BIOFIZIKA Egészségügyi Mérnök MSc A tárgy felelős előadója: Dr. Fidy Judit egyetemi tanár judit.fidy@eok.sote.hu SE Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Két aspektus 1. Molekuláris biofizika molekulaszerkezetek és fizikai megközelítések 2. Biológiai anyagtan fizikai módszerek és paraméterek a speciális biológiai rendszerek leírására, jellemzésére
Részletes tematika http://biofiz.sote.hu Előadások szerdánként, Beznák terem, 8.30-10.00 Gyakorlatok szerdánként, Beznák terem és a Biofizikai Int. gyakorló helyiségei I. em. 10.30-12.00 Felelős: Schay Gusztáv tanársegéd schayg@gmail.com 20-663-2111
A molekuláris szerkezetet alakító kölcsönhatások és funkcionális jelentőségük.
A szerkezeti rend kialakulásának szempontjai molekulák makromolekulák komplexek szigorú de nem statikus rendben
Biológiai rendszerek szerkezetét a kötések hierarchiája jellemzi Atomok Molekulák Makromolekulák: pl. fehérjék H O C N S. H-hidak. Van der Waals. kölcsönhatások elsődleges kötések 0.153 nm De: sóhidak S-hidak is
Fehérje másodlagos szerkezeti elemek: alfa helix, béta lemez
DNS kettős hélix szerkezetek van der Waals kölcsönhatások
Kettős lipid-rétegek, biológiai membránok
Számítógépes szimuláció eredményei Lipid-membránok komplexei fehérjékkel
Molekulák közötti kölcsönhatások biológiai rendszerekben Molekulaszerkezetek kovalens kötései kémia? ---------- Elektrosztatikus kölcsönhatások 1. Coulomb kölcsönhatás q 1 és q 2 ponttöltések r távolságban potenciális energia E Cb q1 q2 = ε r (relatív) dielektromos állandó
A relatív dielektromos állandó ε ( dielektrikum : elektromos tér áthatol az anyagon Faraday) Definició: kondenzátor kapacitása alapján U fegyverzetek között vákuum U o C = ε = fegyverzetek között dielektrikum U < U o dielektrikum kivétele U U o (q o =q) q U C C o, = C E E o o = > 1 q U o E = C F q > C o [ Newton N ] = Coulomb C elektromos térerősség A dielektrikum részecskéi polarizálódnak elektromos térben: a fegyverzeten tárolt töltés erőtere csökken
Két fontos közeg víz 80 apoláros hidrokarbonok ~2 ε Jelentősen módosítják az elektrosztatikus kölcsönhatásokat Nagy dipólusmomentumu vízmolekulák E Cb q1 q2 = ε r pl. Na + és Cl - ε =80, r= 0.3 nm E Cb ~5.4 kj/mól ~ 2xRT Gyenge kölcsönhatás! NaCl disszociál vízben töltések eloszlását statisztikus fizikai modellek írják le
A Coulomb-potenciál termodinamikai értelmezése ionos oldatban E Cb az elektrosztatikus tér munkáját adja meg állandó hőmérsékleten és nyomáson miközben a töltések távolsága végtelenről r -re változik E Cb a G Gibbs potenciál-változásnak felel meg ΔG = ΔH ΤΔS miért lehet a Cb-potenciálnak entropikus jellege? Pl. vizes közeg ΔS δ G δ q1 q2 q1 q2 = Δ = ( ) = δε = ΔG 1 δε 2 δt δt ε r ε r δt ε δt vízre: -0.0046/K TΔS (T=300K) = -1.38ΔG a Cb potenciál ellen hat! A Cb potenciál nemcsak a kötési energiát fedezi (ΔH), hanem az ionoknak a vízmolekulákat rendező (S csökken!) hatását is!
