MONOLISA Total Anti HAV PLUS 2 lemez - 192 vizsgálat 72481

MONOLISA Total Anti HAV PLUS 2 lemez - 192 vizsgálat 72481 KÉSZLET A HAV ELLENI ÖSSZES ELLENANYAG KIMUTATÁSÁRA ÉS MEGHATÁROZÁSÁRA SZÉRUM/PLAZMA MINTÁKBAN ENZIM-IMMUNOASSAY VIZSGÁLATTAL In vitro diagnosztikai célra Gyártói minőségellenőrzés Minden általunk gyártott és forgalomba hozott termék minőségellenőrzési rendszer keretén belül készült, a nyersanyag átvételétől kezdve a forgalmazásig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megtalálható a Bio-Radnál

TARTALOMJEGYZÉK 1. RENDELTETÉS 2. A VIZSGÁLAT ELVE 3. A KÉSZLET ÖSSZETÉTELE 4. SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK 5. EGÉSZSÉGVÉDELMI ÉS BIZTONSÁGI UTASÍTÁSOK 6. ÓVINTÉZKEDÉSEK 7. MINTÁK 8. A REAGENSEK REKONSTITÚCIÓJA - SZAVATOSSÁG - TÁROLÁS 9. A MÉRÉS MENETE: MINŐSÉGI ÉS MENNYISÉGI VIZSGÁLATI MÓDSZEREK 10. RENDSZER-ALKALMAZÁSOK 11. AZ EREDMÉNYEK KISZÁMÍTÁSA ÉS ÉRTELMEZÉSE: KVALITATÍV MÓDSZER 12. AZ EREDMÉNYEK KISZÁMÍTÁSA ÉS ÉRTELMEZÉSE: MENNYISÉGI MÓDSZER 13. A MINTÁK ÉS REAGENSEK PIPETTÁZÁSÁNAK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE (OPCIONÁLIS) 14. TELJESÍTMÉNY 15. VIZSGÁLAT KORLÁTAI 16. IRODALOMJEGYZÉK 2

1 RENDELTETÉS A MONOLISA Total anti-hav PLUS egy enzim-immunoassay készlet az anti-hav össz-ellenanyag kimutatására és meghatározására humán szérumban vagy plazmában. A készlet a kiújuló vagy fennálló hepatitis A vírus (HAV) fertőzés diagnosztizálása szolgál. A készlet alkalmas az immunállapot vakcinálás előtti megállapítására, és a HAV elleni oltás utáni védettség vizsgálatára. A HAV elleni vakcinálás után az anti-hav antitestek mintegy 2 hét után, és ezt követően általában évekig kimutathatóak. Az anti-hav szintek meghatározásának standardizálását a WHO "Anti-Hepatitis A Immunoglobulin 2nd International Standard, 1988" alapján végezték. A készítmény értékét milli-nemzetközi egység/mlben (miu/ml) fejezték ki. Általában a 20 miu/ml koncentrációt tekintjük a HAV fertőzéssel szembeni garantált immunitás küszöbértékének. Ezért a 20 miu/ml-es (az Egészségügyi Világszervezet Anti-Hepatitis A Immunglobulin 2. Nemzetközi Standard, 1998 -ra beállított) standard átlagos abszorbanciáját használjuk Cut-Off értéknek. 2 - A VIZSGÁLAT ELVE A vizsgálat inhibíciós enzimes immuno-assay módszeren alapul, amelynek során HAV elleni egér monoklonális antitestekkel bevont mikrolemezeket, HAV antigént, betegmintákat, majd tormaperoxidázzal jelölt, HAV elleni egér monoklonális anitestet tartalmazó enzimes tracert alkalmazunk. 1. Az első inkubáció ideje alatt a mintákat (vagy kontrollokat) és HAV antigént együtt inkubálják 1 órán át 37 C hőmérsékleten. Amennyiben anti-hav ellenanyag van jelen a mintában, ezek az antitestek komplexet képeznek a HAV antigén reagenssel, így az antigén nem tud kötődni a szilárd fázisban lévő antitestekhez (mikrolemez). 2. Az első inkubálás végén mosással eltávolítjuk a megkötetlen mintát és HAV antigént, valamint az oldható HAV/anti-HAV komplexeket. 3. Minden tesztlyukhoz torma-peroxidázzal jelölt egér monoklonális HAV antitestet adunk, majd 1 órán át 37 C hőmérsékleten inkubáljuk. A szilárd fázishoz a HAV részecskéken keresztül kötődött enzim tracer mennyisége, és az ennek megfelelő enzimaktivitás fordítottan arányos a mintában vagy kontrollban jelenlévő anti-hav ellenanyagok mennyiségével. 4. Az enzim tracer feleslegét mosással eltávolítjuk, majd TMB kromogén/szubsztrátum oldatot adunk minden üreghez. 5. 30 perces inkubálás után szobahőmérsékleten, a reakciót leállítjuk, a mintát spektrofotometriásan leolvassuk a 450/620-700 nm hullámhosszon. Egyetlen minta abszorbanciájának mérése lehetővé teszi az anti-hav össz-antitest kimutatását és mennyiségi meghatározását a vizsgált mintában. 3

