FIZIOLÓGIAI SAJÁTSÁGOK VÁLTOZÁSA A KORAI IDEGSEJTKÉPZÉS SORÁN - IN VITRO VIZSGÁLATOK

SEMMELWEIS EGYETEM SZENTÁGOTHAI JÁNOS IDEGTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA FIZIOLÓGIAI SAJÁTSÁGOK VÁLTOZÁSA A KORAI IDEGSEJTKÉPZÉS SORÁN - IN VITRO VIZSGÁLATOK Doktori (Ph.D.) értekezés Jelitai Márta Témavezető: Dr. Madarász Emília MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Idegi Sejt és Fejlődésbiológia Laboratórium Budapest, 2005

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Szentágothai János Idegtudományi Doktori iskola (Multidiszciplináris orvostudományok) 6/1 Neuromorfológiai és sejtbiógiai Doktori Iskola vezetője: Dr. Réthelyi Miklós, az MTA doktora Programvezető: Dr. Palkovits Miklós, az MTA doktora Szigorlati Bizottság: Elnök: Dr. Csillag András, az MTA doktora Tagok: Dr. Szente Magdolna, az MTA doktora Dr. Kálmán Mihály, az MTA doktora Hivatalos Bírálók: Dr. Tretter László, az MTA doktora Egyetemi docens (SOTE, Orvosi Biokémiai Intézet) Dr. Czéh Gábor, az MTA doktora Tudományos tanácsadó (Pécsi Tudományegyetem, Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet) 2

ELŐSZÓ...6 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE...9 IRODALMI ÁTTEKINTÉS...11 AZ IDEGSZÖVET KIALAKULÁSÁNAK KEZDETI LÉPÉSEI...11 Az idegsejtek differenciálódása a fejlődő embrionális neuroepitheliumban...11 Felnőttkori neuronképzés...14 Progenitorsejtek és őssejtek azonosítása...15 BIOELEKTROMOS TULAJDONSÁGOK...16 Sejtek közötti kontakt kapcsolatok...17 A gap junction felépítése...17 Connexinek előfordulása a központi idegrendszerben...18 Hemicsatornák...18 A gap junction funkciói...19 Kálium-és nátriumioncsatornák...20 Kloridionháztartás...21 Kalciumionháztartás...24 GABA ÉS GLUTAMÁT SZEREPE A KORAI IDEGI FEJLŐDÉSBEN...25 A GABA, mint fontos morfogenetikus jelmolekula...25 A GABA metabolizmusa...25 A GABA szignalizációs rendszer megjelenése a neurogenezis során...26 GABA-transzporterek...27 GABA receptorok...27 A GABA fejlődésben játszott szerepe...31 GLUTAMINSAV A KORAI NEURÁLIS FEJLŐDÉSBEN...34 NMDA receptor...34 NMDA receptor alegységek...35 Az NMDA receptor idegi fejlődésben betöltött szerepe...38 Extracelluláris glutamát tartalom...39 Glutamáttranszporterek...40 AZ IDEGI DIFFERENCIÁLÓDÁS IN VITRO VIZSGÁLATA...42 AZ NE-4C SEJTVONAL RÖVID ISMERTETÉSE...43 CÉLKITŰZÉSEK...47 ALKALMAZOTT ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK...48 Az NE-4C sejtvonal fenntartása és az idegsejtképzés indukálása...48 Primer embrionális idegsejt-tenyészetek készítése...48

Tenyészetett sejtek életképességének mérése, illetve sejtszám meghatározás...49 Szemikvantitatív RT-PCR vizsgálatok...49 Immuncitokémiai festések...50 Sejtszám meghatározás immuncitokémiával...51 Antigének mennyiségének meghatározása in situ ELISA módszerrel...52 Fehérjetartalom meghatározás...53 Fehérje minta készítése...53 Western blot analízis...54 Sejten belüli szabad Ca 2+ koncentráció változás mérése fluorimetriás módszerrel..54 Patch-clamp mérések...56 Glutamátfelvétel mérések...58 Extracelluláris glutamátkoncentráció enzimatikus meghatározása...58 GABA tartalom meghatározás HPLC módszerrel...59 EREDMÉNYEK...61 Az NE-4C sejtek fejlődése során azonosított ionáramok bemutatása...61 AZ NE-4C NEUROEKTODERMA EREDETŰ SEJTEK BIOELEKTROMOS FEJLŐDÉSE...66 Az elkötelezetlen NE-4C sejtek bioelektromos tulajdonságai...66 Bioelektromos sajátságok az idegi elköteleződés fázisában...68 Bioelektromos sajátságok a neuronképződés és neuronális érés időszakában...72 Feszültségfüggő kalciumcsatornák az NE-4C sejtek differenciálódása során...78 Az NE-4C sejtek bioelektromos változásainak összefoglalása...79 A GABA ÉS GLUTAMÁT SZEREPE AZ IDEGI FEJLŐDÉS KORAI SZAKASZÁBAN...82 Szinaptikus proteinek megjelenése...82 GABA a korai neurális fejlődésben...83 Az NE-4C sejtek differenciálódásának minden stádiumában kimutatható GABA...84 Az NE-4C, neuroektoderma eredetű sejtek GABA-t termelnek...86 GABA által indukált ionáramok...88 GABA indukált [Ca 2+ ] IC növekedés a neuronális differenciálódás stádiumában...91 GABA elősegíti a posztmitotikus neuronális előalakok érését...92 Összefoglalás:...93 Glutaminsav szignálrendszer jelenléte az in vitro indukált neurogenezis során...93 Az extracelluláris glutamát tartalom az NE-4C sejtek neurogenezise során...93 A glutamátfelvétel mértékének változásai...96 NMDA receptorok az NE-4C sejtvonal idegi fejlődése során...98 4

NMDA receptor alegységek mrns-e az indukálatlan NE-4C sejtekben...98 Az NMDAR alegység fehérjék jelenléte...101 Működő NMDA csatornák a neuronképződés időszakában...105 Összefoglalás:...106 MEGVITATÁS...110 NE-4C sejtvonal in vitro differenciálódásának rövid összefoglalása...110 Az NE-4C őssejtek és progenitorsejtek fiziológiai jellemzői...112 A passzív konduktancia...113 Gap junction és a passzív konduktancia...113 A passzív konduktancia ionos háttere...115 Az NE-4C őssejtek és progenitorsejtek GABA tartalmának eredete...116 A GABA progenitorsejtekre gyakorolt fiziológiai hatása...117 A passzív konduktanciájú sejtek GABA áramai...118 Bicuculline által kiváltott inward ionáramok...119 Az elköteleződő progenitorsejtek és a passzív decaying ionáram...121 Feszültségfüggő K + és Na + áramok alakulása a neuronális fejlődés során...121 GABA szerepe a posztmitotikus idegsejtek fejlődésében...125 GABA által kiváltott [Ca 2+ ] IC növekedés...126 GABA serkenti az idegsejt-előalak ok differenciálódását...126 NMDA receptor aktivitás...126 Az NMDA receptor működés késve alakul ki az alegységek expressziójához képest...127 NMDA receptor aktivitás megjelenése a szinaptogenezis kezdetétől...128 Glutamát és GABA-transzporterműködés szerepe az idegi fejlődésben...129 KÖVETKEZTETÉSEK...131 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS...134 IRODALOMI HIVATKOZÁSOK...135 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE...158 5

