Sejtciklus átmentek matematikai modellezése élesztő sejtekben

BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI ÉS BIOMÉRNÖKI KAR OLÁH GYÖRGY DOKTORI ISKOLA Sejtciklus átmentek matematikai modellezése élesztő sejtekben Tézisfüzet Szerző: Kapuy Orsolya Témavezető: Dr. Novák Béla Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudományi Tanszék 2009 1

1. Bevezetés, célkitűzés A sejtosztódási ciklust működtető bonyolult enzimfehérjehálózat elemeit és a köztük lévő kapcsolatokat a lehető legpontosabb részletességgel kell megismerni. Ezen szabályozási hálózatok megértéséhez a kísérleti módszerek mellett egyre elfogadottabb a matematikai modellek használata. A matematikai modellek lehetővé teszik, hogy egyenletekkel jellemezzük a regulációs fehérjék közötti kapcsolatokat Ezáltal könnyebben feltárható és megérthető a komplex hálózat viselkedése. A doktoráns éveim során megismerkedtem a biokémiai reakciókinetika alapjaival, és a biológiai ismereteken alapuló matematikai modellek építésével. Novák Béla professzor és munkatársai több modellt is kidolgoztak az elmúlt években. Ezek megfelelően írják le különböző tesztorganizmusokban a molekuláris szabályozó hálózatok dinamikáját. A kidolgozott modellek kielégítően használhatóak a legfontosabb sejtciklus események (úgy, mint DNS replikáció, mitózis) jellemzésére. A modellek azonban egyes sejtciklus folyamatokat nem tárgyalnak, amelyeknek ugyancsak nagy jelentősége lehet a szabályozás során. Doktori munkám során a sejtciklus komplex szabályozási hálózatának megértésére és fejlesztésére helyeztem a hangsúlyt. Külön figyelmet fordítva néhány fontos sejtciklus eseményre, így a sejtciklus átmenetek megfordíthatatlanságának a megértésére, és a fő sejtciklus szabályozó komponens (Cdk) szubsztrátjainak kinetikai analízisére. A matematikai modelleket sarjadzó élesztő tesztorganizmusra alkottam. Elsőként egy olyan modell kidolgozását céloztam meg, amely kísérleti eredményekkel párhuzamosan magyarázza, hogy milyen mechanizmusok szükségesek a mitózisos befejezés irreverzibilissé tételéhez. Emellett számítógépes szimulációkkal próbáltam tesztelni a Cdk szubsztrátokat szabályozó motívumokat, jellemezve azok viselkedését és fontosságát a sejtosztódási ciklus szabályozásában. 2

2. Irodalmi háttér A sejtek meghatározó tulajdonsága, hogy megfelelően alkalmazkodjanak a különböző környezeti feltételekhez, és biztosítsák a robosztusságukat a külső és belső jelek hatására. A sejteknek fenn kell tartaniuk az örökítő anyaguk lemásolásának (DNS replikáció) és a sejtmag kettéosztásának (mitózis) pontos váltakozását generációkon át. Ezen folyamatokhoz a sejtek egy bonyolult fehérjefehérje kölcsönhatásokból álló hálózatot használnak, amely hálózat lehetővé teszi, hogy különböző stimulációkra különböző válaszokat adhassanak. A megfelelő működéshez a szabályozási hálózat pozitív illetve negatív visszacsatolási hurkokat és azok eltérő kombinációit alkalmazza. E hatások eredményeként a dinamikai rendszer alternatív, stabil állandósult állapotokkal rendelkezik illetve oszcillálni is képes [1]. Minden egyes eukarióta sejt szaporodását egy nagyon hasonló szabályozási hálózat irányítja. Éppen ezért az eukarióta sejtek ciklusának vizsgálatát az emberi (humán) sejteknél sokkal egyszerűbb egysejtű, eukarióta sarjadzó élesztő sejtekkel is el lehet végezni. A kapott eredmények jól használhatóak a bonyolultabb szervezetek sejtciklusának a megértéséhez. A sejtosztódási ciklus fő szabályozó molekulája egy speciális protein kináz, amelyet ciklin függő protein kináznak, vagy röviden CDKnak hívnak. Ez a CDK különböző ciklin fehérjékkel alkothat komplexet, így meghatározva, hogy a kináz mely sejtciklus fázisban rendelkezik aktivitással. A kulcs CDK/ciklin komplexnek (Cdk) a mitózisban van nélkülözhetetlen szerepe. Az aktív Cdk koncentrációja jellegzetesen változik a sejtciklus folyamán: a sejt növekedési szakaszában alacsonyabb, sejtmagosztódás során magasabb, majd a mitózist követően magas értékről hirtelen nullára csökken [2]. Ebben a viselkedésben kulcsfontosságú szerepet játszanak a Cdk szabályozási moduljai. Négy ilyen modulról beszélhetünk, amelyekben nemcsak a Cdk aktivitás van szabályozva, de az aktív kináz is visszahat a saját regulátoraira, ezáltal visszacsatolási hurkokat építve a rendszerbe: 1. A mitózisos Cdk szintézise transzkripciós faktor által szabályozott, míg az aktív komplex egy pozitív visszacsatolás keretében aktiválja a saját transzkripciós faktorát. [1] J.J. Tyson, K. Chen, B. Novák (2001) Network dynamics and cell physiology. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2(12): 908916 [2] J. Bloom, F.R. Cross (2007) Multiple levels of cyclin specificity in cellcycle control. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8(2): 149160 3