3 A KÉSZLET ÖSSZETÉTELE Címke A reagensek fajtája Kiszerelés R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8 Mikrolemez 12 csík, egyenként 8 tesztlyukkal, anti-hav monoklonális antitestekkel bevonva Mosóoldat 20x koncentrált Tris NaCl puffer, ph 7,4, 1% Tween 20 oldatot tartalmaz Tartósítószer: Proclin, 0,04% Negatív kontroll Humán szérum, negatív anti-hav antitestekre, HBs antigénre, anti-hcv antitestekre és anti-hiv 1-2 antitestekre. Tartósítószer: Nátrium-azid (< 0,1%) Pozitív standard 20 miu/ml Anti-HAV ellenanyagra pozitív és HBs antigénre, anti-hcv antitestekre és anti-hiv 1-2 antitestekre negatív humán szérum, anti-hav antitestekre negatív, kevert humán szérummal hígítva. Tartósítószer: Nátrium-azid (< 0,1%) Pozitív kontroll 80 miu/ml Anti-HAV ellenanyagra pozitív és HBs antigénre, anti-hcv antitestekre és anti-hiv 1-2 antitestekre negatív humán szérum, anti-hav antitestekre negatív, kevert humán szérummal hígítva. Tartósítószer: Nátrium-azid (< 0,1%) Vírus antigén Tris puffer, amely fehérjét, HAV vírust és mintaindikátor színezéket tartalmaz Tartósítószer hatóanyaga: ProClin 300 (0,1%) Konjugátum Tris puffer, amely fehérjét, peroxidázzal bevont anti-hav konjugátumot és mintaindikátor színezéket tartalmaz. Tartósítószer hatóanyaga: ProClin 300 (0,1%) Peroxidáz szubsztrátum puffer Citromsav és nátrium-acetát oldat ph 4,0; H 2 O 2 (0,015%) és DMSO (4%) tartalommal 2 lemez (70 ml) (1,5 ml) (3,0 ml) (1,0 ml) (28 ml) (26ml) (60 ml) R9 Kromogén Tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó színezett oldat (5 ml) R10 Leállító oldat 1N kénsavoldat (28 ml) 4 - SZÜKSÉGES DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Desztillált vagy ioncserélt víz.nátrium-hipoklorit (hypo) és nátrium-bikarbonát Papírtörlő Egyszer használatos védőkesztyű 4

Védőszemüveg Eldobható kémcsövek Automata vagy félautomata, állítható vagy fix űrtartalmú pipetták, amelyek 50 µl, 80 µl, 100 µl, 200 µl és 1 ml térfogatot kimérésére alkalmasak 10 ml, 200 ml és 1000 ml űrtartalmú mérőhengerek Vortex keverő Automata*, félautomata* vagy manuális mikrolemez-mosó készülék Termosztált vízfürdő vagy száraz inkubátor*, 37 C ± 1 C hőmérsékletre beállítva Tartály szennyezett hulladékoknak Mikrolemez leolvasó készülék* (490, 620, 450/620 és 700 nm szűrőkkel felszerelve) (*) További tájékoztatásért, lépjen kapcsolatba helyi képviselőnkkel, aki tájékoztatni fogja a műszaki részlegünk által validált berendezésekről. 5 - EGÉSZSÉGVÉDELMI ÉS BIZTONSÁGI UTASÍTÁSOK A készletben szereplő minden reagens kizárólag in vitro diagnosztikai célra alkalmazható. A teszt neve és egyedi azonosítószáma minden mikrolemez keretén fel van tűntetve. Az azonosítószám minden csíkon is szerepel. MONOLISA Total anti-hav PLUS: azonosítószám = 59. Használat előtt ellenőrizzük az egyedi azonosítószámot. Amennyiben az azonosítószám hiányzik, vagy eltér a fentitől, a csíkot nem szabad felhasználni. A reagensek és minták kezelésénél viseljünk egyszer használatos kesztyűt, és a munka befejezése után alaposan mossunk kezet. Ne pipettázzunk szájjal. A negatív kontroll (R3), pozitív kontroll (R5) és 20 miu/ml pozitív standard (R4) készítésénél használt humán eredetű anyagokat megvizsgálták, és azokat nem találták reaktívnak hepatitis B felületi antigénre (HBs Ag), hepatitis C vírus (HCV) antitestekre és humán immunhiány vírus (HIV-1 és HIV-2 Ab) antitestekre. Mivel egyetlen tesztelési módszer sem tudja teljes mértékben kizárni a fertőző anyagok jelenlétét, a mintákat és ezeket a reagenseket úgy kell kezelni, mint amelyek fertőző betegségeket terjeszthetnek. A humán eredetű mintákkal vagy reagensekkel, illetve a mosóoldatokkal közvetlen kapcsolatba kerülő anyagokat fertőzőnek kell tekinteni. Kerüljük a minták és mintákat tartalmazó oldatok kiloccsantását. A kiömlött anyagokat 10% hipoklorit oldattal kell leöblíteni. Amennyiben a szennyező folyadék sav, a kiömlést először nátrium-bikarbonáttal kell semlegesíteni, majd hipoklorit oldattal, és végül papírtörlővel szárazra kell törölni a helyet. A tisztításhoz használt anyagokat, a szennyezett hulladékok gyűjtőjébe kell helyezni. Szennyeződés-mentesítés, illetve fertőtlenítés után a humán eredetű mintákat, reagenseket, valamint a szennyezett anyagot és terméket ki kell dobni. A fertőtlenítéshez 5% töménységű nátrium-hipoklorit oldatot használhatunk (1 térfogat hypo 10 térfogat szennyezett folyadékhoz vagy vízhez), amelyben 30 percig kell áztatni, vagy 121 C hőmérsékleten legalább 2 órán át autoklávozzuk. FIGYELEM: NE TEGYÜNK AZ AUTOKLÁVBA NÁTRIUM-HIPOKLORIT TARTALMÚ OLDATOKAT. Kerüljük a szubsztrátum puffer, kromogén és a leállító oldat érintkezését a bőrrel vagy nyálkahártyákkal. Kérésre, rendelkezésre bocsátjuk az anyagbiztonsági adatlapot. Mielőtt az oldatokat a csatornába öntenénk, ne felejtsük el semlegesíteni, illetve autoklávozni a mosási szennyvizet és minden biológiai anyagot tartalmazó folyadékot. Egyes reagensek nátrium-azidot tartalmaznak. A nátrium-azid reakcióba léphet a réz és ólom vezetékekkel, és fokozottan robbanásveszélyes fém-azidok képződhetnek. Annak érdekében, hogy elkerüljük az azidok lerakódásá a csővezetékekben, a reagensek lefolyóba öntésekor ne 5