Éppen az benne a nagy, hogy nem látszik alkalmazhatónak (Csuang-Ce bölcsessége) ELŐSZÓ A központi idegrendszer működésének tanulmányozásához elengedhetetlen felépítésének ismerete. A szerkezet megértéséhez viszont létrejöttének ismerete szükséges. Térben és időben gondosan szabályozott folyamatok sokasága hozza létre azt a funkcionálisan szervezett egységet, melyben nem található két teljesen egyforma idegsejt. Ahhoz, hogy valóban megértsük az idegrendszert létrehozó és fenntartó folyamatok lényegét, nem elég a kiindulási állapotoknak és az azt következő stádiumoknak a jellemzése, de szükséges hozzá az az ismeret, hogy miért éppen az adott formáció alakult ki az adott időben és adott helyen. Mi volt az az ok, ami kiváltotta egy folyamat létrejöttét és mi az a mechanizmus, ami lehetővé tette véghezvitelét. Doktori értekezésemben összefoglalom azokat az alapkutatás körébe tartozó vizsgálatokat, amelyeket a korai idegi sejtfejlődés témakörében végeztem. Kísérleteimet egér és patkány elülső agyhólyagjából származó sejtkultúrákon végeztem, in vitro, ezért az irodalmi áttekintésben a rágcsáló-agy és azon belül is elsősorban a nagyagykéreg idegsejtjeinek fejlődéséről nyert ismereteinek összefoglalására koncentrálok. 6

ÖSSZEFOGLALÓ Doktori munkámban a neuronális irányban történő elköteleződés folyamatát és a differenciálódás kezdeti lépéseit tanulmányoztam az NE-4C embrionális neuroektoderma eredetű sejtvonalon. Vizsgáltam: 1) Az elköteleződő őssejtek, differenciálódó progenitorsejtek bioelektromos tulajdonságait és a neuronális differenciálódás során bekövetkező bioelektromos változásokat. Tanulmányoztam, hogy mik azok a fiziológiás sajátságok, amelyek az egyedfejlődés különböző stádiumaiban azonos progenitorsejt sajátságokat eredményeznek. 2) A legfontosabb serkentő és gátló -glutamát és GABAneurotranszmitterek korai idegfejlődésben betöltött szerepét. Vizsgálataim szerint, az őssejtek és progenitorsejtek ionos kapcsoltsága, a magas nyugalmi kálium és feltételezhetően klorid konduktivitás, és a GABA depolarizáló hatását eredményező magas intracelluláris kloridion tartalom együttesen egy olyan dinamikusan változó és mégis állandó alapállapot alakítanak ki, amely fejlődési stádiumtól függetlenül képes megtartani a differenciálatlan állapotot. Ugyanakkor fennáll a lehetőség, hogy minimális hatások elindíthassák a sejtben a differenciálódás folyamatát. A sejt ingerlékenységét, külső stimulusokra adott válaszoló képességét feltételezhetően a passzívan mozgó kálium-és kloridionok eloszlásának finom összjátéka szabályozza. Az idegi fejlődés során a neuronális morfológia kialakulásával párhuzamosan megszűnik a sejtek ionos kapcsoltsága és ezzel egyidőben feszültségfüggő ionáramok mérhetőek. A feszültségfüggő ioncsatornák expressziója és a komplex áramformák kialakulása változó, és fontos meghatározója a neuronális differenciálódás folyamatának. A neurogenezis kezdetén a GABA hangsúlyosabb szerepet játszik, mint a glutamát. A neurális őssejtek és progenitorsejtek jelentős mennyiségű GABA-t tartalmaznak. A kezdetben magas koncentrációban jelen lévő extracelluláris GABA - a korán kifejeződő GABA(A)R-okon keresztül - tonikus módon depolarizálja a fejlődő progenitorsejteket és a prekurzorsejteket. NMDA receptorok csak a fiatal idegsejtekben, de a szinaptogenezist megelőzve kezdenek működni. A receptor korai működésének kialakulásához az NR2B alegység érett formája szükséges. 7

SUMMARY The aim of my thesis work was to get insight into some early steps of neural cell fate determination and neuronal differentiation. I intended to find some physiological stemand progenitor properties, which distinguish these cells from more mature neural tissue cells and enable them to function as stem cells in different phases of ontogenesis. I studied 1) the bioelectric properties of NE-4C neural stem cells and the changes of these characteristics in the course of in vitro induced neuron formation. 2) the presence and role of GABA and glutamate in the early neuronal cell differentiation. The stem / progenitor cell status, while it can be preserved for years, is characterized by high responsiveness to minimum inductive signals, which can evoke irreversible processes of differentiation. The main bioelectric characteristics of stem cells and progenitors are the multiple ionic coupling, the passive potassium and chloride conductance and the high intracellular chloride level. While these features may contribute to the maintenance of the non-committed stem-like phenotype, the passive movement of potassium and chloride ions may sensibly tune the excitability and responsiveness of progenitor cells. Important changes in the intracellular ion-milieu are, however, prevented by the formation of large clusters of ionically coupled cells and the rapid redistribution of ions in the enlarged (cross-coupled) cytoplasmic volume. With the appearance of neuronal morphology, neighboring cells cease gap junction communication and voltage dependent ionic currents become detectable. The expression of voltage dependent ion channels is accompanied with the formation of complex current profiles. These profiles are changing with the advancement of neuronal maturation and characterize the process of neuronal development. In early phases of neuron formation, GABA plays some more important roles than glutamate. Neural stem cells and progenitors contain and release a relatively high amount of GABA. The extracellular GABA can tonically depolarize the developing progenitors and early neural precursors through the early appearing GABA(A) receptors. Functional NMDA receptors, on the other hand, appear only in postmitotic neural precursors, but before the onset of synaptogenesis. Signalization by either GABA or glutamate effects the developing cells by regulating the actual level of [Ca 2+ ] I. 8

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 4-AP 4-aminopyridin CP cortical plate; kérgi lemez DL -AP5 DL-2-amino-5-foszfonovaleriánsav EAAC excitatory amino acid carrier; serkentő aminosav karrier EAAT excitatory amino acid transporter; serkentő aminosav transzporter EGTA ethylene glycol-bis(2-aminoethyl-ether)-n,n,n,n1-tetraacetic acid E Cl GABA GFP GFAP GDH GJ GLAST GLT [Glu] EC HEPES IR kloridion ekvilibrium potenciál (mv) γ-aminobutyric acid; γ-amino vajsav green fluorescens protein glial fibrillary acidic protein; gliális fibrilláris savas fehérje glutamát dehidrogenáz enzim gap juntion; réskapcsolat glutamate-aspartate transporter ; glutamát-aszpartát transzporter glutamáttranszporter extracelluláris glutamát koncentráció (N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N -[2-ethanesulfonic acid]) input resistance; bemenő ellenállás KCC2 kálium-klorid ko-transzporter 2 K A K DR K IR NF tranziens A-típusu káliumáram delayed rectifier káliumáram; késleltetett egyenirányító káliumáram inward recifier káliumáram; befelé egyenirányító káliumáram neurofilament; NFL, NFM- light és medium forma NKCC1 nátrium-kálium-klorid ko-transzporter 1 NMDA N-methyl-D aspartate MK-801 (+)-5-methyl-10,11-dihydro- 5 H-dibenzo (a,d ) cyclohepten-5,10-imine hydrogen PBS phosphate buffer saline; foszfát puffer PDC L-trans-Pyrrolidine-2,4-Dicarboxylic acid TEA tetraethylammonium chloride TTX tetrodotoxin RA all trans retinoic acid; all-transz retinsav RC2 radial glial cell marker 9

