Módosított miracidiumbújtatási eljárás schistosomiasis mansoni kimutatására Dr. LENGYEL Anna Országos Közegészségügyi Intézet Parazitológiai Osztálya, Budapest "A modified miracidium hatching test for the detection of schistosomiasis mansoni" - Lengyel, A. - Parasit. Hung. 8_. 37-40, 1975. ABSTRACT. The method enables the investigation of the viability of Sch. mansoni eggs in the faeces. The technique is especially applicable when detection of mild infections or a parasitological assessment of the post-treatment recovery is needed. Schistosomiasis mansoni esetekben az orvos teendőit a különféle klinikai és parazitológiai vizsgálatok eredménye határozza meg. A parazitológiai vizsgálatok alapvető célja a schistosomiasis aktiv fennállásának igazolása. Ennek megítélésében a széklet parazitológiai vizsgálata ma is megtartotta jelentőségét. A következőkben néhány székletvizsgálati módszer előnyeinek és hátrányainak recapitulatioja után, a pete élő vagy elhalt állapotának meghatározására a miracidiumbújtatási módszer alapján kialakított eljárásunkat ismertetjük. A módszert trópusi betegek vizsgálatakor, illetve egy magyar csoportban jelentkezett schistosomiasis mansoni esetek klinikai lefolyásának és kezelésének parazitológiai követése során volt alkalmunk kidolgozni (3, 7). Módszertani áttekintés A székletvizsgálati módszerek közül az egyszerű kenet csak igen súlyos fertőzés felderítésére alkalmas (2, 8). Masszív schistosomiasis behurcolása a mérsékelt égövre igen ritka; a magunk másfél évtizedes gyakorlatában egyetlen, direkt kenettel kimutatható intenzitású schistosoma fertőzöttséggel nem találkoztunk. Közepes súlyosságú, mérsékelt és enyhe schistosomiasis diagnosztizálására leggyakrabban használt módszerek a szedimentációs dúsitási eljárások. A parazitológiai laboratóriumok a szedimentációs dúsitás legkülönbözőbb változatait alkalmazzák, rendszerint saját tapasztalataik szerinti módosításban. E módszerek legtöbbje a savak roncsoló, illetve az aldehydek koaguláló és az éter zsíroldó hatásának egyesítésén alapszik, egyesekben előzetes petemosással (TELEMANN-RITCHIE-féle módszer, ecetsavas-éteres dúsitás stb. ), A szedimentációs dúsitások diagnosztikai értéke magas. Előnyös, hogy elvégzésükhöz viszonylag kis mennyiségű (2-3 g) széklet elégséges. A roncsolás és oldás különösen a sok vért és nyákot tartalmazó székletek vizsgálatakor előnyös, elősegíti a vérrel, illetve nyákcáfátokkal bevont peték kiszabadulását. Egyes szedimentációs dúsitásos eljárások kétségtelen hátránya, hogy a petéket kisebb-nagyobb mértékben károsítja. Az ártalom a peteburkot nem érinti; a pete nem deformálódik, a jellegzetes alak, nagyság és szín változatlan marad, A petetartalom, a miracidium jellegzetes struktúrája és ezen belül különösen a kiválasztó rendszer rajzolata azonban rendszerint elmosódottá válik. A savas- vagy formalinos-éteres behatás a miracidiumot elöli; a lárva életműködését jelző finom mozgások, az epitheliumot borító csillószőrök és csillóikkal a gyertyaláng lobogásához hasonló rezgést végző solenocyták aktivitása megszűnik. A miracidium mozgásának megszűntétől eltekintve, a károsodás nem minden petében egyforma fokú és jellegű. Az esetek többségében a pete élő vagy elhalt állapotának meghatározását szedimentációs dúsitás után nyert mikroszkópos képben még gyakorlott vizsgáló sem diagnosztizálhatja biztonsággal. A miracidium károsodását TELEMANN x szerinti vizsgálatokban magunk is tapasztaltuk (1, kép). X A mikroszkópos felvételek elkészítésében nyújtott segítségért dr. ZOLTAI Lászlónak e helyt is köszönetet mondok.
