ZÁRÓJELENTÉS TUDOMÁNYOS HÁTTÉR:

Hasonló dokumentumok
A plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz 4b izoforma szerkezetbeli eltérései polarizált és nem-polarizált sejtekben

A plazmamembrán kalcium ATPáz (PMCA) 2 és 4 izoformák lokalizációjának szabályozása. Doktori értekezés tézisei

A plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata

Jelutak. Apoptózis. Apoptózis Bevezetés 2. Külső jelút 3. Belső jelút. apoptózis autofágia nekrózis. Sejtmag. Kondenzálódó sejtmag

Apoptózis. 1. Bevezetés 2. Külső jelút 3. Belső jelút


A T sejt receptor (TCR) heterodimer

(1) A T sejtek aktiválása (2) Az ön reaktív T sejtek toleranciája. α lánc. β lánc. V α. V β. C β. C α.

A plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPáz intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata

Ca 2+ Transients in Astrocyte Fine Processes Occur Via Ca 2+ Influx in the Adult Mouse Hippocampus

A herpes simplex vírus és a rubeolavírus autofágiára gyakorolt in vitro hatásának vizsgálata

Szignalizáció - jelátvitel

A tumorsejtek által kiválasztott galektin-1 T-sejtekre kifejtett apoptotikus hatásának mechanizmusa

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Receptorok és szignalizációs mechanizmusok

A plazmamembrán kalcium ATPáz (PMCA) 2 és 4 izoformák lokalizációjának szabályozása. Doktori értekezés. Antalffy Géza

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

Preeclampsia-asszociált extracelluláris vezikulák

OTKA ZÁRÓJELENTÉS

A plazma membrán mikrodomének szabályzó szerepe a sejtek növekedési és stressz érzékelési folyamataiban. Csoboz Bálint

Válasz Dr. Szőllősi János opponensi véleményére

A KAR-2, egy antimitotikus ágens egyedi farmakológiájának atomi és molekuláris alapjai

A TATA-kötő fehérje asszociált faktor 3 (TAF3) p53-mal való kölcsönhatásának funkcionális vizsgálata

Az idegsejtek kommunikációja. a. Szinaptikus jelátvitel b. Receptorok c. Szignál transzdukció neuronokban d. Neuromoduláció

Biológiai módszerek alkalmazása környezeti hatások okozta terhelések kimutatására

Kutatási beszámoló A p50gap intracelluláris eloszlásának és sejtélettani szerepének vizsgálata

Transzporterek vizsgálata lipidmembránokban Sarkadi Balázs MTA-SE Molekuláris Biofizikai Kutatócsoport, MTA-TTK Budapest

Biofizika I

MULTICELLULÁRIS SZERVEZŐDÉS: SEJT-SEJT (SEJT-MÁTRIX) KÖLCSÖNHATÁSOK 1. Bevezetés (2.)Extracelluláris mátrix (ECM) (Kollagén, hialuron sav,

Doktori értekezés tézisei

Az ABCG2 multidrog transzporter fehérje szerkezetének és működésének vizsgálata

Egy idegsejt működése. a. Nyugalmi potenciál b. Transzport proteinek c. Akciós potenciál

Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet

a. Nyugalmi potenciál b. Transzport proteinek c. Akciós potenciál. Nyugalmi potenciál. 3 tényező határozza meg:

Két kevéssé ismert humán ABCG fehérje expressziója és funkcionális vizsgálata: ABCG1 és ABCG4 jellemzése

a. Szinaptikus jelátvitel b. Receptorok c. Szignál transzdukció neuronokban d. Neuromoduláció. Szinaptikus jelátvitel.

Új, sejthalált befolyásoló tumor-asszociált fehérjék azonosítása. Dr. Szigeti András. PhD tézis. Programvezető: Dr. Balázs Sümegi, egyetemi tanár

2. A jelutak komponensei. 1. Egy tipikus jelösvény sémája 2. Ligandok 3. Receptorok 4. Intracelluláris jelfehérjék

Receptorok, szignáltranszdukció jelátviteli mechanizmusok

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

A doktori értekezés tézisei. A növényi NRP fehérjék lehetséges szerepe a hiszton defoszforiláció szabályozásában, és a hőstressz válaszban.