felejtsük el semlegesíteni, majd bő vízzel leöblíteni a mosogatót. Egyes reagensek ProClin 300 -at tartalmaznak 0,04%, 0,1% ill. 0,5% mennyiségben. X i Irritáló R43 : bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat. S28-37: Amennyiben a szer bőrrel érintkezik, az érintett bőrfelületet azonnal szappannal és bő vízzel le kell mosni. Használjon megfelelő védőruhát és kesztyűt. Kérésre a gyártótól minden reagens anyagbiztonsági adatlapja rendelkezésre áll. 6 - ÓVINTÉZKEDÉSEK Az eredmények minősége érdekében alkalmazzuk a helyes laboratóriumi gyakorlat elveit: Ne használjunk lejárt szavatosságú reagenseket. Ne keverjünk egyetlen vizsgálatban különböző gyártási tételekből származó reagenseket. MEGJEGYZÉS: az alábbi reagensek esetében a kitben levőtől eltérő gyártási számú reagensek is használhatók, de egy vizsgálaton belül azonos gyártási számú terméket kell használni: mosófolyadék (R2, címke felirata: 20x, zöld színű), peroxidáz szubsztrát puffer (R8, címke felirata: TMB puffer, kék színű), kromogén (R9, címke felirata: TMB 11x, bíbor színű) és leállító oldat (R10, címke felirata: 1 N, piros színű). Ezek a reagensek néhány más Bio-Rad gyártmányú termékhez is használhatók. A mosóoldat (R2, címke felirata: 20x, zöld színű) készítésekor továbbá felhasználhatunk különböző Bio-Rad reagenskészleteból származó mosófolyadékokat (R2, címke felirata: 20x, zöld színű), ha azokat megfelelően hígítjuk és egy vizsgálatsorozaton belül azonos keveréket használunk. Részletes felvilágosításért forduljanak műszaki szolgálatunkhoz. Használat előtt mindig hagyjuk 30 percig szobahőmérsékletre melegedni a reagenseket. Gondosan rekonstituáljuk a reagenseket, elkerülve minden szennyeződést. Ne végezzük a vizsgálatot reaktív gőzök (savas, lúgos vagy aldehid gőzök), illetve por jelenlétében, mivel ezek módosíthatják a konjugátum enzimaktivitását. Használjunk megfelelően mosott és ioncserélt vízzel öblített, vagy lehetőleg egyszer használatos eszközöket. Ne hagyjuk a mikrolemezt kiszáradni a mosás vége és a reagens bemérése között. Az enzimes reakció nagyon érzékeny a fémek vagy fémes ionok jelenlétére. ezért fémes elemeknek nem szabad érintkezésbe kerülni a konjugátumot vagy szubsztrátumot tartalmazó oldattal. Az előhívó oldatnak (szubsztrátum puffer + kromogén) rózsaszínnek kell lennie. A rózsaszín szín módosulása néhány percen belül a rekonstituálás után azt jelenti, hogy a reagens már nem használható, azt ki kell cserélni. Az előhívó oldatot tiszta, egyszer használatos műanyag- vagy üvegedényben készítsük, amelyet előzetesen 1N HCl oldattal átmostunk, majd desztillált vízzel jól leöblítettünk, és megszárítottunk. Ezt a reagenst a sötétben kell tárolni. Minden szérumhoz használjunk új pipetta hegyet. A tesztlyukak mosása az eljárás kritikus lépése: tartsuk tiszteletben az ajánlott mosási ciklusok számát és bizonyosodjunk meg, hogy minden tesztlyuk teljesen feltöltődik, majd teljesen kiürül. A szabálytalan mosás, téves adatokhoz vezethet. Soha ne használjuk ugyanazt a flakont a konjugátum és az előhívó oldat szétosztására. 7 - MINTÁK A vérmintát a szokásos gyakorlat szerint vegyük le. A vizsgálatot hígítatlan szérummal, vagy plazmával kell elvégezni (véralvadásgátlók: EDTA, citrát, citrát-dextróz és heparin oldatok). Az aggregátumokat tartalmazó mintákat vizsgálat előtt centrifugálással deríteni kell. A lebegő fibrin aggregátumok vagy részecskék tévesen pozitív eredményekhez vezethetnek. A mintákat +2-8 C vagy mélyfagyasztva -20 C hőmérsékleten kell tárolni amennyiben a 6

szűrővizsgálatot 7 napon belül elvégezzük. Kerüljük a minták ismételt fagyasztását és felolvasztását. Amennyiben a mintákat szállítani kell, ezeket csomagoljuk a kórokozókra vonatkozó előírásoknak megfelelően, és lehetőleg fagyasztva szállítsuk őket. NE HASZNÁLJUNK SZENNYEZETT, HIPERLIPÉMIÁS VAGY ERŐSEN HEMOLIZÁLT SZÉRUMOKAT. Megjegyzés: Nem befolyásolják az eredményt a maximum 60 g/l albumin és 100 mg/l bilirubin tartalmú, a 36 g/l triolein egyenértéket tartalmazó lipémiás minták, és a maximum 5 g/l hemoglobint tartalmazó hemolizált minták. Hepatitis A vírus (HAV) antitestekre negatív és pozitív mintákat vizsgáltunk eredeti állapotban, majd 3 fagyasztási-felolvasztási ciklus után. Ez a kezelés nem befolyásolja az antitestek kimutatását. 8 - A REAGENSEK REKONSTITUCIÓJA - SZAVATOSSÁG - TÁROLÁS Mielőtt a MONOLISA Total anti-hav PLUS vizsgálati készlet reagenseit használnák, hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni 30 percig. 1) Használatra kész reagensek Mikrolemez (R1) M h t t L Negatív kontroll (R3) Pozitív standard 20 miu/ml (R4) Pozitív kontroll (R5) Vírus antigén (R6) Konjugátum (R7) A reagenst használat előtt homogenizáljuk. 2) Rekonstituálandó reagensek Mosóoldat koncentrátum (20x) R2 Használatra kész mosóoldat előállításához az R2 mosóoldatot 1:20 arányban hígítsuk desztillált vízzel. Egy 12 tesztcsíkos lemezhez 800 ml-t készítsünk. Előhívó oldat (R8 + R9) Hígítsuk az (R9) reagenst 1:11 arányban az R8 reagenssel (például: 1 ml R9 reagenst, 10 ml R8 reagenssel). 10 ml szükséges és elegendő 1-12 csíkhoz. Homogenizáljuk. 3) A kvantitatív meghatározáshoz alkalmazandó reagensek hígítása: Kvantitatív meghatározás esetén készítsünk 40 és 10 miu/ml értéktartomány pontokat, az R4 és R5 reagenseket 1:2 arányban hígítva R3 oldattal. A kalibráció értéktartományát a következő pontok adják meg: Cal 80 = 80 miu/ml kalibrátor = R5 Cal 40 = 40 miu/ml kalibrátor = R5 1/2 hígítás R3 oldatban (100 + 100 µl) Cal 20 = pozitív standard 20 miu/ml = R4 Cal 10 = 10 miu/ml kalibrátor = R4 1/2 hígítás R3 oldatban (100 + 100 µl) Cal 0 = 0 miu/ml kalibrátor = R3 4) Szavatosság - tárolás Tároljuk a készletet + 2-8 C hőmérsékleten. The kit should be stored at +2-8 C. Ezen a hőmérsékleten tárolva a készlet minden reagense felhasználható a csomagoláson feltüntetett lejárati időpontig (kivéve az ettől eltérő utasítás esetén). R t R2 : A kihígított mosóoldat +2-30 C-on tárolva 2 hétig felhasználható. A koncentrált mosóoldat (R2) +2-30 C-on tárolható. 7