2. A mitózisos Cdk aktivitás poszttranszlációs módosítással befolyásolható, nevezetesen, az aktív centrumban történő foszforiláció inaktiválja a fehérjét. Az aktív Cdk egy pozitív és egy kettős negatív visszacsatolási hurokkal segíti saját aktiválódását. 3. Egy sztöchiometrikus inhibitor (Sic1 sarjadzó élesztőkben) képes megkötni a mitózisos Cdkt, és azáltal inaktiválni azt. Ugyanakkor a komplex inaktiválja az inhibitorát, így létrehozva egy antagonizmust a két molekula között. 4. A Cdk lebomlása a proteaszómában történik az APC anafázist serkentő komplex és azok aktivátorainak (Cdc20 és Cdh1) segítségével. Míg a mitózisos Cdk aktiválja a Cdc20at (negatív visszacsatolás), addig foszforilezéssel inaktiválja a Cdh1et (kettős negatív visszacsatolás) [2]. Ahhoz, hogy a sejt fenntarthassa a megfelelő működését, különböző ellenőrzési pontokra és szabályozási mechanizmusokra is szüksége van. Az ellenőrzési pontok mindaddig blokkolják a sejtciklus események továbbhaladását, míg a megjelent hibák kijavításra nem kerülnek. Ezen szabályozási útvonalak a fő Cdk/ciklin komplexek irányítása alatt állnak, megteremtvén így a sejtosztódási ciklus összehangolt működését [2]. Nem elegendő azonban, hogy a sejt megáll a ciklusában, ha valamilyen hibát észlel. Egy másik fontos feladata biztosítani a folyamatok adott irányba történő haladását. A sejt semmilyen körülmények között sem fordulhat vissza a sejtosztódási ciklusában. Ez az esemény ugyanis tönkretenné a DNS replikáció és a mitózis pontos váltakozását. Sokáig úgy gondolták, hogy az átmenetekben a kulcsfontosságú fehérjék degradációja okozza az irreverzibilitást. Novák Béla professzor és munkatársai azonban feltételezték, hogy a fehérje degradáció mellett a szabályozó rendszert felépítő visszacsatolási mechanizmusoknak is nélkülözhetetlen szerepe van [3]. Kísérletesen és elméleti úton szerettük volna alátámasztani, hogy a fehérje degradáció ugyan működik a mitózis végén, de a visszacsatolási hurkok nélkül az átmenet megfordíthatóvá tehető és a sejtek visszamennek a mitózisos állapotba. A kérdés, amire a választ kerestük, hogy létrehozhatóe reverzibilis mitózisos befejezés sarjadzó élesztő sejtekben, amely által a korábban megjelent cikkben szereplő állítás igazolást nyerne. A sejtnek a sejtosztódási ciklus különböző fázisaiban különböző fehérjékre van szüksége, hogy azok betölthessék megfelelő szerepüket (pl. DNS replikációt szabályozó enzimek, [3] B. Novák, J.J. Tyson, B. Győrffy, A. CsikászNagy (2007) Irreversible cellcycle transitions are due to systemslevel feedback. Nat. Cell. Biol. 9(7): 724728 4