A Caskin1 állványfehérje vizsgálata

Az elvégzett munka ismertetése és az elért eredmények összefoglalása:

Intracelluláris ion homeosztázis I.-II. Február 15, 2011

A citoszkeletális rendszer

NÖVÉNYGENETIKA. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

KÉSZÍTETTE: BALOGH VERONIKA ELTE IDEGTUDOMÁNY ÉS HUMÁNBIOLÓGIA SZAKIRÁNY MSC 2015/16 II. FÉLÉV

Az elmúlt években végzett kísérleteink eredményei arra utaltak, hogy az extracelluláris ph megváltoztatása jelentősen befolyásolja az ATP és a cink

Jelutak. 2. A jelutak komponensei Egy tipikus jelösvény sémája. 2. Ligandok 3. Receptorok 4. Intracelluláris jelfehérjék

1. Előadás Membránok felépítése, mebrán raftok

Lymphoma sejtvonalak és gyerekkori leukémia (ALL) sejtek mikro RNS (mir) profiljának vizsgálata

A MASP-1 dózis-függő módon vazorelaxációt. okoz egér aortában

Kutatási beszámoló ( )

Az ioncsatorna fehérjék szerkezete, működése és szabályozása. A patch-clamp technika

A Kv1.3 ioncsatorna szerepe a T sejt aktivációban

Genetikai panel kialakítása a hazai tejhasznú szarvasmarha állományok hasznos élettartamának növelésére

Fehérje expressziós rendszerek. Gyógyszerészi Biotechnológia

Gyógyszerrezisztenciát okozó fehérjék vizsgálata

Biológiai membránok és membrántranszport

SZAGLÁS 2

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen

ZÁRÓJELENTÉS T ( )

A fehérje-fehérje kölcsönhatás szerkezeti alapjai és biológiai szerepük: multidiszciplináris megközelítés (zárójelentés)

Dr. Várnai Péter: MOLEKULÁRIS KÖLCSÖNHATÁSOK SZEREPE EMLŐS SEJTEK JELÁTVITELI OLYAMATAIBAN c. MTA doktori értekezésének bírálata

ZÁRÓBESZÁMOLÓ. A pályázat címe: A WFIKKN fehérjék és a miosztatin, GDF11 közötti kölcsönhatás jellemzése. OTKA nyilvántartási száma: 72125

-Két fő korlát: - asztrogliák rendkívüli morfológiája -Ca szignálok értelmezési nehézségei

NÖVÉNYÉLETTAN. Az Agrármérnöki MSc szak tananyagfejlesztése TÁMOP /1/A

Az Oxidatív stressz hatása a PIBF receptor alegységek összeszerelődésére.

Diabéteszes redox változások hatása a stresszfehérjékre

Immunológiai módszerek a klinikai kutatásban

A Drosophila melanogaster poszt-meiotikus spermatogenezisében szerepet játszó gének vizsgálata. Ph.D. értekezés tézisei.

Membrántranszport. Gyógyszerész előadás Dr. Barkó Szilvia

Egyetemi doktori (Ph.D.) értekezés tézisei

Záróbeszámoló. A pályázat címe: Wnt fehérjék és Wnt receptorok. OTKA azonosító: A kutatási téma ismertetése: előzmények és a kutatás célja

KIS G-FEHÉRJE AKTIVÁLÓDÁS VIZSGÁLATA ANGITENZIN HATÁSMECHANIZMUSÁBAN

Immunológia alapjai előadás. A humorális immunválasz formái és lefolyása: extrafollikuláris reakció és

Az AT 1A -angiotenzinreceptor G-fehérjétől független jelátvitelének vizsgálata C9 sejtekben. Doktori tézisek. Dr. Szidonya László

Részletes szakmai beszámoló Az erbb proteinek asszociációjának kvantitatív jellemzése című OTKA pályázatról (F049025)

Immunológia alapjai előadás MHC. szerkezete és genetikája, és az immunológiai felismerésben játszott szerepe. Antigén bemutatás.

ÖSSZ-TARTALOM. 1. Az alapok - 1. előadás 2. A jelutak komponensei 1. előadás 3. Főbb jelutak 2. előadás 4. Idegi kommunikáció 3.

