Bioortogonális jelölésre alkalmas fluoreszcens jelölőmolekulák előállítása és vizsgálata

Tudományos Diákköri Dolgozat HERNER ANDRÁS Bioortogonális jelölésre alkalmas fluoreszcens jelölőmolekulák előállítása és vizsgálata Témavezető: Dr. Kele Péter ELTE-TTK Kémiai Intézet Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2009

TARTALOMJEGYZÉK 1. Bevezetés...2 2. Elméleti bevezető, irodalmi áttekintés...4 2.1. Fluoreszcencia...4 2.2. Bioortogonális kapcsolások...4 3. Saját eredmények...9 3.1. Célkitűzés...9 3.2. Szintézisek...10 3.2.1.Rövidítések...10 3.2.2. Fluorofórok előállítása...11 3.2.3. Modellkísérletek...14 3.2.4. Sejtjelölési kísérletek...16 3.3. Spektroszkópiai és fluoreszcencia mérések...17 4. Kísérleti rész...19 4.1. Általános...19 4.2. Vegyületek szintézise...19 5. Összefoglalás, távlati tervek...28 6. Köszönetnyilvánítás...29 7. Irodalomjegyzék...30 1

1. BEVEZETÉS A biomolekulák, mint fehérjék, lipidek, szénhidrátok képalkotótechnikákkal történő tanulmányozása fontos szerepet tölt be az élő szervezetekben lejátszódó folyamatok megértésében.[1] A detektálás érzékenysége és viszonylag olcsó kivitelezhetősége miatt ezen képalkotó módszerek előszeretettel alkalmaznak fluoreszcens jelzővegyületeket, mind in vivo, mind in vitro kísérletekben. Ezen eljárások lehetővé teszik a sejten belüli folyamatok tér- és időbeli követését. A zöld fluoreszcens fehérje (Green Fluorescent Protein, GFP) felfedezése és sokrétű felhasználhatósága (amit 2008-ban Kémiai Nobel díjjal is jutalmaztak) megmutatta a fluoreszcencián alapuló szelektív fehérjejelölés előnyeit a hely és a dinamikai tulajdonságok meghatározásban. A genetikailag kódolt csoportoknak ugyanakkor megvannak a saját korlátai. Így például nem alkalmazhatók a poszttranszlációs módosítások mesterséges utánzásakor, vagy a lipidek és más, nem direkt módon kódolt molekulák tanulmányozásakor. Így a természetben megtalálható (endogén) fluoreszcens jelzővegyületeken, (ilyenek például az aromás aminosavak, a porfirinszármazékok, a nukleinsav-bázisok vagy a fluoreszcens fehérjék) kívül szükség van szintetikusan előállított jelzővegyületek alkalmazására is. Az ilyen exogén fluoreszcens jelzővegyületek bevitele a vizsgált rendszerbe kétféleképpen történhet: (i) szintetikus szubsztrátok szintézis közbeni, vagy poszt-szintetikus jelölésével, illetve (ii) a vizsgált természetes vegyületek in situ jelölésével. Az utóbbi technika elengedhetetlen feltétele a jelzővegyületek ún. bioortogonális reakcióval történő bevitele.[2] A bioortogonális reaktánsokra igaz, hogy azok szervezetidegenek, a vizsgált rendszerrel szemben inertek és egymással gyors, szelektív, nagy hatékonysággal lejátszódó reakcióban vesznek részt. Ilyen bioortogonális reakció pl. a Staudinger-redukción [2,3] alapuló ligáció, illetve az alkinok és azidok közti, Cu(I) ionok [4,5], vagy gyűrűfeszültség által [6] katalizált 1,3 dipoláris cikloaddició. A szintetikus fluoreszcens jelzővegyületek közül különös jelentőséggel bírnak azon vegyületek, melyek a vörös, távoli vörös, közeli infravörös (NIR) tartományban gerjeszthetők, illetve emittálnak. Egyrészt jellemző rájuk, hogy a gerjesztésükhöz szükséges fény általában kisebb energiájú, ezért a besugárzáskor kisebb terhelés éri a sejteket, másrészt a kisebb energiájú fény mélyebben képes a szövetekbe hatolni. Ugyancsak előnyös tulajdonsága a kisebb energiájú gerjesztési és emissziós hullámhossznak, hogy az élő szervezetekben található természetes fluorofórokat (aromás aminosavak, nukleotidok stb.) nem, vagy csak 2

kisebb mértékben gerjeszti, ezáltal csökken a saját fluoreszcencia (autofluoreszcencia). Így a fluoreszcenciára amúgy is jellemző, nagy érzékenységű detektálás (jel-zaj arány) tovább javul. Munkám során a fenti kritériumoknak (fluoreszcens és bioortogonális reakcióba vihető) eleget tevő molekulák tervezésével és szintézisével, majd tesztelésével foglalkoztam. 3

2. ELMÉLETI BEVEZETŐ, IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Fluoreszcencia A fény által gerjesztett molekulák számára több lehetőség is kínálkozik, hogy többletenergiájuktól megszabaduljanak. A főbb folyamatok, melyek a fénnyel történő gerjesztést követhetik a következők: rezgési relaxáció, belső konverzió, fluoreszcencia és foszforeszcencia. Ezeken kívül előfordulhat még, hogy a gerjesztett molekula kémiai reakcióban átalakul (fotokémiai reakció). A fluoreszcencia, a rezgési relaxáció és a belső konverzió egymás mellett zajló események, így ezek versengésének eredményeként lesz egyik anyag fluoreszcens vagy nem fluoreszcens. Azokban a vegyületekben nő meg a fluoreszcenciával történő relaxáció szerepe, ahol a másik két folyamat háttérbe szorul. Így például a fluoreszcens molekulák jellegzetesen merev szerkezetűek, mert ezekben a rezgési relaxáció jobban háttérbe szorulhat. Jó példák erre az aromás, főként a heteroaromás rendszerek. A fluoreszcencia hullámhosszának, intenzitásának és a kvantumhasznosítási tényező befolyásolásának lehetőségei: a. Erősebb push-pull rendszer kiépítése Erős elektronküldő és elektronszívó csoportok/szubsztituensek bevitele. Pl.: elektronküldők tipikusan: -OH, -OR, -NH 2, -NR 1 R 2, ; elektronszívók: -SO 2 -, -SO - 3, -NO 2, pozitív töltés, b. Konjugáció kiterjesztése (az aromás rendszerrel) Például két aromás rendszer összekötése polimetin lánccal. c. A molekula további merevítése A szakirodalomban kitűnő összefoglaló munkák találhatók a molekuláris fluoreszcenciáról [7,8]. E helyen csak a legszükségesebb információkat említettem meg 2.2. Bioortogonális kapcsolások Az élő sejtekben található molekulák jelölése és nyomon követése sok kutatás feltétele. Ennek legcélravezetőbb módja az ún. bioortogonális ligáció [2], melynek lényege, hogy két funkciós csoport szelektív, fiziológiás körülmények között lejátszódó nagy hatékonyságú, egymásra nézve szelektív reakciója révén stabil kovalens kötés alakul ki. A bioortogonális 4