SSEA SVZ VDch Vm Vrev VZ 3-Fucosyl-N-acetyllactosamine subventricular zone; szubventrikuláris zóna voltage dependent ionchannel, feszültségfüggő ioncsatorna membránpotenciál érték reversal potenciál, megfordulási potenciál érték ventricular zone; ventrikuláris zóna 10

Irodalmi áttekintés IRODALMI ÁTTEKINTÉS Az idegszövet kialakulásának kezdeti lépései Az idegrendszer fejlődésének első lépése az ektodermától (első csíralemez) elkülönülő neuroektoderma megjelenése. Végeredményben a neuroektoderma kezdeti egy sejtrétegéből alakul ki a teljes gerinces idegrendszer. A velőcső záródása hozza létre az agyhólyagokat és a kamra falát alkotó ventrikuláris zónát (VZ), más néven az elsődleges germinatív zónát. A VZ sejtjeinek folyamatos osztódása révén a neuroepithelium megvastagszik, és többrétegűvé válik. A nagyagykéreg fejlődése során az újonnan született idegsejtekből alakul ki a kezdeti kortikális lemez (CP: cortical plate). A kortikális lemez a későbbi sejtbevándorlások során a kifejlett agykéregre jellemző rétegekre tagolódik (Valverde et al., 1995). Az agykéreg rétegei belülről kifelé, időben egymást követő hullámok során alakulnak ki. Testtájékoktól függetlenül, elsőként a nagy, vetítő neuronok képződnek, majd a kisebb interneuronok genezise következik, és legvégül alakul ki a gliasejtek többsége. Az idegsejtek differenciálódása a fejlődő embrionális neuroepitheliumban A ventrikuláris zóna heterogén felépítésű. Az itt található sejtek funkcionálisan többféle csoportba sorolhatóak. Az egyik legfontosabb működésbeli különbség a sejtek osztódóképessége és fejlődési potenciálja (1. ábra). 1) A neurális őssejt korlátlan osztódásra képes, önmegújító képességgel rendelkező sejt. Aszimmetrikus osztódások révén mind neuron, mind asztroglia és oligodendroglia előalakok létrehozására képes. 2) A progenitorsejt ugyancsak osztódó és önmegújító képességgel rendelkező sejt, fejlődési potenciálja azonban már beszűkült. 3) A neuronális prekurzor sejt osztódásra már nem képes. Olyan, differenciálódási irányát tekintve elkötelezett sejt, amelynek kifejlett alakjához azonban még további fejlődésre van szükség.

Irodalmi áttekintés Radiális neuroepithelium Fejlődő nagyagykéreg MZ CP IZ VZ <E12 E12-14 E14-18 E18< őssejt korlátlanul osztódó progenitorsejt neuronális prekurzor fiatal neuron osztódó nem osztódó nem osztódó 1. ábra Az idegi sejtdifferenciálódás folyamatának stádiumai. A radiális glia 1 a neurális fejlődés során átmenetileg megjelenő sejttípus, amely már a neurogenezis kezdetétől kimutatható. Az utóbbi években az őssejtkutatás fókuszába került, mert kiderült, hogy radiális gliából alakul ki a legtöbb kérgi serkentő neuron (Malatesta et al., 2003; Anthony et al., 2004). Ezen túlmenően, az is bebizonyosodott, hogy a szubventrikuláris zóna 2 (SVZ) progenitorsejtjei is radiális glia eredetűek (Merkle et al., 2004). Így a radiális gliától származtathatóak a kifejlett idegrendszerben képződő neurális sejtek is, mind az asztrogliasejtek, mind a rostrális migrációs ösvényen keresztül a szaglóhagymába vándorló neuronok. Úgy tűnik tehát, hogy a radiális glia kiemelt szerepet tölt be a központi idegrendszer kialakításában, befolyásolva mind a neurális produkciót, mind a kérgi architektúra kialakulását. A posztmitotikus, fiatal idegsejtek létrejöttének magyarázatára az évek során sok különböző hipotézis született, a folyamat mikéntje azonban a mai napig a kutatás tárgyát képezi (Rakic, 2003). Az osztódásra képes sejtek sejtmagjai az osztódási fázis 1 A radiális glia mutatja a korai neuroepithelium sajátságait, ugyanakkor kifejez gliára jellemző markereket is. A korai neuroepithelumra jellemző markerek kifejeződése (nestin, RC1, RC2) megelőzi az asztrogliára jellemző markerek (GFAP (glial fibrillary acidic protein), GLAST (glutamate-aspartate transporter), BLBP (Brain lipid binding protein), Tenascin-C)) expresszióját (Hartfuss et al., 2001). A radiális gliasejtek és a korai neuroepithelium sejtjeinek további közös vonása, hogy mindkét sejttípus kapcsolatot létesít mind a kamra felszínével mind a leendő piális felszínnel, továbbá a szokásostól eltérő 9+0 szerkezetű csillók találhatóak a sejtek kamra felé eső felszínén (Cohen & Meininger, 1987). 2 A szubventrikuláris zóna összetétele napjainkban már jól ismert, A-B és C típusú sejtekre osztható (Doetsch et al., 1997). Az A sejtek a láncmigráló neuroblasztok, a B sejtek lassan osztódó asztrogliasejtek, a C sejtek pedig átmeneti, köztes sokszorozó progenitorsejtek. A gliasejtek szimmetrikus és asszimmetrikus osztódásai révén jönnek létre a C tipusú sejtek, majd további osztódások révén az A sejteknek nevezett migráló neuroblasztok. 12

Irodalmi áttekintés függvényében különböző távolságban találhatóak a kamrafaltól, a sejtmagoknak ezt az oszcilláló mozgását nevezik interkinetikus magvándorlásnak. A ventrikuláris zóna progenitorsejtjeinek osztódása közvetlenül a kamrafal mellett zajlik. A fejlődés során folyamatosan csökken az osztódásra képes sejtek száma. Ezzel együtt jár a multipotenciális differenciálódási potenciállal rendelkező őssejtek, a progenitorsejtek és a fejlődő idegi prekurzorok arányának változása. A kamrafallal való kapcsolatukat megszakító, posztmitotikus sejtek elhagyják a VZ-t, és a neuroektoderma valóban többrétegűvé válik. A kamrát továbbra is határoló sejtrétegből alakul ki az ependyma sejtek rétege. A korai posztmitotikus idegsejtek migrációjához a radiális glia nyújt segítséget, ami átnyúlik a VZ teljes állományán, sőt túlnyúlhat rajta. A neuronális migráció irányát, szekretált faktorok, pl. reelin, extracelluláris mátrix molekulák, növekedési faktorok és sejtfelszíni adhéziós molekulák befolyásolják. A végső helyükre talált fiatal idegsejtek leválnak a radiális gliáról, és a fejlődő idegrendszer adott szintjén differenciálódnak tovább. A radiális gliasejtek nyugalmi membrán potenciálja alacsonyabb, mint a neuronális prekurzor sejteké: -57 és -78-ig mv közé tehető. Bemenő ellenállása nagyarányú kapcsoltságának köszönhetően alacsony (Noctor et al., 2002). Ioncsatornák expresszálódásának tekintetében megoszlanak a vélemények, Noctor és kutatócsoportja szerint nem fejeznek ki feszültségfüggő ioncsatornákat, míg más kutatócsoportok feszültségfüggő kálium-és nátriumáramokat is regisztráltak a sejtekből (Bahrey & Moody, 2003). Kérdéses azonban, hogy az intenzív kapcsoltságban álló sejtek között megvalósuló nagymértékű szabad ionáramlás mennyiben fedi el a feszültségfüggő ioncsatornák működését. Másik vitatott pont, hogy a ventrikuláris zóna sejtjeinek mekkora hányada azonosítható radiális gliasejtként. Ez a fejlődés során folyamatosan változik, nem mindegy tehát, hogy milyen fejlődési időpontban regisztráltak az adott sejtből. A feszültségfüggő ioncsatornák észlelésében fennálló különbségek továbbá adódhatnak abból is, hogy eltérő módszerekkel azonosítanak be egy sejtet, radiális gliaként, neuronális progenitor sejtként vagy akár migráló prekurzorként. 13

