RNS technikák - segédanyag

Átírás

1 RNS technikák - oktatási segédanyag

2 RNS molekulák felépítése, típusai

3 Mi az RNS? DEFINÍCIÓ: Változó hosszúságú, foszfodiészter kötésekkel egymáshoz kapcsolt ribonukleotid-monofoszfát egységekből felépülő (általában) egyszálú polimer. RNS-molekulalánc építőegységek (Ribonukleotid-monofoszfátok) monofoszfát-csoport 5 vég 5 Purin bázisok Bázis Pirimidin bázisok Cukor-foszfát lánc folytatása 5 irányba. Következő ribonukleotid-monofoszfát kapcsolódási helye 4 3 vég szénatomos (pentóz) (1 5 ) cukor-rész Dezoxiribonukleinsav (DNS) :(OH helyett H) Cukor-foszfát lánc folytatása 3 irányba. Következő Boros ribonukleotid-monofoszfát Ákos kapcsolódási helye

4 RNS-molekulalánc cukor-foszfát gerinc Lelógó bázisok Hidrogén hidak kialakulásának kedvező sztereokémiai pozíciókban! A lánc két vége szerkezetileg különböző! 5 vég: foszfát-csoport 3 vég: OH csoport Foszfodiészter kötés: Két szomszédos ribonukleotid-molekula 3 és 5 szénatomját egy monofoszfát molekula kovalensen köti össze! FORRÁS:

5 Nukleinsav polimerizáció I. RNS/DNS szintézis építőkövei in vivo és in vitro is: (Dezoxi)ribonukleotid-trifoszfátok dntpk vagy NTPk dntp= egyenlő mennyiségű datp, dttp, dgtp és dctp RT és PCR reakcióban is!!! (r)ntp= egyenlő mennyiségű (r)atp, (r)utp, (r)gtp és (r)ctp (d)ntp RNS szintézis - RNS polimerázok DNS szintézis - DNS polimerázok Polimeráz aktivitás: nukleinsav molekulák gyártása nukleotidokból (prekurzorok/építőelemek) A nukleinsav molekula: a nukleotidok foszfodiészter kötéssel összekapcsolt lánca!

6 Nukleinsav polimerizáció II. A nukleinsav polimerizáció (in vitro és in vivo) két fő követelménye: -Templát szál (sablon), amelyről az átírás történik - Szabad 3 -OH csoport, amelyhez a következő nukleotid foszfodiészter kötéssel kapcsolódhat Primer = Láncindító, nukleinsav-molekula szabad 3 -OH-véggel! Prime = get ready, prepare PCR-ban: Oligonukleotid primer A polimerizáció 5 3 irányú (invivo és invitro egyaránt) Az 5 vég készül el először, majd csak a polimerizáció végén készül el a 3 vég!

7 Nukleobázisok Két kategória: Purin bázisok: (A, G) Pirimidin bázisok (C, T illetve U) Komplementer bázisok Bázispárosodás szabálya : ( Watson - Crick base-pairing): A purin-és pirimidin bázisok eltérő hidrogén-kötés kialakító tulajdonságaira épül. A hidrogén-hidak mindig komplementer bázisok között jönnek létre. (nincs pl: A-A, C-C vagy A-C kapcsolat!) 2 hidrogén-kötés (-híd): 3 hidrogén-kötés (-híd):

8 Kettős szálú nukleinsav-molekula (RNS vagy DNS) irányultsága Irányultságból adódó kifejezések Upstream: a referencia ponttól 5 vég felé eső Downstream: a referencia ponttól 3 vég felé eső Upstream= felfelé Downstream= lefelé 5 3 AUUAG szekvencia Referencia pont (pl: START kodon) STOP kodon szekvencia

9 RNS típusok riboszómális RNS (rrns): Legnagyobb mennyiségben transzfer RNS (trns) heteronukleáris RNS (hnrns) mrns: - Legkisebb mennyiségben - Legváltozatosabb - Legnagyobb mennyiségi variabilitás sejten belül és sejtek között is! snrns(kisméretű-sejtmagi RNS - smal nuclear RNA) scrns(kisméretű-citoplazmatikus RNS - smal cytoplasmic RNA) mirns(mikro RNS)...

10 Gén és genom szerveződése a transzkripció szemszögéből I. Prokarióta genom Adott metabolikus út (pl.: antibiotikum szintézis) génjei egy csoportot ( génklasztert ) alkotnak. Operon: A genomiális DNS funkcionális egysége, amely egy génklasztert tartalmaz egy promóter irányítása alatt. A promóterirányításával átíródó mrns általában policisztronos, azaz több polipeptidet megszakítás nélkül (vagy rövid megszakításokkal)kódol egy mrns. Cisztron: az egy polipeptidet/fehérjét kódoló egység Prokarióta gén expresszió kinetikája (dinamikája) A génkifejeződés (transzkripció és transzláció) olyan gyors, hogy a még félkész mrns-ről több riboszóma is elindítja a fehérjeszintézist, miközben az mrns eleje már degradálódik is!

11 Eukarióta genom Csak a TELJESEN ÁTÍRT(és érett ) mrns-ről indul meg a fehérjeszintézis! Az éret mrns-ek jelentős része monocisztronos, azaz egy fehérjét kódol. Egyszerre több riboszóma dolgozik egy adott mrns molekulán(=poliszóma)! RNS molekulák lokalizációja a prokarióta sejtben Minden egy helyen! rrns, trns, mrns... a citoplazmában: HOMOGÉN RNS-POOL, később szelektálhatóak a RNS-típusok az RNS extraktumból! RNS molekulák lokalizációja az eukarióta sejtben Más RNS-pool a sejtmagvacskából Más RNS-pool a sejtmagból Más RNS-pool a citoplazmából + mitokondrium + kloroplasztisz

12 Eukarióta HeteronukleárisRNS-ek (hnrns) - Primer transzkriptek - Funkcionális RNS-ek prekurzorai - Lokalizációja: csak a sejtmagban - Az érett mrns-ek prekurzorai is! - Nagyon heterogén csoport! -Átlagos hossz: nukleotid Érett mrnsátlagos hossza: kb! - Mérettartomány: 2000-től nukleotidig! - hnrns-ek többsége lebomlik mielőtt megérik! (SZABÁLYOZÁS) -Időtartomány: 1 perc és 1 óra között! -kb. 25% jut el az érett mrns-szintre! - Egy átlagos sejt összes RNS-ének 1-3%-a mrns!

13 RNS érés Az mrns-prekurzor heteronukleáris RNS-ek jelentős érési folyamatok egész során esnek át. (1) Capping Az RNS szintézis közben! (2) Splicing (3) 3 vég splicing - Poliadeniláció (4) RNS-szerkesztés ( editing ) (5) metiláció

14 Splicing Megfigyelés: Az érett mrns általában rövidebb, mint a DNS-genom szakasz, ami az mrns-t kódolja! Exon: szekvencia-szakasz, amely az érett mrns része is! Intron: Az érés során kivágódó szekvencia-szakasz. Értelmezhető a gén és a hnrns-szintjén is! A splicing során: az intronok kivágódnak, az exonok összekapcsolódnak

15 Néhány érdekesség az exonokról és intronokról Intronok az eukarióta mrns-eken kívül a trns-ek és rrns-ek prekurzoraiban is. Általánosságban, rokon gének intronjainnak pozíciója (!) általában azonos (konzervatív). Mind az intronok száma, mind a hossza változó faj, illetve gén szintjén is. Pl. Emlős DHFR gén: 6 exon, összesen 2000 bázis teljes gén: bázis! Alfa-kollagén: 50 exon, exononként bázis (kb bázis) teljes gén: bázis Nem mindig ugyanazok az exonok maradnak az érett mrns-en! (Alternatív splicing) pl.: patkány Troponin T, RUBISCO-aktiváz Egyes fajok adott génje tartalmaz intront más fajok ugyanazon génje viszont nem! Az intronok általában mindhárom leolvasási keretben tartalmaznak több stop-kodont!