funkciós csoportokkal szemben támasztott további feltételek, hogy biológiailag inertek legyenek, vagyis a célvegyületen kívül ne reagáljanak más funkciós csoportokkal, valamint biokompatibilisek, vagyis nem toxikusak. Mindezek mellett gyakorlati okokból szükséges a megfelelő érzékenység és kimutathatóság elérése, hogy a reakciók gyorsan, legalább a biológiai folyamatok sebességével összemérhetően lejátszódjanak alacsony koncentrációtartományban is, illetve a kapott termék detektálható legyen. Ezen feltételeknek legjobban az olyan fluoreszcens csoportot tartalmazó vegyületek felelnek meg, amelyek bioortogonális reakcióra alkalmas funkciós csoportokat tartalmaznak. A rendelkezésünkre álló lehetséges kémiai reakciók és átalakítások közül csak néhány felel meg ezen elvárások nagyobb részének. Az eddig leírt, biortogonális ligációra alkalmas reakciók az alábbiakban foglalhatók össze: a.) alkinok és azidok közti 1,3-dipoláris cikloaddíció b.) alkének és tetrazolok fotoindukált 1,3-dipoláris cikloaddíciója c.) azidok reakciója foszfinokkal (Staudinger-ligáció) d.) a tetrazinokra épülő fordított elektronigényű Diels-Alder reakciók. a.) Alkinok és azidok közti 1,3-dipoláris cikloaddíció [9,10] Az alkinok és azidok közti dipoláris 1,3-dipoláris cikloaddíciót először Huisgen írta le.[4] (1. ábra) A hosszú reakcióidőt kívánó, 1,4- és 1,5-triazolt eredményező reakció a hőmérséklet emelésével (kb. 100-120 C) felgyorsítható. Lényeges áttörést jelentett a reakció élő rendszerekben történő alkalmazhatóságában, Sharpless, illetve Meldal és munkatársainak közelmúltban történt megfigyelése, miszerint a reakció szobahőmérsékleten és közel kvantitatív hozammal játszódik le Cu(I) ionok jelenlétében.[5] Az egyfajta klikk-reakció - ként is emlegetett folyamat azóta számos alkalmazásra talált.[1,11] Érdekessége a Cu(I) katalizált folyamatnak, hogy bár a fluorofórok bevitele szempontjából kevésbé fontos az eredetileg nem regioszelektív reakció kizárólag az 1,4-szubsztituált triazolt eredményezi. 5

1. ábra Később ezen klikk-reakció Cu(I) katalízist nem igénylő változatát is kifejlesztették. Ez utóbbi, Bertozzi és munkatársai nevéhez fűződő, ciklooktinok és azidok közti reakció, mely a ciklooktinban fellépő gyűrűfeszültség miatti nagy energiatartalomnak köszönhetően nem igényli réz jelenlétét a folyamathoz. (2. ábra) [6] Bár ez a reakció 2-4 nagyságrenddel lassabban játszódik le, mint réz-katalizált változata, és a regioszelektivitás is elvész, nagy előnye, hogy nem igényli a sejtek számára gyakran toxikus réz jelenlétét. Megfelelő szubsztituensek alkalmazásával (pl. fluor) jelentős reakciósebesség érhető el. Legújabb, elméleti számolási eredmények alapján pedig arra következtetnek, hogy bizonyos benzociklooktin-származékok akár gyorsabb reakciót is eredményezhetnek, mint a Cu(I) katalizált reakciók. [12] 2. ábra b.) Alkének és tetrazolok fotoindukált cikloaddíciója Biomolekulához kapcsolt alként tartalmazó lánchoz fotokémiai úton szelektíven és gyorsan köthetünk diaril-tetrazol részt tartalmazó molekulákat.[13] A mechanizmusát tekintve a néhány perces UV fény beugárzás hatására kilépő N 2 után képződő nitrilimin (k 1 = 0,14 s -1, t 1/2 = 5,1 s) 1,3-dipoláris cikloaddícióban reagál az alkénnel (3. ábra). A cikloaddíció másodrendű folyamat, elérheti akár a k 2 = 10 1 M -1 s -1 sebességet is. Előnye, hogy a képződő pirazolin-származék fluoreszcens tulajdonságokkal rendelkezik (a szubsztituensektől függően 6

487-538 nm közötti emissziós maximumokkal) a kiindulási anyagokkal ellentétben. Kvantumhasznosítási tényezője is figyelemre méltó. 3. ábra c.) Staudinger-ligáció Azid csoport trifenil-foszfinos redukciója (ún. Staudinger-redukció) alapján Saxon és Bertozzi 2000-ben dolgozta ki az ún. Staudinger-féle ligációs eljárást.[2,3] A ligációhoz olyan foszfinszármazékot használnak, amiben egyik aril csoporthoz elektrofil csapdát kötnek (pl. észter-csoportot). A képződő ilid vizes közegben történő átrendeződése során a N negatív töltését az elektronhiányos karbonil szén fogja be, majd egy víz belépése és egy alkohol eliminációja során kialakul az amid és a foszfin-oxid (4. ábra). Preparatív szempontból érdemes az észter csoport és a fluorofór azonos aril csoporton történő bevitele. Irodalmi példák alapján jól alkalmazható pl. nukleozidok jelölésére. Előnye, hogy a reagensek és az elimináló molekulák (alkohol, N 2 ) is biokompatibilisek. Hátránya a viszonylag alacsony reakciósebesség (k 1 = 0,4 s -1 és k 2 csak 10-2 M -1 s -1 ) és a foszfinszármazék spontán oxidációja. 4. ábra d.) Fordított elektronigényű Diels-Alder-reakció Az elsőként Hantzsch és Lehmann által előállított 1,2,4,5-tetrazin, [14] vagy más néven s-tetrazin a 3 lehetséges alapváz közül az egyetlen, amelyik stabil. Aromás stabilizációjának energiáját ab initio és szemiempírikus számításokkal is meghatározták: a stabilizáció kisebb, mint a kevesebb nitrogént tartalmazó hattagú rendszerekben.[15] Emiatt relatív nagy reakciókészséget várhatunk a gyűrűtől, amit elektronhiányos volta igazol. A gyakorlatban ez a diénekhez hasonló cikloaddíciós képességükben valósul meg. Carboni és Lindsey 1959-ben 7

számolt be [16] az aromás fluoroalkil-tetrazinok és alkinek, illetve egyszerű olefinek közti [4+2]-es cikloaddíciós reakciókról, a lehetséges mechanizmust pedig Sauer és munkatársai javasolták, és bizonyították is (5. ábra).[17] Tőlük ered a fordított elektronigényű Diels-Alderreakció elnevezés is. 5. ábra A mechanizmusát tekintve elsőként egy biciklusos intermedier képződik, majd gyors nitrogénvesztés közben piridazinná vagy 1,2-dihidro-piridazinná alakul. Utóbbi könnyen piridazinná oxidálódik, amely gyakran spontán is lejátszódik. A reakció bioortogonális jelölésre szintén alkalmas [18]: kinetikáját tekintve gyors (ciklookténnal, mint dienofillel k 2 ~ 10 1 10 3 M -1 s -1 nagyságrendű), a tetrazin reakciókészsége pedig hangolható a gyűrű elektronhiányosságának módosításával. Erre az R 1, R 2 szubsztituensekkel van lehetőségünk. A módszer hátránya a reagensek időigényes előállítása. 8

3. SAJÁT EREDMÉNYEK 3.1 Célkitűzés Munkám során olyan bioortogonális kötésre alkalmas fluoreszcens jelzőmolekulák tervezését és szintézisét kívántam megvalósítani, amelyek a vörös, távoli vörös, közeli IR tartományban emittálnak (6. ábra). További célom volt a fluorofórok kvantumhasznosítási tényezőjének növelése. A jelzővegyületek szintézisét követően azok tesztelése végett modellkísérleteket végeztem, melyek során biomonomerekre kötöttem őket. A tesztelést követően terveztem sejtek fluoreszcens jelölését is. Az 5 és 6 vegyületek tervezésekor megpróbáltam tovább merevíteni a vázat egy csoportunkban korábban előállított fluorofórhoz képest (7), ezzel jobb F értéket és magasabb emissziós hullámhosszt elérni. O N N 3 N N H N PF 6 1 O H O N S N 3 N PF 6 O H O N S 2 N H O N 3 4 N N N N 3 N O O SO 3 N O O SO 3 5 N 6 N O O SO 3 7 6. ábra 9