R8 + R9: Feoldás után a reagens sötét helyen, szobahőmérsékleten (18-30 C) tárolva 6 órán át felhasználható. 9 - A VIZSGÁLAT KIVITELEZÉSE Szigorúan kövessük a protokollt. A vizsgálat minőségének validálása érdekében, használjuk a negatív és pozitív kontroll szérumokat minden vizsgálatnál. Alkalmazzuk a helyes laboratóriumi gyakorlat elveit. Módszerek 5) Gondosan dolgozzuk ki a minták elosztási és azonosítási tervét. 6) Készítsük el a hígított mosóoldatot (hígított R2) és a pozitív antigén munkakontrollt (R5a + R5B) 7) Távolítsuk el a mikrolemez keretet és csíkokat (R1) a védőtasakból. 8) Mérjük be közvetlenül és sorozatban, a mikrolemez előzetes mosása nélkül: 100 µl Vírus antigént (R6) minden tesztlyukba Kvalitatív vizsgálat esetében: 50 µl negatív kontroll (R3) az A1 tesztlyukba, 50 µl 20 miu/ml pozitív standard (R4) a B1, C1, D1 tesztlyukakba 50 µl pozitív kalibrátor (R5) az E 1 tesztlyukba 50 µl az 1. mintából az F1 tesztlyukba 50 µl a 2. mintából a G1 tesztlyukba, stb.... Kvantitatív vizsgálat esetében: 50 µl CAL 0 az A1, B1 tesztlyukakba 50 µl CAL 10 miu/ml a C1, D1 tesztlyukakba 50 µl CAL 20 miu/ml az E1 F1 tesztlyukakba 50 µl CAL 40 miu/ml a G1, H1 tesztlyukakba 50 µl CAL 80 miu/ml az A2, B2 tesztlyukakba 50 µl az 1. mintából tisztán vagy hígítva a C2 tesztlyukba 50 µl a 2. mintából a D2 tesztlyukba, stb. A minták az R3 negatív kontrollal hígíthatók (Cal 0 miu/ml). Amennyiben a mintabemérés 10 percnél tovább történik, ajánlatos a negatív és pozitív kontrollokat a minták után bemérni. Az alkalmazott rendszer függvényében, a kontrollok pozícióját meg lehet változtatni. MEGJEGYZÉS: A minták bemérése után a vírus antigén oldatot (R6) tartalmazó tesztlyukak és a minták vagy kontrollok színe, pirosról narancssárgára vált. A minták jelenléte a tesztlyukakban spektrofotometriás leolvasással ellenőrizhető, 490 nm-en (egyetlen hullámhossz). Lásd a 12 fejezetet: MINTA ÉS REAGENSEK PIPETTÁZÁSÁNAK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE. 9) Amikor lehetséges, fedjük le a mikrolemezt öntapadós fóliával. Jól nyomjuk a lemezre, hogy jól zárjon. 10) Inkubáljuk a mikrolemez termosztált vízfürdőben, vagy mikrolemez inkubátorban a 60 ± 5 percig, 37 C ± 1 C hőmérsékleten. 11) Távolítsuk el az öntapadós fóliát. A tesztlyukak tartalmát szívassuk le a veszélyes biológiai hulladékok tárolására használt edénybe. Mérjünk minden tesztlyukba legalább 0,370 ml mosóoldatot. Hagyjuk ázni legalább 30 másodpercig. Ismét szívassuk le a tesztlyukak tartalmát. Ismételjük meg az eljárást legalább kétszer (azaz összesen legalább 3 mosás). A maradványtérfogatnak kevesebbnek kell lennie, mint 10µl (szükség esetén a lemezt papírtörlőre lefordítva szárítsuk). Automata lemezmosó használata esetén ugyanezt az eljárást kövessük. 12) Gyorsan mérjünk 100 µl konjugátum oldatot (R8 + R9) minden tesztlyukba. Használat előtt a konjugátumot fel kell rázni. Amikor lehetséges, fedjük le a mikrolemezt új fóliával, és inkubáljuk 60 ± 5 percig, 37 C ± 1 C hőmérsékleten. MEGJEGYZÉS: A lila színű konjugátum oldat bemérése ebben a szakaszban spektrofotometriás leolvasással ellenőrizhető 620 nm hullámhosszon (lásd a 12 fejezetet: MINTA ÉS REAGENSEK PIPETTÁZÁSÁNAK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE) 13) Távolítsuk el a fóliát, ürítsünk ki leszívatással minden tesztlyukat, és mossuk legalább 4-szer, a 8

