TRANSZGENIKUS BIOMARKER ZEBRADÁNIÓ (DANIO RERIO) VONALAK ALKALMAZÁSÁNAK LEHETŐSÉGEI AZ ÖKOTOXIKOLÓGIÁBAN Csenki-Bakos Zsolt, Csenki-Bakos Katalin, Kovács Balázs, Ferincz Árpád és Urbányi Béla
Zebradánió OECD által javasolt toxikológiai modell Kis termet Rövid generációs idő Nagy mennyiségű ivartermék ex utero fejlődés, áttetsző embrió teljes genom ismerete a gének, receptorok, a folyamatok molekuláris biológiai és élettani háttere homológ az emlősökkel teljes életciklus vízben Az embriók és a lárvák táplálkozó korig nem minősülnek állatnak!
Fenotípusos markerek keresésének lehetőségei zebradánió embriókon A hal tünetszegény modell. Nehéz találni egy adott vegyületcsoportra általánosan jellemző, könnyen azonosítható fenotípusos markert
Ösztrogénhatású anyagokra jellemző fenotípusos rendellenességek ZEA Heart and soul fenotípus Szabálytalan pigmentáció ZEA
Láthatóvá a nehezen láthatót! BF RFP GFP Fli-1:GFP (LAWSON ÉS WEINSTEIN 2002); GATA-1 :DsRED (YAQOOB et al., 2009) transzgenikus zebradánió embrió
Miért jó a biomarker vonal? In vivo vizsgálhatóak a rendellenességek Klasszikus morfológiai jegyek is Ugyanabban a halban akár különböző időpontokban Komplex környezeti minták vizsgálata lehetséges A transzgenikus zebradánió és a 3R (alternatív modell) MI KELL HOZZÁ?
Legyen LÁTHATÓ GFP fehérje modellje Különböző színű fluoreszcens fehérjék (ZIMMER 2010)
Legyen MÉRHETŐ Promóter, ami: Érzékenyen reagál a vizsgálandó hatásra, Válaszreakciója specifikus és kifejezett BIOMARKER GÉNEK Halakban ösztrogénhatás biomarkerek: vitellogenin (vtg), aromatáz (cyp19b), vitellinburok fehérjék (vep-ek), koriogenin H (cgh), zona radiata és zona pellucida fehérjék (zrp, zp), ösztrogén-receptor alfa (ER-α), albumin, nukleozid difoszfát-kináz (nm23),
Fontos még A riportergén a szervezet valamely sejtjében, szabályozható módon kifejezhető legyen A riporterfehérje féléletideje ne legyen túl hosszú. A riporterrendszer megfelelően érzékeny legyen. A biomarker vonal indikátor szervezetekként vagy koncentrációfüggő, dózis-hatás vizsgálatokra is alkalmas lesz.
Tg(vtg1: mcherry) ösztrogén hatást kimutató transzgenikus bioszenzor zebradánió vonal
Szennyezőanyagok a vízi környezetben hulladéklerakók (1), szennyvíztisztító telepek (2), ipari tevékenység (3), háztartások és kórházak elfolyó vize (4), állattartó telepek (5) szántóföldek, gabonatárolók(6) Kép: Csepeli Andrea
Ösztrogénhatást vizsgáló transzgenikus Cyp19a1b:GFP (Tong et al. 2009) zebradánió vonalak ERE-zvtg1:GFP zebradánió (Chen et al, 2010 ) Tranziens felhasználás: Kim et al. (2009) tranziens aromatáz vizsgálati rendszert dolgoztak ki zebradánióra. Lee et al. (2012) Ösztrogén receptoron alapuló tranziens vizsgálati rendszer amely bármely halfajban is használható lehet a jövőben.