A Coulomb-potenciál-ból származtatott hidratációs energia Born-energia ε=80 r q Δq δg = q q q ΔG = q dq = r r 2 ' δ ' 1 ' ' ε ε 2 ε r q o A végzett munka ha egy ε dielektromos állandójú közegbe, egy r-sugarú üregbe q töltést viszünk be pl. hidratációs energia Mekkora a végzett munka, ha egy iont (Na + ) vízből egy makromolekula v. lipid membrán belsejébe akarunk átvinni? ΔG total = ΔG( ε = 80) ΔG( ε = 2) = 355kJ / mól r=0.095 nm, ion-rádiusz Nagy érték! Rashin, A.A., Honig, B. (1985) Reevaluation of the Born model of ion hydration. J.Phys.Chem. 89, 5588
2. Dipól-kölcsönhatások ponttöltés dipól, dipól dipól, statikus dipól, forgó dipól, indukált dipól Egyszerű példa: ponttöltés álló dipólus q' q E el. sztat. ε r ha l << r q' q + ε r = + q m cosθ 2 ε r q r -- r + r -q l θ +q r r m = q' l dipólus-momentum erősebben csökken a távolsággal Trend: minél bonyolultabb töltéseloszlások hatnak kölcsön, annál erősebben csökken az energia a távolsággal E = m Pl. két dipólus 1 MozgóDip Dip 2 6 + orientációs mozgás 3ε r kt m 2 2 2 szabad rotáció csökkenti a kh. erősségét és rövidíti a hatótávolságot Setlow and Pollard: Molecular Biophysics, Chpt.6, Palo Alto, Addison-Wesley, 1962
Egy különleges dipól kölcsönhatás Diszperziós kölcsönhatás van der Waals kölcsönhatás (London-féle erő) Alapjelenség: a töltéseloszlás molekulákon belül az atomok gyors hőmozgása miatt fluktuál tranziens töltésszeparációk egymás közelében levő molekulák tranziens dipólusmomentuma kölcsönhat indukció, taszítás, vonzás a vonzó kölcsönhatás energiája alacsonyabb nagyobb populáció eredőben vonzó kölcsönhatás molekulák polarizálhatósága E diszp 1 α1 α 2 = 6 4 r 3n közeg törésmutatója I I 1 1 I + I 2 2 molekulák ionizációs energiája Eltérés a szabadon mozgó állandó dipólusok kölcsönhatásától távolság függés hasonló, de más paraméterek!
Egy különleges dipól kölcsönhatás Diszperziós kölcsönhatás van der Waals kölcsönhatás (London-féle erő) Megjegyzések: r r -- α molekulák polarizálhatósága : m = α E -- ε helyett ε víz >> n n víz E MozgóDipólok -- formula érvényes, ha r >> l dipólus-momentum << E Diszp elektromos térerősség E diszp 1 α1 α 2 = 6 4 r 3n I I 1 1 I + I 2 2 Ezt a faktort nehéz általában elméletileg meghatározni, empirikus módszerekkel határozzák meg -- speciális eset: hosszúkás alakú II hidrokarbon láncok fehérjék, membránok lipidjei E diszp 1 5 r
Az elektrosztatikus kölcsönhatások potenciális energiájának távolság-függése, és átlagos energiája Kölcsönhatás Energia-függvény Átlagos kölcsönhatási távolság-függése energia (kj/mól) ion-ion 200-300 r ion - álló dipólus 10-20 r 1 2 álló dipólus - álló dipólus dipólus dipólus hőmozgás mellett diszperziós kölcsönhatás 3 r 6 r 6 r 1-2 0.3 2
Hidrogén-hidas szerkezetek Kölcsönhatás összetett: - kovalens AH---B - elektrosztatikus - diszperziós elektronegatív pillératomok: O, N, F d d < van der Waals rádiuszok összege Nagysága széles tartományban fordulhat elő 3-4 kj/mól 80 100 kj/mól alifás szénhidrogének enzimatikus katalízis 12 35 kj/mól biológiai makromolekulák Víz - szerkezetek ΔH (kj/mól) H 2 O.HOH gáz -23 folyadék -14 jég -12-30 Rendkívüli tulajdonságok