16 Nincs szekvencia-hasonlóság az intron-szekvenciák között! DE! Az exon-intron határokon két dinukleotidos konzervatív szekvencia! Az intron5 vége mindig GU, 3 vége pedig AG dinukleotid. Exon-Intron kereső programok - GENSCAN(MIT's pattern scanning gene finder) - GeneMark(Georgia Tech's gene finder) - FGENESH(HHM-based gene finder from SoftBerry)

17 Eukarióta mrns molekula toplógiája I. Szinte minden mrns molekula alapvetően hasonló felépítésű (topológiájú) 5 Cap A folyamat az RNS-szintézis alatt már megkezdődik (20-30 szabad bázis kell). Addig nem folytatódik az RNS-szintézis, amíg nincs CAP. metil (n=1-4) -guanozin CAP trifoszfát-csoport purin bázis DNS templát szál m (n) G P P P 5 A/G NNN hnrns RNS pol. II transzkripció Funkciók (1) Saját transzkripciójának szabályozása; fontos faktor-kötőhely (2) Exonukleázok elleni védelem (5 3 lebontás akadályozása) Prokariótáknál nincs CAP, degradálódás azonnal megindul! (3) A riboszómákhoz való kötődés, transzláció szabályozása; fontos faktor-kötőhely

18 Leader szekvencia A CAP és a fehérjeszintézis kezdőpontja (AUG) közötti nem kódoló szakasz! Nem kódoló régió = UnTranslated Region /Non-Translated Region = UTR/NTR Általában bázis hosszúság Del lehet pár bázistól több száz bázisig Több fehérjeszintézist szabályozó szekvencia-motívum, faktor-kötőhely. Internal Ribosomal Entry Site = IRES CAP START kodon Kódoló régió Open Reading Frame= ORF m (n) G P P P 5 AUG 5 Leader szekvencia (5 UTR) mrns

19 Kódoló régió A Leader szekvenciától downstream! Az Exonok összekapcsolódásából létrejött folytonosan kódoló szál (csak 1 keretben) Esetek döntő többségében AUG triplettel kezdődik (Metionin!) Prokariótáknál AUG illetve GUG (ritka)! Több AUG is van a kódoló szálon, melyik a kezdő? Nem mindig az első! Kozak-szekvencia Fehérjeszintézis az első STOP kodonig! CAP PPP Kódoló szakasz 5 Leader szekvencia START STOP Purin bázis Triplet-ek= 3 szomszédos nukleotid= 1 beépülő aminosav Guanozin bázis Metionint kódol! (propeptid N-terminálisa M!!!) STOP kodonok: -UAA -UAG -UGA

20 Trailer szekvencia = 3 UTR CAP 5 Kódoló szakasz Trailer szekvencia Nem kódoló szakasz 3 UTR PPP 5 UTR (Leader) START STOP nt 3 Szerepe: Az mrns stabilitásában kiemelt, fontos regulációs faktor kötőhely Citoplazmán belüli lokalizációt szabályozó faktorok kötőhelye ARE régió (AU-Rich Elements): RNS elbomlás szabályozása - RNS instabilitás Mikro RNS-ek célpontjai (mrns kifejeződés szabályozás) Poliadeniláció-iniciációs hely

21 Poliadenin farok CAP 5 3 PPP 5 UTR (Leader) Kódoló szakasz 3 UTR (Trailer) AAAAAA Az eukarióta mrns-ek >99%-a bázis hosszúságú polia-farkos! Elengedhetetlen a nukleo-citoplazmatikus transzporthoz. Megvédi az mrns molekulát a 3 5 degradációtól. Az mrns kódoló génen nincs polit-szakasz! Poliadenilációs szignál AAUAAA (leggyakoribb) AUUAAA AAUAUA Az RNS szintézis nem ott végződik ahol a polia-farok kezdődik (kb bázissal downstream). A hnrnshasítódik annál a pontnál ahol a poliafarok kezdődni fog. Poliadenilációs-szignál szerepe A polia-farok templátfüggetlen módon szintetizálódik (polia-polimerázok) Csak szabad 3 -OH csoport szükséges.

22 Eukarióta hírvívő (messenger) RNS (mrns) topológiája CAP PPP 5 (!!!) 5 UTR (Leader) Transzláció iniciáció Kozak-szekvencia Tranláció termináció [A/G]ccATGG UAA,UAG,UGA START STOP AAUAAA (polyadenilációs szignál) 3 UTR (Trailer) PoliA-farok 3 AAAAAA Kódoló szakasz mrns-ek osztályozása előfordulás alapján - Nagy mennyiségű mrns-ek: több száz kópia/sejt - Közepes mennyiségű mrns-ek: néhány tucat/sejt - Kis mennyiségű mrns-ek: <10/sejt

23 The Devil is in the details" RNS izolálás

24 RNS integritás védelem Az egyszálú RNSmolekulák kémiai természetüknél fogva sokkal instabilabbak, mint a kettős szálú DNS molekulák. VESZÉLYFORRÁSOK: -Lúgos ph (>8.4 ph), magas hőmérséklet (>65 o C). (Kettő együtt!) -Minta, amelyből az RNS extraktum készül, Feltárásnál a szöveti RNS-bontó enzimek (RNÁzok) kiszabadulnak!(lásd később) - Nem megfelelően előkészített anyagok ill. eszközök (pl: pipettahegyek ) - Emberi bőr és testnedvek! MEGELŐZŐ LÉPÉSEK: - Az extrakció fajtájának gondos kiválasztása és a protokoll betartása - A felhasznált anyagok ill. eszközök tisztaságának megőrzése - Megfelelő, tiszta védőfelszerelés használata

25 RNS-bontó enzimek (ribonukleázok- RNÁzok) Szinte minden sejtben jelenlévő enzimcsoport, amely RNS molekulákat képes bontani. Igen stabilak (különböző pufferekben), Forralás, akár autoklávozás után is reaktiválódnak! Reverzibilisen blokkolhatóak!!! Egyes szövetek (pl.: hasnyálmirigy, érésben lévő gyümölcsök) RNÁz-gazdagok Lehetnek endoribonukleázok(láncon belül vág) vagy exoribonukleázok (láncvégeken vág)

26 Extinsic RNÁz aktivitás Extrinsic = mintán kívüli forrásból származó Minden reagensnek, eszköznek, felszínnek RNÁz-mentesnek kell lennie! Steril RNÁz-mentes!!! Lehetőleg külön reagensek, eszközök, munkaterület az RNS-munkáknak Legnagyobb veszélyforrás a bőrfelület! MINDIG HASZNÁLJ (ÉS GYAKRAN CSERÉLJ) KESZTYŰT Külön figyelem az RNS izolálás végén!