A vitellogenin Szik tartaléktápanyagának (vitellin) prekurzora Kifejeződése: májspecifikus ösztrogénfüggő természetes körülmények között csak nőstényekben hímekben és lárvákban ösztrogén hatású anyagok jelenlétében A vitellogenin mérésére OECD protokollok (OECD-TG 230, 234), ELISA vizsgálat alapján kifejlett halakban, vitoellogenin RT-PCR lehetősége (OECD 240)
Hogy fogjunk hozzá? vitellogenin-1 promóter régió és transzkripciós start hely azonosítása ösztrogénválasz elemek azonosítása: 17 db, 1 db teljes ERE (ösztrogén hormonválasz elem (Estrogen Response Element)) új szekvencia
Tranziens expresszió vizsgálata Embriókezelés 100 ng/l 17-ß-ösztradiollal Riporter aktivitás vizsgálata mikroszkóp alatt
Tranziens expresszió vizsgálat eredménye Kontroll fluoreszcens jel az embriók 20%-ában Máj, szik (erős), szem, vesék (gyenge)
A transzgenikus vonal létrehozása Injektált embriók felnevelése (P0) Alapító P0 egyedek kiválasztása az utódok 17-ßösztradiol indukciója és PCR alapú szelekciója alapján A vonal F7 nemzedékben is stabil
Hol várhatjuk a jelet? 5 napos korban csak a bal oldali májlebeny termel vitellogenint vitellogenin Tao és Peng, 2009 lfabp
Nem egyforma? A kifejeződés mértéke és az érintett terület vad típusú embriókban különböző A vitellogenin és a fluoreszcens jel azonos területen fejeződik ki
Protokoll kidolgozása BF mcherry embriók kezelése 200 ng/l EE2-vel 0 hpf kortól a fluoreszcens jel megjelenésének vizsgálata naponta Máj: 3 napos kortól A mi kezelési protokollunk: 72-120 hpf (Korábbi publikációkban: 0-120 hpf) 1 dpf 2 dpf 3 dpf 4 dpf 5 dpf
17-ß-ösztradiol Szennyvíztisztító telepről elfolyó vízben (0,02-0,15 μg/l) EC 50 = 8,304 µg/l
17-α-etinil-ösztradiol Szennyvíztisztító telepről elfolyó vízben (0,1-4,3 ng/l) EC 50 = 30,46 ng/l
Biszfenol-A Szennyvíztisztító telepről elfolyó vízben ( < 0,5 mg/l) EC EC50=2,601 50 = mg/l
Zearalenon Szennyvíztisztító telepről elfolyó vízben (0,001-0,22 μg/l) EC 50 = 10,75 µg/l
Valóban használható? 5 szennyvíz minta (pelyhes, eleveniszapot is tartalmazó fázis) Vizsgálat az új vonallal és ösztrogénhatást kimutató élesztővel (BLYES) Ösztrogénhatás mindkét módszerrel 1 mintában Biolumineszcencia (cps) 350000 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0 25 37,5 50 Hígítás (szennyvíz %) Integrált denzitás % 10 8 6 4 2 0 25 37,5 50 100 Hígítás (szennyvíz %)
Mi a helyzet kifejlett korban? F1 generáció felnőtt (3 hónapos) hímek kezelése 5, 10, 50 és 100 ng/l E2-vel
Terveink A vonal érzékenységének növelése Tranziens vizsgálati rendszer elkészítése Máj sejtvonal létrehozása Multikolor Casper zebradánió vonal létrehozása vtg1: mcherry és egy oocyta-specifikus konstrukció felhasználásával (pl: ovotestis kialakulásának vizsgálata ösztrogénhatású anyagok jelenlétében)
Köszönetnyilvánítás Munkánkat az OTKA (NNF 78834), a KTIA-AIK-2012-12-1-0010 és az NVKP_16-1-2016-0003 pályázatok támogatták. A szennyvízminták biztosításáért köszönet az UTB Envirotec Zrt-nek. A BLYES tesztek elvégzéséért köszönet Balázs Adrienn-nek.
Köszönöm megtisztelő figyelmüket!