A fény Abszorpciós fotometria Barkó Szilvia PTE ÁOK Biofizikai ntézet 2011. február E A fény elektromos térerősségvektor hullámhossz A fény kettős termzete: Hullám (terjedkor) Rzecske (kölcsönhatáskor) B x Elhajlás (diffrakció) nterferencia Polarizáció Fotoeffektus Compton-effektus x Transzverzális hullám Az elektromos a mágneses térerősség vektorai merőlegesek egymásra, valamint a haladási irányra! Vizsgált sugárzás színképre (spektrum) bontható. A spektrumok megjeleni formái vonalas (atomok (magas hőmérsékletű, ritka gázok)) széles hullámhossz tartományokat nulla intenzitás jellemez a spektrumvonalak pozíciói a fényt kibocsátó kémiai elemre jellemzőek (kémiai összetevők, koncentráció) sávos (molekulák) sok, egymáshoz közeli vonal megjelenük a molekula forgásával, illetve a molekulát alkotó atomok vibrációival (rezgeivel) kapcsolatos Sir saac Newton (1642 1727) folytonos (hevített anyagok) a folytos spektrumban minden hullámhossz képviselve van, a szomszédos hullámhosszak intenzitásai folytonosan kapcsolódnak egymáshoz, vagyis a spektrumban nincsenek ugrásszerű intenzitásváltozások Emissziós (kibocsátási) illetve abszorpciós (elnyeli) színképek 1
Magas hőmérsékleten izzó szilárd folyékony anyagok zzó gázok emissziós spektruma Joseph von Fraunhofer (1787 1826) Sötét vonalak a Nap spektrumában, amelyeket a szoláris kromoszférában lévő elemeknek a Nap forró belsejéről kibocsátott látható sugárzás bizonyos hullámhosszain történő abszorpciója okoz. zzó gázok abszorpciós spektruma http://astro-canada.ca/_en/a3300.html Néhány elem vonalas (emissziós) spektruma He A spektrum Egy hullám, például elektromágneses hullám felhasadása alkotó frekvenciáira. Egy intenzitás-jellegű mennyiség ábrázolva egy energiajellegű mennyiség függvényében. Ne Ar intenzitás, beütszám (pl. radioaktivitás mére), fotonszám, transzmittancia, abszorbancia (extinkció, OD) energia azzal arányos mennyiségek (pl. frekvencia, hullámhossz, hullámszám) (nm) Fény anyag kölcsönhatása Kvantált energiafelvétel (foton) Atomi rendszerrel (anyaggal) kölcsönható elektromágneses sugárzás: visszaverődhet (reflexió) elnyelődhet (abszorpció) áthaladhat (transzmisszió) a biológiai hatás létrejöttének feltétele! A fényabszorpció A beeső fénynyaláb elektromos tere az útjába eső kis rzecskék tölteit rezgre kényszeríti apró oszcillátorok vagy rádióadók elektromágneses hullámokat bocsátanak ki Ha ez a rezonanciafrekvencia: a rezgi amplitúdó megnő, belső súrlódás lép fel az oszcillátor energiája lecsökken az anyag rzlegesen elnyeli a sugárzást 2
Transzmisszió Gerjesztő fény f rezonancia Atomi/molekuláris rendszer Fényintenzitás-változás fényforrás detektor T = / Általában százalékban (%) adjuk meg. Abszorpció Az abszorpció - legyen könnyen érthető - legyen jól mérhető - legyen additív E OD A = - log ( / ) = ( ). c. x =. 10 - ( ) x c Lambert-Beer törvény ( ): az extinkciós koefficiens (anyagi minőségtől függ), c: a koncentrációja, x: az optikai úthossz Megjegyz: a transzmittancia (T=/ ) nem additív: ha az egyik komponens átenged 30%-ot, a másik 60%-ot, akkor a kettő együtt NEM 90%-ot fog átengedni! Miért ( ) nemcsak? Hogyan mérjük az abszorpciót? Mert az abszorpció (nm) függő, így az is az kell hogy legyen! fotometria = abszorpciós spektroszkópia Egy fotométer egyszerű sémája: fényforrás monokromátor detektor Prizma vagy optikai rács + r Folytonos fényű, pl.: halogén, deutérium, xenon, stb. lámpa műanyag, üveg, kvarc küvettákban 3
Egy- két-utas fotométerek Az emisszió az abszorpció mére A fotométer linearitása; stray light effect emisszió Tér bármely irányából! Várható tendencia Meredekség: abszorpció Csak lineáris elrendezben! koncentráció A fotométer linearitása; stray light effect Kicsi abszorpció mellett A probléma oka: nem tökéletesek a monokromátorok! 99% kiválasztott 89% kiválasztott Optikai rács Második, harmadik, stb. felharmónikusok! 4
Nagy abszorpció mellett Fényszórás Tömény (nagy koncentrációjú) mintáknál jelentkezhet a stray light effect mellett! 99% kiválasztott 1% kiválasztott Ezt is érzékeli a detektor!!! Az abszorpciós fotometria alkalmazásai Különböző oldatok (pl. fehérjeoldatok!!!) koncentrációjának meghatározása híg oldatok esetén használatos (az oldatban lévő molekulák nem befolyásolják egymás energiaszintjeit) A fehérjék abszorpciója dőfüggő változások nyomonkövete Elektroforézis minták kiértékele A fehérjék abszorpciójának értelmeze Fehérjék abszorpciójának mére Az alapvonal (baseline) jelentősége Fehérje PUFFER!!! 5
Fehérjék abszorpciójának mére Fehérjék abszorpciójának mére Fehérjék abszorpciójának mére Additivitás Alkalmazás: fehérjekoncentráció meghatározása fehérje fluoreszcens próba (nm) dőfüggő mérek 0,2 Anyagi, minőségbeli, szerkezeti változások követe (pl. kémiai reakciók hatására) Abszorpció 0,0-0,2-0,4 0 1000 2000 3000 4000 idõ (s) 6