magosztódás speciális fehérjéi). Észrevehető, hogy az evolúció során speciális kettős szabályozási hálózatok alakultak ki, nevezetesen, ezen fehérjék transzkripciós faktorok által és Cdk által is szabályozottak [4]. A kérdés ekkor az volt, hogy vajon ezen szabályozási modulokban nincsene egy harmadik ág is? Nincse a Cdknak hatása a transzkripciós faktorra, ezáltal létrehozva egy feedfoward hurkot (FFL) a szabályozási modulban [5]? Ha ez igaz, akkor elmondható, hogy a fehérje szabályozása két úton, egy közvetlen és egy közvetett módon is szabályozva van a Cdk/ciklin komplexek által. Lehete ennek a kettős szabályozási hálózatnak valami gyakorlati jelentősége a Cdk szubsztrátokra nézve illetve a sejt robosztusságát tekintve a környezeti hatásokkal szemben? [4] L.J. Jensen, T.S. Jensen, U. de Lichtenberg, S. Brunak, P. Bork (2006) Coevolution of transcriptional and posttranslational cellcycle regulation. Nature 443(711): 594597 [5] U. Alon, S. Mangan (2003) Structure and function of the feedforward loop. PNAS 100(21): 1198011985 5

3. Módszerek A biológiai rendszer szabályozási hálózatának a megértéséhez számítógépes módszereket használtam. Novák Béla professzor és munkatársai olyan matematikai modelleket dolgoztak ki, amelyek a biokémiai reakciókinetika szabályait és törvényszerűségeit alkalmazzák. Az élő sejtben lejátszódó reakciók sebessége és időbeli lefutása felírható kinetikai egyenletekkel. A kölcsönhatások és a paraméterek megadásával minden egyes komponens koncentrációjának időbeli változási sebességére felírhatunk egy közönséges differenciálegyenletet. Az egyenletek összességével egy sokparaméteres, nemlineáris differenciálegyenletrendszert kapunk. Ezt az egyenletrendszert megoldva az eredményeket a kísérletileg tapasztalt viselkedéssel lehet összevetni és bizonyos következtetéseket levonni. Több eset igazolta, hogy a modellek alapján feltételezett összefüggések helytállóak. Mivel a nemlineáris differenciálegyenlet rendszer analitikus megoldása szinte lehetetlen, ezért vagy számítógépes szimulációval, vagy a nemlineáris dinamika kvalitatív módszereit kell alkalmazni. A dolgozat során használt módszerek: 1. A komponensek koncentrációját és annak időbeli változását számítógépes program segítségével határoztam meg, a differenciálegyenletrendszert numerikusan oldottam meg, a koncentrációváltozásokat egy időskálán ábrázoltam. 2. Két kulcsfontosságú differenciálegyenlet vizsgálatára fázissík analízist használtam. Ezen módszer segítségével az egyenletek viselkedése jól vizualizálható, és fontos következtetéseket lehet levonni a rendszer viselkedésére vonatkozóan is. 3. Bifurkációs analízist alkalmaztam, hogy a rendszer dinamikai viselkedésének a tanulmányozása bizonyos meghatározott ún. bifurkációs paramétereknek a hatására lehetővé váljon. 6

4. Eredmények A sejtciklus egyik kulcsfontosságú feladata, hogy biztosítsa a sejtciklus átmenetekben a folyamatok adott irányba történő haladását. Kérdésünk az volt, hogy a sejt milyen módon tudja működtetni ezt az egyirányúságot? Az alapvető fontossággal bíró Cdk aktivitása a mitózis befejezésénél egy kifejezetten magas értékről hirtelen nullára csökken. Ez az aktivitás csökkenés a mitózis során aktiválódó Cdc20nak és Cdh1nek köszönhető. Mivel a fehérjék lebontása termodinamikailag irreverzibilis folyamat, ezért sokáig azt gondolták, hogy ezen fehérjék proteolízise okozza a sejtciklus átmenet egyirányúságát. Egy korábbi munkában megállapításra került, hogy a szabályozási rendszert felépítő visszacsatolási mechanizmusoknak nélkülözhetetlen szerepük van. Az M/G1 átmenetnél ez a Cdk ill. Cdk inhibitor molekulák antagonizmusát foglalja magában. Nevezetesen, a Cdk negatív hatással van az inhibitoraira. A visszacsatolási hurkok szerepének az igazolására az M/G1 átmenetnél, Frank Uhlmann és kutatócsoportja, sarjadzó élesztő sejtekkel végezett kísérleteket. Olyan sejteket készítettek, amelyekbe a natív Cdh1 mellett Cdh1m11 mutáns fehérjét is bevittek. A Cdh1m11 mutáns nem foszforilezhető Cdk által, vagyis a Cdk negatív hatása ilyen módon megszűnik. Kettős negatív visszacsatolás helyett csak a Cdh1m11 tudja gátolni a Cdkt. A mitózis metafázisában, magas Cdk aktivitással szinkronizálták a sejteket. Ahhoz, hogy a fehérje lebomlásáért felelős APCt könnyedén ki illetve bekapcsolhassák, az egyik alegység fehérjéje helyett annak egy hőmérsékletérzékeny mutáns variációját használták. A kísérletek matematikai egyenletekkel történő jellemzéséhez a számítógépes szimulációkon alapuló modellt készítettünk el. Az APC/Cdh1 a Cdk proteaszómában történő lebomlását segíti. A natív Cdh1 és a Cdk között antagonizmus van. A Cdh1m11 ott fejti ki hatását, ahol a natív Cdh1, de a Cdknak nincs rá semmilyen hatása. A Cdk szintézisét transzkripciós faktor szabályozza, amelyet egy pozitív visszacsatolással ő maga aktivál. A Cdk G1fázisú sztöchiometrikus inhibitora képes arra, hogy megkösse, és ezáltal a mitózisos Cdkát inaktív állapotban tartsa. A Cdk pedig foszforilezi a Sic1t, megjelölve őt a proteaszómában történő lebomlásra. A Cdk emellett gátolja a Sic1 transzkripciós faktorát. Tehát a Cdk és Sic1 között is kettős negatív visszacsatolás van. 7