3.2. Szintézisek 3.2.1. Rövidítések BOC...tercier-butil-oxi-karbonil védőcsoport DBU...1,8-diazabicikloundec-7-én DCM...diklór-metán DIPA...N,N-diizopropil-amin DMF...N,N-dimetil-formamid DMSO-d 6...perdeuterált dimetil-szulfoxid EDIPA...N,N,N-etil-diizopropil amin EtOAc...etil-acetát HBtU...O-benzotriazol-tetrametil-urónium-hexafluoro-foszfát Hex...n-hexán HOBt. H 2 O...1-hidroxi-benzotriazol monohidrát HRMS (ESI)...nagyfelbontású tömegspektroszkópiás (High...Resolution Mass Spectrometry) mérés elektrospray...porlasztással (Electro Spray Ionization) KHMDS...kálium-hexametil-diszilazán LDA...lítium-diizopropil-amid MeCN...acetonitril NIR...közeli infravörös (Near Infra Red) tartomány r.t...szobahőmérséklet TEA...N,N,N-trietil amin Tf 2 NPh...N-fenil-bisz(trifluorometán-szulfonimid) THF...1,4-tetrahidro-furán VRK...vékonyréteg-kromatográfia...reflux hőmérséklet F...fluoreszcenciás kvantumhasznosítási tényező 10

3.2.2. Fluorofórok előállítása Az 1 és 2 fluorofór előállításának első lépéseként 4-pikolint (8) alkileztem 1,3-dijódpropánnal. A keletkező pikolínium sót (9) továbbalakítottam, és jód-azid cserével kialakítottam a 10 vegyületet. A pikolinszármazék 4-es helyzetben levő metilcsoportja lazított protont tartalmaz, így aldehidekkel kondenzációs reakcióba vihető. A 4-dimetilaminobenzaldehiddel (11) való reakció termékeként jutottam az 1 célvegyülethez. Ennek ellenionját a jobb kezelhetőség végett nagy feleslegben vett NH 4 PF 6 -tal cseréltem le. Az 1 vegyület továbbalakítása végett az azid csoportot redukáltam. Ezt polimer hordozóhoz kötött PPh 3 -nal történő redukció (Staudinger-reakció) eredményeként értem el. A keletkező amint (12) in situ aktív észterré alakítva (HOBt, HBtU) kapcsoltam a 13 ciklooktinszármazékhoz és jutottam a 2 célvegyülethez. (7. ábra) 7. ábra 11

Az előző lépésben használt ciklooktin-származékot (13), az alábbi reprodukciós szintézissor eredményeként állítottam elő.[11b] Ciklooktanon THF-es oldatához (14) -78 Con frissen elkészített LDA-t adagoltam. A keletkező enoláthoz hozzácsepegtetettem brómmetil-benzoesav-metilészter THF-es oldatát, így jutottam 15-höz. Ebből a 16 triflátszármazékot Tf 2 NPh reagens és KHMDS bázis segítségével állítottam elő. A következő lépésben LDA-val való eliminációs reakcióban kialakítottam a hármaskötést tartalmazó 17-t, melyet LiOH-dal hidrolizálva jutottam a szabad karbonsavhoz (13). (8. ábra) 8. ábra A 3 és 4 fluorofórok előállítása végett danzil-kloridhoz (18) 1-amino-3-bróm-etán hidrobromid sót adtam TEA jelenlétében, így jutottam 19-hez. Ehhez feleslegben vett nátrium-azidot adva lecseréltem a bromidot és jutottam a 3-as célvegyülethez. Ebből a már korábban is alkalmazott trifenilfoszfinos redukció eredményeként állt elő a 20-as amin. Amidkötés kialakításához használt kapcsolószerek segítségével kötöttem hozzá 13 ciklooktinszármazékot, és kaptam 4 fluorofórt. (9. ábra) 12

9. ábra Az 5 fluorofór előállításához, kereskedelmi forgalomban kapható julolidinszármazékból (21) in situ generált Wittig-reagens segítségével kialakítottam a laktongyűrűs szerkezetet (22).[19] Ehhez Vilsmeier-Haack-formilezés körülményei között aldehid csoportot kapcsoltam (23). A kutatócsoportunkban korábban előállított 24-hez 5-jód-pent-1-int kapcsoltam, ezzel kialakítva a 25-ös betain szerkezetet. Egy másik reakcióban a 9-10 vegyületekhez hasonlóan dijód-propánt kötöttem hozzá (26), majd lecseréltem a jódot azid csoportra (27). 23 és 25, illetve 27 összekapcsolása 1-hez hasonlóan pikolin-kondenzációs reakcióban történt (5,6). (10. ábra) 13

10. ábra Az ily módon előállított hat klikk-reakcióra alkalmas fluorofór molekula spektroszkópiai vizsgálatával a 3.3. fejezetben foglalkozom. 3.2.3. Modellkísérletek Az 1 fluorofórral két modellkísérletet végeztem. Egy védett, peptidszintézisre alkalmas aminosav-származékra (N-Boc-Tyr(O-propargil)-O t Bu, 28) és egy védett monoszacharidszármazékra kötöttem ( -1-O-(3-propargil)-2,3,4,6-O-tetraacil-glükóz, 30). A 3 fluorofórt pedig egy nukleozid-származékoz (3-azido-3-dezoxi-timidin, 32) konjugáltam. 14

1 és védett Tyr (28) kapcsolása 1 azidot és 28 alkint Cu(I)-katalizátor és TEA jelenlétében 1,3-dipoláris cikloaddíció mechanizmusával kapcsoltam össze triazollá (29). (11. ábra) 11. ábra 1 és acilezett O-propargil glükóz (30) összekapcsolása Az azidot (1) és a glükóz-alkint (30) a 29 előállításakor alkalmazott körülmények között kapcsoltam össze (31). (12. ábra) 12. ábra 15

4 és 3-azido-3-dezoxi-timidin (32) összekapcsolása A 4 ciklooktin-kötőrészű fluorofórt Cu(I)-katalízis nélkül kötöttem azid csoportot tartalmazó timidin-származékhoz (32), ezzel a 33 triazolt kaptam. (13. ábra) 13. ábra A reakció minden esetben jó kitermeléssel mentek végbe (1. táblázat), következésképpen az előállított fluorofórok alkalmasak lehetnek biopolimerekhez való konjugációra. 1. táblázat. A három modellkísérlet kitermelései 1 + 28 29 1 + 30 31 3 + 32 33 kitermelés (%) 82 95 83 3.2.4. Sejtjelölési kísérletek A 2 vegyületet (Chinese Hamster Ovary, CHO) sejtek sejtfelszíni struktúráinak jelölésében is teszteltük. Ezen kísérleteket az MTA Peptidkémiai Kutatócsoportjában Dr. Bősze Szilvia és Orbán Erika végezték. A sejtek jelölését megelőzően azokat azidomannózamin tartalmú táptalajon tartottuk. Az anyagcserefolyamatok során ezen szénhidrátot a sejtek beépítették a sejtfelszíni glikoproteidjeikbe, így lehetővé téve a sejtfelszíni azidcsoportok jelölését (ciklo)alkintartalmú festékekkel. A sejtek festését két módon is 16

elvégeztük. Az első esetben fixált (elölt) sejteket jelöltünk a ciklooktintartalmú fluorofórral (2), míg a második esetben a sejteket natív állapotukban jelöltük, majd ezt követően kerültek fixálásra. A fluoreszcens mikroszkópos felvételek (14. ábra) azt mutatták, hogy mindkét esetben hatékony sejtfelszíni jelölés történt, azaz a 2 vegyület kiválóan alkalmas ezen célra. A felvételek arra is rámutatnak, hogy abban az esetben, amikor a sejtek nem tartalmaztak azidocsoportokat a felszínükön csak minimálisan, nem-specifikusan jelölődtek (14/C ábra). 14. ábra. Kontroll sejtek (A), Fixált, jelölt sejtek (B), Azidomannózamin-mentes táptalajon tartott, festékkel kezelt sejtek (C), Natívan jelölt sejtek (D) 3.3. Spektroszkópiai és fluoreszcencia mérések Az előállított öt, bioortogonális jelölésre alkalmas fluorofór három különböző fluoreszcens vázat tartalmazott, melyek forofizikai paraméterei az alkalmazott funkciós csopprtoktól függetlenek voltak. A gerjesztési és emissziós maximumokat a 2. táblázatban foglaltam össze az egyes vázakra jellemző gerjesztési és emissziós spektrumok pedig a 15. ábrán láthatók. Az 5 vegyülettel való összehasonlításhoz a 7 vegyület adatait is feltüntettem, hogy láthassuk, változtak-e a spektrális paraméterek a gyűrűmerevítés eredményeként. A táblázat adataiból látszik, hogy a julolidingyűrű beépítése kismértékű vöröseltolódást eredményezett úgy az abszorpciós, mint az emissziós spektrumokban. Az egymáshoz viszonyított kvantumhasznosítási tényezők ( F,5 / F,7 < 1) ellenben azt mutatják, hogy a merevebb szerkezet a várakozásainkkal ellentétben a F csökkenését eredményezte. 17

