakturonáz a növényvilágban oly elterjedt pektint hidrolizálja ill. hidrolizálják, mivel rendszerint nem egy enzimrol, hanem több enzim keverékérol van szó. Az egyes enzimkomponensek közös jellegzetessége, hogy a lineáris felépítésu pektinlánc glikozid-kötéseit hidrolizálják. Eltérnek viszont a támadáspontban, vagy láncvégrol hasítanak le egy-egy galakturonsav egységet (exo-poligalakturonázok), vagy a láncot statisztikusan támadják (endo-poligalakturonázok). A poligalakturonázok (pektinázok) mellett rendszerint jelen van a pektinészteráz is, amely a pektin galakturonsav-metilészter csoportjait hidrolizálja. 148
exo-poligalaktironáz 3 PEKTINÁZ galakturonsav pektin-észteráz A pektinbontó enzimkomplexeket nagyon sok mikroorganizmus képes szintetizálni, így elsosorban penészek (Aspergillus-,és Penicillium-félék) jó pektináz források. Ezen mikroorganizmusokat fel lehet használni enzimpreparátum eloállítására is. A termelt enzimek extracelluláris (sejtenkívüli) természetuek, tehát tenyésztés után a fermentlébol, fehérjeizolálási módszerekkel preparálhatók. A pektinhidrolízisnek több ipari folyamatnál van jelentosége. a pektináz preparátumot adunk gyümölcszúzalékhoz, akkor a léhozam 2-8 %-kal növelheto. A léhozam növekedés a nagy viszkozitású és lémegkötô-képességu pektin hidrolízisének tulajdonítható. A gyümölcsléipar az enzimpreparátumot ezen kívül gyümölcsléderítésre is felhasználja. Az enzimmel nem kezelt gyümölcslé zavaros és szurhetetlen, mivel a gyümölcslé kolloidális anyagait (fehérjéket, rostanyagokat stb.) a pektin mint kiváló védokolloid "oldatban" tartja. a a pektint enzimes úton lebontjuk, a védokolloid hatása megszunik és a lé könnyen kristálytisztára szurheto. A pektinhidrolízisnek a felsoroltakon kívül a textiliparban is van jelentosége, a len és a kender áztatásánál. A len és kenderkórók feltárása mikrobiológiai kezeléssel, az áztatás során történik. A mikrobiológiai folyamat célja a külso háncsrostok maradéktalan elválasztása a belso farészektol. A háncsrészben cellulózban dús, rugalmas kötegeket, rostnyalábokat találunk, amelyeket egymással és a farésszel pektin (mint ragasztóanyag) köt össze. A kenderáztatásnál ez az intracelluláris pektinanyag feloldódik, és ezáltal a szálak szabaddá válnak. A kender és len növényen mindig van a talajból származó pektinázt termelo Bacillus macerans és Bacillus asterosporus, amelyek a számukra kedvezo életfeltételeket jelento meleg (30-35 o-os) áztatóvízben gyorsan elszaporodnak. 149
2.7.4. A penicillin enzimes hidrolízise A Penicillium chrysogenum fermentációjával termelt benzil-penicillin (penicillin G) nevu antibiotikumot eredeti formájában csak korlátozott mértékben használják fel, legnagyobb részét egy enzimes technológiában átalakítják 6-amino-penicillán-savvá(6-APA a rövidítése az angol 6-aminopenicillanic acid névbol), amely azután az úgynevezett félszintetikus penicillinek családjának fo alapanyagát képezi. A benzil-penicillinnek 6-APA-vá alakitását kémiai módszerrel is el lehet végezni a 62.ábra tanusága szerint, azonban igen alacsony homérséklet szükséges az átalakításhoz (ez felveti az alacsony hofokot kibíró rozsdamentes acél szerkezeti anyag kérdését is), illetve szigorúan vízmentes körülményeket kell fenntartani, így ez az eljárás nem lehetett versenyképes a biokonverziót felhasználó eljárással. PENIILLIN-G 2N N S 2 enzim 37,p 7 2 N N S 2 ( 3 ) 2 Sil 2 +Pl 5 2 0 6-APA (-40 ) l 2 N N S 2 2 Si( 3 ) 2 n-bu (-40 ) 2 N 4 9 62.ábra APA szintézis enzimesen és kémiai módszerrel N S 2 A biokonverzióhoz felhasznált penicillin aciláz (E 3.5.1.11) enzimet (eredetileg penicillin-amidáz vagy penicillin-amido-hidroláz) más törzsek mellett például az Escherichia coli baktériummal állítják elo. Magára az átalakítási technológiára több alternatíva is létezik: -A megfermentált és inaktivált E.coli sejteket érintkeztetik szakaszos reaktorban Pen-G oldattal. Egyszeri felhasználás alatt a sejtek, lízis miatt, elvesztik átalakító képességüket. 150
