5. Előadás ukleinsavak kimutatása, szekvenálás
A nukleinsav kimutatás etidiumbromid 3,8-diamino-5-etil-6-fenil-fenantrédiumbromid λ g =254-366 nm λ e =590 nm 2 2 + C25 Br - X + C3 C3 C3 C (C3)2 + (C2)3 + (C3)2 C3 C3 X= : YY-1 X= S: TT-1 X C + 3C
Anthraciklin antibiotikumok daunomycin és doxorubicin Rövidítések A G C T bázis A C cukorrész foszfodiészter kötés A C G papcpg [ACG] http://what-when-how.com/molecular-biology/daunomycin-molecular-biology/
Szekvencia meghatározása 1. Fragmentálás restrikciós enzimekkel (W. Arber,. Smith, D. athans, 1978 obel-díj) baktériumokban és kékalgákban GAATTC CTTAAGC GGCC CCGG EcoRI ae III törzs E. coli Cél: feldarabolás 2. Sorrend meghatározás 2a. Kémiai módosítás/hasítás (A. Maxam, W.Gilbert, 1977) 2b. Didezoxi beépítés-enzimes módszer (F. Sanger et al., 1977)
éhány II-es tipusú restrikciós (endonukleáz) enzim (>2000) Bam I G/GATCC Bacillus amyloliquefaciens Bst I G/GATCC Bacillus stearothermophilus1503-4r Eco RI G/AATTC Escherichia coli RY 13 Fok I GGATG 9 / CCTAC 13 / Flavobacterium okeanokoites ind II GTy/uAC aemophilus influenzae R d ind I A/AGCTT aemophilus influenzae R d pa II C/CGG aemophilus parainfluenzae Msp I C/CGG Moraxella spezies ot I GC/GGCCGC ocardia otitidiscaviarum Sac I GAGC/TC Streptomyces achromogenes Sau 3A /GATC Staphyllococcus aureus 3A Sma I CCC/GGG Serratia marcecescens Sb Xma I C/CCGGG Xanthomonas malvacearum 5'-3' irányban haladva a hasítás pontos helye: '/' jelnél
2a. Kémiai módosítás/hasítás (A. Maxam, W. Gilbert, 1977) 1. lépés 2. lépés ATTGACTTAGCC omogén Single-stranded DS minta előállítása Jelölés a szabad -végen 32 (*) (polinukleotid kináz, észter) *ATTGACTTAGCC 12 mer 3. lépés Kémiai hasítás G reakció A reakció + G reakció T reakció + C reakció C reakció *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATT *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTA *ATTGACTT *ATTG *ATT *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGACT *ATTGAC *ATTGA *AT *A *ATTGACTTAGCC *ATTGACTTAGC *ATTGACTTAG *ATTGA
4. lépés: elektroforézis 5. lépés: autoradiográfia méret 6. lépés: szekvencia leolvasás
http://www.slideshare.net/durgeshsirohi/different-methods-of-gene-sequencing
G reakció 2 C2 - - 7 Kémiai hasítás: urinok 3C S C3 Dimetilszulfát (metilezés) 2 - Bázis (gyűrűfelnyitás) C2 - C3 + - C3 C3 C C 2-2 + C2 β α C + 2 - iperidin (-glikozidos kötés hasítás) C2 - - Bázis (Cukor-foszfát lánc hasítás) - 2C C C - C - C + - -
A > G: A reakció 2 - - - 3C S Dimetilszulfát + C3 0 o C, 0,1 M Cl 2 óra (-metilezés) C -glikozidos kötés hasítás 2 - p 7 90 o C - + 3C 2 3-3C - Bázis (Cukor-foszfát lánc hasítás) C 2 C C C C - - - -
Kémiai hasítás: irimidinek 2 - timin 3C 2 2 hidrazin (-metilezés) - citozin 3C 4-Me-3-pirazolon 1 C 2 3 2 2 3 2 Urea + 3-amino-pirazol - 2 2-dezoxiribozil-hidrazon - piperidin Bázis (Cukor-foszfát lánc hasítás a - végen) 2 asítás a végen
C + T: T reakció - C3 2 2 hidrazin - 2 C3 - - -glikozidos kötés hasítás 2 - - - + piperidin Bázis (Cukor-foszfát lánc hasítás) - - C C 2 C C C C - 2 - - - - -
C reakció C 2 - - C - - C - - - C 2 2 2 - hidrazin 1 M acl (gátolja a timin metileződést) - C - - piperidin + - - - C + - - 2-2 + 2 2 + 2 C
élda: G hasítás után Fragmens hossz 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 *ATTGAACTTAGCC *ATTGAACTTA AACTTAGCC *ATT AACTTA CC + + Színezékkel festett (minden csik) Autoradiográfiás módszerrel jelzett gél ( izotóp csik)
Maxam-Gilbert módszer - kiértékelés
2b. Didezoxi nuleotid beépítés enzimes módszer (F. Sanger et al., 1977)
2b. 1. lépés: Didezoxi nukleotid jelölése a) Radioaktív izotóp ( 32 ) B 32 32 B b) Fluorofór (fluoreszcens jelölés, L. E. ood, 1986)
Áttekintés DS polimeráz primer ( 32 ) ddtt ddct ddgt ddat DEATURÁLÁS T C G A
2b. 2 A DS-polimeráz müködésének blokkolása szekvenálandó DS GAATTCGCTAATGC CTTAA primer DS polimeráz I dat, dtt, dct, dgt + didezoxi analóg (ddat) GAATTCGCTAATGC CTTAAGCGATTA + GAATTCGCTAATGC CTTAAGCGA 4 edény 4 analóg
2b. 3 Gélelektroforézis Leolvasás - komplement szál
1. iroszekvenálás 2. Illumina/Solexa szekvenálás Új-generációs szekvenálás 3. SLiD (Sequencing by ligonucleotid Ligation and Detection) 4. TSMS (True Single Molecule Sequencing) Valódi egymolekulás szekvenálás) 5. SMRT (Single Molecule Real-time) Egymolekulás valósidejű szekvenálás http://www2.technologyreview.com/news/42 7677/nanopore-sequencing/ http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/gentechnologia/ch05.html