Az előbb bemutatott kísérleti körülményeket használva reverzibilis mitózisos befejezés valósítható meg. A sejtek ugyan kilépnek G1 fázisba, de egy átmeneti periódus után visszamennek a mitózisos állapotba. Ez volt az első alkalom, hogy kísérletesen bizonyították, hogy a fehérje lebomlása ugyan működik, de a sejtek mégis képesek visszatérni a mitózisos állapotukba. a) Cdh1m11 b) Cdh1m11 indukció indukció APC off APC off Clb2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 Clb2 Cdc28 Cdc28 Sic1 Sic1 relatív fehérje aktivitás / szint m11 Cdh1 Cdh1 Cdh1m11 indukció APC off 1.0 1.0 0.5 TF Clb2 Clb2 Cdc28 Sic1 m11 Cdh1 Cdh1 relatív fehérje aktivitás / szint 0.0 0.0 0 50 100 idő (perc) 150 0 50 100 idő (perc) 150 0.5 Clb2 Cdc28 TF Clb2 m11 Cdh1 Cdh1 APC off Sic1 1. ábra: A mitózis befejezésének irreverzibilitása sarjadzó élesztőben. a) reverzibilis mitózisos befejezés, Cdh1m11 indukció történt 30 percig, APC 50 perc után lett kikapcsolva; a kulcsfontosságú fehérjék aktivitás/koncentráció változásának kísérleti eredménye és számítógépes szimulációja; b) irreverzibilis mitózisos befejezés, APC 60 perccel a Cdh1m11 indukció kezdete után lett kikapcsolva, a kulcsfontosságú fehérjék aktivitás/koncentráció változásának kísérleti eredményei és számítógépes szimulációja; szaggatott vonal az APC/Cdh1m11 aktivitást jelöli Olyan kísérletet végeztünk, amelyben a Cdh1m11 indukció 30 percig tartott, majd az 50. percben az APC aktivitást is kikapcsoltuk (1a ábra). Ekkor azt tapasztaltuk, hogy a Cdh1m11 indukciójával párhuzamosan a Cdk aktivitása gyorsan esik. Azonban amint az APC aktivitása 8