Ragyogó molekulák: dióhéjban a fluoreszcenciáról és biológiai alkalmazásairól

CELLULÁRIS SZÍV- ELEKTROFIZIOLÓGIAI MÉRÉSI TECHNIKÁK. Dr. Virág László

ZÁRÓJELENTÉS OTKA T037956

Intelligens molekulákkal a rák ellen

Elválasztástechnikai és bioinformatikai kutatások. Dr. Harangi János DE, TTK, Biokémiai Tanszék

Sejtmozgás és adhézió Molekuláris biológia kurzus 8. hét. Kun Lídia Genetikai, Sejt és Immunbiológiai Intézet

ÖSSZ-TARTALOM 1. Az alapok - 1. előadás 2. A jelutak komponensei 1. előadás 3. Főbb jelutak 2. előadás

Jelutak ÖSSZ TARTALOM. Jelutak. 1. a sejtkommunikáció alapjai

Opponensi vélemény. dr. Várnai Péter: MOLEKULÁRIS KÖLCSÖNHATÁSOK SZEREPE EMLİS SEJTEK JELÁTVITELI OLYAMATAIBAN címő MTA Doktori Értekezésérıl

Programozott sejthalál formák és kulcsfehérjéinek kapcsolata - fókuszban a ferroptózis és az autofágia. V. MedInProt Konferencia November 19.

Szívbetegségek hátterében álló folyamatok megismerése a ciklusosan változó szívélettani paraméterek elemzésén keresztül

Egy idegsejt működése

A humán tripszinogén 4 expressziója és eloszlási mintázata az emberi agyban

Immunológia alapjai. Az immunválasz szupressziója Előadás. A szupresszióban részt vevő sejtes és molekuláris elemek

A citoszol szolubilis fehérjéi. A citoplazma matrix (citoszol) Caspase /Kaszpáz/ 1. Enzimek. - Organellumok nélküli citoplazma

Immunológia alapjai. 10. előadás. Komplement rendszer

Az anti-apoptózis mechanizmus vizsgálata agyi ischaemia/hypoxia modellekben

A prion fehérjecsalád citoprotektív és toxikus funkciói

Immunológia alapjai. 16. előadás. Komplement rendszer

térrészek elválasztása transzport jelátvitel Milyen a membrán szerkezete? Milyen a membrán szerkezete? lipid kettısréteg, hidrofil/hidrofób részek

Átírás:

ZÁRÓJELENTÉS A plazmamembrán Ca 2+ ATPáz 4b izoforma apoptotikus fragmentjét reprezentáló mutáns sejten belüli lokalizációja, stabilitása, hatásai a sejtek Ca 2+ háztartására és szerepe az apoptózis folyamatában TUDOMÁNYOS HÁTTÉR: A plazmamembrán típusú Ca 2+ ATPázok (PMCA) a sejtek Ca 2+ homeosztázisában játszanak kitüntetett szerepet. A PMCA fehérjék az ATP kémiai energiáját felhasználva képesek a Ca 2+ citoszólból extracelluláris térbe történő eltávolítására, így biztosítják a sejtek számára létfontosságú alacsony intracelluláris Ca 2+ szintet. A PMCA egyetlen polipeptidláncból felépülő, 10 transzmembrán hélixszel rendelkező, kb.130 kda molekulatömegű integráns membránfehérje. A fehérje lényeges funkcionális egysége a citoszólban elhelyezkedő C-terminális szabályozó régió, mely beépített autoinhibítorként működik: gátolja a katalitikus domének mozgását, és ezáltal az enzim aktivitását. A PMCA fő aktivátora a Ca 2+ -kalmodulin komplex, amely a C- terminális régióban található kalmodulin-kötő szekvenciához kötődik, melynek hatására a fehérje felszabadul a belső gátlás alól. Ezenkívül a C-terminális régió egyes szakaszain keresztül a PMCA olyan multiproteinkomplexekhez kapcsolódhat, melyek speciális szignalizációs membrándoménekbe irányítják a fehérjét [1-4]. A PMCA fehérjéket 4 gén kódolja, melyekről alternatív splicing révén több mint 20 különféle izoforma keletkezhet. A PMCA izoformák C-terminális regulátor régiója nagy mértékben különbözik egymástól, ami lehetővé teszi a variánsok működésének eltérő szabályozását [5]. A PMCA fehérjék közül a PMCA4b izoforma mindenféle sejttípusban megtalálható. A PMCA4b C-terminálisán található PDZ-kötő motívumán keresztül különböző PDZ-domént tartalmazó, un. állványfehérjékhez képes kapcsolódni. Ilyenek a membrán-asszociált-guanilát-kináz (MAGUK) család tagjai, amelyek fontos szerepet játszanak sejt-sejt kapcsolatok illetve multiprotein-komplexek kialakításában; pl. epitél sejtekben az adherens junction, idegsejtben a posztszinaptikus denzitás fehérjeösszetételét a MAGUK család - SAP97, PSD-95, stb - tagjai befolyásolják. Ezek a PDZ fehérjék többféle fehérje-fehérje interakciós domént tartalmaznak (PDZ,SH3,SH2). Tagjai közül többek között a PSD-95, PSD-93, SAP102 esetében igazolták, hogy kölcsönhatnak a PMCA4b fehérjével [6, 7]. KUTATÁSI ELŐZMÉNYEK: Elsőként munkacsoportunk mutatta be, hogy a PMCA4b izoformát az apoptózis folyamata során a kaszpáz-3 proteáz hasítja úgy, hogy a fehérje elveszíti teljes C-terminális regulátor régióját [8], minek következtében egy 120 kda molekulatömegű fragment képződik. A jelen kutatási program keretein belül vizsgáltuk e szerkezeti