2. táblázat Fluorofórok fotofizikai tulajdonságai MeOH-ban 1 3 5 6 7 a abs / nm 480 330 565 566 538 em / nm 600 505 717 721 674 (690) / x10 4 M -1 cm -1 b 4,7 0,34 3,0 2,7 4,8 F n.a. n.a. 0,0068 0,0045 n.a. a A kutatócsoportban korábban előállított fluorofór b a gerjesztési maximum hullámhosszán N N O O SO 3 N Me 2 N O H O N S NMe 2 300 400 500 600 700 800 900 wavelength / nm 15. ábra. Az előállított jelzővegyületek gerjesztési (szürke) és emissziós spektruma (fekete) A modellkonjugátumok (29,31,33) spektroszkópiai vizsgálata alapján megállapítottuk, hogy a konjugációk nem, vagy csak jelentéktelen mértékben változtattak a fotofizikai tulajdonságokon. 18

4. KÍSÉRLETI RÉSZ 4.1. Általános A vegyszerek a Sigma-Aldrich, a Merck, az Alfa Aesar vagy a Fluka cégek termékei, azokat további tisztítás nélkül használtam. A VRK vizsgálatokhoz Kieselgel 60 F 254 -t használtam a Mercktől. Az oszlopkromatográfiát (szintén a Mercktől) Silica Gel 60-nal végeztem. A 1 H- és 13 C-NMR spektrumok Bruker Avance 250 és Varian Inova 600 MHz-es spektrométerekkel készültek. A kémiai eltolódás ( ) ppm-ben szerepel az oldószer jelét használva referenciának. A csatolási állandók (J) Hz-ben értendők. Felhasadások rövidítése: s (szinglett), d (dublett), t (triplett), q (kvintett), m (multiplett). IR-spektrumokat Bruker IFS 55 spektrométerrel vettem fel, a sávok hullámszámban cm -1 -ben értendők. A spektrofotometriás vizsgálatokat Perkin-Elmer Lambda 2S, Shimadzu UVmini 1240 és Varian Cary 50 spektrofotométereken, illetve Varian Eclipse és Jasco FP-6300 típusú spektrofluoriméteren mértem. 4.2. Vegyületek szintézise Klikk-kötésre alkalmas festékek szintézise 9 előállítása 0,93 g (10 mmol) 4-pikolint (7) és 6,05 g (30 mmol) 1,3-dijód-propánt 40 ml MeCNban refluxoltattam 4 órán át. Az acetonitril eltávolítása után 20 ml EtOAc-ot adtam a bepárlási maradékhoz. Állás során világossárga kristályok váltak ki. A terméket szűrtem, majd EtOH-ból átkristályosítottam. (3,39 g, 87%) Op = 126-128 C. 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): = 2,45 (2H, m); 2,61 (3H, s); 3,22 (2H, t, J = 7,1 Hz); 4,59 (2H, t, J = 7,0 Hz); 8,00 (2H, d, J = 6,2 Hz); 8,93 (2H, d, J = 6,3 Hz). 13 C-NMR (DMSO-d 6 ): = 1,30; 21,31; 33,76; 60,30; 128,28; 128,34; 143,75; 158,89. IR: (neat) = 1474; 1607; 1639; 2971; 3015 cm -1. HRMS (ESI): [M] + számolt C 9 H 13 IN + -re: 262,0087; mért: 262,0088. 19

10 előállítása 1,32 g (3,39 mmol) 9-t és 0,551 g (8,474 mmol) NaN 3 -ot 30 ml acetonitrilben refluxoltattam 24 órán keresztül. Az oldószer eltávolítása után 20 ml DCM-t adtam hozzá. A szilárd só (NaN 3 -felesleg, NaI) leszűrése és DCM-es mosása után a szűrletet bepároltam, ami után viszkózus barna olaj maradt vissza. Amennyiben az NMR vizsgálat alapján a reakció nem játszódott le teljesen, úgy a reakciót megismételtem. (0,875 g, 85%) 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): = 2,17 (2H, m); 2,61 (3H, s); 3,47 (2H, t, J = 6,5 Hz); 4,61 (2H, t, J = 7,1 Hz); 8,00 (2H, d, J = 6,3 Hz); 8,95 (2H, d, J = 6,5 Hz). 13 C-NMR (DMSO-d 6 ): = 21,35; 29,51; 47,44; 57,52; 128,28; 143,77; 158,88. IR: (neat) = 1472; 1516; 1639; 2093; 2939; 3012 cm -1. HRMS (ESI): [M] + számolt C 9 H 13 N + 4 -re: 177,1135; mért: 177,1133. 1 előállítása 0,213 g-ot (0,701 mmol) 10 és 0,104 g (0,701 mmol) 4-(dimetilamino)-benzaldehidet (11) 40 ml EtOH-ban kevertettem 60 C-on 10 órán át. A reakciót VRK-val követtem (eluens: MeCN, majd MeCN / NH 4 PF 6 ). A termék 365 nm-es gerjesztésnél narancssárgán fluoreszkált. A reakcióelegy bepárlását követően a terméket oszlopkromatográfiásan tisztítottam (SiO 2, MeCN / MeCN, NH 4 PF 6 ). A megfelelő frakciókat összeöntöttem, és fölös mennyiségű NH 4 PF 6 hozzáadása után eltávolítottam az oldószert. A maradékhoz vizet adtam, a kivált terméket szűrtem, vákuum alatt szárítottam. A termék intenzív bíbor színű kristályos anyag. (0,138 g, 43%) Op = 144-146 C. 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): = 2,16 (2H, t, J = 6,0 Hz); 3,02 (6H, s); 3,46 (3H, s); 4,49 (2H, t, J = 6,0 Hz); 6,78 (2H, d, J = 7,9 Hz); 7,17 (1H, d, J = 16,3 Hz); 7,60 (2H, d, J = 8,4 Hz); 7,92 (1H, d, J = 16,3 Hz); 8,05 (2H, d, J = 5,5 Hz); 8,75 (2H, d, J = 5,8 Hz). 13 C- NMR (DMSO-d 6 ): = 29,83; 40,03; 47,97; 57,25; 112,31; 117,41; 122,73; 122,80; 130,58; 142,66; 143,96; 152,31; 154,24. IR: (neat) = 1529; 1585; 1645; 2099; 2919; 3096 cm -1. HRMS (ESI): [M] + számolt C 18 H 22 N + 5 -re: 308,1870; mért: 308,1866. 2 előállítása 50 mg (0,110 mmol) 1-hez 100 mg (0,300 mmol ekvivalens) hordozóhoz kötött PPh 3 -t tettem 10 ml DCM-ben. 1 óra után 1 ml vizet adtam a reakcióelegyhez, majd éjszakán át kevertettem. Miután az összes kiindulási anyag redukálódott, Celiten szűrtem, majd a szűrletet bepároltam (43 mg, 91%). A nyersterméket (12), mint intermediert, további tisztítás és karakterizálás nélkül vittem a következő reakcióba. 20

