Állatkísérletek elmélete és gyakorlata B szint Animal experiments theory and practice C level Ex vivo izolált szívperfúziós technikák Ex vivo isolated heart perfusion techniques Dr. Csonka Csaba Tartalomjegyzék (Contents) Bevezetés Introduction... 1 Az izolált szívpreparátum fajtái... 2 A perfúziós oldat... 3 A kanül... 4 Mérhető paraméterek (végpontok)... 4 Oxigenizáció... 5 A rendszer takarítása... 5 Referenciák:... 5 Bevezetés (Introduction) A világ fejlett országaiban a halálozási statisztikák szerint a szív- és érrendszeri betegségek a vezető halálokok közé tartoznak, az iszkémiás szívbetegség a társadalom egyik népbetegsége. Sajnos különösképpen igaz ez Magyarországra, ahol Európában az egyik legmagasabb az iszkémiás szívbetegség mortalitása. A koronáriakeringés helyreállítása, az életet veszélyeztető ritmuszavaroknak és a miokardium funkciócsökkenésének megakadályozása illetve megelőzése elsőrendű feladat. Éppen ezért a szívizom védelmét, az iszkémiás adaptáció fokozását célzó kutatások az érdeklődés homlokterébe kerültek, és kiemelt jelentőséggel bírnak. A kutatások ma már elképzelhetetlenek állatkísérletek nélkül. A szív illetve a szívizom kutatásának egyik alappillére az izolált szívperfúziós kísérletek végzése. Ennek lényege, hogy a szíveket a kísérleti állatokból izolálják, és mesterséges körülmények között életben tartják. Élettani - vagy közel élettani - körülményeket teremtve, biztosítva a megfelelő oxigén és tápanyagellátást a szív önálló működésre képes. Az izolált szívmodell feltehetően az egyik legjobb kísérleti elrendezés a modell működtetése során nyerhető kísérleti adatok kvantitatív és kvalitatív voltát tekintve. Gyakorlati szemszögből az izolált szívkészítmény (leginkább a kisemlősök szíveiből) jól reprodukálható, viszonylag könnyen és gyorsan tanulmányozható, nagy mennyiségben kivitelezhető és alacsony ráfordítással működtethető. A vizsgálatok széles spektrumát közvetlenül nyújtja morfológiai, anatómiai, biokémiai, élettani, elektrofiziológiai, gyógyszertani, molekuláris biológiai szempontból. További előnyei közé sorolható, hogy a szív elkülönülten vizsgálható a többi szerv, a szisztémás keringés és egyéb bioaktív vegyületek, hormonok, idegrendszeri szabályzó mechanizmusok, stb. hatásaitól. Bár az izolált szívkészítmény működése során lassú mértékben, de folyamatosan romlik, ám kísérleti szempontból órákig vizsgálható. 1
Általános tapasztalatok szerint a szív teljesítménye óránként mintegy 5-10%-kal romlik. Izolált szívperfúzió számos állatfaj szívével megvalósítható. Közöttük vannak nem emlősök (madarak, békák), kisemlősök (általában rágcsálók), nagyobb emlősök (disznó, kutya, birka, majom), sőt az ember is. A nagyobb termetű fajok szívei azonban magas áruk, nagy egyéni változatosságuk, hatalmas perfúziós folyadék és speciális perfúziós rendszer igényük miatt csak kevéssé terjedtek el. Az intézetben működtetett rendszert jelenleg izolált patkányszívre fejlesztettük ki. A kísérletes patkányszív modell előnyei közé sorolható a kísérletek alacsony költsége és nagy elemszáma. A species további kicsinyítése (pl. egér) a költségeket bár tovább csökkenti, alapvető technikai változtatásokat igényel mind a perfúziós, mind a preparátori oldalról. A mérettel együtt csökkenő keringő folyadéktérfogat és emelkedő pulzusszám a fizikai mérések egyre fokozódó problémáját hozza felszínre (kisebb és gyorsabb nyomásváltozások, a mérőeszközök mérési tartományának csökkentése, relatíve felerősödő zajok, rezonancia jelensége). Az izolált egérszív különös jelentőséggel bír, mert