Az egyszerű szedimentációs eljárás (amely lényegét tekintve petemosás) előnye, hogy a peték élő, torzulatlan állapotban maradnak. A miracidium csillószőreinek mozgása és a lángsejtek aktivitása az ilyen eljárásokkal nyert készítményekben nagy nagyítással rendszerint jól megfigyelhető. Az egyszerű szedimentációnak ugyancsak sokfajta változata van. A szedimentáció és a centrifugálás kombinációján alapuló módszer szintén magas diagnosztikai hatásfokkal használható (1). Valamennyi egyszerű szedimentációs módszer 10-15 g vagy több széklet felhasználását igényli. A nagyobb mennyiségű faeces a diagnosztikai biztonságot növeli, de a gyakorlatban az anyagbeküldés problémái és a készítmények számának növekedése miatt hátrányt jelent. Az egyszerű szedimentációs eljárás előnyeit továbbfejleszti a miracidiumbűjtatás (4), amely a petéből kibújt embryo kimutatására szolgál, így a pete élő állapotának abszolút bizonyítékát adja. Az eljárást diagnosztikai, illetve experimentális módszerként hazai szerzők (BANKI, Gy., ZOLTAI, N., ZOLTAI, L. ) x már a hatvanas években alkalmazták. A miracidium aktiválásában, a laboratóriumi eljárásban és természetes terjedési körülmények között is alapvető tényezők a széklet felhígulása (az osmoticus nyomás csökkenése), a fényhatás, illetve a megfelelő hőmérséklet. Ezek közül a hőmérséklet ingadozása kisebb jelentőségű (5). A miracidiumok kibújása egy vagy néhány óra alatt következik be. Területi kísérletek tanúsága alapján a. kibújás kezdő és befejező időpontja a széklet konzisztenciája szerint változik (6). Saját vizsgálatainkban standard laboratóriumi körülmények között sem azonos időben következett be a miracidiumok kibújása. A kibújt miracidiumok sötét látótér előtt, lupéval vizsgálva, mint világos, gyorsan, 690-750 cm/óra sebességgel körbenúszkáló testecskék láthatók. A kibújás időpontjának bizonytalansága a leolvasásban nehézséget jelent, bár a szabadonúszó periódus rendszerint mintegy 16 óráig is eltart. Az előzőekben ismertetett módszerekkel nyert tapasztalatok után a pete élő vagy elhalt állapotának meghatározására a miracidiumbújtatási eljárás általunk kifejlesztett módosítása bizonyult a legalkalmasabbnak. Módszer Az eljárás első fázisa megegyezik a miracidiumbűjtatás petemosási szakával. A második lépésben a változtatás csak a hűtés időtartamának meghosszabbításából áll. A módosítás lényegét a harmadik szakasz nyújtja, a lárva pozitiv hydro-, thermo- és phototaxisának jobb kihasználásával. Az eljárás menete a következő: 3-4 g székletmintát 30-40-szeres mennyiségű fiziológiás konyhasóoldattal feltöltünk. A durvább alkatrészek eltávolítására a szuszpenziót szitán átszűrjük. Az átszűrt folyadékot ülepítő pohárba öntjük, majd fiziológiás konyhasóoldattal addig mossuk, amíg a felülúszó tiszta nem lesz. Kevés kivételtől eltekintve háromszori mosást alkalmaztunk, egy-egy ülepedési periódus időtartamát 40 percben határoztuk meg. A felülúszó leszívását az üledék feletti szintig vizlégszivattyúra szerelt hasas kihúzott pipettával végeztük. (A dekantálás ellenőrzésére magas petetartalmú széklet vizsgálatakor a felülúszó folyadékot pipettázás után teljes mennyiségben lecentrifugálva megállapítottuk, hogy ilyen időtartamú ülepítés mellett a leszívatás peteveszteséget nem okoz. ) Az utolsó mosófolyadék leszívása után az üledéket 4 C-os, előhűtött, kis mennyiségű csapvízzel öntjük fel, majd a poharat fóliával lefedve 16-18 órán át hűtőszekrényben állni hagyjuk. Ezután a felülúszót az üledék feletti szintig leszívjuk, majd az üledéket kevés kézmeleg csapvízzel felöntve, a poharat 2 órára X BÁNKI, Gy. - ZOLTAI, N. - ZOLTAI, L. (1960): Vizsgálatok a schistosomiasis hazai terjedési lehetőségére vonatkozóan. - Előadás az OKI tudományos ülésén. 1. kép: Károsodott Sch. mansoni pete 2. kép: Érett, élő miracidiumot tartalmazó Sch, mansoni pete 3. a), b) kép: Sch. mansoni peték, a miracidium különböző mozgási szakaszaiban 38