Az előző reakció nyerstermékét (12) feloldottam 10 ml MeCN-ben és 35 mg (0,0936 mmol) HBtU, 16 mg (0,103 mmol) HOBt. H 2 O jelenlétében 25 mg (0,103 mmol) 12-t adtam hozzá 36 ml EDIPA-val. 14 órás kevertetés után bepároltam a reakcióelegyet, és oszlopkromatográfiásan tisztítottam (SiO 2, MeCN), a termék vörös kristályos anyag (35 mg, 70 %). 1 H-NMR (CDCl 3 ): = 1,38-1,41 (1H, m); 1,53-1,61 (1H, m); 1,71-1,83 (3H, m); 1,84-2,01 (3H, m); 2,06-2,14 (2H, m); 2,28 (2H, m); 2,52-2,61 (1H, m); 2,62-2,71 (2H, m); 3,03 (6H, s); 3,50 (2H, m); 4,38 (2H, m); 6,68 (2H, d, J = 7,9 Hz); 6,76 (1H, d, J = 15,8 Hz); 7,02 (1H, bs); 7,22 (2H, d, J = 6,6 Hz); 7,43-7,50 (3H, m); 7,64 (2H, d, J = 4,8 Hz); 7,70 (2H, d, J = 6,6 Hz); 8,36 (2H, d, J = 4,8 Hz). 13 C-NMR (CDCl 3 ): = 23,5; 31,0; 32,6; 33,3; 37,4; 39,1; 39,2; 42,7; 42,9; 44,4; 60,8; 97,5; 99,1; 114,9; 119,0; 125,2; 129,7; 131,8; 133,3; 133,9; 145,4; 145,6; 147,2; 154,8; 157,0; 170,9; 170,7. HRMS (ESI): [M + ] számolt C 34 H 40 N 3 O + -ra: 506,3171; mért: 506,3176. 15 előállítása [11b] A reakciót inert körülmények között, Ar alatt végeztem, és vízmentes THF-et használtam. 1,76 g (14,0 mmol) ciklooktanon (13) 20 ml-es THF-es oldatát -78 C-ra hűtöttem, lassan hozzácsepegtettem 15,4 mmol LDA THF-es frissen készített oldatát (2,17 ml, 15,4 mmol DIPA 20 ml THF-ben + 6,72 ml 2,3 M HexLi, 15,4 mmol hexános oldata). Egy óra kevertetés után hozzáadtam 3,53 g (15,4 mmol) brómmetil-benzoesav-metilészter 10 ml THF-el készült oldatát, majd hagytam szobahőmérsékletre melegedni. 30 perc kevertetés után 10 ml víz hozzáadásával állítottam le a reakciót. Az oldószert rotációs vákuumbepárlón eltávolítottam, a bepárlási maradékot 100 ml EtOAc-ban oldottam, választótölcsérben 3x100 ml vízzel és 1x50 ml telített NaCl-oldattal mostam, MgSO 4 -on szárítottam. A leszűrt oldatot bepároltam, majd oszlopkromatográfiásan tisztítottam (SiO 2, Hex:EtOAc = 50:1 9:1). A termék színtelen olaj, ami állás közben megszilárdul (2,81 g, 73%). 1 H-NMR (CDCl 3 ): = 1,07-2,33 (12H, m); 2,62 (1H, dd, J 1 = 12,2 Hz, J 2 = 5,6 Hz); 2,88-3,07 (2H, m); 3,87 (3H, s); 7,18 (2H, d, J = 8,2 Hz); 7,90 (2H, d, J = 8,2 Hz). 13 C-NMR (CDCl 3 ): = 24,6; 24,7; 25,2; 27,8; 33,0; 38,2; 43,3; 51,6; 52,0; 128,2; 129,1; 129,8; 145,7; 167,1; 218,83. 21

16 előállítása [11b] A reakciót inert körülmények között, Ar alatt végeztem, és vízmentes THF-et használtam. 60 ml THF-ben 2,69 g (9,80 mmol) 15-höz 21,6 ml (10,8 mmol) KHMDS-t (0,5 M toluolos oldat) adtam -78 C-on. 1 óra kevetetés után 3,86 g (10,8 mmol) Tf 2 NPh 25 ml-es THF-es oldatát adtam, majd hagytam szobahőmérsékletre melegedni. 30 perc kevertetés után bepároltam, a maradékot közvetlenül oszlopkromatográfiával tisztítottam (SiO 2, Hex:EtOAc = 20:1 12:1). A termék színtelen olaj (3,29 g, 83 %). 1 H-NMR (CDCl 3 ): = 1,20-1,90 (8H, m); 1,93-2,12 (1H, m); 2,12-2,28 (1H, m); 2,72 (1H, dd, J 1 = 13,5 Hz, J 2 = 7,0 Hz); 2,94-3,02 (1H, m); 3,05-3,17 (1H, m); 3,90 (3H, s); 5,75 (1H, t, J = 8,77 Hz); 7,26 (2H, d, J = 8,2 Hz); 7,97 (2H, d, J = 8,4 Hz). 13 C-NMR (CDCl 3 ): = 25,4; 26,0; 26,7; 30,0; 33,5; 37,6; 40,0; 52,2; 118.7 (q, J = 317,6 Hz); 121,4; 128,5; 129,0; 129,9; 145,0; 151,2; 167,1. 17 előállítása [11b] A reakciót inert körülmények között, Ar alatt végeztem, és vízmentes THF-et használtam. 3,29 g (8,10 mmol) 16 45 ml-es THF-es oldatához LDA (DIPA + HexLi THFben) oldatát csepegtettem -78 C-on, míg a VRK-s követés (Hex:EtOAc = 9:1) alapján a kiindulási anyag (16) el nem fogyott. A reakciót 10 ml víz hozzáadásával állítottam le, majd a THF-et eltávolítottam. A maradékot 100 ml EtOAc-ban oldottam, választótölcsérben 3x100 ml vízzel és 1x50 ml telített NaCl-os oldattal mostam, majd MgSO 4 felett szárítottam. Az oldat bepárlását követően a terméket oszlopkromatográfiásan tisztítottam (SiO 2, Hex:EtOAc = 20:1 9:1). A termék szintén színtelen olaj (500 mg, 24%). 1 H-NMR (CDCl 3 ): = 1,42-2,19 (10H, m); 2,63-2,80 (3H, m); 3,89 (3H, s); 7,28 (2H, d, J = 8,2 Hz); 7,95 (2H, d, J = 8,5 Hz). 13 C-NMR (CDCl 3 ): = 20,9; 28,6; 30,1; 34,9; 36,6; 40,5; 41,8; 52,1; 95,1; 96,2; 128,2; 129,1; 129,7; 145,8; 167,3. 13 előállítása [11b] 500 mg (1,951 mmol) 17-ot feloldottam 24 ml dioxánban, és 6 ml vizet adtam hozzá, majd 1,71 g LiOH. H 2 O-t. 3 órán át 50 C-on melegítettem, majd a dioxánt eltávolítottam. A bepárlási maradékot 100 ml EtOAc-ban oldottam, választótölcsérben 3x50 ml 1 N HCloldattal, 3x50 ml vízzel és 2 x50 ml telített NaCl-oldattal mostam, majd MgSO 4 felett szárítottam. Az oldatot bepároltam, és az így nyert halványsárga-fehér szilárd anyagot hexánnal mostam, míg fehér kristályos anyagot nem kaptam (354 mg, 75%). 22

