A redox-homeosztázis vizsgálati lehetőségei, jelentősége humán és állatkísérletes tanulmányokban

A redox-homeosztázis vizsgálati lehetőségei, jelentősége humán és állatkísérletes tanulmányokban Doktori értekezés 2003 Készítette: Kocsis Ibolya Semmelweis Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, II. Belgyógyászati Klinika Budapest Készült: Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Klinikai Orvostudományok, 2. Ph.D. programjában Tudományági Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Tulassay Zsolt Programvezető: Prof. Dr. Fehér János Témavezető: Dr. Blázovics Anna 1

OLDALSZÁM TARTALOMJEGYZÉK...2 RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK...6 1. BEVEZETÉS...7 1.1. A szervezet redox-homeosztázisa...7 1.1.1. Az antioxidáns egyensúlyt biztosító folyamatok...7 1.1.2. Az oxidatív stressz szerepe a betegségek pathomechanizmusában...9 1.2. Természetes eredetű antioxidánsok...12 1.2.1. Természetes eredetű hatóanyagok szerepe a redox-homeosztázisban, mikroelemtartalom befolyása az antioxidáns hatás kialakulására...12 1.2.2. Raphanus sativus (L.)var. niger...13 1.2.3. Cichorium intybus (L.)...14 1.2.3.1. Polifenol vegyületek: flavonoidok, kávésavszármazékok...14 1.2.3.2. Frukto-oligoszacharidok jelentősége a gastrointestinális traktus egészséges működésének fenntartásában...16 1.2.4. Távol-Keletről származó gyógykészítmények...19 1.2.4.1. A Beiqishen tea drogjai...19 1.3. Vizsgálati lehetőségek az élő szervezet redox-egyensúlyának kutatásában, lehetséges szerepük a diagnosztikában...22 1.3.1. A klinikai szabadgyök-kutatás korszerű eszközei és módszerei...22 1.3.1.1. Antioxidáns státusz vizsgálati lehetőségei...24 1.3.1.1.1. Spektrofotometriás és enzimatikus-kolorimetriás eljárások...24 1.3.1.1.2. Fluoreszcens és lumineszcens detektáláson alapuló mérőmódszerek...28 1.3.1.2. Az oxidatív károsodás vizsgálati paraméterei...30 1.3.1.2.1. Lipidperoxidok, lipid-hidroperoxidok...30 1.3.1.2.2. Izoprosztánok...32 1.3.1.2.3. DNS károsodás során keletkező termékek...33 1.3.1.2.4. Fehérjék oxidációja, protein karbonil csoportok kimutatása és pathofiziológai jelentősége...34 1.3.1.3. Egyéb, kevésbé elterjedt vizsgálati módszerek...35 1.3.2. A szabadgyök-antioxidáns egyensúly mérhető paramétereinek klinikai jelentősége...35 2

2. CÉLKITŰZÉSEK...37 3. MÓDSZEREK...39 3.1. Kémiai analitikai módszerek...39 3.1.1. Szabadgyök-reakciók vizsgálatára alkalmazott módszerek...39 3.1.1.1. Össz-scavenger kapacitás vizsgálata luminometriával...39 3.1.1.2. Redukálóképesség meghatározása...39 3.1.1.3. H-donor-aktivitás meghatározása...40 3.1.1.4. Totál antioxidáns státusz...40 3.1.1.5. Diénkonjugátum meghatározás...41 3.1.1.6.Szabad szulfhidril-csoportok...41 3.1.2. Metabolitok meghatározása...41 3.1.3. Enzimaktivitások meghatározása...43 3.2. Egyéb meghatározások...46 3.2.1. Biológiai minták fehérjetartalma...46 3.2.2. Vörösvértest hemolizátum hemoglobin tartalma...46 3.2.3. Fitokémiai analizisek...46 3.2.3.1. Összpolifenol-meghatározás...46 3.2.3.2. Flavonoidtartalom...46 3.2.3.3. Kávésavmaghatározás...46 3.2.3.4. HPLC vizsgálat...47 3.2.4. Mikroelemtartalom meghatározása...47 3.2.4.1. Növényi mintából...48 3.2.4.2. Állati szövetből...48 3.3. Növényi extraktumok készítése...48 3.3.1. Fekete retek préslé...48 3.3.2. Cikórium kivonat...48 3.3.3. Beiqishen tea...49 3.4. Állatkísérletek...49 3.4.1. Az alkalmazott diétás állatcsoportok...49 3.4.2. Kezelések...49 3

3.4.2.1. Kezelés fekete retek préslével...49 3.4.2.2. Kezelés cikórium kivonattal...49 3.4.2.3. Kezelés Beiqishen tea készítménnyel...50 3.4.3. Szervek előkészítése vizsgálatokra...50 3.4.3.1. Szérum, plazma és vörösvértest hemolizátum készítése...50 3.4.3.2. Máj-és pankreász-homogenizátumok készítése...51 3.4.4. Morfológiai vizsgálatok...51 3.5. Az oxidatív stressz vizsgálata néhány betegségben (humán tanulmányok)... 3.5.1. Gyulladásos bélbetegségben szenvedő betegek...52 3.5.2. Nem-alkoholos steatohepatitisben szenvedők...52 3.5.3. Diabéteszben szenvedők...52 3.6. Anyagok...52 3.7. Matematikai statisztikai analízis...53 4. EREDMÉNYEK...54 4.1. A fekete retek préslé hatása Wistar patkányok szérumparamétereire...54 4.1.1. A préslé antioxidáns tulajdonságának in vitro vizsgálata...54 4.1.2. A préslé hatásának vizsgálata kísérletes hyperlipidaemiában...55 4.2. A cikórium kivonat hatása a szénhidrát- és zsíranyagcserére...58 4.2.1. A cikórium kivonat antioxidáns tulajdonságának in vitro vizsgálata...58 4.2.2. Cikóriumkezelés hatása Wistar patkányokban, kísérletes hyperlipidaemiában.60 4.2.2.1.Májfunkció és lipidanyagcsere paramétereinek változása szérumban...60 4.2.2.2. Vizsgálatok májhomogenizátum mintákban...62 4.2.2.3. Májszövet hisztológiai vizsgálata...65 4.2.3. Cikóriumkezelés hatása Fischer patkányokban, hperlipidaemiában...66 4.2.3.1. Májfunkció és lipidanyagcsere paramétereinek változása szérumban...66 4.2.3.2. Vizsgálatok májhomogenizátum mintákban...68 4.2.3.3.Vizsgálatok pankreász-szöveti homogenizátumban...69 4.2.3.4. Májszövet hisztológiai vizsgálata...70 4.3. A Beiqishen tea hatása egészséges Wistar patkányok homeosztázisára...72 4.3.1. A Beiqisen tea komponensei...72 4.3.2 Szérumparaméterek (enzimek, metabolitok) változásai...72 4

4.3.3 Red-ox paraméterek változásai májhomogenizátumban...73 4.3.4 Mikroelemtartalom meghatározása májhomogenizátumban...76 4.4 Redox-homeosztázis paramétereinek változásai humán betegségekben...78 4.4.1 Gyulladásos bélbetegségben...78 4.4.2 Nem-alkoholos steatohepatitisben...84 4.4.3 Cukorbetegség monitorozása során nyert eredmények...89 5. MEGBESZÉLÉS...92 5.1. Állatkísérletek...92 5.1.1. Fekete retek préslé hatása hyperlipidaemiában...92 5.1.2. Cikórium kivonattal történő táplálékkiegészítés hatása normál és zsírdús diéták alkalmazása során...94 5.1.3. Következtetések a Beiqisen tea állatkísérletes vizsgálata kapcsán...96 5.2. A redox homeosztázist jellemző vizsgálatok jelentősége...98 5.2.1. Gyulladásos bélbetegségek redox homeosztázisa...98 5.2.2. Nem-alkoholos májkárosodásban tapasztalt redox státusz...100 5.2.3. Diabétesz oxidatív monitorozási lehetőségei...101 6. KÖVETKEZTETÉSEK-TÉZISEK...103 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...106 8. IRODALOMJEGYZÉK...108 9. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE...128 5