37C-C-OS termosztatba helyezzük. Állás után az ülepítő pohár egész tartalmát, néhány ml. csapvízzel utánöblítve, kúpos centrifugacsőbe öntjük át és 2000 r. p. m. fordulatszámmal 10 percig centrifugáljuk. A felülúszó leszívása után - amennyiben erre szükség van - az üledék egész mennyiségét vizsgáljuk. A mikroszkópizálást ajánlatos a centrifugálás után azonnal elvégezni. Eredmények A lefedett készítményt kis nagyítással vizsgálva, az élő petében a miracidium szerkezetének finom rajzolata szépen látható (2. kép). Nagy nagyítással a lárva-, illetve a lángsejtek csillangóinak rezgése jól megfigyelhető. A petetokon belül a miracidium jellegzetes mozgását már kis nagyításban megfigyelhetjük (3a, b, kép). Összehúzódáskor a miracidium szinte befűződött képletként látható. A fényerősség változtatásával (a kondenzor le-fel való mozgatása, a diaphragma szűkítése-tágítása) a miracidium mozgása élénkül. Ilyenkor a fény stimulativ hatása, illetve a lárvák pozítiv phototaxisa miatt gyakran figyelhetjük meg a kibújás pillanatát. A frissen kibújt miracidiumok (4. kép) általában néhány másodpercig egyhelyben mozognak, majd csillóikkal és testük összehúzódásával-kinyúlásával (5. kép) nagy sebességgel úsznak tova. A kibújt miracidium szerkezete csak rögzités (hő, formalin) után vizsgálható (6. kép). A miracidium kibújása után visszamaradt, kiürült petetok (7.kép) felderítése természetesen ugyancsak diagnosztikai értékű. Módszerünket TELEMANN-féle eljárással párhuzamosan alkalmazva, számos esetben tudtunk aktív schistosomiasist diagnosztizálni olyankor is, amikor a szedimentációs dúsitás negatív eredményt adott. Néhány esetben alkalmunk volt vizsgálati eredményeinket az immunfluorescens próbával kapott értékekkel összehasonlítani. Két olyan betegünkben, a- hol az immunológiai reakció, az 1:40, 1:80 titerérték alapján csupán a schistosomiasis gyanúját vetette fel, a módszerünkkel egyidejűleg végzett vizsgálat élő pete ürülését mutatta ki. Véleményünk abban foglalható össze, hogy a miracidiumbújtatási eljárás - nem a szedimentációs dúsitás helyett, hanem azzal parallel alkalmazva - növelheti a schistosomiasis diagnosztikai biztonságát és lehetőséget ad az aktív fertőzöttség fennállásának igazolására. összefoglalás A székletminta diluciójának és szedimentaciójának kombinálásával, a miracidiumbújtatási módszer alapján kidolgozott eljárás alkalmas a Sch. mansoni peték élő, illetve elhalt állapotának a megállapítására. A módszer bevált mind a könnyű fertőzések diagnosztizálására, mind pedig gyógykezelés után az eredményesség parazitológiai megítélésére Irodalom 1. BAROODY, B. J. - MOST, H. (1946): The relative efficiency of water centrifugal sedimentation and other methods of stool examination for diagnosis of schistosomiasis japonica. - J. Lab. Clin. Med., 3_1. 815-823. 2. BORDA, C.E. - PELLEGRINO, J. (1971): An improved stool thick smear technique for quantitative diagnosis of Schistosoma mansoni infection. - Rev, Inst, Med. Trop. S.Paulo, J_3. 71-75. 4. kép: Frissen kibújt miracidium 5. kép: Uszó miracidium 6. kép: Miracidium formalinos fixálás után 7. kép: Kiürült Sch. mansoni petetok
3. LENGYEL, A. - VÁRNAI, F. : Közlés alatt. 4. NAUCK,. E.G. (1962): Lehrbuch der Tropenkrankheiten. - G. Thieme Verlag, Stuttgart. 5. PITCHFORD, R. J. - VISSER, P.S. (1972): Some observations on the hatching pattern of Schistosoma mansoni eggs. - Ann. Trop. Med. Parasit., 66. 399-407. 6. UPATHAM, E.S. (1972): Rapidity and duration of hatching of St. Lucian Schistosoma mansoni eggs in outdoor habitats. - J. Helm. 46, 271-276. 7. VÁRNAI, F. - LENGYEL, A. : Közlés alatt. 8. WHO Techn. Rep. Ser. No. 372: Epidemiology and control of schistosomiasis. - 1967, Geneva. Érkezett: 1975. 3. 5. Dr. LENGYEL, A. Országos Közegészségügyi Intézet Parazitológiai Osztálya 1966 Budapest, Gyáli ut 2-6.