változás következményeit a fehérje működésére és megoszlására a sejten belül. A PMCA C-terminális PDZ-kötő régiójának elvesztése multiprotein-komplexek széteséséhez vezethet, ezért tanulmányoztuk, hogy egyes állványfehérjék milyen hatással vannak a PMCA4b megoszlására a plazmamembránban. KUTATÁSI EREDMÉNYEK: 1. Vadtípusú PMCA4b-t és a PMCA4b apoptotikus fragmentjének megfelelő csonkolt mutánst expresszáló sejtvonalak előállítása. Az apoptotikus fragment tulajdonságainak vizsgálatára olyan PMCA4b csonkolt mutáns konstrukciót készítettünk, melynek C-terminálisáról 125 aminosav hiányzik (PMCA4b-ct125), így az ebből átíródó mutáns fehérje a PMCA4b 120 kda molekulatömegű apoptotikus fragmentjének felel meg. A vadtípusú illetve mutáns konstrukciót tartalmazó DNS fragmentet SPsLdS retrovirális vektorba helyeztük, mellyel Phoenix-Ampho pakolósejteket transzfektáltunk. A pakolósejtek révén előállított vírusfelülúszóval MDCK (Madin-Darby Canine kidney) sejteket fertőztünk. A transzdukciót követően a sejteket Geneticinnel szelektáltuk, majd a PMCA4b variánsokat stabilan expresszáló sejtvonalakat hoztunk létre. Western blot technikával kimutattuk, hogy a PMCA4b és a PMCA4b-ct125 fehérjék expressziós szintje a szelekciót megelőző kezdeti érték 5-10-szeresére nőtt [9]. 2. A vadtípusú PMCA4b és mutáns PMCA4b-ct125 fehérjék jellemzése. A fehérjék aktivitását a megfelelő konstrukciót stabilan expresszáló MDCK sejtvonalakból készült membránvezikulák aktív Ca 2+ felvételével határoztuk meg. Megállapítottuk, hogy a PMCA4b és a PMCA4b-ct125 fehérjék aktivitása az expressziós szintnek megfelelő mértékű. Kimutattuk továbbá, hogy míg a vadtípusú fehérje aktivitása kalmodulinnal jelentősen fokozható, a mutáns fehérje kalmodulin nélkül is magas aktivitással rendelkezik, aktivitása kalmodulinnal nem szabályozható. Mivel a PMCA fehérjék fiziológiás működésének alapfeltételét képezik a megfelelő targeting folyamatok, ezért konfokális lézerpásztázó mikroszkóp segítségével vizsgáltuk a fehérjék sejten belüli lokalizációját. Bizonyítottuk, hogy a PMCA4b-ct125 mutáns a vadtípusú fehérjéhez hasonlóan az MDCK sejtek bazolaterális membránjában helyezkedik el. Összefoglalva, eredményeink azt bizonyítják, hogy a PMCA4b apoptotikus fragmentje konstitutíven aktív továbbiakban szuper aktív, valamint hogy a C- terminális régió eltávolítása nem befolyásolja alapvetően a fehérje lokalizációját polarizált MDCK sejtekben [9]. 3. A PMCA4b fehérje eltérő módon viselkedik az apoptózis illetve az oxidatív stressz folyamataiban. Az apoptózist kiváltó különböző kezelések hatására (staurosporin, anti-fas antitest, TNFα, anoikis) a PMCA fehérjét a kaszpáz-3 hasítja, és a kiváltó októl függetlenül - mitokondriális út vagy halálreceptoron keresztül - a jellegzetes 120 kda-os fragment képződik. Megállapítottuk, hogy a PMCA4b apoptotikus fragmentje megtartja 2