fentiekben leírtaknak megfelelően. 14) Készítsük el az előhívó oldatot (lásd a 8 fejezetet: A REAGENSEK REKONSTITÚCIÓJA). 15) Gyorsan mérjünk 80 µl elkészített szubsztrátum oldatot (R8 + R9) minden tesztlyukba. Hagyjuk a reakciót szobahőmérsékleten (18-30 C) és sötétben lejátszódni 30 ± 5 percig. Ez alatt az inkubálás alatt ne használjunk fóliát. MEGJEGYZÉS : A rózsaszínű előhívó oldat szétosztása ebben a szakaszban vizuálisan ellenőrizhető: világos különbség látható az üres és a rózsaszín szubsztrátum oldatot tartalmazó tesztlyukak között (lásd a 12 fejezetet: MINTA ÉS REAGENSEK PIPETTÁZÁSÁNAK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE). 16) Mérjünk be 100 µl leállító oldatot (R10) ugyanabban a sorrendben és sebességgel, mint a szubsztrátum oldat esetében. MEGJEGYZÉS : A színtelen leállító oldat szétosztása ebben a kezelési szakaszban vizuálisan ellenőrizhető. A leállító oldat bemérése után, a szubsztrátum rózsaszín (negatív minták) vagy kék (pozitív minták) színeződése eltűnik a negatív minták esetében, vagy kékről sárgára vált a pozitív minták esetében. 17) Gondosan töröljük le a lemez alját. Legalább 4 perccel a leállító oldat bemérése után és a reakció leállása után 30 percen belül, lemezolvasóval olvassuk le az abszorbanciát 450/620-700 hullámhosszon. 18) Az eredmények feljegyzése előtt ellenőrizzük az egyezést az eredmények és a mikrolemez mintaeloszlási és azonosítási terv között. 10 RENDSZER-ALKALMAZÁSOK MOSÁS: A vizsgálat optimális teljesítménye érdekében gondosan kövessük a leírt mosási eljárásokat. Egyes rendszerek esetében szükség lehet a mosóciklusok számának és a mosási térfogat adaptálása az elfogadhatósági validálási szempontok teljesítése érdekében. 11 AZ EREDMÉNYEK KISZÁMÍTÁSA ÉS ÉRTELMEZÉSE: MINŐSÉGI (KVALITATÍV) MÓDSZER Az HAV ellenanyag jelenlétére vagy hiányára az ismeretlen minták abszorbancia-értékei és a Cut-Off érték összehasonlításával következtetünk. 1. Számítsuk ki a 20 miu/ml pozitív standard (R4) átlagos abszorbanciáját. Példa: Pozitív standard 20 miu/ml (R4) Tesztlyukak optikai sűrűsége (abszorbancia) B1 0,689 C1 0,673 D1 0,680 Összes OD 2,042 Összes abszorbancia 2,042 Átlag OD R4 = --------------------------- = ---------- = 0,680 3 3 2. Számítsuk ki az arányt minden minta esetében: Mintaarány = átlag OD R4 / minta OD 3. A validálási szempontok a következők: a) A negatív kontroll R3 esetében: a mért abszorbanciaérték legyen nagyobb, mint 1,0. b) A pozitív standard 20 miu/ml R4: minden egyes R4 esetében, a mért abszorbancia érték legyen nagyobb, mint 0,350. Amennyiben egy pozitív standard 20 miu/ml eltérése az átlagtól nagyobb, mint 30%, ezt figyelmen 9

kívül kell hagyni, és a számítást a másik két pozitív standard 20 miu/ml értékeiből kell kiszámítani. A pozitív standard 20 miu/ml mért átlagos abszorbanciának és a negatív kontroll mért abszorbanciájának hányadosa (átlag OD R4/ OD R3) kisebb kell legyen, mint 0,6. c) A pozitív kontroll R5 esetében: a mért abszorbanciaérték legyen kisebb, mint 0,300. A pozitív kontroll arányának értéke (R5 arány = átlag R4 OD / R5 OD) legyen nagyobb, mint 1,5. Amennyiben valamelyik szempont nem teljesül, a vizsgálat érvénytelen. 4. Az eredmények értelmezése Azokat a mintákat, amelyeknél az arány értéke 0,9-nél kisebb, a MONOLISA Total anti-hav PLUS vizsgálat szempontjából negatívnak tekintjük. Azokat a mintákat, amelyeknél az arány értéke nagyobb vagy egyenlő 1,1-el, a MONOLISA Total anti-hav PLUS vizsgálat szempontjából pozitívnak tekintjük. Azokat a mintákat, amelyeknél az arány értéke egyenlő vagy nagyobb, mint 0,9 és kevesebb, mint 1,1, új vizsgálatnak kell alávetni a végső értelmezés előtt. Újravizsgálás után a mintát pozitívnak tekintjük a MONOLISA Total Anti-HAV PLUS vizsgálattal, amennyiben az arány értéke nagyobb vagy egyenlő 1,1-el. A mintát negatívnak tekintjük, amennyiben az arány értéke kevesebb, mint 0,9. Amennyiben az arány értéke egyenlő vagy nagyobb, mint 0,9 de kevesebb, mint 1,1, a minta nem értékelhető, és újabb mintát kell alávetni a vizsgálatnak. 12 - AZ EREDMÉNYEK KISZÁMÍTÁSA ÉS ÉRTELMEZÉSE: MENNYISÉGI (KVANTITATÍV) MÓDSZER 1. Számítsuk ki minden kalibrátor átlagos abszorbanciáját Példa: CAL 40 miu/ml Tesztlyukak optikai sűrűsége (abszorbancia) G1 0,295 H1 0,292 Összes OD 0,587 Összes abszorbancia 0,587 Átlag OD. cal 40 miu/ml = ------------------------------ = ----------- = 0,2935 2 2 2. A validálási szempontok a következők: a) A negatív kontroll R3 (Cal 0 miu/ml) esetében: Minden R3 negatív kontroll mért abszorbancia értéke nagyobb kell legyen, mint 1,0. b) A pozitív kalibrátor R4 (Cal 20 miu/ml) esetében: Minden R4 mért abszorbanca értéke nagyobb kell legyen, mint 0,350. A pozitív standard 20 miu/ml mért átlagabszorbanciájának és a negatív kontroll mért abszorbanciájának hányadosa (átlag R4 OD/ R3 OD) kisebb kell legyen, mint 0,6. c) A pozitív kontroll R5 (Cal 80 miu/ml) esetében: Minden R5 pozitív kontroll mért abszorbanciája kisebb kell legyen, mint 0,300. A pozitív kontroll arányának értéke (R5) (átlag R4 OD / R5 OD) > 1,5. d) Átlag OD Cal 0 > átlag OD Cal 10 miu /ml Átlag OD Cal 10 > átlag OD Cal 20 miu/ml Átlag OD Cal 20 > átlag OD Cal 40 miu/ml Átlag OD Cal 40 > átlag OD Cal 80 miu/ml Amennyiben valamelyik szempont nem teljesül, a vizsgálat érvénytelen. 10