3 előállítása 302 mg (1,120 mmol) danzil-kloridot (18) 303 mg (1,485 mmol) 1-amino-3-bróm-etánhidrobromiddal 30 ml DCM-ben reagáltattam 0,46 ml (3,300 mmol) TEA jelenlétében 2 órán át. Az oldószert eltávolítottam, vákuumban szárítottam (sárga szilárd anyag) (19). A reakció VRK-val követhető (Hex:EtOAc = 3:1). További tisztítás és karakterizálás nélkül vittem a következő reakcióba. 40 ml MeCN-ben oldottam és 364 mg NaN 3 -ot hozzáadva 24 órán át refluxoltattam. A reakció teljes lejátszódását VRK-val követtem (Hex:EtOAc = 5:1). Oldószert eltávolítottam, DCM-ben oldottam, vízzel mostam, MgSO 4 -on szárítottam, majd oszlopkromatográfiával tisztítottam (SiO 2, Hex:EtOAc = 10:1 5:1). A termék zöldessárga olaj (236 mg, 66%). 1 H-NMR (CDCl 3 ): = 2,89 (6H, s); 3,01-3,07 (2H, m); 3,27 (2H, t, J = 5,8 Hz); 5,08 (1H, t, J = 5,8 Hz); 7,20 (1H, d, J = 7,3 Hz); 7,52 (1H, dd, J 1 = 7,3 Hz, J 2 = 8,8 Hz); 7,59 (1H, dd, J 1 = 7,3 Hz, J 2 = 8,8 Hz); 8,24 8,28 (2H, m); 8,56 (1H, d, J = 8,8 Hz). 13 C-NMR (CDCl 3 ) = 42,2; 45,2; 50,7; 115,2; 118,4; 123,0; 128,5; 129,3; 129,7; 130,5; 144,4; 151,9; 171,1. IR: (neat) = 3290, 2940, 2832, 2787, 2099, 1572, 1309, 1140 cm -1. HRMS (ESI): [M+H] + számolt C 14 H 18 N 5 O 2 S + -ra: 320,1181; mért: 320,1178. 4 előállítása 127 mg (0,398 mmol) 3-hoz 317 mg (0,953 mmol ekvivalens) hordozóhoz kötött PPh 3 -t adtam 10 ml DCM-ben. 1 óra kevertetés után 1 ml vizet öntöttem a reakcióelegybe, majd egy éjszakán át kevertettem szobahőmérsékleten. A reakció VRK-val követhető (Hex:EtOAc bármilyen arányú elegyével, mert a termék a felcseppentés helyén leragad). Teljes lejátszódás után az elegyet Celiten szűrtem, DCM-mel mostam, bepároltam, vákuumon szárítottam. Sárga kristályos anyagot kaptam (106 mg, 91%) (20), amit további tisztítás és karakterizálás nélkül vittem a következő reakcióba. 22,0 mg (0,0750 mmol) 20 és 18 mg (0,0750 mmol) 13 5 ml MeCN-ben készült oldatához 27,0 mg (0,0712 mmol) HBtU-t, 11,5 mg (0,0750 mmol) HOBt. H 2 O-t és 24 l (0,1364 mmol) EDIPA-t adtam. Egy éjszakán át kevertettem szobahőmérsékleten, közben többször VRK-val követtem (Hex:EtOAc = 1:1), majd az oldószer eltávolítása után oszlopkromatográfiásan tisztítottam (SiO 2, Hex:EtOAc = 1:1). A termék sárga kristályos anyag (34 mg, 88%). 23

1 H-NMR (CDCl 3 ): = 1,29-1,41 (2H, m); 1,47-1,59 (1H, m); 1,62-1,94 (5H, m); 2,05-2,11 (2H, m); 2,54-2,67 (3H, m); 2,78 (6H, s); 3,03 (2H, dd, J 1 = 6,0 Hz, J 2 = 10,4 Hz); 3,38 (2H, dd, J 1 = 6,0 Hz, J 2 = 10,4 Hz); 5,95 (1H, t, J = 6,0 Hz); 6,81 (1H, t, J = 5,5 Hz); 7,04 (1H, d, J = 7,1 Hz); 7,08 (2H, d, J = 8,2 Hz); 7,34-7,43 (2H, m); 7,48 (2H, d, J = 8,4 Hz); 8,14 (1H, dd, J 1 = 1,1 Hz, J 2 = 7,3 Hz); 8,19 (1H, d, J = 8,7 Hz); 8,43 (1H, d, J = 8,5 Hz). 13 C-NMR (CDCl 3 ): = 22,6; 28,4; 29,9; 34,7; 36,5; 39,7; 40,1; 41,6; 43,0; 45,3; 94,8; 96,3; 115,2; 118,5; 123,1; 127,0; 128,5; 128,9; 129,4; 129,5; 129,8; 130,5, 131,5; 134,3; 144,1, 151,9; 168,0. HRMS (ESI): [M+H] + számolt C 30 H 36 N 3 O 3 S + -ra: 518,2477; mért: 518,2471. 22 előállítása [19] 500 mg (2,30 mmol) 21 julolidin-származékhoz 1,136 g (2,74 mmol) trifenilfoszfónium-ecetsav-metilészter bromid sót adtam 409 l (2,73 mmol) DBU jelenlétében 10 ml DMSO-ban. 20 perces forralás után szobahőmérsékletre hűtöttem, majd aprított jégre öntöttem. A vizes elegyet négyszer extraháltam DCM-mel. Az egyesített szerves fázisokat kétszer mostam vízzel, MgSO 4 felett szárítottam, VRK-val (Hex:EtOAc = 1:1) ellenőriztem az összetételt. Az oldószer eltávolítása után kromatográfiásan tisztítottam (SiO 2, Hex:EtOAc = 3:1 1:1). A termék piszkossárga kristályos anyag (333 mg, 60 %). 1 H-NMR (CDCl 3 ): = 1,96 (4H, m); 2,74 (2H, t, J = 6,5 Hz); 2,87 (2H, t, J = 6,3 Hz); 3,24 (4H, m); 5,97 (1H, d, J = 9,2 Hz); 6,83 (1H, s); 7,45 (1H, d, J = 9,16 Hz). 13 C-NMR (CDCl 3 ): = 20,2; 20,5; 21,4; 27,4; 49,6; 50,0; 106,7; 108,2; 108,3; 118,2; 124,9; 144,0; 145,9; 151,7; 162,7. 23 előállítása 0,4 ml POCl 3 és 0,4 ml DMF elegyét 30 percig kevertettem Ar alatt. 314 mg (1,301 mmol) 22 3 ml DMF-el készült oldatát öntöttem hozzá, majd 2 órát kevertettem tovább 60 C-on. A reakciót VRK-val követtem (Hex:EtOAc = 1:1). A reakcióelegyet kb. 30 ml jégvíz elegyre öntöttem, majd szilárd NaOH adagolásával semlegesítettem. DCM-es extrakció után (az oldószer eltávolítását követően) oszlopkromatográfiásan tisztítotam (SiO 2, Hex:EtOAc = 2:1 1:1). A termék bordó kristályos anyag (148 mg, 42 %). 1 H-NMR (CDCl 3 ): = 1,96 (4H, m); 2,74 (2H, t, J = 6,0 Hz); 2,86 (2H, t, J = 6,4 Hz); 3,36 (4H, m); 6,95 (1H, s); 8,09 (1H, s); 10,07 (1H, s). 13 C-NMR (CDCl 3 ): = 19,9; 20,0; 20,9; 27,3; 50,0; 50,4; 106,1; 108,1; 112,9; 119,9; 128,3; 145,0; 149,4; 153,8; 162,3; 188,0. 24