27 Laboratóriumi eszközök/vegyszerek előkészítése RNS munkákhoz Előkészítés is kesztyűben Műanyag eszközök: Csak elősterilizált, RNS munkára alkalmas eszközök Üvegeszközök: Száraz kisütés: 2-3 óra, kb. 200 o C Vegyszerek/reagensek: Készítés dátuma és a lejárati idő feljelölve! Használj aliquot-okat!!! (kis adag vegyszer/reagens) RNÁz-mentesítés: DEPC (dietil-pirokarbonát) 0,05 %: Víz!!!, eszközök RNáz mentesítésére Mikróbák! RÁKKELTŐ! Autoklávban elbomlik (CO 2 + Et-OH) PCR Inhibitor H 2 O 2, (3% végkonc.): min fürdő. LEJÁRATIIDŐ!!! RNAse AWAY : Eszközök, munkafelületek RNÁz és nukleinsav-mentesítésére 0,1 N NaOH+ 0,5% SDS oldat: ISMÉTELT MOSÁS, ERŐSEN LÚGOS ph

28 Intrinsic RNÁz aktivitás Intrinsic = A mintából származó A minták homogenizálásakor szabadulnak fel Az RNS-el együtt izolálódhatnak, és később aktiválódnak ( Látens RNÁzok ) IntrinsicRNÁzaktivitás gátlása HŰTÉS (4 o C) RNáz Inhibitorok alkalmazása (legelterjedtebb, lásd később.) Macaloidok-agyagból előállított szuszpenzió (0.015 w/v%-oskoncentrációban) megköti az RNÁzokat. Centrifugálással elválasztható. Vanadil-ribonukleozid komplexek - oxovanádium(iv) ion blokkolja az RNÁzokat! Reverz transzkripciót is gátol!!! Proteináz K / Pronáz- Aspecifikus fehérjebontó enzimek, Széles ph spektrum (4,0-12,0) és hűmérséklet-spektrum (25-65 o C) RNS-el átvihető, elbontja az enzimeket (pl. Reverz transzkriptázt)

29 RNS-extrakció: Biológiai mintákból megfelelő fizikai-kémiai reakciókkal tiszta és intakt, a későbbi kísérleteknek megfelelő (!) RNS molekulák kinyerése! Fő lépései: Szövetminták előkészítése Sejtek feltárása (homogenizálás) Sejt/szövet lizálása (feloldása) RNS feltárás RNS elkülönítése a többi sejtalkotó molekuláktól (fehérjék, DNS ) RNS kicsapás/megkötés ( töményítés ) RNS szubpopuláció(k) szelektálása (OPCIONÁLIS) RNS minta tárolása

30 A sejtkultúrák tulajdonságai az RNS izolálás szempontjából - Korlátlan mennyiségű minta - Általában homogén sejtpopuláció - Természetesen szabadabb sejtfelszín, - Kismértékű előkezelés szükséges a sejtfeltáráshoz (pl.: tripszines emésztés) - Kevés ECM - Jóval egyszerűbb és ismertebb protokollok A szövetminták tulajdonságai az RNS izolálás szempontjából - Kevés minta is megfelelő RNS mennyiséget ad ( 100 mg ) - Heterogén sejtpopulációk heterogén RNS-pool - Változó mennyiségű, minőségű ECM változó mértékű sejfeltárás - In situ vizsgálatokra alkalmas - Nehéz reprodukálhatóság (mintavétel, minta méret )

31 Kézi sejtfeltárás (homogenizálás): - Dounce homogenizátor( douncer ) Alexander Dounce( ) Sejtorganellumok(sejtmag és mitokondrium) izolálásával foglalkozott douncer : üveg mozsár + kerámiaborítású őrlőfej hézag: 13 µm sejtek roncsolódnak, organellumok nem!

32 Mechanikus sejtfeltárás (homogenizálás): Működésének alapja: A mintát erőteljes nyíróerők hatásának tesszük ki, melyek darabokra tépik a szövetet! Polytron - Általános szöveti homogenizáló (pl.: állati-, növényi, bakteriális ) - Cserélhető, könnyen tisztítható (autoklávozható) fej - A fej-egység apró, rezgő fűrészfogazott késekből áll - Hátrányai: - Több minta homogenizálásakor mintakeveredés esélye nagy! - Melegedés, Habképződés - Teljes roncsolás!

33 Mechanikus sejtfeltárás (homogenizálás): -Bead Beater technika Sejtfallal rendelkező minták homogenizálása Sejtorganellumok felszabadítása Ellenálló mintákhoz (pl.: rovarminták, porc ), Apró fémgyöngyök, vagy pengék rázása (ᴓ: 0,1-2mm) Hátrányai: - Gyors hőmérsékletemelkedés - Változó hatásfok

34 Mechanikus sejtfeltárás (homogenizálás): - Szonikálás A minták ultrahangos (20 50kHz) kezelése Előnye: Nincs segédeszköz (pl.: gyöngyök, kések) a mintában. Alkalmas sejtmagvacskák(nukleolusz) (!) felszabadítására is. Hátrányai: - Gyors hőmérsékletemelkedés -Lassú - Változó hatásfok

35 Fagyasztva-porlasztás( Cryopulverization ) A módszer alapja, hogy a szövetek (is) törékennyé válnak extrém hidegben. Jól használható erősebb szöveteknél/mintáknál (pl.: porc, kötőszövet-gazdag minta, növényi magvak...) Lényege: A szövetmintát folyékony nitrogénbe mártjuk, majd mechanikus úton felaprítjuk. Hátránya: - Jelentős mintaveszteség - Anyag/eszközigényes -Veszélyes Előnye a hatásfoka, főleg kombinálva egyéb kémiai detergensekkel.

36 RNS izolálás növényi mintákból SEJTFAL: Primer sejtfal: celluóz mikrofibrillumok, pektinek, glikánok Secunder sejtfal: lignin, kutin Agresszívebb lépések szükségesek a sejtfeltáráshoz! KLOROPLASZTISZ: Saját RNS-ek a gélképen SZÉNHIDRÁTOK, POLIFENOLOK: RNS LiCl-oskicsapása, majd centrifugálás A növényi RNS-ek sokkal stabilabbak, mint az állatiak! Változó RNS-tartalom 1 g Levél µg teljes RNS 1 g Gyümölcshús 6-20µg teljes RNS

37 Sejtfal eliminálása: Enzimatikusúton -protoplaszt-képzés. Gyakran alkalmazott enzimek: lizozim, celluláz, mannáz, zimoláz Előnye: Intakt ( sértetlen ) sejteket eredményez! Hátránya: Nehezen beállítható, nem mindig működik, időigényes (pl.: Saccharomycesfajok aktív osztódásakor (érzékeny) más a sejtfal-összetétel, mint a nyugalmi szakaszban(ellenálló) Mechanikus úton: Leggyakrabban fagyasztva porlasztás (folyékony N 2, majd őrlés) Bead Beater

38 II. A megfelelő membrán-feloldási módszer kiválasztása Két fő kategória: 1. Erős denaturáló szerek: (pl. TRIzol / TRI reagent ) Guanidin-sók(Guanidinium tiocyanate; guanidinium hydrochloride) Nátrium-dodecil-szulfát(SDS) N-Lauril-szarkozin Urea Fenol 2. Enyhe lízis-pufferek(nem-ionos, hipotóniás lízis-pufferek) Hatóanyagok (detergensek): Nonidet P-40 (NP-40) (1% végkonc.) IGEPAL CA-630 [SIGMA] Triton X 100 (0.1% végkonc.)

39 II. A megfelelő membrán-feloldási módszer kiválasztása Erős denaturáló szerek alkalmazása: CÉL: teljes RNS extraktum készítése (rrns, trns, hnrns, mrns ) Az erős denaturálók a sejtmembránt és a sejtkompartmentek membránjait is teljesen feloldják. SŐT szövetminták is homogenizálhatóak benne! Felszabadítja az összes nukleinsavat (genomiális és mitokondriális DNS-t is!) Utólagos DNS-eltávolítás szükséges (pl.: DNÁz-emésztés/ DNS kicsapás) Denaturálódnak és INAKTIVÁLÓDNAK A FEHÉRJÉK (RNÁzokis) szobahőmérsékleten végezhető extrakció.

40 II. A megfelelő membrán-feloldási módszer kiválasztása Enyhe lízis-pufferek alkalmazása: CÉL:a sejtmembrán feloldása mellett a kompartmentekmembrán-integritásának fenntartása. A sejtmembrán és a kompartmentek membránja eltérően reagál a detergensre. Centrifugálással elválasztható a citoplazma-oldat a sejttörmeléktől. A sejtlízis után a citoplazmatikus és a sejtmagi (vagy mitokondriális ) RNS külön-külön izolálható. -NEM INAKTIVÁLÓDNAK AZ RNÁZOK, SŐT! - RNÁz inhibitorok alkalmazása elkerülhetetlen -Extrakciófolyamata előfagyasztott (-20 o C) eszközökkel, vegyszerekkel! -A szöveti RNÁzok is a minta-forrás maghőmérsékletén aktívak!