közel nullára zuhan, a Cdk újra szintetizálódik, mert meg tudja menteni önmagát a szintézisére gyakorolt pozitív visszacsatolással. A Sic1 ugyan elkezd akkumulálódni, de a magas Cdk szint lenyomja a Sic1 aktivitását, vagyis a sejt egy átmeneti periódus után vissza tud menni mitózisba. Ugyan a Cdh1m11 indukció hatására a Cdk aktivitás proteolízist szenved, de a mitózis befejezése mégis reverzibilis. Abban az esetben figyeltünk meg irreverzibilis mitózisos befejezést, amikor a Cdh1m11 indukciót a 60. percben kapcsoltuk ki (1b ábra). A Cdh1m11nek a Cdkra gyakorolt negatív hatása hiába szűnt meg, a Cdk képtelen volt bekapcsolni a transzkripciós faktorát és képtelen volt rá, hogy lenyomja a Sic1t. A Sic1 szint magas értéken stabilizálódik, és a sejt végleg kilép mitózisból és G1 fázisba kerül. A kísérleteket megismételtük Sic1 hiányos és Sic1 túltermelő mutáns sejtekkel is. Azt tapasztaltuk, hogy Sic1 hiányos sejtekben bármikor kikapcsolhatjuk az APCt, a mitózis befejezése mindig reverzibilis marad, ugyanakkor a Sic1 túltermelő sejteknek jóval rövidebb a reverzibilis tartománya. Más szóval a Sic1Cdk kettős negatív visszacsatolás jelentősen befolyásolja az M/G1 átmenet irreverzibilitását. A Cdk szint csökkentése proteolízissel a mitózis befejezése során szükséges, de nem elégséges feltétel az irreverzibilis M/G1 átmenet biztosításához. A mitózis befejezésének irreverzibilitásához a Cdk szintet ugyanis nem elég lecsökkenteni, hanem tartósan alacsonyan is kell tartani. A mitózisból való kilépés csak akkor válik megfordíthatatlan folyamattá, amennyiben a Cdk aktivitása egy bizonyos küszöb érték alá esik, ekkor ugyanis a növekvő Sic1 aktivitás már képes arra, hogy őt inaktívan tartsa. A sejtciklus átmenetek irreverzibilitását tehát nem a fehérjék degradációja, hanem a szabályozó rendszert felépítő visszacsatolási mechanizmusok okozzák. Eredményeim között egy olyan matematikai analízis is szerepel, amely a szabályozási hálózatban megtalálható kettős negatív visszacsatolást írja le multifoszforiláció segítségével. A legtöbb Cdk szubsztrátnak ugyanis nem egy, hanem több foszforilációs helye van, amelyek a fehérje kinetikai viselkedésében döntő fontosságúak. Az általam épített egyszerű modellek a különböző multifoszforilációs útvonalakat vizsgálják matematikai egyenletekkel, arra a kérdésre keresve a választ, hogy tudunke megfelelő bistabilitást bevinni a rendszerbe. Megállapítottam, hogy különböző disztributív útvonalak közel azonos pontossággal írják le a bistabil viselkedést. Az eredmények gyakorlati jelentősége, hogy biológiailag jóval precízebbek, mint az eddig használt matematikai formulák. 9

Új kísérleti eredmények kimutatták, hogy a fehérjék kettős regulációja mind transzkripciós faktorok (TF), mind Cdk által egy gyakori motívum a sejtciklus szabályozásában. Kísérleti eredmények felhasználásával és bioinformatikai adatbázisban való kutatás során megállapíthatjuk, hogy egy harmadik ág is van a szabályozásban, méghozzá a Cdk és a TF között. Ennek lényege, hogy az adott fehérjére (Pr) a Cdk által egy közvetlen és egy közvetett szabályozási út is hat, létrehozva így egy feedforward loop (FFL) motívumot. A közvetett szabályozás TFon keresztül történik. Nyolc FFL motívumot különböztethetünk meg, a három molekula közötti kölcsönhatások előjelének függvényében. A motívumokat eloszthatjuk két nagy csoportba aszerint, hogy a TF aktiválja vagy inaktiválja a fehérjét (2a és 2b ábra). a) / TF TF / b) Pr Pr Cdk Pr Pr / TF TF / G1 S G2 M G1 S G2 M G1 c) d) / TF TF / Pr Pr Cdk Pr Pr / TF TF / G1 S G2 M G1 S G2 M G1 relatív fehérje aktivitás 1.0 0.5 relatív fehárje aktivitás 1.0 0.5 0.0 0 100 200 300 idő (perc) 0.0 0 100 200 300 idő (perc) 2. ábra: A lehetséges nyolc feedforward hurok (FFL) szabályozási motívum, amelyben a fehérje (Pr) egy közvetlen és egy közvetett útvonalon is szabályozva van Cdk által, és azok számítógépes szimulációja egy egyszerű sarjadzó élesztő modellbe építve; a) a négy lehetséges FFL hálózat, ahol a transzkripciós faktor (TF) pozitívan hat a fehérjére; b) a négy lehetséges FFL hálózat, ahol a TF negatívan hat a fehérjére; c) számítógépes szimulációja a négy lehetséges FFL motívumnak, ahol a TF pozitívan hat a fehérjére; d) számítógépes szimulációja a négy lehetséges FFL motívumnak, ahol a TF negatívan hat a fehérjére; a fekete görbe a Cdk aktivitást, a színes görbék az adott FFL motívumba tartozó fehérjék aktivitását ábrázolják 10