Hidrogén-hidas szerkezetek Biológiai makromolekulák térszerkezetének kialakulása speciális szempontok: - kötéserősség függ a környezettől - nem a ΔH hanem a ΔG vezérli? AH.OH 2 + B..HOH AH.B + HOH..OH 2 - amidok és karbonil csoportok erősen polárosak, de H-kötés csökkenti a polaritást H-kötések erősebbek a fehérjék és lipid membránok belsejében - network formációk: H-donor atom töltéseloszlása megváltozik nő az elektronegativitás jobb akceptor lesz víz-klaszterek kialakulása, H-kötések láncolata fehérjékben Weinhold, F. (1997) Nature of H-bonding in clusters, liquids and enzymes. J.Mol.Struct. 398, 181
Hidrofób kölcsönhatás biológiai makromolekulák belső szerkezetében igen jelentős foszfoglicerát kináz enzim víz-dobozban Ioncsatorna-fehérje sejtmembránba ágyazva Az apoláros szénhidrogén-láncok egymás felé fordulva a víz-molekulákkal való kölcsönhatásokat csökkentik - hidrofób effektus
Hidrofób kölcsönhatás termodinamikai értelmezés elv: szénhidrogének és víz kölcsönhatása energia-befektetést igényel víz - víz szénhidrogén - szénhidrogén dipól dipól diszperziós kh. ERŐS Mi hajtja a szegregációt? víz szénhidrogén keveredés: ΔH 0 H H O H H H H O víz H H Jellegzetes hőmérséklet-hatás Magas T diszperziós kh. erősödik víz-orientáció gyengül ΔS szegr ~ ΔS oldott,de ΔH<<0 => ΔG= ΔG szegr -ΔG oldott <0 magas hőmérséklet: H-driven Alacsony T (RT): A víz molekulák rendezett szerkezetet alakítanak ki egymással az apoláros molekula felületénél S csökken, de szegregációnál kevésbé, ΔH ~0 ΔG = ΔH TΔS = ΔG szegr -ΔG oldott < 0 A szegregált és az elkeveredett állapot közötti különbség: szegregált állapotban a rendezésből eredő entrópia-változás kisebb alacsony hőmérséklet: S-driven Dill, K.A. (1990) Dominant forces in protein folding. Biochemistry 29, 7133
Hidratációs erők Makromolekulák felületi töltései kölcsönhatnak víz-molekulákkal. Molekula molekula kölcsönhatáshoz a kötött vízmolekulákat le kell választani. A kötött víz-molekulák helyettesítése nagy energia-befektetést igényel. Rövid távú kh. r hidr ~ 0.1 r el.sztat Különösen jelentős: fehérjéknél lipid membrán-felületeknél Abeln, S., Frenkel, D. (2011) Accounting for protein-solvent contacts facilitates design of non-aggregating lattice proteins. Biophysical Journal, 100, 693
π elektron kation kölcsönhatások + töltés kvadrupól (két dipól) és töltés indukált dipól jelleg ----- + + + + + ----- E 1 kh 3 r Vizes közeg kevésbé csökkenti mint a Cb-kh energiáját aromás szénhidrogén Trp Tyr Phe E 0. 5 E víz E Cb víz 0.05 E Cb de E ~ 0. 25 E Cb Gallivan, J.P., Dougherty, D.A. (1999) Cation- π interactions in structural biology. PNAS 96, 9459 (2000) JACS 122, 870