41 III. A nukleázok aktivitásának gátlása A választott módszer kompatibilis az alkalmazott pufferekkel? Munkafolyamat: 4 o C!!! Ribonukleáz inhibitorok: - Speciális fehérjecsoport (enzimek) - Humán placentából ill. patkány májból izolált enzimek - Szelektíven kötnek egy-, vagy többféle RNÁz enzimet (inaktivál) DE NEM MINDET - Kompetitív, nem-kovalens kötés - A legtöbb enzimes módszerrel kompatibilis (pl.: cdns-szintézis ) - Széles választék (pl.: RNaseOUT, SUPERaseIn, RNAsin, RiboLock ) - Különbség az inhibitorok szelektivitásában, pufferigényében, hőstabilitásában! - Alkalmazásakor kerülni kell: erős só konc., magas hőm., magas urea konc.

42 IV. A megfelelő fehérje-mentesítési módszer kiválasztása CÉL: A sejtlizátum teljes fehérje-mentesítése (RNÁzoktól is) A mintából átvitt fehérjék erősen csökkentik (akár fel is függeszthetik) az enzimatikus reakciókat,. pl.: hiszton-fehérjék. Alkalmazható módszerek: - Proteináz K emésztés (aspecifikus fehérjebontó, SDS, Urea és EDTA jelenlétében is) - Szerves oldószerrel történő ismételt extrakció(pl.: fenol-kloroform) - Guanidin-extrakció alkalmazása - Fehérje-kisózás (kicsapás) - Fizikai szeparáció szilika-oszlopokkal(kit-ek, lásd később) - Ezek kombinációi

43 V. A megfelelő nukleinsav töményítési módszer kiválasztása Meghatározó jelentőségű a további reakciók sikeressége szempontjából, hogy mekkora a kópiaszáma a vizsgálni kívánt RNS-nek (előző e.a anyag). Lehetőségek: RNS precipitáció (kicsapás) különböző só és alkohol kombinációjával Magas só koncentrációjú oldatban a nukleinsavak rosszul oldódnak. RNS-kicsapódás hőmérsékletfüggő (-20 o C akár egész éjjel!) RNS - méretfüggő A sós-alkoholos kicsapás határértékei: DNS: 50 ng/ml RNS: 100 ng/ml!!!

44 RNS precipitáció (kicsapás) különböző só és alkohol kombinációjával Só Törzsoldat konc. Szükséglet végkoncentráció NaOAc 3M (ph 5.2) 0,1 vol. 300 mm NaCl 1M 0,1 vol. 200 mm LiCl 8M 0,1 vol. 800 mm NH 4 OAc 10M 0,2 vol. 2M Glikogén 10mg/ml 0,01 vol. 0.1 mg/ml Alkohol Etanol (95-100%) Izopropanol(100%) Szükséges térfogat a sóoldat hozzáadása után 2,2-2,5 vol. 0,6-1,0 vol.

45 V. A megfelelő nukleinsav töményítési módszer kiválasztása Egyéb lehetőségek: -Vákuum-centrifugálás Hátrány: magas hőmérséklet, sókoncentráció! TÚLSZÁRADÁS - Liofilizálás (fagyasztva- szárítás) Hátrány: drága gép, sókoncentráció! - Szilika-oszlop alapú töményítés (nukleinsav-izoláló kittek) Hátrány: Behatárolt megkötési mennyiség Adott minimum elúciós térfogat. Lásd.: GYÁRTÓI PROTOKOL (!)

46 VI. A kész RNS-extraktum tárolási formái Minta(RNS-extrakció előtt): -Intakt szövetminta vagy sejtkultúra -80 o C-on, vagy folyékony nitrogénben -Guanídium-sóoldatban (pl.: TRIzol ) homogenizálás után -80 o C-on - RNAlater : Szövetmintán belül ható RNS stabilizáló (Terepen is használható) Tisztított RNS-extraktum a legstabilabb, ha alkoholos csapadékként -80 o C-on tároljuk. Rövid ideig (< 1 hét): Nukleáz-mentesvízben /TE pufferben oldva -20 o C-on. vagy alkoholos csapadékként -20 o C-on. Hosszabb ideig (2-6 hónap): Nukleáz-mentes vízben/te pufferben oldva -80 o C-on. Hosszú távú tárolás Tiszta formamid(100%) FORMAzol : >2 év (!) után is stabil az RNS (-20 o C-on) RNAlater RT előtt tisztítani kell! TE puffer: 10 mmtris; 0.1 mmedta; ph 7,5

47 Szilikát-filteres oszlopok Számos különböző gyártó, még több különféle termék Nem csak RNS extrakcióra, RNS tisztításra, DNS extrakció/ PCR termékek tisztítása Működésük alapja azonos: A nukleinsav erősen kötődik a szilika-membránhoz magas só koncentráció, és erős denaturáló szerek (Pl.: guanidium-sók) jelenlétében. Mosási és centrifugálási lépések után a nukleinsav lemosható alacsony só koncentrációjú vizes oldattal! Általában a kitt-hez mellékelt lízis puffer határozza meg, hogy DNS-t vagy RNS-t izolálunk!

48 The Devil is in the details" RNS szubpopuláció-szelektálás, integritás, mennyiség

49 RNS izolálás Affinitás mátrixok polia+ mrns felszaporítása Módszerek csoportosítása: - pozitív szelekció (mrns-t szelektáljuk) - negatív szelekció (rrns-t/trns-t szelektáljuk) A pozitív szelekció: Lényege, hogy a vizsgált molekulát (polia-mrns) különítem el a környezetétől. Módszerek alapja: A mátrix polit és a minta polia szekvenciáinak bázis-párosodása A kapcsolódás magas ion-koncentráció jelenlétében!

50 RNS izolálás Affinitás mátrixok polia+ mrns felszaporítása (pozitív szelekció) Típusai: -polit-borítottcellulóz/polisztiréngyöngyök (mátrix) gyöngyök: kis méret (Ø: 1,1 µm), nagy felület! - biotinilált-oligodt próba + avidin-borított mátrix

51 polit-borított cellulóz/polisztirén gyöngyök pl.: Oligotex mrna Kit- Qiagen MicroPoly(A)Purist Kit - Ambion (Life Technologies ) Poly A+ RNA -Clontech Kiindulási minta: Szeparálás: Eluálás: - tisztított teljes RNS-izolátum(rRNS, trns, mrns...) - sejtlizátum - centrifugálással (pellet összegyűjtése, majd reszuszpenzió) - mágneses módszerrel (pellet szeparálása erős mágnesekkel) (pl.: Magnetic mrna Isolation Kit New England Biolabs.) Alacsony só koncentrációjú pufferrel, előmelegítés ( 55 o C) hatásfoknövelő

52 biotinilált-oligodt próba + avidin-borított mátrix pl: mrnacapturekit -Roche A módszer működésének alapja A polit és a polia szekvenciák bázis-párosodása (oligodt-próba + minta polia) Az avidin erős és magas specificitású kötődése a biotinhoz. 1 avidin: 4 biotin

53 biotinilált-oligodt próba + avidin-borított mátrix pl: mrnacapturekit Roche Kiindulási minta: - tisztított teljes RNS-izolátum - sejtlizátum Próba: Felszín: biotin-jelöltoligodt 20 molekulák Avidin-borított felszínű PCR csövek A módszer előnye: Az izolálás végén a lekötött mrns tovább vihető RT-PCR reakciókra ugyanabban a csőben! Bármilyen nukleinsav-molekula biotinilálható! rrns-szelekció hnrns-szelekció...