25 előállítása 1,00 g (5,12 mmol) 3-szulfo-4-pikolint (24) 20 ml MeCN és 15 ml DMF elegyében oldottam fel. 2,13 g (10,98 mmol) 5-jód-pent-1-int adtam hozzá, majd a reakcióelegyet 24 órán át refluxoltattam, A reakciót VRK-val követtem (DCM:MeOH = 9:1 + pár csepp TEA). Az oldószer elpárologtatása után a kapott piszkossárga nyersterméket oszlopkromatográfiásan tisztítottam (SiO 2, DCM:MeOH:TEA = 9:1:0 9:1:0,3). A termék sötétzöld kristályos anyag, valószínűleg só szennyezővel együtt (összesen 1,758 g (143%)), mivel az NMR-mérés alapján tiszta volt. 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): = 2,08 (2H, m); 2,25 (2H, td, J 1 = 6,6 Hz, J 2 = 2,2 Hz); 2,79 (3H, s); 2,84 (1H, t, J = 2,6 Hz); 4,62 (2H, t, J = 7,0 Hz); 7,99 (1H, d, J = 6,3 Hz); 8,88 (1H, d, J = 6,3 Hz); 9,09 (1H, s). 5 előállítása 15 ml EtOH-ban föloldottam 100 mg (0,371 mmol) 23-t és 165 mg (0,690 mmol, fölöslegben, mert nem volt oldószer mentes) 25-t, majd 4-5 csepp piperidint adtam hozzá. Egy éjszakán át kevertettem 60 C-on, közben VRK-val követtem (DCM:MeOH = 9:1 + pár csepp TEA), majd a bepárolt reakcióelegyet először oszlopkromatográfiásan tisztítottam (SiO 2, DCM:MeOH = 12:1 9:1), utána pedig VRK-szilikagéles tölcsérbe helyezve rendre: éterrel, EtOAc-tal, DCM-mel mostam, mivel egyikben sem fut a termék, végül DCM:MeOH = 9:1 eluenssel oldottam le. A termék mélylila színű kristályos anyag (88 mg, 48 %). 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): = 1,81-1,98 (4H, m); 2,01-2,16 (2H, m); 2,20-2,32 (2H, m); 2,67-2,82 (4H, m); 2,84-2,93 (3H, m); 4,55 (2H, t, J = 7,5 Hz); 7,22 (1H, s); 7,77 (1H, d, J = 16,3 Hz); 8,03 (1H, s); 8,29 (1H, d, J = 16,3 Hz); 8,38 (1H, d, J = 7,3 Hz); 8,76 (1H, d, J = 7,9 Hz); 9,04 (1H, s). 26 előállítása 700 mg (3,59 mmol) 3-szulfo-4-pikolint (24) 30 ml MeCN és 30 ml DMF elegyében oldottam fel. 4,245 g (14,35 mmol) 1,3-dijód-propánt adtam hozzá, majd egy napon át refluxoltattam, VRK-val követtem (DCM:MeOH = 9:1 + pár csepp TEA). Az oldószer elpárologtatása után a kapott nyersterméket oszlopkromatográfiásan tisztítottam (SiO 2, DCM:MeOH = 10:1 9:1). A termék citromsárga kristályos anyag, kevés oldószer (MeOH) és valószínűleg só szennyezővel együtt (összesen 1,469 g, 120%), mivel az NMR-mérés alapján az oldószeren kívül mást nem tartalmazott. 25

1 H-NMR (DMSO-d 6 ): = 2,41 (2H, m); 2,78 (3H, s); 3,21 (2H, t, J = 7,2 Hz); 4,60 (2H, t, J = 7,3 Hz); 8,01 (1H, d, J = 6,3 Hz); 8,90 (1H, dd, J 1 = 6,2 Hz, J 2 = 1,4 Hz); 9,08 (1H, s). 27 előállítása 1,077 g (3,157 mmol) 26-t 30 ml MeCN és 5 ml DMF elegyében oldottam fel (némi melegítés segítségével). 0,821 g (12,627 mmol) NaN 3 sót adtam hozzá, és egy napig refluxoltattam, a reakciót VRK-val követtem (DCM:MeOH = 9:1). Szobahőmérsékletre való hűtés után Celiten leszűrtem a kiváló csapadékot, majd eltávolítottam az oldószert: 1,668 g (206%). A termék tisztaságát 1 H-NMR-spektroszkópiával ellenőriztem: kb. 40 m/m%-ban tartalmazza a kívánt terméket, a maradékban DMF oldószert, és a kiindulási anyag nem volt kimutatható ezzel a módszerrel. Tehát a termék 667 mg (82%). 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): = 2,11 (2H, m); 2,74 (3H, s); 3,40 (2H, t, J = 7,5 Hz); 4,59 (2H, t, J = 6,6 Hz); 7,98 (1H, d, J = 6,3 Hz); 8,88 (1H, d, J = 5,1 Hz); 9,06 (1H, s). 6 előállítása 17 ml EtOH-ban föloldottam 125 mg (0,464 mmol) 23-t és 375 mg (150 mg (0,585 mmol) ekvivalens tiszta 27) oldószeres 27-t, majd 4-5 csepp piperidint adtam hozzá. Egy éjszakán át kevertettem 60 C-on, közben a reakciót VRK-val követtem (DCM:MeOH = 9:1 + pár csepp TEA). A reakcióelegy bepárlását követően a terméket először oszlopkromatográfiásan tisztítottam (SiO 2, DCM:MeOH = 12:1 9:1), utána pedig VRKszilikagéles tölcsérbe helyezve DCM-mel mostam, majd DCM:MeOH = 9:1 oldószereleggyel eluáltam. A termék mélylila színű kristályos anyag (188 mg, 80 %). 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): = 1,81-1,96 (4H, m); 2,10-2,20 (2H, m); 2,20-2,25 (2H, m); 2,68-2,81 (4H, m); 2,96-3,05 (2H, m); 3,40 (2H, m); 4,56 (2H, t, J = 7,42 Hz); 7,23 (1H, s); 7,77 (1H, d, J = 16,1 Hz); 8,04 (1H, s); 8,28 (1H, d, J = 16,3 Hz); 8,39 (1H, d, J = 6,5 Hz); 8,78 (1H, d, J = 7,1 Hz); 9,06 (1H, s). A jelölt biomonomerek szintézise Általános eljárás az adduktok szintézisére: az azid vagy alkin funkciós csoportot tartalmazó fluorofórt (1 ekv.) és a módosított biomonomert (1,1 ekv.) MeCN-víz (50 v/v%) keverékében szobahőmérsékleten kevertettem 10% CuI és 20% TEA jelenlétében 16 órán át. A termékeket vagy egyszerű szűréssel vagy oszlopkromatográfiásan (SiO 2 ) tisztítottam. 26

Ciklooktin (13) funkciós csoportot tartalmazó fluorofórok esetében CuI és TEA nélkül kiviteleztem a reakciót. 29: (82%). 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): = 1,29, 1,30, 1,31, 1,32 (18H, s); 2,30-2,36 (2H, m); 2,65-2,85 (2H, m); 3,00 (6H, s); 3,85-3,94 (1H, m); 4,15-4,23 (1H, m); 4,26-4,34 (1H, m); 4,39-4,49 (2H, m); 4,87-4,94 (1H, m); 5,00-5,05 (1H, m); 6,69 (2H, d, J = 8,1 Hz); 6,73 (1H, d, J = 8,5 Hz); 6,75 (1H, dd, J = 8,5 Hz, J = 19,2 Hz); 6,90 (1H, m); 7,04-7,14 (4H, m); 7,55 (2H, d, J = 8,9 Hz); 7,86 (1H, d, J = 16,2 Hz); 7,93-8,01 (2H, m); 8,60-8,70 (2H, m). 13 C-NMR (DMSO-d 6 ): = 30,7; 30,9; 31,2; 33,4; 38,7; 43,2; 48,4; 59,4; 63,6; 81,2; 83,4; 115,0; 117,1; 120,0; 125,4; 125,5; 133,2; 133,3, 133,4, 145,5; 146,5; 146,7; 147,4; 155,1; 157,0, 158,5; 159,3; 174,3. HRMS (ESI): [M] + számolt C 39 H 51 N 6 O + 5 -ra: 683.3920; mért: 683.3905. 31: (95%) 1 H-NMR (DMSO-d 6 ): = 1,88 (3H, s); 1,93 (3H, s); 1,97 (3H, s); 2,01 (3H, s); 2,30-2,40 (1H, m); 3,10 (6H, s); 3,90-4,10 (3H, m); 4,10-4,25 (2H, m); 4,40-4,50 (3H, m); 4,55-4,68 (2H, m); 4,72-4,94 (3H, m); 5,2-5,27 (1H, m); 6,76 (1H, dd, J = 5,2 Hz, J = 8,6 Hz); 6,78 (1H, d, J = 8,6 Hz); 6,95-7,19 (2H, m); 7,55 (1H, dd, J = 4,9 Hz, J = 8,6 Hz); 7,6 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,85-7,95 (1H, m); 7,99-8,08 (2H, m); 8,65-8,75 (2H, m). 13 C-NMR (DMSO-d 6 ): = 20,0; 20,1; 20,2; 20,3; 30,4; 39,5; 46,2; 56,2; 56,5; 61,5; 61,8; 67,9; 70,5; 70,7; 71,9; 98,5; 111,8; 116,9; 122,2; 124,2; 130,0; 142,2; 143,2; 143,4; 151,8; 153,7; 168,9; 169,1; 169,4; 169,9. 32: (83%). Két regioizomer keveréke 67-33%. 1 H NMR (DMSO-d 6 ): = 1,00-1,11 (1H, m); 1,30-1,55 (5H, m); 1,66-1,74 (1H, m); 1,81, 1,83 (3H, s, regioizomerek); 2,55-2,77 (3H, m); 2,81 (6H, s); 2,83-2,86 (1H, m); 2,90-2,94 (2H, m); 2,98, 3,08 (1H, dd, J 1 = 7,6 Hz, J 2 = 13,5 Hz, regioizomerek); 3,23-3,28 (3H, m); 3,36-3,40 (1H, m); 3,49-3,62 (1H, m); 3,64-3,72 (1H, m); 4,18 (1H, dq, J 1 = 3,5 Hz, J 2 = 12,3 Hz); 5,03-5,11 (1H, m); 5,30 (1H, dt, J 1 = 4,7 Hz, J 2 = 17,6 Hz); 6,42-6,54 (1H, m); 7,12-7,23 (2H, m); 7,32 (1H, d, J = 7,0 Hz); 7,53-7,65 (4H, m); 7,71, 7,78 (1H, s, regioizomerek); 8,03-8,07 (1H, m); 8,09-8,11 (1H, m); 8,25-8,33 (2H, m); 8,43-8,45 (1H, m); 11,33, 11,35 (1H, s, regioizomerek). HRMS (ESI): [M+H] + számolt C 37 H 49 N 8 O 7 S + -ra: 785,3445; mért: 785,3419. 27