-Élo de rögzített E.coli sejteket tartalmazó folytonos (töltött oszlop vagy STR) reaktoron áramoltatják keresztül az átalakítandó Pen-G oldatot. Ekkor azonban a sejt fenntartásra szolgáló tápanyagok szennyezik a terméket és metabolikus mellékreakciók is fellépnek. -A penicillin aciláz enzimet kinyerik az E.coli sejtekbol, hordozóhoz rögzítik és folytonos reaktorban használják fel. Egyértelmuen ez a technológia a legáltalánosabban felhasznált, annak ellenére, hogy az enzimkinyerés plusz eljárásrészeket és természetesen költséget is jelent. Ennek az utóbbi eljárásnak a részleteivel foglalkozunk az alábbiakban. Az enzimet nagyhozamú E.coli szakaszos fermentációjával állítják elo. A sejteket centrifugálással választják el a fermentlétol, egy kisebb térfogatú pufferoldatban felszuszpendálják majd nagynyomású homogenizátorral feltárják. Ezt kétlépéses kisózás követi: eloször a sejttörmelékeket és a nukleinsavakat csapják ki, majd az enzimet. Az újraoldott enzimet tovább tisztítják majd a relative tiszta enzimet polimer-golyókra immobilizálják. Ezeket az immobilizált enzimrészecskéket kereskedelmi forgalomban meg lehet vásárolni és eléggé stabilisak ahhoz, hogy ipari felhasználást nyerhessenek (néhány hónapos felezési idejük van). A dezacilezési rekció kinetikai viselkedése eros termék és szubsztrát inhibíciót mutat, azaz mind a 6-APA mind a PEN-G inhibitorai a reakciónak. Részletes számítások azt mutatták, hogy töltött oszlopreaktor használata lenne az optimális ebben az esetben, azonban amint a reakció elorehalad, a p csökken, s ez a termék bomlásához vezet, ezért p-szabályozást kell megvalósítani, ami viszont töltött oszlopokban nem igazán lehetséges (nem pillanatszeru ingrediens elkeveredés miatt). Ezért, hogy a keveredés is jó legyen és a plugflow üzemmódot is megközelítsék, a valóságban 4 sorba kötött STR-rel oldják meg a problémát. Így több mint 95%-os PEN-G konverziót sikerül elérni. Ez a négy sorbakötött reaktor optimális. Kevesebb jentosen rontaná a konverziót, öt pedig alig növeli azt, ugyanakkor a nagy 6-APA koncentráció eros végtermékinhibíciót okozna (és természetesen a beruházási és üzemeltetési költségek is megnövekednének). A reaktorkaszkádból eltávozó reakcióelegybol a p izoelektromos pontra állításával kicsapják a 6-APA-t majd szurés és mosás után szárítják. A fenti eloállítási séma rendkívül egyszeru, ugyanakkor a tényleges üzemszeru eloállítás rendkívül komplex, bonyolult, hiszen például a homérséklet szabályozást, az automatikus katalizátorcserét (egyébként emiatt egy ötödik reaktor is van a muködo négy mellett), a készülékek helyben történo tisztítási igényét, stb nem érinti teljes részletességgel. 151
Érdekességként megjegyezzük, hogy a penicillin-acilázt nem csak a PEN-G lebontására, henem szintézisre is fel lehet használni: félszintetikus antibiotikumokat, így ampicillint, amoxycilllint állítottak elo segítségével acil donorként fenil-glicint illetve p--fenil-glicint alkalmazva, amikor is peptid kötés jön létre ezek és a 6APA között. E reakciók az enzim "eredeti funkciójának " megfordításai (l.még aspartám eloállítást is), és bizonyítják a viszonylag egyszeru hidrolitikus enzimeknek a szerves szintézisekben potenciálisan betöltheto nagy szerepét. A 63. Ábrán a penicillin G szekezetét, bontási lehetoségeit és néhány félszintetikus penicillin származékot tüntettünk fel. 2N fenilecetsav N S penicilloin-sav 2 N 2 β-laktám gyûrû N S 2 tiazolidin gyûrû N 2 N S 2 6-amino-penicillánsav fenoxiecetsav 2 V-penicillin N 2 ampicillin 3 3 meticillin 63.ábra A penicillin enzimes bontása. Félszintetikus penicillinek. 152