54 RNS izolálás Affinitás mátrixok polia+ mrns felszaporítása Módszerek csoportosítása: - pozitív szelekció (mrns-t szelektáljuk) - negatív szelekció (rrns-t/trns-t szelektáljuk) A negatív szelekció: A vizsgált molekulákon (mrns) kívül lehetőleg minden mást kivonok a mintából. Főleg prokariótáknál, mivel nem jellemző a polia-farok az mrns-eken.

55 Prokarióta mrns felszaporítás rrns kifogás A teljes RNS-pooljelentős része 16S és 23S rrns A szelekció lényege: rrns-szekvencia specifikus nukleinsav-próbák szilárd felszínen (pl.: PCR-cső, ELISA lemez, mágneses gyöngyök...) A teljes RNS izolátumból a hibridizált rrns-ek elválaszthatóak rrns, trns szelektív lebontása: A legtöbb bakteriális mrns 5 végén trifoszfát(5 PPP) csoport rrns és trns molekulák 5 végén monofoszfát(5 P) csoport 5 P-specifikus 5 3 exonukleáz(rnáz) alkalmazása Az rrns és trns 10-20%-át távolítja el!

56 RNS izolátumokminőségi vizsgálatai Mikor végezzük el? -Az RNS izolálás után (főleg szöveti RNS) - Hosszú ideig tárolt, ismeretlen minőségű RNS-minta esetén - Ha valami nem működik, aminek működnie kéne

57 Minőségellenőrző vizsgálatok UV spektrofotometria UV abszorpciós (elnyelési) vizsgálatok A vizsgálat alapja: Tiszta nukleinsav-oldatnak karakterisztikus abszorbancia-profilja van! nm-es fényhullámhossz-tartományban. Elnyelési maximum: 260 nm

58 Nukleinsav abszorbancia-profil elemzése Az abszorbancia-profilból(spektrum) megállapítható a minta tisztasága /minősége A profil eltérése a tiszta nukleinsav-oldat profiljától jelzi a szennyezés természetét. Spektrumon azonosítható szennyeződések típusai: Fehérje Sók Szerves vegyületek abszorbancia maximuma: 280 nm abszorbancia maximuma: 240 nm abszorbancia maximuma: 230 nm RNS/DNS abszorbancia maximuma: 260 nm

59 A szennyezés mértékének megállapítása: A különböző abszorbancia-maximumok arányának elemzésén alapul A 260 /A 280 < 1.8 Fehérje-szennyezés (mintából) A 260 /A 230 <1.8 A 260 /A 240 <1,4 Szerves vegyületek jelenléte (pl.: fenolát, tiocianát RNS izolálásból) növényi RNS-nél: akár poliszaharidok! Ionos (só) vegyületek (RNS izolálásból) jelenléte Optimális arányok: DNS RNS Tiszta nukleinsav A 260 /A 280 RNS-nél: 2.0, DNS-nél: 1.8

60 Fontos tudnivalók a nukleinsav-minta UV spektrumáról! -A nukleinsavak A 260 értéke nem ph-függő, DE -A fehérjék A 280 értéke, és így az A 260 /A 280 arány ph-függő!!! ph 5,4 8,5 RNS A 260 /A 280 : 1,5 2.0!!! A ph 8.0 oldat mért értéke a releváns! A nukleáz-mentes desztillált víz ph-ja 6.0! Ne használj NFW-t, használj inkább TE puffert (ph 8.0)

61 - A 260:280 arány eltolódása érzéketlen a fehérjeszennyezés mértékére! - Kis eltolódás is nagy szennyezésre utal! % nukleinsav % fehérje 260:280 arány Tiszta nukleinsav A 260 /A 280 RNS-nél: 2.0, DNS-nél: 1.8

62 Fontos tudnivalók a nukleinsav-minta UV spektrumáról! FENOL SZENNYEZÉS - A fenolnak (TRIzol/TRI Reagens alkotóelem) abszorpciós maximuma: 270 nm! -Csúcs A 270 -nél fenol szennyezésre utal! FIGYELJ RÁ! - A fenol jelenléte a nukleinsav-koncentráció jelentős túlmérésével jár! AZ ALKOHOL SZENNYEZÉS jelenléte a abszorbancia-spektrumon Nem kimutatható!

63 Spektrofotometriás mérések - Figyelmeztetések Ha lehetséges scanning spektrofotométert használj ( nm hullámhossz tart.) Nem elég csak a 260 nm-es érték, kell az egész spektrum! Lehetőleg ne NFW-ben oldott nukleinsavat mérj Az NFW enyhén savas ph-ja (6,0) befolyásolja a mérést Mindig ugyanaz a pufferrel legyen a vak, mint amivel a nukleinsavat feloldottad.

64 Nukleinsav mennyiségi meghatározása spektrofotometriás módszerrel Mikor szükséges: -Reverztranszkripció: megfelelő hatásfokhoz enzim : primer : RNS-templát arány szükséges - Expressziós vizsgálatok: templát mennyiség normalizációhoz A mérés alapja: A nukleinsavak A 260 értéke [RNA]ng/µl= A 260 hígítás 40 [dsdna]ng/µl= A 260 hígítás 50 [ssdna]ng/µl= A 260 hígítás 33 Oligonukleotidok primerek Ahol: (Egyedi ext. koeficiens) A 260 : abszorbancia/optikai denzitás260 nm-en(od 260 ) 40: Az RNS átlagos extinkciós koeficiense (1 OD = 40μg RNS) 50: A dupla szálú DNS átlagos extinkciós koeficiense (1 OD = 55μg dsdna) 33: Az egyszálú DNS átlagos extinkciós koeficiense (1 OD = 33μg ssdna)

65 Minőségellenőrző vizsgálatok Nem spektrofotometria módszerek RNS elektroforézis Előnyei: Hátránya: RNS minta molekuláinak méret szerinti szétválasztása. Nem eszközigényes Egyszerűen elvégezhető RNS-degradáció kimutatható DNS kontamináció kimutatható Nem olyan érzékeny a szennyező anyagokra, mint a spektrofotometria Nem lehet azonosítani a szennyező anyagokat Mintaigényes

66 RNS elektroforézis Intakt, tiszta RNS karakterisztikus elektroforézis-profil Intakt az RNS, ha a 28S rrns: 18S rrnsarány 2:1 (vagy 2,5 : 1) EUKARIÓTA Minél jobban eltér az arány annál használhatatlanabb az izolátum. Intakt RNS elektroforetikus profilja: - Minimális smear (maszat) a 18S és 28S rrns-ek körül -az 5S, 5.8S rrnsés a trns-ekdiffúz sávként a gél alján

67 Minőségellenőrző vizsgálatok Nem spektrofotometria módszerek Ellenőrző RT-PCR reakció Általában sorozatos kudarcok esetén! Lehetséges-e az RNS mintából sikeres RT-PCR reakciót végrehajtani? Elég tiszta/intakt-e a minta? Standard RT-PCR reakció egy jól működő primer-párral pl: β-aktin, GAPDH (glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz) Ha nincs eredmény KUKA és új RNS izolálás

68 The Devil is in the details" Reverz transzkripció

69 A reverz transzkripció célja: - A target RNS molekula DNS-re történő átírása (transzkripciója)! - Eredmény: cdns(c = complementary/komplementer) Kulcsenzim: - RNS-függő DNS polimeráz Szinonimák: RT, RTáz, revertáz, RdDp(=RNA-dependent DNA polymerase) NEM: rt(=real time) RT-PCR rt-pcr Forrás: - Retrovírusok(= Retrográd információáramlás ) pl.: HIV MoloneyMurineLeukemiaVirus(M-MLV) (Moloney = Az első leírójának a neve) Avian Myeloblastosis Virus(AMV) Ezek rekombinánsvariánsai!