Rövidítésjegyzék ASH alkoholos steatohepatitis AST aszpartát-aminotranszferáz ALT alanin-aminotranszferáz ADH alkoholdehidrogenáz CAT kataláz CHOL koleszterin EDTA etiléndiamintetraecetsav GSH redukált glutathion GSH-Px glutathion-peroxidáz GGT gamma-glutaminsav-transzamináz GOT glutamin-oxálecetsav-transzamináz GPT glutamin-piroszőlősav-transzamináz HDL magas fajsúlyú lipoprotein (high density lipoprotein) HPLC nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (high performance liquid chromatography IBD gyulladásos bélbetegségek (Inflammatory bowel diseases) IDDM inzulin dependens diabetes mellitus MDA malondialdehid NASH nem-alkoholos steatohepatitis NIDDM nem-inzulin dependens diabetes mellitus RLU relative light unit (kemilumoneszcens fényintenzitás) SOD szuperoxid dizmutáz TAS totál antioxidáns státusz TG trigliceridek TBARS tiobarbitursav-reaktív anyagok Statisztikai rövidítések: X átlag SD standard deviancia A dolgozatban előforduló idegen kifejezéseket a MTA ajánlása szerint írtam. 6

1. BEVEZETÉS 1.1. A szervezet redox-homeosztázisa 1.1.1. Az antioxidáns egyensúlyt biztosító folyamatok A biokémiai, fizikai-kémiai vizsgálati módszerek folyamatos fejlődésével párhuzamosan a szervezetben zajló élettani folyamatokról, azok molekuláris hátteréről szerzett ismereteink napról napra mélyülnek. Az 1990-es évek végére, az oxidoredukciós elektronátvitelen alapuló kémiai reakciók, a reakciókban keletkező szabad gyökök, reaktív oxigén intermedierek biológiai szerepének pontosabb megismerésével a Sellye-i stressz, mint alapfogalom, az oxidatív stressz fogalmává bővült, s szinte új értelmet nyert az élettani folyamatok magyarázatában, a betegségek kialakulásának megértésében (109). Az utóbbi öt évben a vizsgálatok új irányvonala sejtszinten kutatja az oxidációsredukciós folyamatokat, a sejtek közötti jelátviteli mechanizmusra kifejtett, olykor szelektív hatást (84). Az antioxidánsok oxidatív károsodást kivédő képessége a szignál transzdukció lépéseinek kutatásán keresztül válik mindinkább értelmezhetővé. Az élettani folyamatok elektronátviteli reakcióiban játszott szerepüket tekintve az antioxidánsokat két csoportba különíthetjük el. A preventív antioxidánsok (coeruloplasmin, albumin, ferritin, myoglobin, transferrin, metallothionein) a reaktív oxigén intermedierek keletkezését akadályozzák meg. A scavengerek, azaz a gyökfogó antioxidánsok közömbösíteni igyekeznek a rendkívül gyors és reakcióképes, párosítatlan elektronnal rendelkező molekulákat a keletkezésük helyén, megakadályozva ezzel a gyökök révén egyébként beinduló láncreakciót (iniciáció). Az utóbbi csoportba számos természetes kismolekula (vitaminok, szabad-sh csoportot tartalmazó vegyület, aminok, tiolok, quinolinok stb.), ill. enzimek tartoznak. Az enzimek között említjük a superoxid-dizmutáz, a glutathion-peroxidáz, a glutathionreduktáz mellett a katalázokat, valamint az ún. metalloenzimeket, amelyek átalakítják, eliminálják a felesleges számban keletekező szabad gyököket, elhárítva ezzel lehetséges lipid-, illetve fehérjekárosító hatásukat. A kismolekulasúlyú vegyületek, protondonor tulajdonságuknak köszönhetően játszanak fontos szerepet a gyökök közömbösítésében, mint pl. a glutathion, az aszkorbinsav, tokoferol, bilirubin, húgysav (a nukleotidok lebomlási terméke), vagy épp a karotionoidok, flavonoidok, mint növényi eredetű vegyületek, hatóanyagok (164). Oldékonyságukat tekintve mind a vizes-, mind a 7

lipidfázisban működnek antioxidánsok egymással kölcsönhatásban, egymás hatását kiegészítve. Például a sejtmembrán lipifázisában elhelyezkedő tokoferol, antioxidáns funkcióját ellátva tokoferoxil gyökké alakul miáltal polaritása megváltozik és a vizes fázis felé mozdul el. A vízoldékony fázisban funkcionáló aszkorbinsav, mint H-donor azonnal redukálja, azaz regenerálja a gyököt, miközben maga válik szabad gyökké (41). A természet az így keletkező dehidroaszkorbinsav regenelálását is megoldja, a glutathion révén (101). Epidemiológiai kutatások (leíró, eset-kontroll és követéses vizsgálatok) igazolják az összefüggést az antioxidáns vitaminok növekedett mértékben történő fogyasztása és a cardiovasculáris betegségek okozta morbiditási és mortalitási adatok csökkenő száma között (179, 214). Randomizált, dupla-vak, placébó-kontrollált vizsgálatok azonban nem mutatták hatásosnak a béta-karotinok és az E-vitamin alkalmazását a coronaria betegségek kivédésében. Kivételt képez a Cambridge Heart Association Study, melyben 2002 brit férfi és nő esetében angiográfiával igazolt corornaria-betegségben az E-vitaminnal történő kezelés (400-800 IU/nap) hatására, a nem-fatális myocardiális infarktus előfordulását illetően a szerzők 77%-os csökkenésről számolnak be (199). Elsősorban a karotinoidokkal kapcsolatban, gyakran találkozunk ellentmondásos eredményekkel (125, 156) Az A-vitamin, a béta-karotinból képződik a bélhámsejtek enzimjeinek hatására. A növényvilágban elterjedt poliizoprenoid vegyületcsalád több száz (több mint 500) képviselője közül azonban csupán kb. 30-nak van A-vitaminszerű hatása. Ilyen vegyületek pl. a lutein likopén, fukoxantin, kanthaxantin, kriptoxantin, zeaxantin. Az A- vitamin fiziológiásan a látás, hámképződés, növekedés, szaporodás, immunfolyamatok, csontanyagcsere és a nyálkahártyák fiziológiás működéséért felelős. E sokoldalú hatás oka, hogy az A-vitamin és az aktív retinoid metabolitok, mint ligand-dependens transzkripciós faktorok vesznek részt a génszabályozásban. Ez a vitamin is fontos szerepet tölt be a szív-és érrendszeri betegségek kezelésében, a daganatos elváltozások megelőzésében, bőrbetegségek gyógyításában. Túlzott fogyasztása a nyálkahártyák és a bőr kiszáradását, elszarusodását okozza, idegrendszeri és endokrin tünetek jelentkeznek. A karotinoidok, mint antioxidánsok, védenek a reaktív oxigén szabad gyökökkel szemben, közömbösítik a peroxid gyököket. A béta-karotin antioxidáns viselkedése 8

