A neutrofil granulociták és monociták fagocitózis indexe egészséges és preeclampsiás terhességben Kövér Ágnes ÁOK VI. évfolyam Debreceni Egyetem Klinikai Központ Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Témavezető: Dr. Lampé Rudolf
A preeclampsia 1. A humán terhesség legveszélyesebb megbetegedése Terhesség specifikus, multiszisztémás Világszerte vezető oka az anyai és magzati morbiditásnak és mortalitásnak A preeclampsia és az eclampsia évente az anyai halálesetek körülbelül 14%-áért felelős, ami 50000-75000 nőt érint
A preeclampsia 2. Korábban egészséges nők terhességének 20. hete után kialakuló hypertonia és proteinuria Terhességi magas vérnyomás: legalább kétszer mért 140/90 Hgmm feletti érték esetén Fehérjevizelés (>300 mg/nap) A terhesség okozza, közvetlen oka nem ismert, de az utóbbi időben egyre inkább a károsodott anyai immunfunkció kerül előtérbe
Hajlamosító tényezők Életkor Elhízás Első terhesség Ikerterhesség Cukorbetegség Vesebetegség Korábban megállapított magas vérnyomás Genetikai háttér (protein C, protein S, antitrombin deficienciák, Leiden mutáció)
Szövődményei 1. Magzati szövődmények Koraszülés Tartós méhen belüli oxigénhiány Magzati retardáció Halál 2. Anyai szövődmények Görcs (eclampsia) HELLP szindróma Tüdővizenyő Lepényleválás Veseelégtelenség Májelégtelenség Stroke Halál
A preeclampsia pathogenezise A gyulladás központi szerepe. Tüneteinek megjelenése előtt megfigyelhető a károsodott vaszkuláris endothel funkció. A gyulladásos stimulus kialakításához: a nem megfelelő placentáció okozta hipoxia trofoblaszt mikropartikulumok útján gyulladás és endothel diszfunkció másik lehetséges okozója, az infekció is nagy valószínűséggel részt vesz a preeclampsia etiológiájában. A trofoblaszt mikropartikulumok és az infekciót okozó mikróbák eliminálásában fontos szerepe van a fagocitózisra képes fehérvérsejteknek.
Mikropartikulumok szerepe Egészséges terhesség során is, de preeclampsiában szignifikánsan nagyobb mennyiségű syntitiotrophoblast mikropartikulum (STMP) jut az anyai vérkeringésbe Kísérletesen bizonyított, hogy preeclampsiában ezen mikropartikulumok endothélsejt diszfunkciót okoznak Nem tisztázott, hogy a mikropartikulumok eliminálása hogyan történik, de a fagocita funkció jelentős szerepet játszhat benne
Fagocita funkció A fagocitózis olyan folyamat, melynek során az erre képes fehérvérsejtek (pl. neutrofil granulociták, monociták) részecskéket kebeleznek be. A fagocitózis funkciója kettős: egyrészt a bekebelezett mikróbák elpusztítása effektor funkció, másrészt kapocs a veleszületett és szerzett immunitás között. Partikulum Aktin filamentum Lizoszóma Fagolizoszóma Lizoszóma Opszonin Fagoszóma Stern et al.: Particle and Fibre Toxicology 2012, 9:20
Monociták szerepe Anyai és magzati vérben is jelen vannak, szerepet játszanak a preeclampsiában megfigyelhető megnövekedett vaszkuláris rezisztenciában. Nagy mennyiségben termel gyulladásos citokineket (pl.:il-6, IL-8). A.Victor Hoffbrand, John E.Pettit- Clinical Haematology, Mosby-Wolfe, London, 1994.
Granulociták szerepe Perifériás vérben aktiválódnak, az endothel-diszfunkció okozói Oxidatív stressz indukálta gyulladásos folyamatok Szuperoxid-anion termelés (nem csökken le, ellentétben az egészséges terheseknél mért értékkel) A.Victor Hoffbrand, John E.Pettit: Clinical Haematology, Mosby-Wolfe, London, 1994.
Tudományos előzmények, célkitűzés Egészséges terhességben és preeclampsiában a fehérvérsejtek fagocita funkciójának jellemzésére nincs ismert irodalmi adat. Célunk volt mind egészséges terhességben, mind preeclampsiában a fagocita funkció megfigyelése neutrophil granulocitákban és monocitákban. Egészséges terhesség fiziológiájának és preeclampsia pathofiziológiájának jobb megismerése.
Vizsgált betegek Egészséges, nem terhes (n=20) hasonló életkorúak és testtömeg indexűek, nem dohányoznak, gyógyszert rendszeresen nem szednek Egészséges terhes (n=25) hasonló életkorúak, gesztációs korúak, testtömeg indexűek, nem dohányoznak, gyógyszert rendszeresen nem szednek Preeclampsiás (n=25) vérnyomásuk egyenlő, vagy nagyobb, mint 140/90 Hgmm, egy nap kétszer mérve, min. 6 óra különbséggel, valamint vizeletük fehérjetartalma több, mint 0,3 gramm/24 óra
Vizsgálatban résztvevő személyek klinika adatai Nem terhesek (n=20) Egészséges terhesek (n=25) Preeclampsiások (n=25) P érték Életkor 29,1 3,2 29,0 5,2 29,3 3,4 >0,05 Gestatios kor a vérvételkor (hét) NA 36,4 1,2 36,1 0,9 0,05 Gestatios kor a szüléskor (hét) NA 40,4 1,7 37,6 2,6 <0,01* Terhesség előtti BMI (kg/m 2 ) NA 23,3 1,2 24,2 1,7 0,05 BMI a szüléskor (kg/m 2 ) 21,2 2,5 24,9 1,5 29,8 1,3 <0,05* Paritás a NA 0 (0-2) 0 (0-2) 0,05 Systolés vérnyomás a vérvételkor (Hgmm) 106,5 6,1 108,9 7,4 148,9 7,9 <0,001* Diastolés vérnyomás a vérvételkor (Hgmm) 66,9 5,4 70,9 7,3 100,7 7,4 <0,001* Újszülött súlya (gramm) NA 3578 526,5 3030 710,1 <0,01* Proteinuria a vérvételkor (vizeletben kereszt) a 0 (0-0) 0 (0-0) 2 (1-3) <0,001* a Az értékek átlagot jelölnek (tartomány). BMI= testtömeg-index (kg/m 2 ). NA: nem értelmezhető. *szignifikáns különbség egészséges terhesek és preeclampsiás terhesek között.