70 Az RT enzimek általános tulajdonságai I: -Mezofilenzimek (működési tartomány: o C) Magas hőfokon inaktiválhatóak! (>75-85 o C) - Nem amplifikálnak! -Szabad 3 OH-függőpolimerizáció Csak szálfolytatásra képesek Oligonukleotid(primer) A polimerizáció nukleinsav-típus független: bármilyen RNS molekulát képesek átírni komplementer DNS-re. (cdns)!! részlegesen lebomlott RNS-t is (!) - CSAK 5 3 irányú ásrás!

71 Az RT enzimek általános tulajdonságai II: - Lassú átírás DNS-polimerizáció sebessége: kb. 1-1,5 nt/ sec (in vitro) Taqpolimeráz: nt/ sec - Magas hibaarányú átírás (High error rate/low Fidelity) 1 / (AMV) cdns klónozásnál gond lehet!!! 1 / (M-MLV-RT) Nincs 3 5 exonukleázaktivitása (proofreading)!

72 Az RT enzimek általános tulajdonságai IV. RT-típusok: - AMV-RT és változatai: Felhasználás: rövidebb templátok átírására ( nt) Eredetileg is magasabb hőfokon (50 o C) is aktív. Jobb hatásfok, mint az M-MLV-RT. - M-MLV-RT és változatai: Felhasználás: hosszabb templátokátírására ( nt), full- length cdna Eredetileg alacsonyabb hőfokon aktív (37-42 o C), DE számos mesterséges hőstabil változat! Az RT enzimek fejlesztésének egyik iránya a hőstabilitás növelése!

73 RT enzimek RNS-bontó aktivitása (Ribonukleáz H aktivitás) Az RT enzim felbontja a foszfodiészter-kötéseket az RNS szálon! Exo-, és endonukleáz funkció (szálon belül, és szálak végén is bont). Kettős szálhoz kötött aktivitás: pl.: Templát RNS:primer, vagy RNS:DNS hibrid a polimerizáció lelassulásakor Rontja a reakció hatásfokát, specificitását! Az AMV-RT-nek erősebb, mint az M-MLV-RT-nek! NEM MINDIG ROSSZ! Az RT enzimek fejlesztésének másik iránya az RNAseH-aktivitás csökkentése/kiütése! Teljes hosszas cdns szintézisnél probléma!!!

74 RT reakciót követő RNAseH emésztés (!) Külön kapható RNAse H enzimmel (endoribonukleáz) végezhető (!) Nagyméretű terméket produkáló, ún. Long Range RT-PCR reakciók előtt Felszabadítja a PCR primerek tapadási helyeit a cdns-en. Növeli a PCR reakció hatásfokát. 4-8 bázisonként felbontja a foszfodiészter-kötéseket az RNS:DNS hibrid RNS szálán DE NEM BONTJA EL AZ RNS-t. Bizonyos száljelölő reakciók (pl.: TdT) előtt kötelező! nt RNS 6-8nt cdns 5

75 RT emelt hőfokon (>50 o C) - Csak hőstabil RT enzimekkel - Csak szekvencia spec. primerrel (Tm!!!) - Hosszabb cdns-t eredményez (másodlagos struktúrák) - Az RT-t követő PCR specificitását növeli Hődenaturált RNS-hez előmelegített puffer+rt enzim (Lásd később) Reverz transzkripció - Oligonukleotid primertípusok: (A)OligodT (B) Oligo dt-anchor (C) szekvencia-specifikus reverz primer (D) random hexamer(nnn NNN)

76 Oligo dt-anchor: Anchor-rész(horgony) VTTTTTTTTT 3 Oligo dt-rész 5 Kevert bázisok kódszótára primer mix: ATTTTTTTTTTTTT CTTTTTTTTTTTTT GTTTTTTTTTTTTT Az oligonukleotid primer a target RNS tapadási helyének lehetőleg PONTOS reverz komplementere! RNS Kritikus az első 6-8 nukleotid! RNS RT-enzim dokkolási helye! RNS Oligo dt-anchor

77 Random hexamer - NNN NNN(N= bármely nukelotid) - Templát-független kötődés (rrns, trns, hnrns, mrns...) - Több letapadási hely a templátokon - Több, különböző hosszúságú, RÉSZLEGES cdns termék - Nincs szál ligálás! - Másodlagos struktúrák kikerülhetőek Tmalacsony 25 o C előinkubáció NE >42 o C RT hőmérséklet

78 A reverz transzkripció limitáló tényezői! - RNS templát mennyisége és minősége, tisztasága! (pl.: poliszaharidok, proteázok...) - A target RNS hossza, bázisösszetétele (GC-gazdag-, illetve homopolimer szakaszok) - Másodlagos struktúrák! - Reakciókörülmények!

79 RT reakcióelegy összetétele 0,5 ml-es vagy 0,2 ml-es, steril, zárható tetejű csőben! Hűtött tartóban ( hűtőrack ) kb. 4 O C-on! Nukleáz-mentes deszt. víz Puffer (10x vagy 5x töménységű) dntpoldat (datp, dgtp, dctpés dttpmix) Reverz primer /Oligo dt(anchor) / rand. hex. RNáz Inhibitor (pl.: RNAsin ) Hőstabil RT Hőstabil RNáz Inhibitor! Reverz transzkriptáz enzim +RNS extraktum

80 RT reakcióelegy összeállítása mintaprotokoll Több minta esetén készíts RT-mastermixet! Sok minta (>10) esetén számolj rá 10%-ot! Pipettázási hiba Összetevők 1 csőre Steril dh 2 O (NFW) 6µl dntp(10mm) 1µl Primer (20µM) 1µl 8µl Ne melegítsd az RNS-t pufferált közegben + 2μl( ng) of RNS templát Hődenaturálás: 70 o C 5 perc, majd azonnal jégbe (min. 2 percre) Összetevők 1 csőre Steril dh 2 O (NFW) 6µl 10X Puffer (ph 8,3) 2µl RNÁz Inhibitor (20U/µl) 1µl RT enzim (20U/µl) 1µl 10µl Hőstabil RT-enzim: + Előmelegített (RT optimum hőm.) Mastermix 2

81 Reverz transzkripciós hőprogram Reverz transzkriptáz mezofil enzim Optimum hőmérséklet RT-enzimfüggő, általában 42 O C Magas hőfokon (>75 o C) inaktiválhatóak. Az átírási idő függ a target RNS mennyiségétől, hosszától, az alkalmazott RT-enzimtől Klasszikus hő program: 25 O C 5 min Primer tapadás (random hexamer) 42 O C 10 min -1 h Lánchosszabbítás (Elongáció) 85 O C 5-15 min Enzim inaktiválás (Termináció) 4 O C HA struktúráltaz 5 vég: o C 5 min

82 RT adalékanyagok - Glicerol(max. 20 v/v%) - DMSO (Dimetil Szulfoxid, max 10 v/v%) RNS strukturáltság csökkentése DE, PCR inhibitor (>0,4 v/v%) - Zselatin (max 10 μg/ml végkonc.) - Acetilált BSA (Bovine Serum Albumin) Stabilizálja az RT enzimet Az RT-PCR érzékenységét növeli

83 Tth RNS/DNS polimeráz - Thermus thermophilus termofil DNS polimeráz enzimje -74 o C-on aktív, Fél életidő: 95 o C-on 20 perc (hőstabil) -5 3 DNS polimeráz aktvitás DNS templátról (Mg 2+ függő) -5 3 DNS polimeráz aktvitás RNS templátról (Mn 2+ függő) Ugyanaz az enzim használható az RT-hez és a PCR-hez is! Hátrányai: - Rossz hatásfokú cdns szintézis -Mn 2+ eltávolítása -Mn 2+ rontja a PCR érzékenységét DNS exonukleáz aktivitás (szálbontó)