Irodalmi áttekintés Felnőttkori neuronképzés Napjainkra már túlhaladott az az elképzelés, mely szerint a kifejlett központi idegrendszer nem képes idegsejt pótlásra (Altman, 1962; Goldman & Nottebohm, 1983). Számos eredmény bizonyítja az idegsejt képzés lehetőségét és multipotenciális progenitorsejtek jelenlétét a kifejlett idegrendszerben (Reynolds & Weiss, 1992). Az agy bizonyos területein (szubventrikuláris zóna és gyrus dentatus) egész életünk során fennmaradnak mind neuron, mind gliasejtek létrehozására képes őssejtek (Kaplan & Bell, 1984; Cameron et al., 1993). A posztnatálisan megszűnő VZ neuronképző funkcióját felnőttkorban a szubventrikuláris zóna (SVZ) veszi át (Garcia-Verdugo et al., 1998). Ekkor azonban már csak interneuronok és gliasejtek képzése mutatható ki (Luskin, 1993; Rietze et al., 2001). Egyre több eredmény igazolja, hogy kifejlett idegrendszerben a SVZ bizonyos asztrogliasejtjei funkcionálnak őssejtként (Doetsch et al., 1999; Laywell et al., 2000). Ezáltal a neuroepitheliális sejt radiális glia asztrogliasejt sor szolgálhat fejlődési útmutatóként a multipotenciális őssejtek származásáról (2. ábra) (Alvarez- Buylla et al., 2001). 2. ábra Neurális őssejtek származási útvonala és a progenitor sejtek eredete. A. Buylla et al.: (2001) A unified hypothesis on the lineage of neural stem cells A radiális gliasejtek és asztrogliasejtek újonnan felfedezett funkciója magával hozta a gliasejt azonosításának problémáját. Korábban általánosan bevett gyakorlat volt, hogy 14

Irodalmi áttekintés egy sejtet GFAP 3 expressziója alapján definiáltak érett asztrogliának. A radiális gliát ugyancsak GFAP expressziója alapján sorolták a gliasejtek közé. Ez azonban nem ilyen egyszerű. Kimutatható ugyanis GFAP tartalom dinamikus, a sejt pillanatnyi funkcióját tükröző változása. Megkérdőjeleződött, hogy a GFAP valóban végdifferenciált sejtekre jellemző marker-e, és kifejeződése feljogosít-e arra, hogy asztrogliasejtként azonosítsuk pl. a radiális glia sejteket (Walz, 2000; Alvarez-Buylla et al., 2001; Barres, 2003). Progenitorsejtek és őssejtek azonosítása Az őssejt kutatás előtérbe kerülésével sürgető kérdés lett az őssejtek azonosítása és egyértelmű elkülönítése a környező szövet sejtjeitől. A mai napig nem ismert igazi őssejt specifikus marker. Több marker együttes expressziója vagy hiánya alapján lehet csak valószínűsíteni, hogy egy sejt őssejtként működik-e vagy sem. Az őssejtek azonosítását tovább nehezíti, hogy kifejezik az adott szövetre jellemző érett szöveti markereket is (Fuchs & Segre, 2000). Ugyancsak a mai napig nem tisztázott, hogy hogyan határozható meg egy sejt fejlődési potenciálja. Kérdéses, hogy a felnőttkori őssejtek fennmaradó embrionális őssejtek, vagy differenciálódási képességüket visszanyerő, újonnan kialakuló sejtek lennének-e (Cai et al., 2004). Az őssejtként működő asztrogliasejtek, az elköteleződő progenitorsejtek és az embrionális őssejtek megkülönböztetése, fejlődési potenciáljuk meghatározása nehezen kivitelezhető. A progenitorsejtek fejlődési potenciáljának beszűkülése elviekben a belső tulajdonságok megváltozásának köszönhető, ami in vitro tenyésztési körülmények között és az in vivo fejlődés során is megmarad (Seaberg & van der Kooy, 2003; Seaberg et al., 2005). Szubventrikuláris zónából izolált sejtek in vitro differenciáltatása során bizonyítható, hogy a progenitor sejtek mellett léteznek multipotens őssejtek is (Alvarez- Buylla et al., 2001). Az in vitro differenciáltatás azonban még nem bizonyítja, hogy a sejtek in vivo, a kifejlett agyi környezetben is ugyanolyan széles fejlődési potenciállal rendelkeznek. Az őssejt definiálásakor in vivo, nem lehet szétválasztani a környezet megszorító hatásait a sejt belsőleg meghatározott fejlődési potenciáljától. Kérdéses, hogy 3 A gliasejtek jellegzetes markere a gliális fibrilláris savas fehérje (GFAP). A GFAP-t eredileg érett asztrogliasejtekben írták le, bár a Schwann sejtekben is megtalálható. Éretlen ependyma sejtekben és tannocitákban szintén megtalálható a GFAP, míg Bergmann gliában és Müller sejtekben csak kifejlett állapotban mutatható ki (Walz, 2000). Oligodendrogliában nem fordul elő. Az egyértelmű, hogy kizárólag asztrogliában vagy az asztrogliával valamilyen módon kapcsolatba hozható sejtekben fordul elő. Reaktív gliózisban termelődése megnő, és közösen expresszálódik az ekkor újra kifejeződő nestin és vimentin fehérjével. Rágcsálókban (ellentétben a humánnal), a neurális fejlődés kezdetén nem termelődik GFAP a radiális glia sejtekben. 15

Irodalmi áttekintés a felnőttkori korlátozott mértékű differenciálódás csak a környezet hatásának köszönhető, vagy valóban szűkebb differenciálódási potenciállal rendelkező sejtekről van szó. A környezet megszorító hatása mellett szól, hogy az őssejteket eredeti környezetükből kiszakítva és új szövettípusba helyezve elérhető, hogy az eredeti szövetkörnyezettől teljesen eltérő sejttípusokká differenciálódjanak. Így idegi őssejtekből akár haematopoetikus sejteket (Bjornson et al., 1999), vagy csontvelő őssejtekből idegsejteket sikerült differenciáltatni (Mezey et al., 2000). Bioelektromos tulajdonságok Az idegsejtek közötti kommunikáció alapeleme az ingerlékeny membrán. Az idegsejtmembrán speciális biofizikai tulajdonságaiért a membrán két oldala között kialakult ioneloszlás, és a membránban elhelyezkedő aktív ionpumpák és ioncsatornák felelősek. Az ioncsatornák nyitódását, illetve csukódását okozhatja a sejtmembrán két oldala között fennálló potenciálkülönbség változása (feszültségfüggő ioncsatornák), specifikus ligandumok kötődése (ligandum vezérelt ioncsatornák), valamint intracelluláris szabályozó molekulák, mechanikus ingerek vagy a környezet kémiai tulajdonságainak megváltozása. A fejlődés során fokozatosan alakul ki az érett idegsejtekre egyedien jellemző ioneloszlás és ioncsatornakészlet. A változás nem írható le egy egyszerű érési folyamattal. Komplex, összetett rendszerek összehangolt változásairól van szó, amely lehetővé teszi, hogy ugyanazokra az ingerekre a különböző stádiumokban lévő sejtek eltérően reagáljanak. Az ioneloszlás minden fejlődési állapotban meghatározója a transzportfolyamatoknak, a sejtmembrán két oldala között fennálló potenciálkülönbségnek és az intracelluláris kalciumion szint ([Ca 2+ ] IC ) változásainak. Ezért az ioncsatornák részletes feltérképezése nélkülözhetetlen az idegi sejtdifferenciálódás aktivitásfüggő folyamatainak megértéséhez. Bioelektromos tulajdonságok alatt az ionok sejten belüli, sejtmembrán-menti eloszlását, ennek az eloszlásnak a változásait, illetve a változás módjának lehetőségeit értem. Ezeknek a tulajdonságoknak a feltérképezése in vivo, a fejlődés korai szakaszaiban nagyon nehezen megvalósítható. Az egysejt rétegű neuroektodermából vagy a ventrikuláris zóna progenitorsejtjeiből az egyetlen sejtből elvezetett patch-clamp 4 mérések nagyon nehezen vagy egyáltalán nem kivitelezhetőek. A sejtidentitás 4 A patch-clamp eljárás során, a sejtmembránon keresztül történő ionmozgást regisztráljuk. Ennek alapja a sejten belüli-és a sejtet körülvevő oldatba merülő elektród között folyó áram mérése. 16