bizonyos kísérleti állatok (genetikailag módosított törzsek, knock out egerek) csak ebben a fajban érhetők el. Ezek az elérhető törzsek a rohamosan fejlődő genetikai kutatás eredményei, és majd minden tudományágban (így a kísérletes kardiológiában is) kiemelkedő szerepet játszanak. Kijelenthető viszont, hogy ideális állat nincs, a megfelelő állatmodellt a kísérletek jellege szerint célszerű megválasztani. Az izolált szívpreparátum fajtái (Types of isolated heart perfusions) Az izolált szívkészítménynek számos variációja terjedt el a tudomány körében, ám működési szempontból két alapvető formája különböztethető meg: az egyik az úgynevezett Langendorff-féle retrográd perfúziós rendszer (Langendorff, 1896) a másik pedig a Neely nevéhez kapcsolt dolgozó rendszer (Neely és mtsai., 1967). Langendorff perfúzió Langendorff perfusion A legegyszerűbb szívperfúziós rendszer alapelvét Langendorff írta le még a XIX. század végén (Langendorff, 1896). A Langendorff perfúzó során a szívet egyetlen helyen, az aortán keresztül kell megkanülálni (12. ábra). Ennek folyamán állandó nyomású (vagy mint azt később tárgyaljuk időegység alatt állandó térfogatú) perfúziós folyadék áramlik retrográd úton az aortakanülön keresztül az aortába. Mivel a bal kamrai kiszájadzásnál található zsebes billentyűk nem engedik a folyadékot a kamra üregébe folyni, az a zsebes billentyűk mögött eredő koronáriaartériákba áramlik, melyek a szív vérellátását biztosítják. A Langendorff-féle rendszer tehát egy passzív perfúziós elrendezés, ahol a szív átáramlása nem függ annak munkájától, a szív perfúziója minden körülmény között biztosított és mértéke csak a szív koronáriáinak állapotától függ. A Langendorff perfúziónak két fajtája ismeretes. Az egyikben a szívbe állandó nyomáson áramlik a folyadék. Ezt az állandó nyomást a közlekedőedények elvével biztosíthatjuk, adott magasságba emelve a perfúziós oldatot tartalmazó rezervoárt. Ilyen esetekben a szívet a koronáriákon időegység alatt átáramló folyadék mennyisége jellemzi. A másik elrendezésnél a szívbe retrográd úton időegység alatt állandó térfogatú oldatot áramlik egy pumpa segítségével. Ilyenkor a szív előtt közvetlenül elhelyezett nyomásmérő által regisztrált nyomással és annak megváltozásával lehet a szív működését jellemezni. 2
Neely-féle preparátum Neely perfusion A Neely-féle preparátum a Langendorffnál sokkal komplexebb izolált szív-tüdő készítmény. Itt a perfúziós oldat egy vénás rezervoárból a bal pitvari kanülön keresztül a bal pitvarba, majd a bal kamrába áramlik, ahonnan a szív saját munkája juttatja a mesterséges tüdőbe. Ebben az elrendezésben a koronária keringést a szív saját antorográd munkája biztosítja, így a rendszer a fiziológiás állapotot sokkal inkább közelíti. A perfúziós oldat (Perfusion solution) Bár az élő szervezet az evolúció során kifejlesztette a leghatékonyabb rendszert a szervek ellátására, izolált szívperfúziós kísérleteknél a vér alkalmazása számos problémát vetne fel. Ezért a szív átáramoltatását leggyakrabban egy speciális perfúziós oldattal végzik (Krebs és Henseleit, 1932). A perfúziós folyadéknak számos követelménynek kell megfelelnie. Legfontosabb, hogy biztosítsa a perfundált szerv továbbélését az izoláció után. Ehhez tartalmaznia kell egyrészt megfelelő mennyiségű oldott oxigént valamint a szerv funkciójához nélkülözhetetlen tápanyagokat. Rendszerünkben ez utóbbit a glükóz biztosítja, noha a szív energiaellátást nagyobb részben zsírsavakból és ketontestekből fedezi. A zsírsavak oldása és oldatban tartása azonban nehézkes. A magas