eredeti plazmamembrán lokalizációját, ezáltal feltételezhetően aktívan vesz részt a sejtek Ca 2+ szintjének szabályozásában az apoptózis folyamata során [10]. Ezzel szemben arzenit (As 2 O 3 ) kezeléssel kiváltott oxidatív stressz hatására a fehérje nem fragmentálódik, viszont a kezelést követő 5-6 órán belül jelentős mértékű internalizáció figyelhető meg (közlésre előkészítve). Ezzel összhangban hippokampális neuronokban citotoxikus mennyiségű glutamát kezelés szintén a PMCA4b fehérje internalizációját okozta. Kimutattuk, hogy a glutamát kezelés hatására megnövekedett Ca 2+ eltávolítása a sejtekből - feltehetően a PMCA internalizáció következtében - időben elnyújtott folyamat. Az internalizáció miatt hosszabb ideig fenntartott magas Ca 2+ szint a sejtek nekrotikus pusztulásához vezethet, amely számos neurodegeneratív betegség alapját képezi [11]. 4. Az intracelluláris Ca 2+ koncentráció szabályozása az apoptózis során. A továbbiakban azt vizsgáltuk, hogy az apoptotikus sejtek mennyire képesek a citoszólikus Ca 2+ koncentráció szabályozására. Kísérleteinkben EGFP-vel jelölt PMCA4b és PMCA4b-ct125 plazmiddal tranziensen transzfektált HeLa sejteket használtunk. Az apoptózis indukciót követő különböző időpontokban a sejteket X-Rhod-1 (Abs/Em = 580/602 nm) Ca 2+ indikátorral töltöttük majd a sejtekhez ionomicint adtunk. Kísérleteink azt mutatták, hogy az anti-fas antitest által kiváltott apoptózist követően a sejtek nagy százalékában az ionomicinnel kiváltott Ca 2+ sokk után a nyugvó Ca 2+ szint helyreáll. Nagy problémát jelentett azonban, hogy az anti-fas antitesttel kezelt morfológiailag lekerekedett és a tenyésztő edény aljáról levált apoptotikus sejtek nagy része a töltés és mosogatások során jelentősen sérült és elveszett. Ezért fordult érdeklődésünk a genetikailag kódolt Ca 2+ szenzorok felé. A genetikusan kódolt rendszerek esetében ugyanis nincs szükség a kísérletek előtt a sejtek festékkel történő feltöltésére, és segítségükkel valamennyi hosszabbtávú celluláris hatás folyamatosan követhető. Az általunk kiválasztott konstrukciót (GCaMP2) kutatási célra már megkaptuk Junichi Nakai (RIKEN Brain Science Institute, Saitama, JAPAN) csoportjától [12], majd tranziensen több sejtvonalban is expresszáltuk. Mind az irodalmi adatok [13], mind saját előkísérleteink alapján a rendszer magas fluoreszcencia intenzitással, nagy stabilitással, kitűnő jel/zaj aránnyal, másodperces feloldással működve képes a citoplazmikus kalcium szint monitorozására, mind receptor-függő, mind apoptotikus változások követésére. Ezekben a kísérletekben a PMCA molekulát mcherry fluoreszcens fehérjével (Abs/Em = 587/610) jelöltük. Ily módon a GFP alapú Ca 2+ szenzor mellett az mcherry-pmca jel sejten belüli megoszlása konfokális mikroszkóp segítségével egyidőben követhető. Az 1.A. ábrán látható, hogy 6 órás anti-fas antitesttel történő kezelés hatására a sejtek lekerekednek és jellegzetes apoptotikus hólyagok jelennek meg. A B/C panelek az ionomicinnel kiváltott átmeneti Ca 2+ jelet mutatják a GCaMP2 és mcherry-pmca4b fehérjéket együtt kifejező sejtekben. Kísérleteink azt bizonyítják, hogy a sejtek az apoptózis indukciót követően több órán keresztül képesek a citoszólikus Ca 2+ szint szabályozására, amelyben a PMCA feltehetően fontos szerepet játszik (Pászty et al. közlésre előkészítve). 3