Irodalmi áttekintés meghatározásának kérdésessége még tovább nehezíti a vizsgálatokat. A bioelektromos tulajdonságok vizsgálata új technikák megjelenésével és a felnőttkori őssejtek felfedezésével kapott új lendületet. Az őssejtek és a progenitorsejtek patch-clamp mérése kifejlett agyszövetben könnyebben kivitelezhető. Másrészt az őssejtek előállításával és in vitro tenyésztésével, illetve a neurosphere-ek 5 fenntartásával lehetővé vált a neurális progenitorsejtek fiziológiájának in vitro tanulmányozása. A GFP-s jelölési módok alkalmazása a sejtazonosítást tette könnyedebbé. A különféle indukciós faktorok és az ioncsatorna működés összefüggései azonban még mindig nem ismertek teljesen. Így annak ellenére, hogy az őssejtek és neurális progenitorok fejlődését szabályozó géneknek kifejeződési mintázata egyre jobban ismert, és egyre több fejlődési stádiumot jelző markert sikerült azonosítani, az őssejtek és a progenitorsejtek bioelektromos tulajdonságai és az ioncsatornák expressziós mintázata továbbra is intenzív kutatást igényelnek. A bioelektromos tulajdonságok bemutatásakor - az eligazodást elősegítendő - megtartottam az eredeti szakirodalom széles körben használt angol nevezéktanát. Sejtek közötti kontakt kapcsolatok A sejten belüli ioneloszlást nagymértékben szabályozza a sejtek között kialakuló kontakt kapcsolatrendszer, amelyen keresztül lehetőség nyílik a kapcsolt csoporton belüli, közvetlen információcserére. A kémiai szinapszisok kialakulása előtt, a fejlődés korai szakaszában kiemelt fontosságú a réskapcsolatokon (gap junction, GJ) keresztül történő ionos és kémiai jelátvitel. A gap junction mediált kommunikáció alapvető szerepet játszik a neuroektodermális sejtek korai fejlődésében. Az egyedi idegsejtdifferenciálódással párhuzamosan a sejtek kapcsoltságának mértéke csökken, ezáltal lehetővé téve az egyedi válaszok és egyedi idegsejtkapcsolatok kialakulását (Montoro & Yuste, 2004). Felnőtt idegrendszerben a réskapcsolatok kifejeződése szigorúan meghatározott neuron populációkra korlátozódik. Gliasejteken általánosan expresszálódnak. A gap junction felépítése A connexin molekulák hexamer elrendezésben alakítják ki a sejtmembránban lévő hemicsatornát (connexon). Az érintkező membránokban lévő connexonokból összeálló csatorna, 1 kda-ig közvetlen átjárást biztosít a szomszédos sejtek intracelluláris terei 5 A neurosphere olyan neural stem cell eredetű, egy sejtből származó klonális sejtaggregátum, melyben a sejtek, mind neuronális mind gliális irányba differenciáltathatóak. A differenciálódó neurosphere heterogén; egyaránt tartalmaz őssejteket, gliális és neuronális progenitorsejteket és prekurzorokat. 17

Irodalmi áttekintés között. A csatorna permeabilitása, feszültségfüggése és egyéb paraméterei a felépítő connexin molekulák függvényében változik (Evans & Martin, 2002). Poszttranszlációs módosítások, foszforilációs folyamatok ugyancsak módosítják a csatorna tulajdonságait. Az újonnan felfedezett pannexin molekulák, Px1 és Px2 szintén képesek gap junctionhöz hasonló struktúrát formálni az idegrendszerben (Bruzzone et al., 2003). A pannexin molekulákból felépülő csatornák feszültségfüggése kisebb, konduktanciája viszont nagyobb, mint a kizárólag connexinek által formált csatornáé (Bao et al., 2004). Connexinek előfordulása a központi idegrendszerben A családnak legalább 20 tagját írták le rágcsálókban, amelyek expressziója térben és időben jellemző az adott szövet és sejttípusra (Sohl et al., 2005). Az érett neuronokban a cx36 (cx32, cx26, cx43, cx45, cx57), míg az asztrogliasejtekben elsősorban a cx43, valamint a cx26 és cx30 fordul elő (Sohl et al., 2005). Oligodendroglián a cx29, 32 és 47 expresszálódik, melyek közül a 29 kizárólag az oligodendroglia sejteken található. Fejlődés során a progenitorsejtek elsődlegesen a cx43-at fejezik ki, de leírták a cx26-ot, cx45-öt, cx46-ot és 36-ot is progenitorokon (Hormuzdi et al., 2004). Hemicsatornák Régebbi elképzelések szerint a hemicsatornák nyugalmi állapotban (a szomszédos sejt connexonjához való kapcsolódás hiányában) zártak. Nyitott hemicsatornán keresztül nagymértékű kontrollálatlan áramvezetés és anyagáramlás jöhetne létre (Bennett et al., 2003). Az utóbbi években azonban, egyre több eredmény jelzi, hogy a hemicsatornák önállóan is működhetnek fiziológiás körülmények között (Bennett et al., 2003). Bár a hemicsatornák nyitási valószínűsége kicsi, a funkcionáló hemicsatornák konduktanciája meghaladja a réskapcsolatokon keresztül történő ionáramlás konduktanciáját (Trexler et al., 1996). A működő hemicsatornák felépítésében elsődlegesen a cx43-as connexin molekula veszt részt (Li et al., 1996; Plotkin et al., 2002; Boucher & Bennett, 2003). A hemicsatornák működő jelenlétéről egyelőre kevés adat áll rendelkezésünkre. A radiális gliasejtek spontán kalciumhullámainak generálásában, és ezáltal az osztódás szabályozásában viszont már kimutatták közreműködésüket (Weissman et al., 2004). 18