diabetikus" glükózszint (10 mm, lásd az alábbi táblázatot), azért szükséges, mert inzulin hiányában az élettani glükózszint nem képes feladatát ellátni. A hiányzó inzulint pótolni lehet, ám komplex hatásai és legfőképpen ára miatt ritkán használatos. Az oldat ionösszetételének kvalitatíve és kvantitatíve is le kell képeznie a szervezet extracelluláris ionmiliőjét, különös tekintettel a Na +, a K + és a Ca 2+ ionokra. A perfúziós oldatnak ezen túlmenően megfelelő ozmolaritásúnak (300 mosmol) kell lenni, valamint pufferkapacitással (CO 2, HCO 3 rendszer) kell rendelkezni a fiziológiás 7,40±0,05-as ph fenntartásához. Az oldat egyenletes 37 C-os hőmérsékletét a termosztálórendszer biztosítja. Az oldatot elkészülte után 5 µm-es papírszűrőn kell átszűrni, az oldhatatlan szennyeződések eltávolításának céljából, hogy a szív koronáriáinak eltömődését meggátoljuk. Az izolált szívperfúziós kísérletekhez módosított (Csonka és mtsai, 1999) Krebs- Henseleit (Krebs és Henseleit 1932) oldatot használunk. Az oldat összetételét az alábbi táblázat tartalmazza: mol súly koncentráció (mmol/i) NaCl 58,5 18,39 NaHCO 3 84 25,00 KCI 74,5 4,11 MgCl x 6H 2 O 203 1,46 KH 2 PO 4 136 1,18 glükóz 180 11,11 CaCl x 2 H 2 O 147 2,50 A perfúziós oldatot minden kísérlet előtt frissen kell elkészíteni, hogy ezzel megelőzhető legyen az oldatban az alkotók kicsapódása (főleg Ca 2+ ), illetőleg az 3
oldat bakteriális fertőződése. A elkészült oldatot szükség esetén 2-8 C-on lehet tárolni maximum 3 napig. A perfúziós oldat összetételénél (esetlegesen beleadott vizsgálati anyagok esetén) ügyelni kell arra, hogy az oldat a rendszerből hideg illetve forró desztillált vízzel maradéktalanul kimosható legyen, apoláros komponenst lehetőség szerint ne tartalmazzon. Szükséges továbbá, hogy az oldat lehetőség szerint az átbuborékoltató rendszerű oxigenizáció során ne habozzon. A kanül (Canulla) A szív csatlakozása a rendszerhez a kanülökön keresztül történik. A szív két helyen van megkanülálva, az aorta az aotrakanülön, míg a bal pitvar a bal pitvari kanülön keresztül. Külső felszínük harántul rovátkolt, így a szív kanülálása után az aortát és a bal pitvari szájadékot sebészi cérnával körülhurkolva a szívet elmozdulás nélkül a kanülre lehet kötni. Ahhoz, hogy a szív a legideálisabb helyzetben működhessen, a kanül nagyon pontos pozicionálására van szükség. Mérhető paraméterek (végpontok) (End point parameters) A Neely-rendszerben mód nyílik arra, hogy a bal pitvari kanülön keresztül a bal pitvaron át egy vékony nyomásmérő katétert vezessünk a bal kamrába. Így a bal kamrai nyomás közvetlenül is mérhető, mégpedig egy olyan rendszerben, ami igen jól közelíti a fiziológiás állapotot. A bal kamrai nyomásgörbe folyamatos monitorozásával és számítógépes kiértékelésével módunkban áll a bal kamrai funkciós paraméterek mérésére. A bal kamra funkciós paraméterei A bal kamrai nyomásgörbe kiértékeléséből az alábbi funkciós paraméterek meghatározására nyílik mód: Bal kamrai által kifejtett nyomás (LVDP): a bal kamrai csúcsnyomás (PSP) és a végdiasztolés nyomás különbsége. Értéke megmutatja, hogy a szív mekkora nyomásváltozás kifejtésére képes a szisztolé során. Bal kamrai végdiasztolés nyomás (LVEDP): a disztole legvégén, közvetlenül a szisztolé előtt mért bal kamrai nyomás. Ennek változása az egyik legérzékenyebb jelzője a szív funkcióváltozásának. A bal kamrában kifejlődő nyomás idő szerinti első deriváltjának maximum és minimum értéke (+dp/dtmax, -dp/dtmax). Ezek a szív kontrakciójáról és relaxációjáról adnak felvilágosítást. A nyomásparaméterek