3. Az eredmények értelmezése Az optikai sűrűséget (abszorbanciát) pontonként az x-tengelyen, a vonatkozó HAV antitest koncentrációt miu/ml egységekben kifejezve pedig az y-tengelyen ábrázoljuk. A minták anti-hav ellenanyag koncentrációját (miu/ml) a minta átlag abszorbanciájából lehet meghatározni úgy, hogy azt felvesszük az x-tengelyen, a kalibrációs görbét metsző pontot kivezetjük az y-tengelyre és leolvassuk a koncentrációt. A vizsgált minták koncentrációját a kalibrációs görbéből olvassuk le. Amennyiben a mintát előzőleg hígítottuk, a hígított minta koncentrációját a hígítási faktorral meg kell szorozni. Azokat a mintákat, amelyeknél a koncentráció 18 miu/ml alatt van, a MONOLISA Total anti-hav PLUS vizsgálat szempontjából negatívnak tekintjük. Azokat a mintákat, amelyeknél a koncentráció 22 miu/ml vagy ez felett van, a MONOLISA Total anti-hav PLUS vizsgálat szempontjából pozitívnak tekintjük. Azokat a mintákat, amelyeknél a koncentráció 18 miu/ml vagy nagyobb de kevesebb, mint 22 miu/ml, egyszer új vizsgálatnak kell alávetni a végső értelmezés előtt. Újravizsgálás után a mintát negatívnak tekintjük a MONOLISA Total anti-hav PLUS vizsgálat szempontjából, amennyiben a koncentráció kisebb, mint 18 miu/ml. A mintát pozitívnak tekintjük, amennyiben a koncentráció 22 mui/ml vagy magasabb. Amennyiben az újravizsgált minta koncentrációja 18 miu/ml vagy nagyobb, de kevesebb, mint 22 miu/ml a minta nem értékelhető, és újabb mintát kell alávetni a vizsgálatnak. 13 - MINTA ÉS REAGENSEK PIPETTÁZÁSÁNAK SPEKTROFOTOMETRIÁS ELLENŐRZÉSE (OPCIONÁLIS): A VÍRUS ANTIGÉN (R6) ÉS MINTA PIPETTÁZÁSÁNAK ELLENŐRZÉSE A minta és vírus antigén oldat (R6) jelenlétét a tesztlyukban spektrofotometriásan is lehet ellenőrizni 490 nm hullámhosszon: a vírus antigén oldatot (R6) tartalmazó tesztlyuk abszorbanciája 0,500 vagy magasabb legyen. A minta vagy kontroll bemérése után, minden tesztlyuk átlagabszorbanciájának növekedése legalább 0,100 legyen. Nem lehet a minták pipettázását ellenőrizni, amikor az R6 reagenst a mintával homogenizáljuk. MEGJEGYZÉS : A minták hozzáadása után a vírus antigén oldat (R6) színe pirosról narancssárgára vált. A KONJUGÁTUM (R7) PIPETTÁZÁSÁNAK ELLENŐRZÉSE A konjugátum (R7) jelenlétét a tesztlyukban spektrofotometriásan is lehet ellenőrizni 620 nm hullámhosszon: minden tesztlyuk abszorbanciája 0,500 vagy magasabb legyen. MEGJEGYZÉS : az R7 konjugátum színe lila. AZ ELŐHÍVÓ OLDAT (R8 + R9) PIPETTÁZÁSÁNAK AZ ELLENŐRZÉSE Az előhívó oldat (R8 + R9) jelenlétét a tesztlyukban spektrofotometriásan is lehet ellenőrizni 490 nm hullámhosszon: minden tesztlyuk abszorbanciája 0,100 vagy magasabb legyen (az alacsonyabb abszorbancia általában az előhívó oldat hibás bemérésére utal). MEGJEGYZÉS : Az előhívó oldat bemérése után az addig színtelen üres tesztlyukak rózsaszínre váltanak. 14- TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐK A MONOLISA Total anti-hav PLUS teljesítményét 3 helyszínen határozták meg, véletlenszerűen kiválasztott véradóktól, HAV fertőzött betegektől, kereskedelmi és szerokonverziós panelekből, és vakcinált betegek nyomonkövetéses vizsgálata során vett mintákkal. A Specificitás A specificitás az 561 véletlenszerűen kiválasztott véradók esetében 100% [99,47 100 %] (IC 95), 561/561 volt. További 700 betegmintát vizsgáltunk (fagyasztott vagy nem). A specifikusság 100% [ 99,57%-100%] (IC 95), 700/700 volt. 192 különböző kórképű vagy állapotú beteg mintáit, akik nem voltak kapcsolatban a hepatitis A vírussal (terhes nők, reumatoid faktor, anti-nucleáris antitestek, anti-egér Ig vagy egyéb vírusos vagy baktériumos fertőzés), 11