A B F/F o C 0 sec 55 sec 60 sec 70 sec 200 sec 5 4 3 2 1 0 0 50 100 150 200 sec 1. ábra: Az apoptotikus sejtek hosszú ideig képesek a citoszólikus Ca 2+ szint szabályozásásra. HeLa sejteket GCaMP2, valamint mcherry- PMCA4b konstrukciókkal transzfektáltuk, majd 1 µg/ml anti- FAS ellenanyaggal (+1µg/ml ActinomycinD) apoptózist indukáltunk. A 6 órás kezelést követően 500 nm ionomycinnel váltottunk ki a sejtekben Ca 2+ szignált. A, GCaMP2 (kék) és mcherry-pmca4b (piros) koexpressziója. B, Ca 2+ szignál apoptotikus sejtekben. A felvételek az egyes ábrákon feltüntetett időpontokban készültek. Az ionomycin hozzáadása a mérés kezdete után 50 másodperccel történt. C, Az A panelen fehér nyíllal jelzett sejtekben lezajló Ca 2+ szignálok görbéi. A fekete nyíl az ionomycin hozzáadását jelöli. 5. A szuper aktív PMCA hatása a sejtek Ca 2+ anyagcseréjére. Tanulmányoztuk, hogyan befolyásolja a regulációjától megfosztott szuper aktív mutáns bevitele a sejtek Ca 2+ anyagcseréjét. Az intracelluláris kalcium szint meghatározásához vadtípusú PMCA4b és PMCA4b-ct125 mutáns fehérjéket stabilan expresszáló MDCK sejteket GCaMP2 fehérjét kódoló plazmiddal tranziensen transzfektáltunk. A transzfekciót követő második napon a Ca 2+ jelet purinerg receptorokon keresztül ATP-vel váltottunk ki. 2. ábra: 100 µm ATP-vel kiváltott Ca 2+ szignál MDCK sejtekben. Kontrol, PMCA4b és PMCA4b-ct125 mutánst stabilan kifejező MDCK sejtekben a 100 µm ATP-vel kiváltott Ca 2+ jelet tranziensen expresszált GCaMP2 indikátor segítségével követtük. Az adatok minden esetben 20-30 sejt átlagát mutatják. A színes görbék a mérési pontokat kötik össze (0.4 mp/pont). A modell alapján illesztett görbéket az ábrán fekete vonallal jelöltük. A modellhez felhasznált sebességi állandók megtalálhatóak: [14-16]. 4