mellett az aortakanülnál elhelyezett áramlásmérő segítségével az aorta átáramlást, míg a szívből elfolyó perfúziós oldat időegységre eső térfogatának mérésével a koronária átáramlást tudjuk mérni. E két érték összege a szív perctérfogatát adja. Mindezeken túlmenően mérni tudjuk a szív frekvenciáját (HR) is akár a nyomáshullámok elemzésével, akár a szívre kapcsolt elektrokardiogram kiértékelésével. Ezen paraméterek mérésével a szív pumpafunkciója kielégítően jellemezhető, ennek technikai feltételeit a perfúzió oldaláról a Neely-féle elrendezés biztosítja. 4
Oxigenizáció (Oxygenation) Mint azt már korábban említettük, a rendszer működéséhez, vagyis a szerv továbbéléséhez, a normál metabolizmus, a transzmembrán iongrádiens és a kontrakciós energiaszükséglet fenntartásához a megfelelő oxigenizációt biztosítani kell. Ehhez 95% O 2 és 5% CO 2 keverékét (karbogén) buborékoltatunk át a perfúziós oldaton. A folyadékban fizikailag oldódó oxigén elegendő a szív oxigénszükségletének fedezésére. A gázkeverék 5% CO 2 tartalma a perfúziós folyadék optimális ph beállításához szükséges. A rendszer takarítása (Washing) Az izolált szívperfúziós rendszert minden használat után gondosan és alaposan el kell mosni. A mosogatás kiemelt jelentőséggel bír az elvárható működés szempontjából. A perfúziós oldatot a rendszerből maradéktalanul el kell távolítani. Ehhez szobahőmérsékletű desztillált vizet alkalmazunk legalább kétszer, majd az utolsó fázisnál forró (lobogó) vízzel öblítünk. A desztillált víz alkalmas a perfúziós oldat kimosására. A rendszer minden részét különös gonddal öblítsük át! Figyelembe kell venni az esetlegesen alkalmazott gyógyszerek oldékonyságát is, nehogy a rendszerben megmaradó gyógyszer a következő kísérletek eredményeit befolyásolja. Ahhoz, hogy a rendszer tisztaságát megőrizzük, tartózkodnunk kell a mosogatószerek alkalmazásától, mert ezek a szerek a legkisebb koncentrációban is módosíthatják kísérleteinket. A forró vizes öblítés mindamellett, hogy a hidrofil és jó hatékonysággal a hidrofób alkotókat is kimossa a rendszerből, fertőtlenítő hatással is bír. Elfogadhatóan pusztítja el a baktériumokat, algákat, gombákat. Célunk az, hogy a rendszert - korlátainkhoz mérten - sterilen" tartsuk. A mosogatás végén a rendszert a csatlakozópontoknál szedjük szét, a pangó mosófolyadékot távolítsuk el, edényeinket hagyjuk tökéletesen megszáradni. Ezt segítik az üvegedényekről lecsavarozható csatlakozók. Mosogatás után a rendszer nyitott üvegedényeit fedjük le, a porosodás gátlása végett. Referenciák (References): Csonka C, Szilvassy Z, Fulop F, Pali T, Blasig IE, Tosaki A, Schulz R, Ferdinandy P. Classic preconditioning decreases the harmful accumulation of nitric oxide during ischemia and reperfusion in rat hearts. Circulation 100:2260-2266 (1999) Krebs, HA and Henseleit K. Untersuchungen über die Harnstoffbildung im Tierkorper. Z. Physio/. Chem. 210:33-66 (1932) Langendorff 0. Untersuchungen am uberlebenden Saugethierherzen. Arch. Ges. Physiol. 61 :291-332 (1895) Neely JR, Liebermeister H, Battersby EJ, Morgan HE. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am. J. Physio/. 212:804-814 (1967) Sutherland FJ and Hearse DJ. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. (The lnternational Society tor Heart Research Handbook of Experimental Laboratory Procedures) http://www.usouthal.edu/ishr/help/help.htm Csonka Csaba. izolált szívperfúziós rendszer kifejlesztése patkányhoz. Diplomamunka. Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, VIK, orvosbiológiai mérnök szak. (2002) 5