Egyszerű sarjadzó élesztő modellbe építve a FFL motívumokat szimulációkkal teszteltem, hogyan viselkednek a Cdk aktivitásának (2c ábra, fekete görbe) függvényében. Ha a Cdk aktiválja a TFt és a Prt (2c ábra, piros görbe), akkor a fehérje aktiválódása követi a Cdk aktivitását, míg azok a szubsztrátok, amelyeknek a TFát és magát a Prt is gátolja, akkor jelennek meg, ha Cdk aktivitás nincs a sejtben (2c ábra, sárga görbe). Meglepő viselkedést tapasztalunk, ha a Cdknak a két karon ellentétes hatása van a szubsztrátra: amennyiben gátolja a TFt, de közvetlenül serkenti a fehérje szintézisét, a Cdk aktiválódására ugrásszerűen jelenik meg a fehérje (2c ábra, sötétszürke görbe), míg ellentétes esetben (Pr gátolódik, TF aktiválódik) akkor képez csúcsot, ha a Cdk aktivitása hirtelen leesik (2c ábra, zöld görbe). Megfigyeltük, hogyha a TF inaktiválja a fehérjét (2b ábra), akkor az FFL motívumokra az előbb bemutatottakkal egyező viselkedést tapasztalunk (2d ábra). Ennek magyarázata, hogy közvetett ágon a két kölcsönhatás előjelének az összege számít, nem pedig azok sorrendje. A FFL motívumok jelentősége, hogy a sejtnek minden fázisában van egy fehérjecsoportja, amelyik aktiválódni tud, és hogy éppen melyik teszi, az a Cdk függvénye. A kísérleti eredmények ismeretében sikerült minden egyes motívumra példát találni. A mitózis végén aktiválódó FFL motívumra megfelelő példának adódott a hasadó élesztő szeptumképződését iniciáló komplex szignál átvivő hálózat (SIN). Az egyszerűsített modell tartalmazza a hálózat meghatározó tulajdonságát, nevezetesen, a SIN kizárólag a magosztódás után tud aktiválódni. A modell emellett még különböző, szeptum képzésében defektes mutáns sejtek viselkedését is magyarázni tudja. 11

5. Tézisek Dolgozatomban az eukarióta sejtciklus egyes kulcsfontosságú elemének szerepét vizsgáltam, reakciókinetikai modellezés keretében. A sejtciklus átmenet irreverzibilitását meghatározó fehérjefehérje kölcsönhatásokat analizáltam. A sejtciklus hálózatban előforduló kettős negatív visszacsatolás jellemzőit tanulmányoztam, különös tekintettel a multifoszforiláció szerepére a szabályozásban. A periodikus Cdk szubsztrátok viselkedésének vizsgálata a sejtciklus során szintén tárgya a dolgozatomnak. 1. Matematikai modellt építettünk abból a célból, hogy a sejtciklus átmenetek irreverzibilitásáért felelős kölcsönhatásokat felderítsük. Ennek érdekében párhuzamos kísérleti és elméleti munkákat végeztünk. A mitózisból való kilépést tanulmányozva sikerült reverzibilis mitózisos befejezést létrehozni, és ezáltal bebizonyítani, hogy a korábban széles körben elterjedt nézettel ellentétben az átmenetek irreverzibilitásához a visszacsatolási mechanizmusok nélkülözhetetlenek. A fenti munkához a kísérleti körülményekhez igazodó, korábban már alkalmazott, sarjadzó élesztő modellt dolgoztam át [3]. 2. A sejtekben a sejtmag osztódás során működő visszacsatolási mechanizmusokat fázissík analízis alkalmazásával és bifurkációs diagram készítésével teszteltem. Megállapítottam, hogy a Cdk kináz lebomlása szükséges, de nem elégséges feltétele a mitózis irreverzibilissé válásához. Ezen elméleti módszerek alkalmazásával sikerült bizonyítanom, hogy a Cdk aktivitásnak egy küszöbérték alá kell csökkennie, ekkor tudnak aktiválódni a Cdk inhibitorok, és a mitózisból való kilépés megfordíthatatlan folyamattá válik [3]. 3. Matematikai analízist végeztünk abból a célból, hogy a korábban megalkotott modellekben alkalmazott GoldbeterKoshland függvényt egy biológiailag megalapozottabb leírásra cseréljük fel. Kiindulásul azt használtuk fel, hogy a regulációban fontos Cdk szubsztrátok többsége multifoszforileződik. Valamennyi különböző multifoszforilációs lehetőséget áttekintettem, a megfelelő egyenletek megalkotása segítségével. Arra az eredményre jutottam, hogy a disztributív foszforilációs mechanizmus képes arra, hogy a szükséges nemlineáris viselkedést bevigye a rendszerbe [4]. 4. Fázissík analízissel és bifurkációs diagram készítésével vizsgáltam a rendezett, disztributív és a rendezetlen, disztributív multifoszforilációs útvonalakat. Megállapítottam, hogy a 12