Irodalmi áttekintés A gap junction funkciói A réskapcsolatok neurális fejlődésben betöltött szerepét két nagy szakaszra oszthatjuk. 1) A fejlődés korai szakaszában a GJ fontos szerepet játszanak a progenitor sajátság fenntartásában és az idegi elköteleződés kialakításában. Az előagyi ventrikuláris zóna osztódó progenitorsejtjei 20-100 sejtes csoportokat alkotnak (Lo Turco & Kriegstein, 1991; Yuste et al., 1992). A kapcsoltság a kéreg fejlődése során fokozatosan csökken, de a felnőtt korban is megmaradó szubventrikuláris zóna osztódó progenitorsejtjei szintén gap junction kapcsolt egységekbe rendeződnek (Menezes et al., 2000). A progenitorsejtek életképességét és osztódási kapacitását a GJ keresztül zajló kommunikáció nagymértékben befolyásolja (Bannerman et al., 2000; Melanson-Drapeau et al., 2003). Az utóbbi évek eredményei alapján úgy tűnik, hogy a réskapcsolatok szerepe nélkülözhetetlen a folyamatos proliferáció fenntartásában (Duval et al., 2002; Cheng et al., 2004). A cx43 expressziója ennek megfelelően az osztódó sejtek általános jellemzőjének mondható, az embrionális progenitorsejteken kívül, jellemző a felnőttkorban is fennmaradó őssejtekre és progenitorsejtekre egyaránt (Cai et al., 2004). A sejtek kapcsoltságának mértéke az osztódási szakasz közeledtével csökken az egyedi sejtciklus során. A hemicsatornák ekkor spontán kinyílnak és az osztódási folyamatokban fontos szerepet játszó kalciumhullámok generálódnak (Weissman et al., 2004). A connexinek nem neuronális differenciálódási folyamatokban való részvétele ugyancsak a proliferációban játszott általános szerepüket igazolja. A drosophila connexin fehérjéinek megfelelő innexin 4 molekula a germatogenezisben, valamint a cx43 a hematopoezisben is szerepet játszik (Montecino-Rodriguez & Dorshkind, 2001; Tazuke et al., 2002). Az asztrogliasejtek által indukált neurogenezisben szintén nélkülözhetetlenek a GJ kapcsolatok. Az asztrogliasejtek (a szekretált faktorok mellett) kontakt kapcsolatokon keresztül fejtik ki neuronális differenciálódást indító hatásukat (Lim & Alvarez-Buylla, 1999). 2) Posztmitotikus fiatal neuronok differenciálódása során, GJ kapcsolatokon keresztül zajló kommunikáció befolyásolja a sejtek migrációját és a neuronális érési folyamatokat is. Mind a radiális gliasejteken, mind a rostrális migrációs ösvényen keresztül történő migrációban kimutatható a réskapcsolatok szerepe (Menezes et al., 2002; Weissman et al., 2004). A fejlődő kéregben réskapcsolatokon keresztül történik az idegsejtek aktivitásának terjedése és szinkronizációja, amit később a szinaptikus hálózatok biztosítanak (Peinado et al., 1993; Froes & Menezes, 2002). 19

Irodalmi áttekintés Kálium-és nátriumioncsatornák A sejtmembrán két oldala közötti gyors káliumion mozgás elsősorban a membránon átívelő feszültségfüggő káliumcsatornákon keresztül valósul meg. A feszültségfüggő ioncsatornák között a káliumcsatornák csoportja a legnagyobb és a legváltozatosabb. A különböző kinetikai és farmakológiai tulajdonságokkal bíró elsődleges alegységek (α subunit) oligomer elrendezésben formálják a csatorna pórust, amelynek jellemzőit tovább módosítják a különféle kiegészítő alegységek (β subunit), illetve a sejt egyéb fehérjéivel kialakított interakciók (Coetzee et al., 1999). Egy-egy csatorna kinetikai és farmakológiai tulajdonságai nagymértékben különbözhetnek a fejlődés során eltérő alegység kompozícióból felépülő csatornákban és a különböző sejt típusokban. Az ioncsatornák alegységeinek összetételében történő változások a neurális fejlődés folyamán még nem teljesen ismertek. A káliumra áteresztő ioncsatornák alapvetően három nagy csoportba sorolhatóak (Coetzee et al., 1999). 1) Az első, a legnagyobb csoport. Ide sorolják a hat transzmembrán doménnel rendelkező α alegységekből felépülő csatornákat. Ide tartoznak a feszültség által aktivált káliumcsatornák (Kv, Eag, Elk, Erg, KQT) és a kalcium által aktivált káliumcsatornák. A csoport egysége kérdéses, attól függően, hogy milyen arányú szekvencia homológia alapján fogadunk el két alegységet egy csoportba tartozónak. 2) A két transzmembrán doménnel rendelkező alegységek inward rectifier hiperpolarizációra aktiválódó befelé egyenirányító káliumcsatornákat formálnak (Kir). 3) A leak káliumcsatornák pedig négy transzmembrán doménnel rendelkező alegységekből (TWIK, TREK, TASK, TRAAK, TRESK) állnak. Az alegységek ismertetésére nem térek ki, hiszen a doktori munka keretében történő vizsgálataim csak a teljes sejtben mérhető áram megjelenésére szorítkoztak, és nem tettem különbséget az áramok között a várható alegység-kombináció függvényében. A káliumcsatornák egy csoportja negatív membránpotenciál értékeken folyamatosan nyitott. Ezáltal küszöbalatti potenciál értékeken a káliumcsatornák határozzák meg a neuronok ingerelhetőségét. Részt vesznek a nyugalmi membránpotenciál kialakításában, szabályozzák az akciós potenciál küszöbértékét, és befolyásolják a szinaptikus bemeneteket. A káliumáramok a neurogenezis során végig fontos szerepet játszanak, befolyásolják már a kezdeti proliferáció és a migráció folyamatát is. 20

Irodalmi áttekintés Feszültség által aktivált káliumcsatornák működése befolyásolja az osztódásra képes sejtek sejtciklusának váltakozását (DeCoursey et al., 1984; Nilius & Wohlrab, 1992). Az outward káliumáram blokkolása a cdk2 aktivitásának gátlásán keresztül akadályozza a sejtciklust (Ghiani et al., 1999). A sejtek proliferációjára gyakorolt hatás azonban alegységtől függően ellentétes is lehet, ahogyan azt kimutatták az oligodendroglia progenitorsejtek esetén is (Vautier et al., 2004). A nátriumcsatorna elsődleges α alegysége 4 doménből épül fel, amelyek egyenként hat transzmembrán szegmenst tartalmaznak. Az α alegység magába foglalja a pórust és a feszültségszenzort, és meghatározza a csatorna főbb farmakológiai tulajdonságait. Az alegységnek több változata ismert (~20), amely fajonként és sejt típusonként különböző (Czéh & Puskár, 2001). A nátriumcsatornákat elsődlegesen szelektív antagonistájuk a tetrodotoxin (TTX) 6 hatása alapján azonosítják. Az áram korán megjelenik, ventrikuláris zóna progenitorsejtjeiben már az embrionális kor 12. napjától (E12) kimutatható (Mienville et al., 1994). A Cajal-Retzius 7 sejtek többségében kimutatható a nátriumcsatorna mrns-e, míg a reelin negatív sejtek (nem Cajal-Retzius sejtek) csak 27%-a fejezi ki a nátriumcsatornát (Albrieux et al., 2004). A SVZ sejtjeinek 60%-án mérhető nátriumáram, de akciós potenciál még nem regisztrálható ezeknél a sejteknél (Wang et al., 2003). Kloridionháztartás A fiatal neuronális progenitorsejtek és az érett neuronok intracelluláris kloridkoncentrációja lényeges különbséget mutat. Az érett neuronok kloridionszintje viszonylag alacsony, kérgi neuronban (P16) 12 mm. Kortikális plate (E16) fejlődő neuronjaiban 29 mm és a ventrikuláris zónában már 37 mm (Owens et al., 1996). A magas kloridkoncentráció fontos szerepet játszik a korai fejlődési folyamatokban, pl. meghatározó a GABA korai depolarizáló hatásában (lsd. később). Az érett neuronok 6 Szenzoros neuronokban létezik TTX inszenzitív nátriumáram is pl. DRG (dorsal root ganglion) neuronokban (Caffrey et al., 1992), azonban ezen nátriumáramok időbeli lefutása akár tízszer lassabb is lehet, mint a TTX szenzitív áramé. Fejlődő és érett gliában szintén előfordul TTX rezisztens nátriumáram (Sontheimer & Waxman, 1992) 7 A Cajal-Retzius sejtek átmeneti sejtpopulációt alkotnak, a kortikális plate kialakulását megelőző preplate területén is kimutathatóak. Az embrionális fejlődés folyamán jelentős számban képviseltetik magukat, majd a posztnatális fejlődés kezdetén számuk egyre csökken, míg végül eltűnnek a kéregből (Marin-Padilla, 1998). A Cajal-Retzius sejtek fontos szerepet töltenek be a radiális glia kialakításában és fenntartásában, illetve hozzájuk köthető a kéreg rétegzett felépítésének kialakításában kulcsszerepet játszó reelin fehérje termelése (D'Arcangelo et al., 1995; Ogawa et al., 1995; Frotscher, 1998). 21