A 2. ábra a konfokális mikroszkóppal detektált kalcium jel időbeli lefutását mutatja. Az alacsony endogén PMCA4b-t kifejező kontroll sejtekben stimulus hatására jelentős intracelluláris Ca 2+ koncentrációnövekedést figyeltünk meg, amely időben lassan, elnyújtva tért vissza a nyugvó szintre. A vadtípusú PMCA4b-t nagyobb mennyiségben kifejező (kb. 10-15x) sejtekben a Ca 2+ jel amplitúdója nem változik a kontrollhoz képest, viszont rövidebb idő alatt cseng le. A szuper aktív PMCA4b-ct125 mutánst kifejező sejtekben egy szignifikánsan alacsonyabb amplitúdójú és igen gyorsan lecsengő Ca 2+ jelet figyeltünk meg. A 2. ábra azt is demonstrálja, hogy a kísérleti pontok kiválóan illeszkednek a [17] közleményében leírt modellhez, amely figyelembe veszi a különböző csatornák, valamint a PMCA fehérjék in vitro meghatározott kinetikai paramétereit. Eredményeink azt mutatják, hogy a PMCA fehérjék aktiválódási folyamataiban bekövetkező változások (a C-terminális régió módosulatai alternatív splice révén vagy proteolitikus emésztés hatására) jelentősen módosíthatják Ca 2+ jel dinamikáját (eredmények közlésre előkészítve). 6. Fehérje-fehérje kölcsönhatások szerepe a PMCA4b eloszlására a plazmamembránban. A szuper aktív PMCA4b fehérjéről hiányzó szakasz fontos eleme a fehérje C-terminálisán található PDZ-kötő szekvencia [7, 18, 19]. Ezért a továbbiakban tanulmányoztuk e motívum szerepét a PMCA4b plazmamembrán lokalizációjában. Feltételeztük, hogy a vizsgált sejtek PDZ fehérje készlete nem elegendő, hogy a tranziens transzfekciót követően képződő nagyobb mennyiségű PMCA fehérjéhez kötődve befolyásolja annak viselkedését. Ezért a PDZ-kötő szekvencia szerepét úgy tanulmányoztuk, hogy különféle sejtekben a PMCA4b fehérjével együtt fejeztük ki a MAGUK fehérjecsalád egyik ismert tagját, a három tandem PDZ domént tartalmazó PSD-95 (post-synaptic density-95) állványfehérjét. Bár irodalmi adatok bizonyítják, hogy a PSD-95 kötődik a PMCA4b molekulához annak PDZ-kötő motívumán keresztül, ennek a kölcsönhatásnak a PMCA szubcelluláris lokalizációjára kifejtett hatása még nem ismert. Ezért megvizsgáltuk, hogy az együttes expresszió befolyásolja-e a PMCA4b sejten belüli mozgását illetve lokalizációját. Eredményeink azt mutatták, hogy a PSD-95 állványfehérje 1. elősegíti a PMCA4b megjelenését a plazmamembránban; 2. hatására a PMCA4b molekula szigetszerű csoportokba rendeződik; 3. a PSD-95 részlegesen immobilizálja a PMCA4b molekulákat a sejtfelszínen; és 4. az ép aktin háló jelentős szerepet játszik a PMCA4b szigetszerű elrendeződésének stabilizálásában [20]. Vizsgálataink szerint tehát a PDZ kölcsönhatások nagymértékben befolyásolhatják a PMCA4b speciális membrán kompartmentbe történő szerveződését, és ezáltal feltehetően a PMCA Ca 2+ jelátvitelben betöltött szerepét is. ÖSSZEFOGLALÁS Eredményeink azt bizonyítják, hogy a PMCA4b fehérjét - függetlenül az apoptózist kiváltó októl a kaszpáz-3 proteáz hasítja és egy 120 kda molekulatömegű fragment képződik. A fehérje közben elveszíti C-terminális regulátor régióját, és szuper aktívvá válik. Feltételezhetően a szuper aktív PMCA fragment hatékony 5