kulcsfontosságú paraméterek változtatása közel azonos eredményre vezet a két különböző multifoszforilációs útvonal esetén. Mindkét mechanizmus alkalmas a sejtciklus során előforduló bistabil állapotok leírására [4]. 5. Bioinformatikai adatbázisban történő vizsgálódás segítségével tanulmányoztam a periodikus Cdk szubsztrátokat. Megállapítottam, hogy ezen fehérjék transzkripciós faktorai maguk is Cdk szubsztrátok, ezáltal egy kettős szabályozási motívumot hozva létre (feedforward hurok FFL). A transzkripció és a transzláció okozta időkésés figyelembe vételével differenciálegyenleteket írtam fel a fehérjék és a transzkripciós faktorok koncentráció változásaira. Így lehetővé vált a motívumok kinetikai jellemzése [2]. 6. A különböző FFL motívumokat beépítettem egy olyan matematikai modellbe, amely periodikus Cdkaktiválódásra képes. A motívumokat számítógépes szimulációval teszteltem. Megállapítottam, hogy minden egyes sejtciklus fázisra egy adott FFL motívumjellemző. Minden motívumra találtam a sarjadzó élesztőben előforduló Cdk szubsztrátok között referenciákkal igazolható példát [2]. 7. A hasadó élesztő szeptumképződését aktiváló bonyolult molekuláris hálózatot a megfelelő FFL motívumra sikerült egyszerűsítenem. Így a sejtciklus modellbe építve a motívumot, az adott (vad típusú) fiziológiás állapot leírhatóvá vált. A modell a vad típusú sejtciklus tárgyalásán túlmenően a különböző szeptációs mutánsok viselkedését is magyarázni tudja [1]. 13

6. Alkalmazási lehetőség A molekuláris biológiai kutatásokkal karöltve a matematikai modellek készítésének is fontos szerepe van az eukarióta sejt osztódási ciklusának a megértésében. Az elméleti módszerek lehetővé teszik, hogy a szabályozási hálózatra, mint egész rendszerre nézzünk rá, és ezáltal jóslásokat tegyünk a még hiányzó elemekre és kölcsönhatásokra. A biológiai kísérletek azonban nélkülözhetetlenek az élő sejt megértéséhez, és a modellek tovább fejlesztéséhez. Pl. annak ismerete, hogy a sejtosztódási ciklus szabályozási hálózatában fontos Cdk szubsztrátok multifoszforileződnek, azok után, hogy matematikailag általunk igazoltan magyarázza a bistabil viselkedést, a közeljövőben ez komoly átalakításokat tesz szükségessé a már meglévő sejtosztódási ciklust leíró modelljeinkben. Az eukarióta sejtciklust szabályozó fehérje molekulák és kinetikai viselkedésük megismerése nagy gyakorlati jelentőséggel bír. Nem csupán biológiai, hanem orvosi szempontból is fontos, hogy a sejtciklus és minden egyes részfolyamatának a szabályozását megismerjük, hiszen ez sokat segíthet, hogy a sejt egészének a működését megértjük. Ezáltal lehetővé válhat az emlős sejtek kontrollálatlan szaporodásának, a rákos betegségnek a megértése is. Ezen folyamatok ismerésével képesek lehetünk olyan gyógyszerek kifejlesztésére, amelyek célzottan avatkoznak bele a kórosan indukált sejtszaporodásba, blokkolva azt. 14