párhuzamosan vizsgáltuk egy kereskedelmi forgalomban lévő EIA teszttel. A 2 vizsgálatsorozat egyezősége 99,48% volt (191/192). A specificitás 100% volt (95/95). Egy influenza ellen vakcinált beteg mintáját pozitívnak találtunk a kereskedelmi EIA teszttel, de negatív volt a MONOLISA Total anti-hav PLUS készlettel. B Érzékenység Az érzékenységet 424 pozitív véradó minta és 1274 pozitív minta (3 különböző helyszínről) segítségével vizsgáltuk. Összesen 1698 mintát vizsgáltunk a MONOLISA Total anti-hav PLUS készlettel és összehasonlítottuk egy kereskedelmi EIA teszttel. Az érzékenység 100% volt a véradó és betegminták esetében is. Három kereskedelmi HAV szerokonverziós panelből és 12 beoltott betegtől származó mintát is vizsgáltunk, és az eredményeket összehasonlítottuk egy kereskedelmi EIA teszttel. A 2 vizsgálatsorozat egyezősége 100% volt. C Mérési pontosság A mennyiségi eredményeket miu/ml-ben adjuk meg, melynek kalibrálása a WHO "Anti-Hepatitis A Immunoglobulin 2nd International Standard, 1988" alapján történt. Korrelácós vizsgálatot végeztek a WHO nemzetközi standardból nyert 0, 10, 20, 40, és 80 miu/ml koncentrációk és a kit kalibrátorai között. A korrelációs koefficiens és a korrelációs egyenes meredeksége 0,98- nak, illetve 1,04-nek adódott. D A vizsgálat reprodukálhatósága A MONOLISA Total anti-hav PLUS vizsgálat reprodukálhatóságát 4 minta vizsgálatával határoztuk meg: 1 negatív minta, és 3 HAV Ab pozitív minta (alacsony, közepes, magas). A vizsgálaton belüli reprodukálhatóságot ennek a 4 mintának a 30-szor elvégezett vizsgálatával elemeztük. A vizsgálatok közötti reprodukálhatóságot ennek a 4 mintának duplikátumban végzett vizsgálatával elemeztük, 20 napon keresztül, minden nap 2 független vizsgálatsorozattal. Az eredmények a következő táblázatban láthatók: 1. táblázat: Vizsgálaton belüli reprodukálhatóság Minta Negatív Gyenge pozitív Közepesen pozitív Erősen pozitív Átlagarány 0,43 2,25 3,08 4,29 SD 0,02 0,15 0,19 0,19 CV% 4,87 6,50 6,29 4,47 Minta Negatív Gyenge pozitív Közepesen pozitív Erősen pozitív Átlag titer 2,78 39,96 67,33 >80 SD 1,21 2,69 5,26 Nem áll rendelkezésre CV% 43,53 6,72 7,81 Nem áll rendelkezésre 2. táblázat: Vizsgálatok közötti reprodukálhatóság Minta Negatív Gyenge pozitív Közepesen pozitív Erősen pozitív Átlagarány 0,45 2,13 3,43 4,80 SD 0,03 0,29 0,33 0,49 CV% 6,31 13,68 9,61 10,23 Minta Negatív Gyenge pozitív Közepesen pozitív Erősen pozitív Átlag titer 3,10 38,91 71,88 >80 12

SD 1,24 3,65 4,13 Nem áll rendelkezésre CV% 39,96 9,38 5,75 Nem áll rendelkezésre 15 - A VIZSGÁLAT KORLÁTAI Egyetlen fertőző betegség diagnózisát sem szabad csupán egy vizsgálati eredményre alapozva felállítani. A diagnózis felállításánál tehát együttesen kell figyelembe venni a beteg anamnézisét, tüneteit, valamint a szerológiai vizsgálatok eredményeit. A minták bakteriális fertőzése befolyásolhatja a mért abszorbancia értékeket. 13

16 -IRODALOMJEGYZÉK Costa-Mattioli Mauro, Di Napoli A, Ferré V, Billaudel S, Perez-Bercoff R, Cristina J : Genetic variability of hepatitis A virus. Journal of General Virology (2003), 84, 3191-3201 Normann A, Jung C, Vallbracht A, Flehmig B : Time course of Hepatitis A Viremia and Viral Load in the Blood of Human Hepatitis A Patients. Journal of Medical Virology 9999 :1-7 (2003) Lutz G. Guertler : Virus safety of human blood, plasma, derived products. Thrombosis Research 107 (2002)S39-S45 Jennifer A. Cuthbert : Hepatitis A : Old and New. Clinical Microbiology Reviews, Jan. 2001, p. 38-58 Morag Ferguson, Dawn Sands, Nico Lelie : Hepatitis A Immunoglobin : An International Collaborative Study to Establish the Second Intertional Standard. Biologicals Vol. 28, Issue 4, December 2000, p. 233-240 World Health Organization, departement of communicable Disease Surveillance and Response : Hepatitis A. Who/cds/csr/edc/2000.7 (http://www.who.int/emc) Centers for Disease Control and Prevention (CDC) : Prevention of hepatitis A through active or passive immunization, recommendations of the advisory committee on immunization practices (ACIP). MMWR october 01, 1999 /48(RR12) ;1-37 Rosa M. Pinto, Juan F. Gonzalez-Dankaart, Gloria Sanchez, Susana Guix, M. Jose Gomara, Monica Garcia, Isabel Haro, Albert Bosch : Enhancement of the immunogenicity of a synthetic peptide bearing a VP3 epitope of hepatitis A virus. FEBS Letters 438 (1998) 106-110 Stanley M. Lemon : Type A viral hepatitis : epidemiology, diagnosis, and prevention. Clinical Chemistry 43 :8(B) 1494-1499 (1997) Stanley M. Lemon and Leonard N. Binn : Serum neutralizing antibody response to hepatitis A Virus. The Journal of Infectious Diseseases Vol. 148, no. 6 December 1983 Bertram Flehmig, Michael Ranke, Hans Berthold, Hans-Joachim Gerth : A Solid-Phase Radioimmunoassay for Detection of IgM Antibodies to Hepatitis A Virus. The Journal of Infectious Diseases Vol. 140, no. 2 August 1979