84 Kiegészítő szál szintézis Az RT reakció (cdns szintézis) eredménye: kettős szálú RNS:DNS hibrid A kiegészítő szál szintézis célja: DNS:DNS kettős szálú molekula Leggyakoribb: PCR (az első ciklusban elkészül a kiegészítő szál) (ha van ismert primer hely a cdns3 végén) Egyéb módszerek: - SMART cdns szintézis (Clontech) - Self-priming módszer - Szálcsere módszer

85 The Devil is in the details" RT-PCR első rész

86 PCR Áttekintés Lényege: Egy (vagy több) célzott DNS molekula in vitro enzimatikus úton történő felszaporítása! Kulcsenzim: Hőstabil(hipertermofil; > 60 o C) DNS polimeráz enzim (pl.: Taqpolimeráz) A nukleinsav polimerizáció (in vitro és in vivo) két fő követelménye: - Templát szál (sablon), amelyről az átírás történik DNS extraktum / cdns/ nyers DNS minta (pl.: Baktérium telep, fág plakk) -Szabad 3 -OH csoport, amelyhez a következő nukleotid foszfodiészter kötéssel kapcsolódhat PCR-ban: Oligonukleotid primer

87 PCR alapja: A hőmérséklet ciklikus változtatása: Fűtés-hűtés ciklusok sorozata a DNS disszociációja és az oligonukleotidprimerek enzimatikus meghosszabbítása a célpont DNS felsokszorozása érdekében. A reakció egy PCR készülékben ( thermal cycler ) ciklusosan zajlik: 1. DNS denaturációja(95 o C) 2. Primer tapadás (Annealing) a célmolekulára (42-65 o C) 3. Primer meghosszabbítása (72 o C) Ez a ciklus 30-35x ismétlődik

88 PCR Eredmény Igen kis mennyiségű kiválasztott templát DNS több milliószoros (!) mennyiségben felsokszorozható viszonylag rövid időn belül. Fontos fogalmak - Szenzitivitás: minél kevesebb kiindulási DNS - Szelektivitás: csak a kívánt DNS -Produktivitás ( hozam ): kívánt mennyiségű felszaporítás Egy optimalizált PCR nagyon szenzitív (akár 1 db DNS molekula) és nagyon produktív (akár db)

89 Kontamináció Megelőző lépések I. Carryover (amplikon) kontamináció: Egy előző PCR reakció terméke akaratlanul (kontrollálatlanul) átkerül a következő reakcióba. (Vigyázz, nem konzekvens jelenlét!!!) A reakcióelegy összeállításának bármely pontján Ragályos, szétterjed a laborban (!) Jobb megelőzni, mint megszüntetni L K +K Megelőző lépések - A labor saját eljárás utasításai (Standard Operating Procedure SOP) - Lehetőleg minél kevesebb lépés - Munkafolyamatok szétválasztása (Labor tervezés) - Egyirányú anyagáramlás -UV megvilágítás alkalmazása

90 Kontamináció Megelőző lépések II. - Munkafolyamatok szétválasztása (Labor tervezés) - Lehetőleg külön helyiség (vagy legalább külön asztal) - Külön eszközök (pipetta, hegy, tartók, köpeny...) NINCS CSEREBERE! - Anyagáramlás a legtisztábbtól, nincs visszaút! - Legveszélyesebb: Gélelektroforézis Reagens előkészítő (PCR mastermix) nukleinsav-mentes Templát (nukleinsav) előkészítő PCR termék vizsgálat (gélelektroforézis) PCR amplifikáció (PCR készülék)

91 Kontamináció Megelőző lépések III. - Fő veszélyforrás: Aeroszol (pipetta-kontamináció) - Filteres pipettahegyek alkalmazása (legalább a templát bemérésénél) - Mindig csak egy cső nyitva a templát bemérésénél (PCR reamplifikációnál!) - Negatív kontroll - Uracil-N-glikoziláz(UNG) alkalmazása PCR reakcióelegy: dttp helyett dutp Templát inkubálása UNG-vel Az UNG-kezelt templát hozzáadása a reakcióelegyhez

92 RT-PCR Áttekintés Két lépéses folyamat: (1) Az RNS molekulák átírása cdns-re(cdns szintézis) (2) target-cdns felszaporítása PCR módszerrel. cdns szintézis / Reverz transzkripció: Adott RNS molekula komplementer DNS-re (cdns) történő in vitro enzimatikus átírása Szabad 3 -OH függő (Primer-függő) átírás, általában alacsony hőmérsékleten (42-55 o C) RT primerek: specifikus Oligo(dT) random hexamer

93 Kétlépéses RT-PCR (Two-tube/ Two-step RT-PCR) -Az RT és a PCR térben és időben is elkülönülve, külön csőben. - Egy cdns termék több PCR-t is kiszolgálhat RT reakcióelegy összetétele Nukleáz-mentes deszt. víz Puffer (10x vagy 5x töménységű) dntp oldat Reverz primer RNáz Inhibitor (pl.: RNAsin ) Reverz transzkriptáz enzim +RNS templát PCR reakcióelegy összetétele Nukleáz-mentes deszt. víz Puffer (10x vagy 5x töménységű) dntpoldat Reverz primer Forward primer Hőstabil DNS polimeráz enzim (Taq) +(c)dns templát RT: 42 o C PCR: o C

94 Egylépéses RT-PCR (Single-tube/ One-step RT-PCR) -Az RT és a PCR csak időben elkülönülve, ugyanabban a csőben. - Főleg diagnosztikai vizsgálatokhoz - Megoldandó probléma: mezofil RT (cdns szintézis) vs. hipertermofil PCR Alapja a termostabil polimeráz választása -TthRNS / DNS polimeráz - Hot start DNS polimerázok: Konvencionális Taq DNS polimeráz, antitaq antitesttel inaktiválva(rt alatt) RT után hődenaturáció(95 o C-10 min), RT inaktiválás és Taqaktiválás

95 Termostabil(hipertermofil) DNS polimerázok I. Alapvető különbségek: hőstabilitás (féléletidő 95 o C-on) (Mennyi ciklust bír ki?) átírási sebesség átírási kapacitás száljavító aktivitás ( proofreading ) (Milyen gyorsan képes dntp-ket beépíteni?) (Mekkora terméket képes átírni?) 3 5 exonukleázaktivitás

96 Termostabil(hipertermofil) DNS polimerázok II. Alapvető jellemzők: 3 5 -Száljavító (+) enzimek (pl.: Pfu, Vent R ) - Hőstabilabbak Hosszabb templátokat képesek átírni ( bp) -Nincs T túlnyúlás a lánc 3 végén ( Tompa vég / Bluntend ) -Lassabb átírás: 2 min / 1000 bp ELBONTJÁK A SZABAD PRIMEREKET (!) A templát után mérjük be az enzimet (!) - Száljavító (-) enzimek (pl. Taq, Tth) - Rövidebb templátokat képesek átírni ( bp) -Van T túlnyúlás a lánc 3 végén ( Ragadós vég / Stickyend ) -Gyorsabb átírás: 1 min / 1000 bp 3 T 5 5 T 3

97 Termostabil(hipertermofil) DNS polimerázok II. Enzim mixek (Enzyme blends): A száljavító (-) enzimek átírási sebességét és a száljavító (+) enzimek átírási kapacitását egyesíti! (Gyorsan sokat) A két enzim (Taq + Pfu) együttműködve végzi az amplifikálást A Taq végzi az átírás dandárját A Pfu pedig a hibajavítást Akár bptermékek is amplifikálhatók A nagyobb ciklusszámú (>35) PCR reakcióknál az utolsó ciklusokban csak a Pfudolgozik, a Taqkiég!