7. Közlemények 7.1. A dolgozat alapjául szolgáló közlemények 7.1.1. Publikált folyóiratcikkek 1. A. CsikászNagy, O. Kapuy, B. Győrffy, J.J. Tyson, B. Novák (2007), Modelling the Septation Initiation Network (SIN) in fission yeast, Current Genetics, Vol 51, 245255 IF: 2.507 I: 6(3) 2. A. CsikászNagy, O. Kapuy, A. Tóth, C. Pál, L.J. Jensen, F. Uhlmann, J.J. Tyson, B. Novák (2009), Cell cycle regulation by feedforward loops coupling transcription and phosphorylation, Molecular Systems Biology, 5:236. Epub 2009 Jan 20. IF: 9.954 I: 0 3. S. LopezAviles, O. Kapuy, B. Novák, F. Uhlmann (2009), Irreversibility of mitotic exit is the consequence of systems level feedback, Nature, (megjelenés alatt) IF: 28.751 I: 0 4. O. Kapuy, D. Barik, M.R. Domingo Sananes, J.J. Tyson, B. Novák (2009), Bistability by multiple phosphorylation of regulatory protein, (előkészületben) 7.1.2. Publikált absztraktok 1. O. Kapuy (2004), A mathematical model for the regulation of cell division, Periodica Polytechnica Ser. Chem. Eng., Vol 48, NO 2 2. O. Kapuy, A. CsikászNagy, B. Győrffy, J. J. Tyson B. Novák (2007), The modelling of septation in fission yeast, Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica; Vol 54, Suppl. 1 3. O. Kapuy, S. LopezAviles, F. Uhlmann, B. Novák (2008), A mitózis befejezésének irreverzibilitása, Biokémia, Vol 32, 3 4. O. Kapuy (2009), Mathematical model of molecular regulatory networks, Periodica Polytechnica Ser. Chem. Eng., (megjelenés alatt) 7.2. A dolgozat alapjául szolgáló előadások 7.2.1. Szóbeli előadások 1. O. Kapuy (2005), A sejtosztódás matematikai modellje, Országos Tudományos Diákköri Konferencia, Vegyipari Szekció, Budapest, március 2123. (magyar nyelvű) 2. O. Kapuy (2007), Mathematical models of molecular regulatory networks, BME Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar, 4. Doktoráns Konferencia, Budapest, február 7. (magyar nyelvű) 3. O. Kapuy, A. CsikászNagy, J.J. Tyson, B. Novák (2007), Modelling septation in fission yeast, 15 th International Congress of the Hungarian Society for Microbiology, Budapest, július 1820. (angol nyelvű) 15

4. O. Kapuy, S. LopezAviles, F. Uhlmann, B. Novák (2008), A mitózis befejezésének irreverzibilitása, A Magyar Biokémiai Egyesület 2008. évi Vándorgyűlése, Szeged, augusztus 31 szeptember 3. (magyar nyelvű) 7.2.2. Poszter prezentációk 1. O. Kapuy, B. Győrffy, J.J. Tyson, B. Novák, A. CsikászNagy (2005), Mathematical model for fission yeast septation control, 6 th European Conference on Mathematical and Theoretical Biology, Drezda, Németország, július 1822. 2. O. Kapuy, A. CsikászNagy, B. Novák (2006), A mathematical model of the initiation of DNA replication, European Fission Yeast Meeting, Hinxton, Egyesült Királyság, március 1618. 3. O. Kapuy, A. CsikászNagy, B. Novák (2006), A mathematical model for the DNA replication checkpoint in fission yeast, ISSY25 Systems Biology of Yeasts From Models to Applications, Hanasaari, Finnország, június 1821. 4. O. Kapuy, A. CsikászNagy, B. Novák (2007), Mathematical model for the DNA replication checkpoint, FEBSSysBIO2007: Advanced Lecture Course on Systems Biology From Molecules to Life, Gosau, Ausztria, március 1016. 5. O. Kapuy, B. Novák (2008), Bistability by protein multiphosphorylation, Computational Cell Biology, Hinxton, Egyesült Királyság, március 2629. 6. O. Kapuy, B. Novák (2008), Bistability by protein multiphosphorylation, 2008 Annual Retreat of the Biochemistry Department, Oxford, Egyesült Királyság, április 1516. 7.3. Egyéb közlemények 7.3.1. Publikált folyóiratcikkek 1. F. Bartha, O. Kapuy, C. Kozmutza, C. Van Alsenoy (2003), Analysis of weakly bound structures: hydrogen bond and the electron density in a water dimer, Journal of Molecular Structure (Theochem), Vol 666667, 117122 IF: 1.122 I: 3(2) 7.4. Egyéb előadások 7.4.1. Poszter prezentációk 1. F. Bartha, O. Kapuy, C. Kozmutza (2003), Analysis of weakly bound structures, The role of Chemistry in the Evolution of Molecular Medicine A tribute to Professor Albert SzentGyörgyi, Szeged, Magyarország, június 2729. 2. O. Kapuy (2003), The interaction of CH 2 O: A historical aspect in Hungary, On role of formaldehyde in biological systems Methylation and demethylation process 6 th International Conference, Pécs, Magyarország, október 1216. 16