Irodalmi áttekintés alacsony kloridszintjének beállításához számos fejlődésbeni váltás szükséges az ionszintet meghatározó csatorna és transzporterrendszerekben. Doktori munkámban nem végeztem közvetlen vizsgálatokat a kloridioncsatornák és transzporterrendszerek működésének kimutatására. A kloridionszintet befolyásoló lehetséges hatások áttekintését mégis fontosnak tartom a korai progenitorsejtek működésbeli sajátságainak megértése céljából. Az intracelluláris kloridkoncentráció kialakításában részt vesznek a feszültségfüggő kloridcsatornák (ClC 1-7), anion cserélők és kation-klorid transzporterek (Nilius & Droogmans, 2003). Ez utóbbiakat ionszelektivitásuk alapján nátrium-klorid kotranszporterekre (NCC1, NKCC1, NKCC2) és K-Cl ko-transzporterekre (KCC1, KCC2, KCC3 és KCC4) csoportosítják (Jentsch, 1996; Clayton et al., 1998a). Kation-klorid ko-transzporterek A nátriumfüggő kation ko-transzporterek segítségével a kloridion befelé mozog a sejtbe. A fejlődő idegsejtek kloridion akkumulációjáért elsősorban az NKCC1 felel 8 (két kloridion bejövetelét egy kálium-és egy nátriumion kíséri). Fejlődő neuroepitheliumban (E12.5) alacsony szinten, de detektálható az NKCC1 mrns-e (Hubner et al., 2001). A ko-transzporter fejlődésbeni eloszlásának leírása nem egységes, Smith és munkacsoportja szerint (1998) a ventrikuláris zóna és szubventrikuláris zóna sejtjeiben nem fordul elő csak a CP fejlődő neuronjaiban. Míg Rivera (2002) eredményeinek megfelelően bőséges a radiális gliában és proliferatív zónákban, majd az embrionális fejlődés 17. napja után (E17) a IIIβ tubulin 9 pozitív neuronokban mutatható ki (Clayton et al., 1998a;; Li et al., 2002). Megjegyzendő azonban, hogy Smith laboratóriumában patkányon dolgoztak, míg Li eredményei egéren születtek. A ko-transzporter expressziós csúcsát a posztnatális fejlődés harmadik hetében éri el, és stabilizálódik a felnőttkorban is jellemző szinten (Plotkin et al., 1997). Kifejlett állatban az NKCC1 érett neuronokban és asztrogliasejtekben egyaránt expresszálódik (Kanaka et al., 2001; Yan et al., 2001). A kloridionok káliumfüggő ko-transportereken (KCC) keresztül történő mozgása a sejten belüli kloridion koncentrációt csökkenti. A KCC2 számottevő mértékben a posztnatális fejlődés első hetében jelenik meg a központi idegrendszerben. A KCC2 8 Az NCC-1 és NKCC2 csak vesében fordul elő. 9 A IIIβ tubulin neuronokra jellemző filamentum. A fejlődés során az egyik legkorábban megjelenő neuronális markernek tekintik. 22

Irodalmi áttekintés működés által csökkenő [Cl - ] IC meghatározó lesz a GABA által kiváltott hiperpolarizáció kialakulásában (Rivera et al., 1999) 10. Kloridioncsatornák Napjainkban az alábbi kilenc feszültségfüggő kloridcsatornát különböztetik meg emlősökben: ClC1-7, ClCKa és ClCKb. Ezek közül a ClC-2,3,4,5,6,7 fordul elő az agyban (Jentsch, 1996; Chen, 2005). Az idegi fejlődés során elsősorban a sejt plazmamembránjában kifejeződő ClC-2 működése jelentős 11. KCC2 ClC-2 AE Cl - Cl - Cl - K+ HCO - 3 Cl --otmozgató molekulák Cl - AE HCO - Na + /K + 3 2Cl - NKCC1 3. ábra Intracelluláris kloridionszintet beállító transzporterek és ioncsatornák a fejlődő idegsejtekben. A ClC-2 az embrionális fejlődés 15. napján jelenik meg, bár szintje ekkor is meglehetősen alacsony. A neurális érés során mennyisége fokozatosan növekszik, a CP (E18) neuronjaiban expresszálódik, a SVZ-ban azonban nem (Clayton et al., 1998b). Újszülött állat hippocampusában nem működőképes truncated forma expresszálódik, ami hozzájárul a GABA és glicin fejlődés során tapasztalható depolarizáló hatásához (Mladinic et al., 1999). Kifejlett idegrendszerben elsősorban a nagy vetítő neuronokban expresszálódik, az interneuronokra kevésbé jellemző (Smith et al., 1995). A ClC-2 hiperpolarizációra aktiválódik és a kloridkoncentráció alacsony szinten való tartásáért felel (Nilius & Droogmans, 2003). 10 A KCC1 embrionális és kifejlett idegrendszerben egyaránt előfordul. Kifejeződik nem neurális szövetekben is (Kanaka et al., 2001). KCC3 majdnem mindenhol megtalálható az agyban, de elsődlegesen a gerincvelőre jellemző (Kanaka et al., 2001). A KCC4 bőségesen expresszálódik a ventrikuláris zónában majd mrns szintje a születés után lecsökken (Li et al., 2002). 11 A ClC-4,5,6,7 intracelluláris organellumokhoz kötött (Nilius & Droogmans, 2003). A nem a sejt plazmamembránjában elhelyezkedő csatornák működése és funkcionális tulajdonságai még nagyon kevéssé ismertek, de a feltárt működő ioncsatornák egyedülállóak kettős ionpórusukkal és az ebből adódó különböző vezetési tulajdonságaikkal (Chen, 2005). A ClC-3 előfordul a sejtmembránban is, de elsősorban szinaptikus vezikulákon jellemző. 23