védelme alatt, az apoptotikus sejtek hosszú ideig képesek a citoszólikus Ca 2+ szint szabályozására. Oxidatív stresszt kiváltó szerek hatására a PMCA fehérje nem fragmentálódik, viszont ebben az esetben jelentős mértékű internalizáció és a citoszólikus Ca 2+ szint hosszan tartó megemelkedése figyelhető meg. A C-terminális régió meghatározónak bizonyult a PMCA4b plazmamembránban történő eloszlásának szempontjából is. Kimutattuk, hogy a PSD-95 állványfehérje a PMCA C-terminálisán található PDZ-kötő motívumon keresztül elősegíti a PMCA kijutását a plazmamembránba, és itt a képződő fehérje-komplex szigetszerű csoportokba rendeződik. Kísérleteink arra utalnak, hogy különféle PDZ kölcsönhatások nagymértékben befolyásolhatják a PMCA4b speciális membrán kompartmentbe történő szerveződését, ezáltal a PMCA Ca 2+ jelátvitelben betöltött szerepét. További kutatásaink során szeretnénk feltárni, hogy a variábilis C-terminális régió egyes motívumai milyen szerepet játszanak a PMCA fehérjék dinamikus megoszlásában, a lokális és globális Ca 2+ jel szabályozásában, valamint a Ca 2+ koncentrációváltozások által modulált jelátviteli folyamatokban. Vizsgálataink elősegíthetik a Ca 2+ homeosztázis felborulására visszavezethető egyes malignus elváltozások illetve degeneratív betegségek közötti összefüggések jobb megismerését. IRODALOMJEGYZÉK 1. Wang, K.K., A. Villalobo, and B.D. Roufogalis, The plasma membrane calcium pump: a multiregulated transporter. Trends Cell Biol, 1992. 2(2): p. 46-52. 2. Penniston, J.T. and A. Enyedi, Modulation of the plasma membrane Ca2+ pump. J Membr Biol, 1998. 165(2): p. 101-9. 3. Strehler, E.E., et al., Plasma membrane Ca2+ ATPases as dynamic regulators of cellular calcium handling. Ann N Y Acad Sci, 2007. 1099: p. 226-36. 4. Brini, M. and E. Carafoli, Calcium pumps in health and disease. Physiol Rev, 2009. 89(4): p. 1341-78. 5. Strehler, E.E. and D.A. Zacharias, Role of alternative splicing in generating isoform diversity among plasma membrane calcium pumps. Physiol Rev, 2001. 81(1): p. 21-50. 6. Kim, E., et al., Plasma membrane Ca2+ ATPase isoform 4b binds to membrane-associated guanylate kinase (MAGUK) proteins via their PDZ (PSD-95/Dlg/ZO-1) domains. J Biol Chem, 1998. 273(3): p. 1591-5. 7. DeMarco, S.J. and E.E. Strehler, Plasma membrane Ca2+-atpase isoforms 2b and 4b interact promiscuously and selectively with members of the membrane-associated guanylate kinase family of PDZ (PSD95/Dlg/ZO-1) domain-containing proteins. J Biol Chem, 2001. 276(24): p. 21594-600. 8. Paszty, K., et al., Plasma membrane Ca2+ATPase isoform 4b is cleaved and activated by caspase-3 during the early phase of apoptosis. J Biol Chem, 2002. 277(9): p. 6822-9. 9. Paszty, K., et al., The caspase-3 cleavage product of the plasma membrane Ca2+-ATPase 4b is activated and appropriately targeted. Biochem J, 2005. 391(Pt 3): p. 687-92. 10. Paszty, K., et al., Cleavage of the plasma membrane Ca+ATPase during apoptosis. Ann N Y Acad Sci, 2007. 1099: p. 440-50. 11. Pottorf, W.J., 2nd, et al., Glutamate-induced protease-mediated loss of plasma membrane Ca2+ pump activity in rat hippocampal neurons. J Neurochem, 2006. 98(5): p. 1646-56. 12. Mao, T., et al., Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One, 2008. 3(3): p. e1796. 13. Kotlikoff, M.I., Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J Physiol, 2007. 578(Pt 1): p. 55-67. 6

14. Caride, A.J., et al., The plasma membrane calcium pump displays memory of past calcium spikes. Differences between isoforms 2b and 4b. J Biol Chem, 2001. 276(43): p. 39797-804. 15. Dode, L., et al., Dissection of the functional differences between sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+- ATPase (SERCA) 1 and 2 isoforms and characterization of Darier disease (SERCA2) mutants by steadystate and transient kinetic analyses. J Biol Chem, 2003. 278(48): p. 47877-89. 16. Penheiter, A.R., et al., A model for the activation of plasma membrane calcium pump isoform 4b by calmodulin. Biochemistry, 2003. 42(41): p. 12115-24. 17. Caride, A.J., et al., The plasma membrane Ca2+ pump isoform 4a differs from isoform 4b in the mechanism of calmodulin binding and activation kinetics: implications for Ca2+ signaling. J Biol Chem, 2007. 282(35): p. 25640-8. 18. Goellner, G.M., S.J. DeMarco, and E.E. Strehler, Characterization of PISP, a novel single-pdz protein that binds to all plasma membrane Ca2+-ATPase b-splice variants. Ann N Y Acad Sci, 2003. 986: p. 461-71. 19. Kruger, W.A., G.R. Monteith, and P. Poronnik, The plasma membrane Ca(2+)-ATPase: regulation by PSD-95/Dlg/Zo-1 scaffolds. Int J Biochem Cell Biol. 20. Padanyi, R., et al., PSD-95 mediates membrane clustering of the human plasma membrane Ca2+ pump isoform 4b. Biochim Biophys Acta, 2009. 1793(6): p. 1023-32. 7