98 Enzimválasztás megfontolások - Rövid termékekhez (<1500 bp): Sima Taq polimeráz Egylépéses RT-PCR is lehet - Közepes termékekhez ( bp): Pfu vagy proofreading(+) polimeráz - Hosszú termékekhez (>4000 bp): Long Range Enzim mixek (Taq + Pfu)

99 Oligonukleotid primerek - A sikeres PCR amplifikáció alapja KÉT jól megtervezett oligonukleotid primer (!) - A polimeráz a primer 3 végét folytatja templát-függő módon. Kódoló szál (ekvivalens: mrns) Templát szál (ekvivalens:cdns) 5 primer Upstream primer Forward primer Sense primer (+) primer Watson 3 primer Downstream primer Reverse primer Antisense primer (-) primer Crick

100 Oligonukleotid primerek nukleotid sorrend Tapadási hely Kódoló szál mrns Tapadási hely Forward Reverz Forward primer nukleotid sorrendje: Megegyezik a kódoló szálon (mrns-en) lévő tapadási hely szekvenciájával. Reverz primer nukleotid sorrendje: A kódoló szál (mrns) tapadási helyének komplementere fordított irányban.

101 Oligonukleotid primerek tervezése Alapszabályok I. Méret: nukleotid(méret akkor specificitás ) 3 vég bázispárosodása elengedhetetlen (legalább az első 6-8 nt) 5 vég permisszív, túlnyúló szekvenciát is tartalmazhat (pl.: Adapter) Magas GC tartalom kerülendő (40-55% ideális) GC eloszlás egységes legyen Kerülendő az ismétlődés (pl.: CGT CGTCGTCGT) Max két darab G vagy C legyen a 3 vég utolsó 6 bázisán

102 Oligonukleotid primerek tervezése Alapszabályok II. Intramolekuláris hibridizáció Nem specifikus leverődés Hozamcsökkenés (akár jelentős) Intermolekuláris kapcsolat (3 3 végek között) Primer-dimerek, hozamcsökkenés Specifikus termék 100 bp Aspecifikus termék (primer-dimer)

103 Olvadáspont (Tm) Az a hőmérséklet ahol a reakcióközegben lévő egyazon oligonukleotidok fele hibridizálva van a célpont DNS-hez, a másik fele szabadon van Függ a primer hosszától és a bázisösszetételétől (hossz akkor Tm ; GC tartalom akkor Tm ) Valamint a puffer mono- és divalens kation mennyiségétől (Na + és Mg 2+, akkor Tm ) ATG TGC ACA Tm kiszámítása (hozzávetőleges) = 26 o C Tm= 2 o x(a+t)+ 4 o x(g+c) Csak nt hosszúságú primereknél Max 68 o C-os számított értékig alkalmazható Nem veszi figyelembe a szabad Mg 2+ koncentrációt (!) 5 túlnyúlást (pl. adaptert) tartalmazó primereknél a primernek csak a hibridizáló része vesz részt a Tmszámításban (!)

104 Az olvadáspont és az annealing(t A ) viszonya Az alkalmazott primerek Tmértéke határozza meg a PCR reakció T A hőmérsékletét. T A = Tm-5 o C Tm hatása a PCR reakció kimenetelére PCR reakciók esetében fontos, hogy lehetőleg azonos vagy közel azonos Tm-el rendelkező primereket használjunk. Ha különbözik a két primer Tm-je, akkor alacsonyabbtm-esprimer alapján határozzuk meg az annealing hőmérsékletet.

105 Degenerált oligonukleotid primerek I. Kevert bázisok kódszótára Primer mixek (!), ahol az egyes primerek szekvenciái közel azonosak, adott pozícióban viszont különböző, meghatározott bázisok lehetnek CCT CCYGCA ATW3 5 CCT CCC GCA ATA 3 25% 5 CCT CCTGCA ATA 3 25% 5 CCT CCC GCA ATT 3 25% 5 CCT CCTGCA ATT 3 25% Hasznosak, ahol Nem ismert a modellorganizmus cél-nukleinsav szekvenciája Rokon célmolekulákat együtt szeretnénk amplifikálni (pl.: duplikált gének mrns-ei, Single nucleotide polymorphism- SNP)

106 Degenerált oligonukleotid primerek II. A primer(-mix) degeneráltsági fokát növelve a primer(-mix) szelektivitása csökken (!) Max. 4-5 degenerált pozíció legyen. Degeneráltsági fok csökkentése: Inozin: Mind a négy bázissal képes kapcsolódni. Ne legyen a primer 3 végén (!) Egyes enzimeknél (Pfu) ne használd (!) CCT CCYGCA ATI3 5 CCT CCC GCA ATI 3 5 CCT CCTGCA ATI 3

107 The Devil is in the details" RT-PCR második rész

108 Oligonukleotid primer tervezése I. - Ismert szekvenciára (a modellorganizmus cél-mrns szekvenciája ismert) - Ismert rokon szekvenciára, (lehetőleg közeli) rokon modellorganizmus - A cél mrns által kódolt ismert aminosav szekvenciára Backward seqencing pl. rövid neuropeptid-szekvenciák, shotgun-sequencing

109 Oligonukleotid primer tervezése I. Ismert szekvenciára (a modellorganizmus cél-mrns szekvenciája ismert) Teljesen szekvencia-specifikus, optimális primerek tervezhetőek full match primer pairs Érdemes online primer tervező programok használata pl:primer Blast

110 Oligonukleotid primer tervezése II. Ismert rokon szekvenciára, (lehetőleg közeli) rokon modellorganizmus A vizsgált organizmus célpont mrnsszekvenciája nem ismert, DE rokon modellállatok célpont mrns szekvenciái igen. 1. célpont mrns szekvenciák legyűjtése GenBank adatbázisból 2. A szekvenciák illesztése (pl.: ClustalW/ Omega...) 3. Konzervatív régiók azonosítása (általában degenerált primer lesz) Transferrin mrns

111 Oligonukleotid primer tervezése III. - A cél mrns által kódolt ismert aminosav szekvenciára Backward seqencing - Cél: A rendelkezésünkre álló peptidet kódoló mrns(ek) kifogása RT-PCR-el. Törekedjünk egy triplet-es (Met, Trp) aminosavakban gazdag régiót találni Kodon preferencia táblázat alapján szelektálhatóak a preferált triplet-ek 6x triplet-es aminosavak (pl.: Leu, Arg) kerülendők

112 Primerek feloldása Rendelt primer liofilizálva érkezik Feloldás(NFW-ben, SOP alapján): - tömeg alapján (µg) - molekula mennyiség alapján (mol) 1. Törzsoldat készítése (100µM vagy 1 µg/µl) 2. Munkahígítás készítése (20µM vagy 0,1 µg/µl)

113 Long Range PCR Enzim: Általában enzim-mix (Taq + Pfu, Bővebben lásd 6. EA anyaga) dntp: ultratisztított dntp-k, emelt végkoncentrációban ( µm) Mg 2+ koncentráció: Optimalizációszükséges (1,5-2,5 mm) Templát: Lehető legtisztább, legintaktabb DNS (cdns) Reakció kondíciók: Primerek: Hot start PCR Elongáció: 68 o C, 1min/kb (Tovább életképes az enzim) Általában két primer-pár (Külső és belső primer-pár) Primer Tm> 65 o C, Tmkülönbség max1-2 o C Szekvencia specifikus full-match primerek minimum nt NESTED PCR

114 Long Range PCR Gélelektroforézis Termék méret függő gél-sűrűség és futtatási feszültség Futtatási feszültség alapja az elektródák távolsága (cm) Nagyobb méretű (>7 kb) termékeknél hűtés ajánlott VIGYÁZZ: 0,7%-os gél könnyen szakad (!) Forrás:

115 Hot start PCR Megoldás: Hot start enzimek alkalmazása (anti-taq antitesttel blokkolt Taq, lásd 6. EA) A reakciócsövet visszatartod amíg a blokk el nem éri a 94 o C-ot A reakcióelegy egyik komponensét (pl. dntp) csak 94 o C-os reakcióelegyhez adod A reakcióelegy komponenseit hőre lágyuló inert viasz (Pl.: AmpliWax ) választja el.