erősen függ az oxigén tenziójától. 15-20 torr oxigénnyomáson antioxidáns, 760 torr nyomáson pedig prooxidánsként viselkedik (144, 162). 1.1.2. Az oxidatív stressz szerepe a betegségek patomechanizmusában Amennyiben a nagy számban képződő reaktív oxigén intermedierek közömbösítése meghaladja a szervezet antioxidáns kapacitását - az utóbbi években mindinkább ismertté váló terminológia szerint - oxidatív stressz - alakul ki. Az oxidatív stressz kialakulásának genetikai hátterét, a következményes immunológiai és biokémiai folyamatokat, azok egymásra hatásait a legutóbbi évek kutatásai alapján ismerhetjük meg, bár még mindig keveset tudunk az egyensúlyi állapot felbomlásának lehetséges okairól. A szabad gyökök, az élettani, biokémiai elektronátviteli reakciókban játszott szerepükből adódóan, részt vesznek a sejtek közötti szignál transzdukcióban, enzimek aktiválásában, gátlásában, a sejtciklus szabályozásában, az apoptozis és nekrózis folyamataiban (163, 166). Az oxidatív stressz bekövetkezte jelzi annak a szervezetben meglévő, az egészséges redox-homeosztázist biztosító egyensúlynak a megbomlását, melynek során a keletkező reaktív oxidatív intermedierek sejtszerkezet, illetve szövetkárosító hatását a szervezet antioxidáns kapacitása már nem képes kivédeni. Az idősödés élettani folyamatának hátterében meghúzódó biokémiai változásokban nagy számú populációban végzett vizsgálati eredmények bizonyítják az élettani változások bekövetkeztéért felelős oxidatív reakciók szerepét pl. a lipidperoxidációban, nukleinsavak károsításában, apoptózis indukálásában (11, 25, 125). Az antioxidáns státuszban bekövetkező egyensúly felbomlás kóros biokémiai, sejtélettani folyamatokat elindító szerepét kutatási eredmények bizonyítják. A humán szervezetet érintő betegségek patomechanizmusáról szóló elméletek alapvetően módosultak az oxidatív sejtkárosító biokémiai folyamatok pontosabb megismerése révén, főként az alkoholos (55, 56, 111, 112) és a nem-alkoholos eredetű krónikus májkárosodással (16, 19, 22, 57), az atherosclerosis kialakulásának antioxidánsok segítségével történő megelőzésével (48), valamint a cardiovasculáris megbetegedésekkel (85, 110, 224), elsősorban a gyulladásos reakciók talaján kifejlődő funciókárosodásokkal (192), gyulladásos bélbetegségekkel (26, 104, 170), valamint a máj és epeutak megbetegedéseivel (58, 78, 79, 80) kapcsolatban. 9

Az atherosclerosis módosított oxidatív elmélete szerint, az LDL először a subendotheliális térben extracellulárisan felhalmozódik, majd szerkezetileg módosul. Ez a módosult forma azonban már elegendő a vasculáris celluláris válaszreakció beindításához, melynek során monocyta kemotaktikus faktor termelődése indul meg. További granulocyta és macrophág kolónia stimuláló faktorok elválasztása révén fokozódik a macrophágok differenciálódása az artériák falában. Az akkumulálódó monocyták és macrophágok tevékenysége révén az LDL molekula tovább oxidálódik, a molekula fehérje komponensének töltése tovább tolódik negatív irányba, így a macrophágok felületén lévő scavenger receptorok számára, mint idegen ágens fog jelentőséget kapni. A lezajló fagocytózis során az oxidált LDL molekula macrophágban történő internálódása eredményeként keletkező habos sejtforma, nem vesz részt a folyamat negatív feed back regulációjában, azaz a koleszterint a macrophágok zavartalanul veszik fel. A habos sejtek képződésén túl az oxidált LDL direkt kemotaktikus ingert jelent a monocyták számára, stimulálva azok kötődését az endothel falához. A habos sejtekké alakuló monocyták nem képesek elhagyni az endothélt, hanem a subendotheliális térben felszaporodva, a lysosomális enzimek felszabadulása révén előidézik az érfal atherosclerotikus károsodását. Palinski és munkatársai 1989-ben igazolták az LDL in vivo oxidatív módosulását, és kimutatták az atherosclerotikus elváltozás helyéről extrahált és in vitro körülmények között oxidált LDL molekulák közötti azonosságot (161). Az LDL molekula oxidatív módosulása és az atherosclerosis kialakulása közötti összefüggés adja az alapját az antioxidánsok potenciális megelőző szerepével kapcsolatos kutatásoknak a szív-érrendszeri betegedésekben. A közlemények elsősorban állatkísérletes eredményekről számolnak be, melyek a probucol, az N N diphenil-pheniléndiamin szintetikus antioxidáns, valamint az E- vitamin előnyös szerepét támasztják alá (188, 198). Egyes szerzők a szabad gyökök indukálta koleszterin akkumuláció létrejöttében, ciklikus AMP-függő folyamatnak tulajdonítanak kiemelkedő szerepet (71). Az antioxidánsok bevitele és a koszorúérbetegségek kialakulása közötti kapcsolatot vizsgálta az a placébó kontrollált, randomizált epidemiológiai vizsgálat (Cholesterol Lowering Atheroslerosis Study), melyben koronária bypass műtéten átesett betegeket vizsgáltak.. A terápia során, colestipol, niacinnal együtt történő alkalmazásának lehetséges előnyös hatásán túl, 100 IU/nap E-vitamint is fogyasztottak a 10

betegek. A két éves követés során angiográfiás vizsgálatok segítségével kimutatható volt a koronária betegség progressziójának csökkenése (86, 125). Tovább folytatva a betegségek sorát, ma már egyértelmű a reaktív oxigén intermedierek szerepe az izületek gyulladásos megbetegedéseiben (158), gyulladásos bélbetegségekben (18, 184, 166), tumoros folyamatokban (109, 207), a szem betegségeiben (90, 54), pancreasbetegségekben (93, 94), valamint a krónikus veseelégtelenségben kialakuló carcinomás elváltozásokkal kapcsolatban is további, számos kutatási eredmény bizonyítja az oxidatív gyökök túlsúlyba kerülésének sejtműködést károsító szerepét (35). Diabetesben, és annak késői szövődményeiben humán vizsgálatok eredményei bizonyítják a redox homeosztázis megbomló egyensúlyát (32, 219), a szövetek (pl. érendothel) antioxidáns kapacitásának (137, 138), de legfőképpen a szervezet össz-antioxidáns státuszának általános legyengülését (31, 33, 64, 197, 171, 202, 205). 11