Irodalmi áttekintés Anion cserélők A sejten belüli kloridszintet befolyásoló anion cserélőket, nátriumfüggő (NDAE) és nátriumfüggetlen (AE) csoportokba osztják. Az AE 12 (anion exchange) család tagjain keresztül klorid-és bikarbonát (HCO 3 -) ionok cserélődnek (Kopito, 1990). Működésük során növekszik a sejten belüli klorid-, és egyben szabályozódik a HCO - 3 koncentráció. Érett idegsejtekben a család AE3 tagjának működése mutatható ki (Raley-Susman et al., 1993). A nátriumfüggő klorid-bikarbonát cserélő (NCBE: Na + driven Cl - - /HCO 3 exchanger) a sejten belüli kloridkoncentrációt csökkenti. Megjelenése (E12) megelőzi a KCC2 kifejeződését a fejlődő kéregben (Hubner et al., 2004). Klorid- ATPáz A klorid-atpáz működése során a kloridionok a sejtből kifelé mozognak. A szállításához szükséges energiát a pumpa közvetlenül az ATP hasításából nyeri. Az embrionális fejlődés 18. napjától kimutatható, és működése fokozódik a korai posztnatális fejlődés során (Zeng et al., 2001). Kalciumionháztartás A kétértékű kalciumion másodlagos hírvivő molekulaként fontos szerepet játszik szinte minden, sejtben zajló folyamatban (Barish, 1998). Részt vesz a sejtek migrációjában, a neuronok túlélésében, a neuritok növekedésében, a szinapszisok formálódásban, a transzmitterek ürülésében, az idegi fenotípus kialakításában (Ghosh et al., 1994; Gu & Spitzer, 1997). Mint másodlagos hírvivő molekula része a szignalizációs útvonalaknak és közrejátszik számos gén átíródásában. Az [Ca 2+ ] IC kezdetben spontán oszcillációk révén (Moody, 1998), később a feszültségés ligandumfüggő (pl. NMDA ioncsatorna) sejtfelszíni ioncsatornák szabályozott és összehangolt működése révén, illetve ko-transzporterek által vezérelt módon változik. Intracelluláris kalciumszint változás kialakulhat az extracelluláris tér felől történő ionbeáramlással, valamint az inositol 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) és ryanodine (RyR) receptorok által mediált ionmozgással az intracelluláris raktárakból (Berridge, 1998). Az embrionális fejlődés során mindkét receptor működőképes már a neurogenezis kezdetétől (E12), kifejeződnek az osztódóképes proliferatív sejtekben is (Faure et al., 2001). 12 Az AE1 erythrocyta-ban és vesében fordul elő, míg az AE2 számos epithel és nem epithel szövetben megtalálható. 24

Irodalmi áttekintés A kalciumcsatornák között elektrofiziológiai és farmakológiai kritériumok alapján az L, N, T, P, Q és R csatornákat különböztetik meg neuronokban (Czéh & Puskár, 2001). A csatornákat α és β alegységek építik fel, melyből az α alegységek formálják a csatorna pórust, a β alegységek a farmakológiai és elektrofiziológiai tulajdonságokat módosítják. A neuronális differenciáció során a csatornák expressziós mintázata lényeges változásokat mutat, a csatornák eltérő szerepét sugallva a fejlődésben. Az L-típusú kalciumcsatorna a kétéltű fejlődés már blastula és gastrula állapotában kifejeződik és a kalcium szignál neuronális indukciós faktorok szabályozásán keresztül, beleszól már az idegrendszer fejlődésének iniciálásába is (Leclerc et al., 1999). A későbbiekben a Q, N és L-típusú kalciumcsatornák, illetve a belső kalcium raktárakból ürülő kalciumionok által generált spontán citoplazmatikus kalcium oszcillációk számos fejlődésbeni folyamatot irányítanak (Spitzer et al., 2002). GABA és glutamát szerepe a korai idegi fejlődésben A fejlődő és kifejlett idegrendszer sejtjeinek ioneloszlásában jelentős szerepet játszanak a ligandum vezérelt ioncsatornák. Ezek között is kiemelten fontos szerepet játszik a GABA és a glutaminsav, hiszen a kifejlett központi idegrendszer serkentő és gátló kémiai szinapszisainak többségében a jelátvitel glutamát és GABA közvetítésével történik. Idegi jelátvivő szerepük mellett, ezek a kismolekulájú neurotranszmitterek fontos morfogenetikus jelmolekulaként működnek a fejlődés oly korai szakaszaiban, amikor a szinapszisok még nem alakultak ki (Lauder et al., 1986; Lipton & Kater, 1989). E két neurotranszmitter idegi fejlődésben játszott szerepét ezért külön fejezetben foglalom össze. A GABA, mint fontos morfogenetikus jelmolekula A GABA metabolizmusa A GABA szintézisét két enzim katalizálja, a 65 és 67 kda-os glutaminsav-dekarboxiláz (GAD). A GAD67 túlnyomórészt a citoplazmában található, és feltételezhetően a nem szinaptikus GABA képzésben van szerepe, míg a GAD65 elsősorban a sejtmembrán mentén lokalizálódik, és a szinaptikus jelátviteli folyamatok számára termel GABA-t (Erlander et al., 1991; Soghomonian & Martin, 1998; Kanaani et al., 1999; Hsu et al., 25

Irodalmi áttekintés 2000). Különböző ingerek hatására eltérően szabályozódik a citoplazmatikus (metabolikus) és vezikuláris raktárakból való GABA ürülés (Waagepetersen et al., 2001). Az embrionális fejlődés során a GAD67 génről alternatív hasítással keletkezik egy 25 és egy 44kD-os forma, melyből a 25kD-os enzimatikusan nem aktív. A GAD44-es fehérje E11-től egészen P21-ig kimutatható, felnőtt korban azonban már nem jellemző (Behar et al., 1994a; Szabo et al., 1994; Katarova et al., 2000). A GABA lebontása szorosan kapcsolódik a citrát-körhöz. Az úgynevezett GABAshunt alternatív útvonal révén kimaradnak bizonyos lépések a citrát-körből. A citrát-kör általános aktivitásának 17%-át is kiteheti ez az útvonal, amely során a GABA köztes anyagcsere termék marad (Hassel et al., 1998; Waagepetersen et al., 1999a). A sejtek GABA tartalma tehát nem választható el a sejtek általános anyagcsere állapotától (Waagepetersen et al., 1999b). A GABA szignalizációs rendszer megjelenése a neurogenezis során A GABA szignalizációs rendszer minden résztvevője korán megjelenik a nagyagykéreg fejlődése során. A GABA nagymértékű, a kifejlett állapothoz képest sokszoros mennyiségű expressziója a differenciálódó agyterületeken alátámasztja a GABA morfogenetikus szerepét. A leendő kéreg és striátum területén már az embrionális fejlődés 13. napjától előfordulnak GABA tartalmú sejtek (Fiszman et al., 1993). A ventrikuláris és szubventrikuláris zóna osztódó progenitorsejtein kimutatható a GABA(A) receptor és GABA által kiváltott ionáram regisztrálható (Ma et al., 1998). A fejlődés korai időszakaszaiban a GABA és a GABA(A) receptorok elsősorban a külső plexiform rétegben és a CP alatt elhelyezkedő subplate-ben találhatóak (Cobas et al., 1991). A GABA tartalmú idegsejtek számának drasztikus növekedése egybevág a GAD67-es forma expressziójával (Lauder et al., 1986; Behar et al., 1993). A GABA receptorok expressziós mintázata nem fed át a GABA tartalmú sejtek régiójával (Cobas et al., 1991; Ma & Barker, 1998). A fejlődő kéreg (E17) szinte teljes területén kimutatható mind a GAD enzim, mind GABA tartalmú sejtek, kivéve a VZ-t, ahol csak a GABA(A) receptor alegységek expresszálódnak (Cobas et al., 1991; Ma & Barker, 1998; Maric et al., 2001). Születés körül (E18-20) már a ventrikuláris zóna területén is megjelennek GABA tartalmú sejtek (Cobas et al., 1991; Ma & Barker, 1998). 26