Kovalens (atomi/kémiai) kötések energetikai leírása Harmonikus potenciállal közelítik a kötés egyensúlyi paraméterei közelében: Harmonikus rezgés a kötés mentén f = φ m E kov kötéserősség = 1 φ 2 ( x x ) 2 0 egyensúlyi kötéstávolság mérése IR spektroszkópiával : f φ C C kötés nyújtása : φ = 275x10 3 kj/mól(nm) 2 pl. 0.01 nm nyújtás E > 10 RT Hasonló harmonikus potenciálok a kötés szögek függvényében is. kötések körüli elfordulások energiája ~ RT
Eddig vonzó kölcsönhatások Kötések kialakulása: szterikus gátlás mellett E = pot B r m taszítás m>n E pot = A n r vonzás r= kölcsönható részecskék távolsága r o = egyensúlyi kötéstávolság E k = kötési energia Atomi rádiuszok értelmezése A kötéstávolság (r o = r A + r B ) és kötési energia E k a kölcsönhatási energiafüggvények konkrét függvény-alakjától függ ( a és b)
Atomi rádiuszok különböző kölcsönhatásokban Elem Rendszám Van der Waals sugár (nm) Kovalens sugár (nm) Ionsugár (nm) Ion H 1 0,120 0,037 H + C 6 0,170 0,077 0,029 C + N 7 0,155 0,075 0,025 N + O 8 0,152 0,073 0,140 O 2- F 9 0,147 0,071 0,117 F - P 15 0,180 0,106 0,058 P 3+ S 16 0,180 0,102 0,184 S 2-
Szterikus gátlás a Pauli elv alapján: Lennard Jones potenciál A taszító potenciált az elektronfelhők átlapolása okozza rövid hatótávolságú kölcsönhatás A vonzó kölcsönhatást a diszperziós/van der Waals potenciál adja: E L J = ( ) ( ) 6 ) r 12 r 0 0 4E0 r r Kötési energia
A makromolekulák szerkezete és komplex-képzése a környezeti molekulákkal való kölcsönhatás jelenlétében energia-minimum-állapotot jelent Zöld: fehérje 44 kda tormaperoxidáz enzim víz-ion környezetben Sárga: ionok Piros-fehér: vízmolekulák
További szerveződés sejtes szinten molecular crowding Piros: aktin filamentumok Kék:sejtmag Zöld:microtubulusok
A biológiai folyamatokban az energia-minimum-elvek statisztikus jelleggel érvényesülnek. Kötések folyamatosan felszakadnak és újraépülnek, a kötéserősségek hierarchiája alapján szerkezeti dinamika
Boltzmann eloszlás ε N független részecske - ε k, ε i T, termikus egyensúly, - rendszer egy mikroállapotában egy részecske energiája ε i, n j ε 1, ε 0, n 0 (Az összes részecske konkrét energiaállapota definiálja) Az N független molekulából álló rendszer teljes energiája E ni ε i ni = = N a betöltési számok egy konkrét sorozata jelenti a rendszer egy makroállapotát { n 0, n1,... }
Boltzmann eloszlás p Z n i i = = e Z ε i kt n = t ε i kt e i Ne Z ε i kt Boltzmann eloszlás fontos összefüggések Annak valószínűsége, hogy adott ε i energiájú állapot a rendszerben megvalósul állapotösszeg n n i 0 = e ε i ε 0 kt e Δε kt Két energiaállapot relatív betöltöttsége = Boltzmann faktor
Boltzmann eloszlás összhangban a tapasztalattal ε N,T termikus egyensúly ε k, n k ε i, n i n i = Ne Z ε i kt T 3 >T 2 >T 1 T 3 >T 2 >T 1 ε 1, n 1 ε 0,, n 0 n j n o = e ε ε j o kt = e Δ ε kt
Mit értsünk a biológiai anyag szerkezetén? Pl. makromolekuláris konformáció? Energia-minimum igen sokféle kölcsönhatás Foszfoglicerát kináz Röntgenkrisztallográfia NMR A konformáció sok mikroállapot időbeli és térbeli eredője Hőmérsékletre érzékeny