1.2. Természetes eredetű antioxidánsok 1.2.1. Természetes eredetű hatóanyagok szerepe a redox-homeosztázisban, mikroelemtartalom befolyása az antioxidáns hatás kialakulására A kutatók rendelkezésére álló egyre érzékenyebb és pontosabb analitikai módszerek megteremtették a lehetőségét az évezredes népgyógyászati tapasztalatok hátterében álló biokémiai folyamatok megfelelő tisztázásának, a különféle növényi eredetű hatóanyagokkal kapcsolatban korábban csak tapasztalati úton megismert, az emberi szervezetben kifejtett előnyös, betegség esetén, akár terápiás hatás igazolásának (4, 140). Farmakognóziai kutatások eredményeként, az 1980-as években vált egyértelművé, hogy a növényi kivonatokkal kapcsolatos hatás a bennük kimutatható vegyületek szinergizmusának tulajdonítható. Valamely komponens izolálása, a többi vegyülettől történő elkülönítése a kivonat hatásosságának csökkenését, vagy a hatás teljes elvesztését okozhatja. Szintén az 1990-es évek szakirodalmi adatai révén került előtérbe a növényi polifenolok, kiemelten a flavonoidok (8, 87, 95) jelenléte a növényi eredetű élelmi anyagokban (114). A hazai és a nemzetközi kutatási eredmények egyaránt kifejezett antioxidáns, lipidperoxidációt gátló, vagy fém-kelát képző tulajdonságot igazoltak. Egyes közlemények összegzik a flavonoidok (szilimarin) közvetlenül a szabad gyökökre gyakorolt hatását is (21, 129, 59, 98). Tovább folynak a vizsgálatok a flavonoidok felszívódási körülményeinek tisztázására. A növényi kivonatok potenciális antioxidáns tulajdonságának igazolásához olyan analitikai módszerek használatosak, melyekben a mesterségesen generált reaktív intermedierek (szabad gyökök) detektálható, lumineszcens vagy fluoreszcens jelet adnak. Ehhez a közeghez hozzáadva a növényi kivonatot, a jel intenzitásának megváltozása adja az értékelés alapját. A szervezet megfelelő redox-homeosztázisa, az egészséges szöveti anyagcsere és működés szempontjából alapvető feltétel, melyben az antioxidáns védekező mechanizmus és a katalitikus szerepet betöltő fémionok egyaránt fontos szerepet játszanak (15, 56, 206). A szervezetben az esszenciális átmenetifémionok koncentrációja szigorúan, míg a toxikus nehézfémionok metabolizmusa gyengén szabályozott, és kiürülésük is lassú (195). A nehézfémek akkumulációja nagy koncentrációban gátolja az enzimaktivitásokat, befolyásolja az akut-fázis proteinek 12

szintézisét. A d-mező elemei egyfelől xidatív stressz kiváltói (elősegítve a lipiperoxidáció egyes lépéseit)(201, 220, 225), másfelől a szervezet antioxidáns védelmét biztosító enzimek alkotó elemei (134). A szabadgyök-károsodásokkal és az antioxidáns hatású vegyületek biokémiájával kapcsolatos kutatások eredményei igazolták, hogy az étrendi antioxidánsoknak, nyomelemeknek, alapvető jelentősége van számos megbetegedés prevenciójában, ill. regressziójában (88, 53, 110, 128, 129) fontos eszközei, kiegészítői lehetnek az alkalmazott terápiának például Parkinson kórban (52), vagy Alzheimer betegség esetén (183). Az antioxidáns vegyületek, valamint a fémionok szempontjából kontrollálatlanul alkalmazott kivonatokkal azonban jelentősen megromolhat a szervezet redox-homeosztázisa, amely ilyen körülmények között már nem tudja szabályozása alatt tartani a szabad gyökök képződésével járó biokémiai folyamatokat (15, 82, 100). Fémionok jelenlétében, az egyéb kötülmények között hatékony antioxidáns vegyületek veszíthetnek hatásukból, vagy akár teljesen hatástalannak is bizonyulhatnak egyes szöveti károsodások kivédésében (2). A nyomelemek koncentrációja valamint az antioxidáns enzimaktivitás és lipidperoxidáció közötti szoros összefüggést vizsgálták kutatók magas vérnyomás betegségben (113). A természetes növényi eredetű antioxidánsoknak a szervezet redox-homeosztázisát befolyásoló szerepe az utóbbi évtizedekben egyre nagyobb érdeklődésre tett szert a kutató szakemberek körében (210, 133). Ezen kutatási eredmények az egészségmegőrzés fontosságának mind nagyobb jelentőséget tulajdonítva, alapvetően megváltoztathatják táplálkozási szokásainkat, életmódunkat,. 1.2.2. Raphanus sativus L. var.niger A fekete retek (Raphanus sativus L. var. niger) régóta ismert élelmiszer és fűszernövény. A népi gyógyászatban a hasi puffadás, teltségérzés, elégtelen emésztés kezelésére és megelőzésére, valamint az epekő kialakulásának megelőzésére, epetermelés fokozására használják. Gyógyhatású vegyületei között mustárglikozidokat (izotiocianátokat), illóolajokat, enzimeket, enziminhibitorokat, mikroelemeket, B- és C- vitamint tart számon az irodalom (24, 91, 168). Jelentős mennyiségben tartalmaz továbbá flavonoidokat és egyéb polifenol jellegű vegyületeket, glükozinolátokat, melyekből mirozináz enzim hatására izotiocianátok keletkeznek, mely vegyületek a glükozinolátok aglikonjai. Néhány szerző a glükozinolátok és a belőlük keletkező 13

izotiocianátok direkt antioxidáns hatásáról is beszámolt (222). A fekete retek préslé in vitro vizsgálata során megnyilvánuló össz-scavenger kapacitást növelő hatásában, jelentős flavonoid tartalma is szerepet játszhat (128). Az utóbbi évtizedek kutatási eredményei számolnak be a flavonoidok LDL-oxidációt, valamint thrombocita aggregációt gátló hatásáról. Számos in vitro tanulmány igazolja a flavonoidok antioxidáns tulajdonságát, mely meghatározott kísérleti körülmények között erősebbnek mutatkozott az α-tokoferolénál. In vitro vizsgálatokban a flavonoidok gátolták mind a celluláris, mind az extracelluláris tényezőkkel előidézett LDL oxidációt. A kvercetin és a rutin nagy koncentrációban megakadályozta az oxidált LDL jelenléte miatt bekövetkező sejtkárosodást, gátolva a lipoproteinek oxidációját. Kisebb koncentrációban, közvetlenül védték a sejteket az oxidált LDL citotoxikus hatásaitól (147, 148). A polifenol vegyületekre jellemző, irodalmi adatokkal is alátámasztható antioxidáns, szabadgyök scavenger tulajdonság (28, 176, 177) in vitro vizsgálati rendszerben is megfigyelhető. 1.2.3. Cichorium intybus (L.) 1.2.3.1. Polifenol vegyületek: flavonoidok, kávésavszármazékok A cikórium vagy katángkóró (Cichorium intybus L.) már a 17. században is hasznos gyógynövény volt májbetegségek és epepanaszok, illetve húgyúti fertőzések kezelésére. A cikórium fontos népélelmezési cikk is, mivel rügyei savanyúságként, virága és levelei salátaként fogyaszthatók. A Cichorium endivia pörkölt gyökere pedig pótkávéként ismert, mivel a gyökér inulin (polifruktóz) tartalma a pörkölés során karamellizálódik, és ez eredményezi a jellegzetes aromás kávéízt (168). Emellett a növény jellegzetes komponensei közé tartoznak még a szeszkviterpén laktonok, mint keserűanyagok, melyek hozzájárulnak a növényből készült kivonatok emésztést elősegítő hatásához. Hatano és munkatársai a cikórium növény gyökerében kimutatható flavonoid vegyületek szabadgyök-scavenger tulajdonságáról számoltak be 1988-ban (83). Gazzani és munkatársai a Cichorium intybus var. Silvestre antioxidáns és prooxidáns tulajdonságú komponenseit vizsgálta in vitro és ex vivo.vizsgálataik során az egyes frakciók antioxidáns tulajdonsággal rendelkező vegyületei mind kémiai mind biológiai rendszerekben kifejtették hatásukat. A cikórium növény kivonatának 14