A vizsgálat menete 1. Fehérvérsejt szeparálás Plazma PMNLs Ficoll 1.077 g/cm³ centrifugálás 24 C 400 G 30 min Ficoll 1,110g/cm³ PMNLs Vvt. PMNLs: polimorfonukleáris sejtek: monocita, granulocita; Vvt: vörösvértest
2. Sejtek kitapasztása Sejttenyésztő kamra: granulocyták és monocyták kitapasztása Sejttenyésztő kamra 3. Zymosan hozzáadása és fixálás Zymosan A hozzáadása, mely jelölve van fluorescein- isothiocyanate-tal(fitc) Opszonizált fagocitózist indukál Sejtek fixálása tárgylemezre 4%-os Paraformaldehid oldattal Paraformaldehid oldat
4. Festés 4.1 Granulocyták festése DAPI-t tartalmazó fedőmédiummal sejtmagok festése (DAPI: 4 6 -diamidino-2-fenilindol) 4.2 Monocyták festése Kettős antitest jelölés (indirekt): A monocita specifikus antitestet (egérben termeltetett) anti humán CD 14+ Egér IgG ellenes fluoreszcensen jelölt (Texas Red) másodlagos antitest Fedés
5.Kiértékelés Kiértékelés: Fluoreszcens mikroszkóppal történt Fagocitózis index= Fagocitált részecskék száma 100 Statisztikai próba: kétmintás t-próba, szignifikanciaszint: p<0,05
Granulociták Egészséges nem terhes Egészséges terhes Preeclampsiás (kontroll) Zöld: fagocitált zymosan részecskék; kék: granulociták sejtmagja
Monociták Egészséges nem terhes Egészséges terhes Preeclampsiás (kontroll) Zöld: fagocitált zymosan részecskék; kék: monociták sejtmagja; piros: monociták sejthártyája
Fagocitózis index Neutrofil granulociták fagocitózis indexe 5 4 * * p<0,001 (b vs. a) # p<0,001 (c vs. b, c vs. a) 3 2 # Egészséges nem terhes Egészséges terhes Preeclamsiás terhes 1 0 a b c
Fagocitózis index Monociták fagocitózis indexe 5 * p<0,001 (b vs. a) 4 * # p<0,001 (c vs. b, c vs. a) 3 2 # Egészséges nem terhes Egészséges terhes Preeclamsiás terhes 1 0 a b c
Konklúzió I. Egészséges terhességben mindkét vizsgált fehérvérsejt típus fagocita funkciója szignifikánsan csökkent az egészséges nem terhes kontrollokéhoz képest. Ez egy védekező mechanizmus lehet a magzat, mint hemiallograft érdekében, az anyai immunszuppresszió jeleként. Magyarázatot adhat arra a jelenségre, hogy egészséges terhességben az anyai fertőzések nagyobb számban fordulnak elő, mint nem terhesekben; illetve a fertőzések lefolyása súlyosabb.
Konklúzió II. Preeclampsiás betegeknél mind neutrofil granulociták, mind monociták esetében a sejtek fagocita funkciója szignifikánsan csökkent az egészséges terhesek és egészséges nem terhesek fagocita funkciójához viszonyítva. A preeclampsiában mért csökkent fagocita funkció része lehet a kórkép immunregulációs zavarának. A keringő STMP-k eliminálása ezáltal zavart szenvedhet, így azok kifejthetik károsító hatásukat az endothel sejtekre, következményes endothel diszfunkciót okozva, ami a preeclampsiára jellegzetes szisztémás endothelsejt károsodást kialakíthatja.
Köszönetnyilvánítás Dr. Lampé Rudolf Prof. Dr. Póka Róbert Prof. Dr. Ádány Róza DE Megelőző Orvostani Intézet dolgozóinak: Dr. Szűcs Sándor Dr. Pál László Dr. Árnyas Ervin Debreceni Egyetem belső kutatási pályázata
Köszönöm a megtisztelő figyelmet!
Függelék A bemutatott eredmények közül önállóan végeztem az alábbiakat: Fehérvérsejtek szeparálása, kitapasztása (neutrofil granulociták, monociták) Kezelés zymosan-nal (opszonizált fagocitózist utánozza, jelölve van fluoresceinisothiocyanate-tal) Sejtek festése (DAPI-sejtmag, monociták - Kettős AB jelölés: monocita specifikus antitestet, azaz anti humán CD 14+ és IgG ellenes antitest Texas Red fluoreszcens festékkel van konjugáltatva, ami anti CD14-hez kötődik) Kiértékelés: fagocitózis index: fagocitált részecskék száma/100 Statisztikai próba: kétmintás t-próba, szignifikancia szint: p<0,05 Előadás, táblázatok és diagramok készítése A részt vevő személyek klinika adatainak gyűjtése