5. ÖSSZEFOGLALÁS, TÁVLATI TERVEK Az elvégzett munka eredményeiből láthatjuk, hogy az előállított jelzővegyületek közül mindegyik alkalmas biológiai képletek fluoreszcens jelölésre. A vegyületek közül külön kiemelendő a 2 vegyület, amely nem igényel átmenetifém katalízist a konjugációhoz. Modellkísérletekben igazoltuk, hogy jelzővegyületeink igen jó hatásfokkal kapcsolódnak a célmolekulákhoz. Azon kísérleteink, amelyek arra irányultak, hogy a gyűrű kimerevítésével a kvantumhasznosítási tényező növekedését érjük el, sajnos nem vezettek eredményre. Viszont a merevebb szerkezetű származékoknál (5 és 6) az emissziós spektrum vöröseltolódását figyeltük meg, amit pozitív eredményként értékelhetünk. Kísérleteink rámutattak arra, hogy ezen jelzővegyületek módosított biomonomerekre köthetők. Ezen monomerek akár szintetikusan, akár az élő szervezetek metabolizmusát felhasználva a jelölni kívánt biopolimerbe juttathatók. Munkánk eredményeképpen a dolgozatban szereplő molekulák nagy részéből (1,2,3,4) közlemény is megjelent. [20] Fontos megemlíteni azt is, hogy az itt előállított fluoreszcens jelzővegyületek egy része immár kereskedelmi forgalomban is kapható (Luminochem Kft.). További lehetőségek a fluoreszcens jelölő molekulák felhasználására: (i) több fluorofórból álló rendszerek kölcsönhatásaiból nyerhető információk: FRET (Förster Resonance Energy Transfer) rendszerek, illetve (ii) fluoreszcencián alapuló szenzorok kifejlesztése, (iii) biokémiai, immunológiai vizsgálatok. További terveim között szerepel új NIR-fluorofórok kifejlesztése és vizsgálata. 28

6. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretném köszönetemet nyilvánítani témavezetőmnek, Dr. Kele Péternek a mindenre kiterjedő segítségéért, Nagy Krisztának a laboratóriumi munka terén nyújtott tanácsaiért és a csoport összes többi tagjának a támogatásukért, segítségükért, bíztatásukért és lelkesítésükért. Külön köszönet a spektroszkópiai mérésekben nyújtott segítségükért a Universität Regensburg munkatársai közül Prof. Dr. Otto S. Wolfbeisnek, Daniela E. Achatznak és Martin Linknek. 29

7. IRODALOMJEGYZÉK [1] S. T. Laughlin, J. M. Baskin, S. L. Amacher, C. R. Bertozzi, Science 2008, 320, 664-667. [2] a) J. A. Prescher, C. R. Bertozzi, Nat. Chem. Biol. 2005, 1, 13-21. b) P. V. Chang, J. A. Prescher, M. J. Hangauer, C. R. Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 8400-8401. c) K. L. Kiick, E. Saxon, D. A. Tirrell, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99(1), 19-24. d.) Kurpiers, T.; Mootz, H. D., Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 1729-1732. e.) M. D. Best, Biochemistry, 2009, 48, 6571 6584. [3] E. Saxon, C. R. Bertozzi, Science, 2007, 287, 2007-2010. [4] R. Huisgen, Proceedings of the Chemical Society of London, 1961 357-396. [5] a) V. V. Rostovtsev, L. G. Green, V. V. Fokin, K. B. Sharpless. Angew. Chem. Int. Ed., 2002, 41, 2596-2599. b) C. W. Tornøe, C. Christensen, M. Meldal, J. Org. Chem., 2002, 67, 3057 3064. [6] a) J. M. Baskin, J. A. Prescher, S. T. Laughlin, N. J. Agard, P. V. Chang, I. A. Miller, A. Lo, J. A. Codelli, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104, 16793-16797. b) X. Ning, J. Guo, M. A. Wolfert, G-J. Boons, Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 2253-2255. [7] B. Valeur, Molecular Fluorescence Principles and Applications, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, 2002. [8] A. G. Szabo, Fluorescence principles and measurement in Spectrophotometry and Spectrofluorimetry (2nd Edition), Oxford University press, Oxford, 2000, 33-67. [9] H. C. Kolb, M. G. Finn, and K. B. Sharpless, Angew. Chem. Int. Ed., 2001, 40, 2004-2021. 30

[10] J. E. Moses, A. D. Moorhouse, Chem. Soc. Rev., 2007, 36, 1249 1262. [11] a) N. J. Agard, J. A. Prescher, C. R. Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047. b) N. J. Agard, J. M. Baskin, J. A. Prescher, A. Lo, C. R. Bertozzi, ACS Chem. Biol. 2006, 1, 644-648. c) E. M. Sletten, C. R. Bertozzi Org. Lett. 2008, 10, 3097-3099. [12] K. Chenoweth, D. Chenoweth, W. A. Goddard III, Org. Biomol. Chem., 2009, 7, 5255-5258. [13] a) W. Song, Y. Wang, J. Qu, M. M. Madden, Q. Lin, Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 2832-2835. b) W. Song, Y. Wang, J. Qu, Q. Lin, J. Am. Chem. Soc., 2008, 130, 9654 9655. [14] A. Hantzsch, M. Lehmann, Chem. Ber., 1900, 33, 3668-3685 [15] C. J. Tai, L. Yang, N. L. Allinger, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 11906-11917. [16] R. A. Carbon, R. V. Lindsey, J. Am. Chem. Soc., 1959, 81, 4342-4346. [17] J. Sauer, G. Heinrichs, Tetrahedron Lett., 1966, 41, 4979-4984. [18] N. K. Devaraj, R. Weissleder, S. A. Hilderbrand, Bioconjugate Chem., 2008, 19, 2297-2299. [19] G. A. Lemieux, C. L. de Graffenried, C. R. Bertozzi, J. Am. Chem. Soc., 2003, 125(16), 4708-4709. [20] P. Kele, X. Li, M. Link, K. Nagy, A. Herner, K. Lőrincz, Sz. Béni, O. S. Wolfbeis, Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 3486-90. 31