antioxidáns tulajdonságát in vitro, a β-karotin-linolénsav oxidációs metodikai rendszer segítségével igazolták, antioxidáns aktivitási %-ban (AA%) kifejezve. További ex vivo vizsgálatok során máj-mikroszóma preparátum segítségével a lipiperoxidációban keletkező termékeket, mint 2-thiobarbitursav reaktív vegyületekként határozták meg. Az alacsony molekulasúlyú (MW<3000) prooxidáns vegyületeket, a savas közegben való oldhatóság jellemezte. A legnagyobb mértékű antioxidáns aktivitással rendelkező barna frakció elegyét alkotó komponensek nem oldódtak savas közegben, a jellemző molekulasúly pedig nagyobb volt, mint 300 000 Dalton, amint azt az elegy elektroforetikus analízise igazolta. Az antioxidánsok azonos koncentrációinak egyidejű jelenléte biztosította a növényi kivonat lipidperoxidációt gáló hatását. Prooxidáns vegyületek jelenlétében a növényi kivonat, alacsonyabb antioxidáns, és lipidperoxidáció elleni protektív hatást mutatott A vegyületek kémiai szerkezetének azonosítását a szerzők ebben a munkájukban még nem végezték el (70, 103). A kávésav és származékai (pl.: eszkuletin), mint a Cichorium intybus (L.) hidroxi-kumarin típusú vegyületei, szintén a figyelem központjába kerültek, lehetséges májtoxicitást kivédő hatásuk miatt. Gilani és munkatársai paracetamol és CCL 4 indukálta májkárosodásban vizsgálták a 6 mg/testsúly kg dózisban alkalmazott eszkuletin hatását, egerekben. Az eszkuletinnel előkezelt állatokban a paracetamol 1g/testsúly kg dózisban okozott 100%-os mortalitási aránya 40%-ra csökkent. Az eredményt az előkezelt és az előkezelésben nem részesülő állatok esetében mért enzimaktivitások közötti különbségek is alátámasztották (73). A polifenolos vegyületek közül a kávésav (fenolsav), általában növényi eredetű táplálékainkban, mint klorogénsav fordul elő, amely vegyület a kávésav, kínasavval alkotott észtere (168, 36). Az irodalomban antioxidáns (27), N-nitrosilációt gátló (107) és in vitro DNS protektív hatásról (97, 193) találhatunk beszámolókat. Epidemiológiai vizsgálatok igazolták például kávéfogyasztók esetében, a kávésav tápcsatornában történő abszorpciója és a colon-carcinómák előfordulásának gyakorisága közötti fordított összefüggést (116, 209). Jelentős gyulladásgátló és atherosclerosist kivédő szerepét helyezik előtérbe azok a kutatási eredmények, amelyek e vegyületek LDL oxidációt kivédő (211, 27), illetve leukocita apoptózist indukáló hatásukról (186, 157) számolnak be. A kutatások kiterjednek a klorogénsav és a kávésav felszívódásának 15

vizsgálatára is, követve a vegyület metabolitjainak mennyiségét a keringésben, valamint kiválasztásuknak egyes lépéseit (7, 155). 1.2.3.2. Frukto-oligoszacharidok jelentősége a gastrointestinális traktus egészséges működésének fenntartásában A cikórium frukto-oligoszacharidok, összefoglaló néven, fruktánok, olyan szénhidrátok, melyekben a fruktozil-fruktóz kapcsolódások képezik a glikozid kötések legnagyobb hányadát. A cikórium fajok a Compositae növényi család tagjai, az élelmiszeripar számára inulin-forrást jelentenek. A cikórium inulin elnevezés mind a GpyFn (α-d-glükopiranozil-[β-d-fruktofuranozil]n-1-d-fruktofuranozid), mind a FpyFn (β-d-fruktopiranosil-[β-d-fruktofuranozil]n-1-d-fruktofuranozid) vegyületeket magában foglalja. A fruktózegységek száma viszonylag széles tartományban, 2-70-ig változhat. A natív inulinból az élelmiszeriparban rövid szénláncú oligofruktózokat (DP 2-10) állítanak elő részleges enzimhidrolízis segítségével (endoinulináz EC 3.2.1.7 felhasználásával), valamint hosszú láncú fruktánokat ipari fizikai-szeparációs technológia alkalmazásával. A cikórium frukto-olgoszacharidok számos gyümölcsben és zöldégben jelentős mennyiségben megtalálhatók. Átlagos napi fogyasztása az Egyesült Államokban 1-4 g között (145), míg Európában 3 és 11 g között változik (213). A leginkább elterjedt források közt említhetjük a búzát, a vöröshagymát, banánt, fokhagymát és a póréhagymát. A cikórium-inulin és az oligofruktózok a legtöbb európai országban hivatalosan is elismert természetes élelmiszeralkotók, élelmi rostanyagok. Az utóbbi időben terjedt el az az analitikai eljárás, amely segítségével a növények és élelmiszerek inulin és oligofruktóz tartalma meghatározható (173). A fruktóz monomerek C2 szénatomjának β-konfigurációja következtében, az inulin ellenáll a humán emésztőenzimek (α-glükozidáz, maltáz-izomaltáz, szukráz) működése révén bekövetkező hidrolízisnek, mivel ezek az enzimek csak az α-glikozidos kötéseket képesek hasítani. Ennek következtében ezeket a szénhidrátokat a nem emészthető oligoszacharidok osztályába sorolják (40, 46). Utóbbi tulajdonságuknak köszönhető az a jelentős élettani hatásuk, hogy a vastagbélben elősegítik az endogén baktériumok megfelelő szaporodását, így indirekt energiát, anyagcseretermékeket és esszenciális nyomelemeket biztosítnak a szervezet számára (96). Az ilyen természetű tápanyagokat más néven vastagbél táplálékokként (colonic food) is említik, jelentős 16

prebiotikus hatást tulajdonítva ezen élelmi anyagoknak (72). A vastagbélben történő fermentálódás során tejsav és rövid szénláncú karboxi savak keletkeznek, melyek következtében a coecalis ph csökken, azaz savas irányba tolódik el. Remesy és munkatársai az inulin hatásaként az oligofruktózok vastagbélben végbemenő fermentálódása miatt felszaporodó rövid láncú zsírsavaknak tulajdonítja a mucosa hyperplasiát, valamint a vékony és vastagbélben a bélfal megvastagodását (175). A coecumban tapasztalható ph csökkenésre vezetők vissza az inulin további élettani hatásai, mint például a kálciumfelszívódás fokozódása, a hypotrigliceridaemia a hypoinsulinaemia, továbbá a precarcinomás colon-elváltozások kialakulásának csökkent kockázata is, mely hatásokat kísérletes modellekben igazoltak (181, 182, 213 ). A fenti hatások közül a legígéretesebbnek a kalcium fokozott biohasznosítása mutatkozik az állakísérletek alapján (45, 153, 154,). A legutóbbi, izotóp- technikát alkalmazó humán vizsgálatok eredményei szerint 16,8 g oligofruktózzal, valamint 40 g inulinnal történő diétakiegészítés hatására a kálcium abszorpciója több mint 10 %-al fokozódott (40, 212). Legutóbbi vizsgálati eredmények szintén alátámasztják a frukto-oligoszacharidok, ásványianyagok felszívódását elősegítő hatását, kivédendő a fitonsavnak az ásványianyagcsere-forgalmat károsan befolyásoló szerepét a szervezetben (51, 123). A frukto-oligoszacharidok szénhidrát- és lipidanyagcserét befolyásoló hatását állatkísérletes modellekben és humán vizsgálatokban is megfigyelték (223). Causey és munkatársai emelkedett szérum-összkoleszterin szinttel rendelkező férfiak csoportját vizsgálta 3 hetes, átlagosan 20 g inulin tartalmú diéta alkalmazása során. A diéta szignifikáns csökkenést okozott a szérumtriglicerid koncentrációkban, amely összhangban áll Williams és munkatársai által végzett vizsgálatok eredményeivel, akik 3o egészséges felnőtt esetében, 8 héten keresztül alkalmazott inulintartalmú diéta hatásaként, szintén az éhgyomri szérumtrigliceridek szignifikáns csökkenését tapasztalták (29). Az inulin tartalmú diéta szérumkoleszterin koncentrációkra gyakorolt hatását vizsgálva ellentmondásos eredmények jelentek meg az irodalomban (44, 167). Delzenne szerint az inulin triglicerid-csökkentő hatása a májban a de novo zsírsavszintézis során, a lipogén enzimek gátlásán keresztül valósul meg (46). Az oligofruktózok hosszú távú diétás alkalmazása Kok és munkatársai vizsgálatában kivédte a trigliceridek májsejtekben történő felhalmozódását (106). Fiordaliso és kollegái munkájának eredményeként pedig a plazma triglicerid 17