IVD (GB) - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) (FR) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) (ES) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) (IT) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) (DE) - CE Konformitätskennzeichnung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) (PT) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) (SE) - CE-märkning (Europeiskt direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik) (DK) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) (GR) - CE ( 98/79/CE in vitro ) (PL) - CE oznaczenie (Dyrektywa unijna 98/79/CE dotycząca produktów medycznych do badań in vitro) (LT) - CE ženklas (Europos sąjungos direktyva 98/79/CE dėl in vitro diagnostikos medicinos prietaisų) (HU) - CE jelzés (98/79/CE Európai Irányelv az in vitro orvosi diagnosztikai eszközökről) (EE) - CE märgistus (Euroopa direktiiv 98/79/CE in vitro diagnostikameditsiiniseadmete kohta) (SK) - CE označenie o zhode (Európska direktíva 98/79/CE pre in vitro diagnostické zdravotnícke postupy) (CZ) - CE značka (Evropská direktiva 98/79/CE o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro) (NO) - CE-merking (EU-direktiv 98/79/CE om medisinsk utstyr til in vitro-diagnostikk) (RO) - Marca CE (Directiva europeana 98/79/CE pentru dispozitive medicale de diagnostic in vitro) (BG) - СЕ маркировка (Европейска директива 98/79/CE за ин витро диагностичните медицински изделия) (GB) - For in vitro diagnostic use (GB) - Catalogue number (FR) - Pour diagnostic in vitro (FR) - Référence catalogue (ES) - Para diagnóstico in vitro (ES) - Número de catálogo (IT) - Per uso diagnostico in vitro (IT) - Numero di catalogo (DE) - In-vitro-Diagnostikum (DE) - Bestellnummer (PT) - Para uso em diagnóstico in vitro (PT) - Número de catálogo (SE) - In vitro-diagnostik (SE) - Katalognummer (DK) - In vitro diagnose (DK) - Katalognummer (GR) - in vitro (GR) - (PL) - Do stosowania in vitro (PL) - Numer katalogu (LT) - in vitro diagnostikai (LT) - Katalogo numeris (HU) - Csak in vitro diagnosztikai alkalmazásra (HU) - Cikkszám (EE) - In vitro diagnostiliseks kasutamiseks (EE) - Katalooginumber (SK) - Na diagnostiku in vitro (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Pro diagnostiku in vitro (CZ) - Katalogové číslo (NO) - Til in vitro-diagnostikk (NO) - Katalognummer (RO) - Pentru diagnostic in vitro (RO) - Număr de catalog (BG) - За ин витро диагностика (BG) - Каталожен номер (GB) - Manufacturer (GB) - Authorised Representative (FR) - Fabricant (FR) - Représentant agréé (ES) - Fabricante (ES) - Representante autorizado (IT) - Produttore (IT) - Distributore autorizzato (DE) - Hersteller (DE) - Bevollmächtigter (PT) - Fabricante (PT) - Representante Autorizado (SE) - Tillverkad av (SE) - Auktoriserad representant (DK) - Fremstillet af (DK) - Autoriseret repræsentant (GR) - (GR) - (PL) - Producent (PL) - Upoważniony Przedstawiciel (LT) - Gamintojas (LT) - Įgaliotasis atstovas (HU) - Gyártó (HU) - Meghatalmazott Képviselő (EE) - Tootja (EE) - Volitatud esindaja (SK) - Výrobca (SK) - Autorizovaný zástupca (CZ) - Výrobce (CZ) - Zplnomocněný zástupce (NO) - Produsent (NO) - Autorisert representant (RO) - Producător (RO) - Reprezentant autorizat (BG) - Производител (BG) - Упълномощен представител (GB) - Batch code (GB) - Expiry date YYYY/MM/DD (FR) - Code du lot (FR) - Date de peremption AAAA/MM/JJ (ES) - Código de lote (ES) - Estable hasta AAAA/MM/DD (IT) - Codice del lotto (IT) - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG (DE) - Chargen-Bezeichnung (DE) - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT (PT) - Código do lote (PT) - Data de expiração AAAA/MM/DD (SE) - Batchnr (SE) - Utgångsdatum ÅÅÅÅ/MM/DD (DK) - Batchkoden (DK) - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD (GR) - (GR) - YYYY/MM/DD (PL) - Numer serii (PL) - Data ważności YYYY/MM/DD (LT) - Serijos numeris (LT) - Galioja iki YYYY/MM/DD (HU) - Gyártási szám (HU) - Szavatossági idő ÉÉÉÉ/HH/NN (EE) - Partii kood (EE) - Aegumistähtaeg AAAA/KK/PP (SK) - Číslo šarže (SK) - Použiteľné do RRRR/MM/DD (CZ) - Číslo šarže (CZ) - Datum exspirace RRRR/MM/DD (NO) - Partikode (NO) - Utløpsdato ÅÅÅÅ/MM/DD (RO) - Număr de lot (RO) - Data expirarii AAAA/LL/ZZ (BG) - Партиден номер (BG) - Срок на годност година/месец/ден

(GB) - Storage temperature limitation (FR) - Limites de températures de stockage (ES) - Temperatura límite (IT) - Limiti di temperatura di conservazione (DE) - Lagertemperatur (PT) - Limites de temperatura de armazenamento (SE) - Temperaturbegränsning (DK) - Temperaturbegrænsning (GR) - (PL) - Temperatura przechowywania (LT) - Saugojimo temperatūriniai apribojimai (HU) - Tárolási hőmérsékleti határok (EE) - Piirangud säilitustemperatuurile (SK) - Skladovacia teplota od do (CZ) - Teplotní rozmezí od do (NO) - Oppbevaringstemperatur (RO) - Limitele de temperatură la stocare (BG) - Температурни граници на съхранение (GB) - Consult Instruction for use (FR) - Consulter le mode d'emploi (ES) - Consulte las instrucciones de uso (IT) - Consultare le istruzioni per uso (DE) - Siehe Gebrauchsanweisung (PT) - Consulte o folheto informativo (SE) - Se bruksanvisningen (DK) - Se instruktion før brug (GR) - (PL) - Sprawdź instrukcję (LT) - Ieškokite informacijos vartojimo instrukcijoje (HU) - Olvassa el a használati utasítást (EE) - Kasutamisel vaata instruktsiooni (SK) - Katalógové číslo (CZ) - Viz návod k použití (NO) - Se bruksanvisninger (RO) - Consultati prospectul de utilizare (BG) - Виж инструкцията за употреба

Bio-Rad 3, bd Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette - France Tél.: +33 1 47 95 60 00 01/2009 Fax.: +33 1 47 41 91 33 Code: 883561