Molekuláris/makromolekuláris szerkezetet kialakító kölcsönhatások E k ~ elsődleges kötések : kovalens ionos 2 6 ev/kötés fémes E k ~ másodlagos kötések H-híd 0.1 - néhányszor x 0.1 Hidrofób kölcsönhatás ~ 0.1 van der Waals dipól ponttöltés ~ 0.1-0.2 dipól dipól ~ 0.02 dipól indukált dipól ~ 0.01 időleges dipól ~ 0.02 (diszperziós) elektronvolt 1 ev= 23 kcal/mole ~ ~ 100 kj/mole
Szerkezeti rend testhőmérsékleten T=310 K Kérdés: van-e olyan kötés a szerkezetben, ahol az energiaállapot a kötött állapothoz képest éppen a kötési energiával magasabb? többlet-energiával bíró kötések száma n n kötött = e Ek kt n N kt ~ 0.027 ev RT ~ 2.6 kj/mól T=310 K, k=1.38x10-23 J/K Boltzmann állandó kt E k
Szerkezeti rend testhőmérsékleten T=310 K 0.027 ev E k többlet-energiával bíró kötések száma n n kötött e Elsődleges kötések E k kt >> Ek kt pl. E n N n N k e = 2.7eV 2.7eV o. o27ev = e Termikus okokból elsődleges kötések nem szakadnak fel testhőmérsékleten 100 0 A szervezetet felépítő alapmolekulák szerkezete stabil
Szerkezeti rend testhőmérsékleten T=310 K 0.027 ev E k Másodlagos kötések H-hidak pl. E n N e = 01. ev o.1ev o. o27ev Termikus okokból elsődleges kötések nem szakadnak fel testhőmérsékleten (1-7 kcal / mole) e 3.7 Hidrofób kölcsönhatások, van der Waals kölcsönhatások k = 2.46 10 2 2.5% elsődleges -> van der Waals/diszperziós E k kt A másodlagos kötések jelentős számban felszakadtak testhőmérsékleten szerkezeti dinamika
A szerkezeti dinamika alapvetően fontos szerepet kap a biológiai makromolekulák funkcionális kölcsönhatásaiban tormaperoxidáz enzim nanosecundum-os időtartomány foszfoglicerát kináz enzim millisecundum-os időtartomány
A Boltzmann eloszlás figyelembevétele az energetikai megfontolásokban: az elektrosztatikus potenciál leírása a Poisson Boltzmann egyenlettel Poisson-egyenlet : ponttöltések és dipólusok helyett általános töltéssűrűség-eloszlásnak megfelelő potenciál-függvényre (ϕ): Egy referencia-ponthoz viszonyított helyzetvektor r 2 ϕ( ) = 4 π ρ( r ) ε [ cgs] Töltés-sűrűség-eloszlás r r ρ( ) = qe N Av zi ci ( ) i Boltzmann-eloszlás figyelembe-vétele: Ponttöltés által végzett munka a ϕ potenciáltérben ΔE = q U = q ( ϕ ) 2 ϕ1 Ion-koncentráció Mól/l ( ) = bulk konc. aholϕ( ) = 0 r ci ( ) c ( ) i = e r q e z i ϕ ( ) kt c i
A Boltzmann eloszlás figyelembevétele az energetikai megfontolásokban: az elektrosztatikus potenciál leírása a Poisson Boltzmann egyenlettel Poisson-Boltzmann-egyenlet: ϕ(r) elektromos potenciál-függvény, ami figyelembe veszi az ionok árnyékoló hatását r r q N 2 q z ( ) / ( ) z c ( ) e kt e A e i ϕ ϕ = i i ε i Egyszerűbb formák, Elhanyagolások, Következmények gyakorlaton Debye távolság (ionok árnyékoló hatása)
Ajánlott irodalom: Meyer B. Jackson: Molecular and Cellular Biophysics 2006, Cambridge University Press Damjanovich, Fidy, Szöllősi: Orvosi Biofizika 2008, Medicina