koncentrációja csökkent szignifikánsan az adott állatcsoportban, oligofruktózok adagolásának hatására (60). A Cichorium intybus L. hepatotoxicitást kivédő hatását Gadgoli és Mishra vizsgálta Wistar patkányokban, CCL 4 és paracetamol vegyületek által kiváltott májkárosodásban in vivo, és in vitro (65). A toxikus vegyületek alkalmazása mellett a metanolos növényi kivonattal történő kezelés hatására a májfunkciót tükröző enzimaktivitások értékei a cikóriumkezelt állatcsoportban szignifikánsan csökkentek. Hasonló eredmény született a vizes növényi kivonattal történő kezelés hatására is. Az acetonos növényi kivonattal történő kezelés azonban nem járt eredménnyel. A cikórium növény kivonataiban meglévő komponensek májtoxicitást kivédő hatását egyrészt azok antioxidáns tulajdonságával, másrészt a paracetamol, citokróm P450 enzimkomplex segítségével végbemenő metabolizmusának gátlásával magyarázták a szerzők, kivédendő a májtoxikus metabolitok képződését. (108). 18

1.2.4. Távol-Keletről származó gyógykészítmények 1.2.4.1. A Beiqishen tea drogjai Az emberiség ősidők óta ismeri és gyűjti a gyógynövényeket. Az ázsiai mezőgazdaság kezdetei egyes feltételezések szerint 7000-13000 évre nyúlnak vissza. Gyakorlatilag a gyógynövények megismerése és tudatos alkalmazása is ezektől az időktől datálható (17). A Beiqishen tea gyártó által deklarált komponensei az Astragalus mongolicus, a Lycium barbarum, a Ganoderna lucidum és a Camellia sinensis. Az Astragalus mongholicus, Kína északi részén (Yunnan és Sichuan kerületeiben) őshonos növény, több mint 2000 fajtája ismert világszerte. A gyógyászati célra felhasznált drogot a növény gyökérzete alkotja. A hagyományos kinai orvoslásban évszázadok óta jól ismert gyógynövény, a Kínai Gyógyszerkönyvben is hivatalosan jegyzett, drogja tonizáló, diurézist fokozó és daganatképződést gátló hatással rendelkezik. A modern kínai orvoslásban terápiás célokra, mint immunstimuláns használatos (89). Az elsősorban szaponinokat (asztragallosidae I-II-III és fitoszterolokat (kampeszterol, sztigmaszterol, szitoszterol) tartalmazó növényi készítmény, hasonló hatása miatt, a Ginseng gyökér készítmények helyettesítésére is alkalmas. Az antibiotikus és antioxidáns (szuperoxid-savenger) hatásért a növény által tartalmazott izoflavon vegyületek (kalikozin) a felelősek. Ez utóbbi hatóanyaga révén a növényből készült kivonat alkalmas Giardia fertőzés gyógyítására, valamint in vitro körülmények között a növény kórokozóellenes hatását igazolták a kloroquin-rezisztens Plasmodium falciparummal szemben (132). A Lycium barbarum (kínai farkasbogyó), a Solanaceae (burgonyafélék) családba tartozó ritka növény, melyet Kínában mind gyógy-, mind élelmi növényként is alkalmaznak. A gyógyhatású drogot a növény termése adja, melyet már i.e. 1400-1000 idején is ismertek. A kellemes ízű, piros színű bogyótermés hatóanyagai közé tartoznak a β-karotin, C-vitamin, a poliszacharidok, valamint 21-féle nyomelem is. Hatóanyagainak kémiai jellegét, hatását, alkalmazhatóságát napjainkban is kutatják. Utóbbiak közül kiemelkedik vérnyomás és vércukorcsökkentő hatása. Hazánkban is ismert évelő cserje, magyar neve: ördögcérna. A hazánkban honos növény azonban minden részében atropint és hioszciamint tartalmaz, amely gyógyászati alkalmazását erősen korlátozza, sőt, mint mérgező növényt említi az irodalom (81). 19

A Ganoderma lucidum (pecsétviaszgomba) (Basidiomycetes) gombát a kínai népgyógyászatban 4000 éve ismerik és alkalmazzák. A neve Ling zhi jelentése: a halhatatlanság növénye. A gomba mycéliumából és spórájából előállított készítmények legjelentősebb hatóanyagai közé a poliszacharidok és a triterpének -mint hidrofób, ciklikus hidrokarbonok- tartoznak (121). Korábbi kutatások, a gomba poliszacharid vegyületeinek in vivo és in vitro immunmoduláns hatását igazolták (120). További kutatási eredmények a triterpének antioxidáns, májvédő, plazma-koleszterinszint csökkentő, anti-hypertenzív, valamint thrombocyta-aggregációt gátló tulajdonságáról számoltak be a β-galaktozidáz, a koleszterol-szintetáz, és az angiotensin konvertáló enzimre kifejtett gátló hatás révén (203). A legutóbbi vizsgálati eredmények a Ganoderma alfajokból izolált triterpének tumorsejt ellenes, citotoxikus aktivitásáról számolnak be, többek között humán Hep3B hepatoma sejteken tapasztalt apoptosist indukáló hatás alapján (67). A hatás molekuláris mechanizmusa azonban még nem tisztázott. Lin és munkatársai legutóbbi kutatásukban normál és daganatos májsejteken vizsgálták a triterpén vegyületek hatását a sejtek jelátviteli mechanizmusában részt vevő molekulákra. Eredményeik alapján, a daganatos májsejtek növekedési tendenciájának gyors csökkenését tapasztalták az általuk alkalmazott gombakivonat (WEES-G6) protein kináz C-re, valamint a mitogén-aktiválta protein kinázokra kifejtett gátló hatása révén. Öszehasonlítva a daganatos sejtekkel, a normál máj-sejtvonalon hasonló enzimgátló hatást nem detektáltak (121). A biotechnológia új eredményei, valamint a modern kémiai-analitikai eljárások egyaránt hozzájárultak a növényi immunstimuláló vegyületek kémiai természetének, hatásmechanizmusának mind tökéletesebb megismeréséhez. Az utóbbi három évtizedben több poliszacharid és poliszacharid-fehérje komplex került azonosításra gombákból, algákból és egyéb növényekből. A különleges érdeklődést a vegyületekkel kapcsolatban igazolt immunmoduláns és antikarcinogén hatás keltette fel (120). A makrogombákban olyan vízben oldódó poliszacharidokat (poliglukánokat) azonosítottak, amelyek jellegzetes kötéstípusuknak (1-3, 1-6 C-C kötésű, β-d-glükánok) és molekulatömegüknek (200-500 ezer Dalton) köszönhetően immunstimuláns és tumornövekedést gátló hatással rendelkeztek. Az immunmoduláns hatásmechanizmusból adódóan e vegyületek daganatellenes hatása kevésbé vagy egyáltalán nem társul egyéb toxikus, sejtkárosító mellékhatásokkal, 20

szemben a citosztatikumokkal (99). Gan és munkatársai S180 solid tumor növekedésgátlásával igazolták a Lycium barbarum daganatellenes hatását, valamint vizsgálták humán mononukleáris sejtekben az interleukin-2, valamint a tumornekrózis faktor-α termelődését, szemikvantitativ reverz transzkripciós és polimeráz láncreakció (RT-PCR) technikák felhasználásával történő citokin-mrns analízisen keresztül (68). Eredményeik alapján, a növény hatóanyagai növelték a kétféle citokin termelődését a mononukleáris sejtekben, mely folyamat biztosíthatja a kóros mértékű sejtosztódás immunterápia útján előidézett regresszióját. 21

1.3. Vizsgálati lehetőségek az élő szervezet redox-egyensúlyának kutatásában, lehetséges szerepük a diagnosztikában 1.3.1. A klinikai szabadgyök-kutatás korszerű eszközei és módszerei Ahogyan sokasodnak a kutatási eredmények és a gyakorlati tapasztalatok, az oxidatív stressz fogalma, mint az egészséges szervezet egyensúlyát megbontani, gyengíteni képes állapot, egyre inkább elfoglalja megfelelő helyét az orvostudományban. A szükségszerűen bekövetkező szemléletváltozás következményeként, a gyakorló orvosok számára egyre inkább fontossá válik, hogy betegeik kezelése során a terápia sikerességét biztosítandó, minél több információt szerezzenek a szervezet redox-homeosztázisáról. Ezért az utóbbi időkben egyre több, az oxidatív stresszt vizsgáló módszert alkalmaznak a diagnózis helyes felállításához, a terápia tervezéséhez. A megnövekedett igény miatt folynak a kutatások a megfelelő vizsgálati paraméterek (szérum, plazma, vizelet) azonosítására, valamint a vizsgálatok elvégzéséhez szükséges könnyen kivitelezhető, pontos, az adott paraméterre nézve specifikus analitikai módszerek kidolgozására (196, 218, 221). A szabad gyökök, mivel önmagukban igen rövid élettartamúak (10-4 -10-12 sec) rendkívül gyorsan reakcióba lépnek a környezetükben levő szerves vegyületekkel, így csak a nagyon érzékeny, speciális technika, az Elektron Spin Rezonancia (ESR) eljárás segítségével lehet keletkezésüket, jelenlétüket in vivo detektálni (169). Az ESR technikát Zavoisky fedezte fel és alkalmazta először, 1944-ben. Manapság a kémia, fizika, biológia és az orvostudomány számos területén alkalmazzák az eljárást, szabad gyökök képződésével járó folyamatok tanulmányozására. Tekintettel arra, hogy mind a berendezés, mind az eljárás igen bonyolult és drága, nem alkalmazható nagy számban végzendő, gyors és informatív laboratóriumi analitikai célokra. Az utóbbi évtizedben olyan egyszerűbben kivitelezhető kolorimetriás, és immunreakción alapuló módszereket fejlesztettek ki, melyek során az adott paraméter (antioxidáns enzimaktivitás) meghatározása, spektrofotometriás detektálás révén valósul meg. A fotometriás analitikai eljárás viszonylag könnyű laboratóriumi kivitelezhetősége mellett másik előnye, hogy automatizálható is, így segítségével, viszonylag nagy számú vizsgálati minta (szérum, plazma, hemolizátum) egyidejű, gyors és pontos analízise válik lehetővé. 22

A különféle fehérjemolekulák, specifikus antitestek biotecnológiai úton történő előállításának köszönhetően, az immunológiai reakción alapuló enzimkötéses reakciók (immunoassay) is gyorsan elterjedtek a gyakorlatban. A vizsgálati módszerek ezirányú fejlődése nagymértékben megkönnyítette az oxidatív folyamatok kutatásával foglalkozó szakemberek munkáját, valamint adta meg az alapját az antioxidánsok alkalmazásával kapcsolatos széles körű populációban végzett epidemiológiai vizsgálatok megvalósításának is (200). A legismertebb epidemiológiai vizsgálatok között említhetjük Verlangieri és munkatársai 1985-ben közreadott eredményeit, melyek inverz összefüggést mutattak ki a gyümölcs- és zöldségfogyasztás, valamint a cardiovasculáris megbetegedések gyakorisága között, amerikai populációban (215). A Nurses Health Study 87 245 amerikai ápolónő körében végzett vizsgálat során szintén fordított összefüggést mutatott ki a koronáriabetegségek előfordulása és az α- tokoferol fogyasztása között (199). A kutatási célokat szolgáló vizsgálatok egyszerűbb kivitelezhetőségén túl, megteremtődtek a feltételek akár a hazai lakosság egészségi állapotát felmérendő, szűrő jellegű vizsgálatok kivitelezésének. 23

1.3.1.1. Antioxidáns státusz vizsgálati lehetőségei 1.3.1.1.1. Spektrofotometriás és enzimatikus-kolorimetriás eljárások Az egyszerűen kivitelezhető kolorimetriás, módszerek során a meghatározandó paraméter aktivitása (antioxidáns enzimek esetén), vagy koncentrációja (oxidációs metabolitok esetén), az analitikai eljárásban sztöchiometrikusan keletkező reakciótermékeknek spektrofotometriás detektálásán keresztül határozható meg. Figyelembe véve az antioxidáns vegyületek közötti lehetséges szinergizmust, továbbá a szabad gyökök az antioxidáns enzimek szintézisére kifejtett szignáltranszdukción keresztül megvalósuló hatását, egy-egy oxidációs metabolit koncentrációjának, vagy egy adott enzimaktivitás önmagában történő meghatározása nem tükrözheti megfelelően a szervezet redox egyensúlyának valódi állapotát. Ezért meg kell fontolni, hogy milyen paramétereket határozzunk meg. A klinikai gyakorlat szempontjából például a protondonor vegyületek (C-vitamin, E-vitamin) koncentrációinak meghatározása, vagy az elektron-átviteli reakciókat katalizáló enzimek (szuperoxid dizmutáz, glutation reduktáz) aktivitásának mérése a szervezet általános redox-egyensúlyának megítélésében nyújthat segítséget. Az antioxidáns tulajdonságú enzimek aktivitásemelkedése a fokozott oxidatív stressz állapotjelzője lehet, mivel ezek az enzimek katalizálják a felszaporodó szabad gyökök közömbösítését adott biológiai rendszerben. Szuperoxid dizmutáz (SOD): Intracellulárisan a citoplazmában Cu/ZnSOD és a mitokondriális MnSOD egyaránt megtalálható (174). Az enzim aktivitásának meghatározása vörösvértestek lizátumából lehetséges. Az alkalmazott fotomeriás eljárás, a xantin/xantin oxidáz rendszerben szuperoxid gyök hatására keletkező vörös színű formazán terméket detektál, 505 nm-en. A vizsgálati mintában (heparinnal, EDTA-val alvadásgátolt vérminta) meghatározásra kerülő szuperoxid-dizmutáz enzim a keletkező gyököt hatástalanítja H 2 O 2 valamint O 2 keletkezésén keresztül, miközben csökken a színintenzitás. Az abszorbancia mérhető csökkenése egyenesen arányos a mintában jelenlevő enzim aktivitásával. Az irodalomban magas enzimaktivitásokról számoltak be colorectalis karcinómában (187), szisztémás sclerosisban (143), myositisben (141) és malignus melanomában (190). Angina pectoris után, valamint myocardiális infarktuson átesett 24

betegek esetében pedig egyes szerzők alacsony SOD aktivitást tapasztaltak (34, 216). Francia kutatók nagy létszámú (n=1836), egészséges populációban vizsgálták a plazma és a vörösvértest eredetű szuperoxid-dizmutáz enzim biológiai variabilitását. A jellemző életkor széles határok között (4 és 97 év között) változott. A 65 év feletti korcsoportban, az enzimaktivitások szignifikáns csökkenése volt kimutatható, míg a 65 évnél fiatalabb egészséges felnőtt csoportban, közel azonos enzimaktivitások mutatkoztak. A szerzők a plasma SOD és a vörösvértest SOD aktivitások között pozitív korrelációt bizonyítottak. Az eredmények alapján ajánlások születtek a 65 évnél fiatalabb egészséges egyénekre jellemező normálérték tartományra, mely a SOD esetében nem különbözött nemek szerint (77). Glutation peroxidáz (celluláris GPX): Szelénium dependens enzim, amely 70%-ban a citoplasmában, 30%-ban a mitokondriumokban fordul elő. Szerepet játszik a szerves peroxidok és a H 2 O 2 eliminálásában. Az analitikai eljárás során a vizsgálati minta legtöbbször vörösvértest lizátum (160). Egyszerű fotometriás eljárás során a redukált NADPH oxidatív átalakulására bekövetkező abszorbancia csökkenést detektáljuk, amely egyenesen arányos a GPX enzim aktivitásával. Tartós, fokozott fizikai terhelés hatására (136), valamint krónikus veseelégtelenségben (30) kialakuló oxidatív stressz állapotában emelkedett enzimaktivitásról számoltak be. Az enzimaktivitás változásának monitorozásával felismerhető a korai szelenium-hiányos állapot, valamint segítségével megítélhető a daganatos betegségek kialakulásának megnövekedett kockázata (189). A humán extraceluláris glutation peroxidáz (pl-gpx), mint antioxidáns biomarker meghatározása kompetitív enzimkötéses, immunoszorbens technikával (ELISA) végezhető. Az eljárás igen alacsony koncentráció tartomány mérésére alkalmas, specificitását pedig az alkalmazott szilárd hordozóhoz kötött specifikus, GPX ellenes poliklonális antitestek biztosítják, melyekhez a vizsgálati mintában található plazma- GPX, megfelelően kapcsolódik. Az így megkötött enzim molekulákat újabb, ezúttal alkalikus foszfatázzal (ALP) kapcsolt antitestekkel jelezhetjük, majd egy, az ALP enzimmel reakcióba lépő mesterséges szubsztrát vegyület (p-nitrofenil-foszfát, pnpp) 25

segítségével képzett színes termék, 405 nm-en történő fotometrálásával, meghatározzuk a vizsgálati minta enzimtartalmát. Glutation reduktáz (GR): Az enzimaktivitás meghatározása fotometriás mérésen alapszik. A redukált NADP(H) abszorbancia csökkenését detektáljuk 340 nm-en. Szokás a glutationreduktáz aktivitási koefficiens meghatározása is, mely esetben flavin adenin dinukleotid, mint koenzim hozáadása mellett, illetve hiányában végezzük el az enzimaktivitás mérését, majd e két eredmény hányadosából képezzük a koefficienst. Alacsony GR enzimaktivitási szint esetén nem történik meg a szervezetben az oxidált glutation - mint az egyik legfontosabb antioxidáns- regenerációja funkcióképes redukált formává, vagyis megnő a szervezetben az oxidatív stressz kialakulásának esélye (101). Az enzim az előbbiekben említett glutation-peroxidáz meghatározásával együtt jelzőértékű lehet a cardiovasculáris megbetegedések kialakulási esélyének megítélésében. Már a hatvanas évek vége óta ismert, hogy a glutation-reduktáz aktivitási szintje összefügg a táplálkozás során bevitelre kerülő riboflavin vitamin mennyiségével (13) Gyermekpopulációban végzett enzimvizsgálatok eredményei alapján, a gyermekek 11 %-nál megállapítható volt a riboflavin hiány (119). Glutation (GSH) : A citoplazmában termelődő glutamil-ciszteinil-glicin tripeptid szabadgyökscavenger szerepét a glutation-peroxidáz enzim működésén keresztül fejti ki. Glutathion a legtöbb emlőssejt citoplasmájában termelődik, de kutatási eredmémyek igazolják a glutathion fogyasztásnak a plazma glutathion-szintjére kifejtett hatását (61). A legnagyobb arányban a vörösvértestek tartalmazzák. Legfontosabb funkciója a redoxfolyamatok egyensúlyának biztosításában az aszkorbinsav oxidált formájának (dehidroaszkorbinsav) visszaalakítása újra funkcióképes formává. Az aminosav transzportban koenzim funkciót lát el, xenobiotikumok, karcinogén vegyületek eliminálásában vesz részt. Szöveti koncentrációjának csökkenése számos betegségben, gyulladásos folyamatok esetén detektálható, jelzi az antioxidáns kapacitás kimerülését, a krónikus oxidatív stressz állapot meglétét például a humán colon gyulladásos 26

megbetegedéseiben (185), tumoros folyamatok kialakulásának esetében (194), valamint a májszövet diffúz károsodása esetén (152, 172) Redukált/Oxidált glutation arány meghatározása (GSH/GSSG): A glutation (GSH) a sejtekben millimoláris, a plazmában mikromoláris nagyságrendű koncentrációban található. Oxidációja során diszulfid vegyületté alakul, így e két vegyület arányának meghatározásával módunkban áll a szövetek oxidatív státuszának meghatározása, egyes betegségekben, például májbetegségben, tapasztalatok születtek rövid távú hepaticus hypoxia állapotának megfigyelése során, a fenti paraméter meghatározásának alkalmazásával (47). A vizsgálati eredmények révén lehetővé válik továbbá, daganatos elváltozások során a szöveti károsodás mértékének megítélése. Az analitikai eljárás sarkalatos kérdése a vizsgálati mintában a glutation további oxidációjának blokkolása, mely problémát a metodikák általában az N- etilmaleimid vegyület felhasználásával tudják kiküszöbölni (6). Az alábbiakban a szervezet általános redox-státuszát jellemző, monitorozásra alkalmas, a laboratóriumi analitikai gyakorlat számára kifejlesztett metodikai lehetőségeket tekintjük át. Össz-antioxidáns kapacitás meghatározás (TAS) A módszer angol neve: Total Antioxidant Status, olyan fotometriás eljárás, mely az össz antioxidáns kapacitás mérésére a 2,2-azino-bis(3-etilbenz-tiazolin-6-szulfonsav) (ABTS) vegyületet használja. Az analitikai eljárás során olyan szabadgyök-reakció zajlik, amelyben az ABTS* gyök kation keletkezik. A gyökképződés mértékét az abszorbancia változás fotometriás detektálásával határozhatjuk meg. A kémiai reakcióelegy myoglobint és H 2 O 2 tartalmaz, melyek az oxidatív folyamatot beindítják. A vizsgálati mintában meglevő antioxidáns vegyületek a mérés folyamán a reakcióelegyben gátolják e kation képződését, ezzel magát, az abszorbancia változás alapját adó színreakciót. Ebből a gátlásból eredő abszorbancia csökkenés mértéke egyenesen arányos a vizsgálati minta antioxidatív kapacitásával, melyet a mérés során mmol/l koncentrációegységben fejeznek ki. A mérés standardizálására E-vitamin vagy aszkorbinsav antioxidánsok használatosak. Vizsgálati mintaként szérum és plazma egyaránt használható. A módszert klinikai automatákra is kifejlesztették. 27