Biológiailag aktív molekulák kölcsönhatásvizsgálata NMR-spektroszkópiával

Átírás

1 Biológiailag aktív molekulák kölcsönhatásvizsgálata MR-spektroszkópiával 1 H- 15 -HSQC Perczel András Budapest,

2 Ugyanazt az MR paramétert ( 1 H, 13 C, 15, 31 P, 57 Fe) követjük. L szabad forma E EL kötött forma E + L k 1 k 1 EL K d = = k +1 k +1 [E] [L] [EL] Cserefolyamatok az MR-spektroszkópiában Chemical exchange kémiai csere avagy a mag kémiai környezetének a cseréje Csere: ugyanaz a mag kettő vagy több kémiai környezet között ugrál, amelyek MR paraméterei eltérnek: - kémiaieltolódás-értékei (CSA), - skaláris vagy dipoláris csatolási állandók (J, D) - relaxációs paraméterek (T 1, T 2, OE)

3 A cserefolyamat megjelenése a spektrumban annak függvénye, hogy miként viszonyul egymáshoz a cserefolyamat sebessége és a különböző állapotok MR paramétereinek a nagysága. az MR időskálán lassú csere miatt a kötött és a szabad forma jelei szétválnak az MR időskálán közepes sebességű csere (a jel eltűnhet) az MR időskálán a gyors csere miatt egybeolvadnak a kötött és a szabad forma jelei

4 Jellegzetes MR mozgási időskálák lassú igen gyors igen lassú gyors ultra gyors s ms μs ns ps fs relaxációs időskála makroszkópikus diffúzió és spin-rács relaxációs áramlás spektrális kémiai időskála csere Időállandó (T 1 ) molekuláris (tipikusan a spektrum reciproka (Hz) rotáció sec., vagy min.) (ω 1 - ω 2 )τ spek 1 Δω=2500Hz (5ppm 11.74T) τ spek 32μs Larmor-időskála ami alatt a spin 1 radiánnyit precesszál molekuláris ω 0 τ 0 1 vibráció pl. ω 0 =500MHz τ 0 0.3ns lassú csere jelalak perturbáció gyors csere

5 az MR időskála relatív: ugyanazon molekuláris komplexben egyszerre lehet lassú, közepes és gyors cseresebességet megfigyelni A 15 jelölt S100B fehérje és a CapZ peptid 1 H- 15 HSQC spektruma. (1mM fehérje + 0; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,5; 2,5 mm peptid) Kilby, Van Eldik és Roberts. Protein Sci. 1997, 6, ν L ν EL kicsi nincs jelszélesedés nagyon gyors csere ν L ν EL nagyobb jelszélesedés közepesen gyors csere ν L ν EL igen nagy jelentős jelszélesedés közepes csere

6 Egy ~17 kda globuláris fehérje 1 H-spektruma H 2 O/D 2 O 9/1, T=300K, c 1mM ( p p m )

7 Heteronukleáris egyszeres-kvantum koherencia spektrum HSQC = Heteronuclear Single-Quantum Coherence 1,1 J~90Hz H z -2H z y +2H z y cos( t 1 ) H x cos( t 1 ) H x cos( t 1 )cos( H t 2 ) H

8 3D-OESY-HSQC

9 2D és 3D MR-spektrumok összevetése Homonukleáris 2D TOCSY Homonukleáris 2D TOCSY amid H (ujjlenyomat) tartománya

10 2D és 3D MR-spektrumok 15 1 H 1 H- 1 H TOCSYamid H (ujjlenyomat) tartománya 1 H 1 H- 15 3D TOCSY csíkok (strips) EVTCEPGTTFKDKCTCRCGSDGKSAACTLKACPQ

11 Három esettanulmány 1) Természetes szerinproteáz-inhibitorok kötődésvizsgálata 2) A dutpáz katalitikus mechanizmusának és ligandumkötésének vizsgálata 3) Kalmodulin és egy Vinca alkaloid analóg (KAR2) kötődésvizsgálata

12 Természetes szerinproteázinhibitorok kötődésvizsgálata MR-rel jelölt ligandum (4kDa), jelöletlen fehérje (25kDa) együttműködésben Gráf Lászlóval és munkatársaival (ELTE Biokémiai Tanszék)

13 Katona et al. J.Mol.Biol.2002, 315, Töltések a humán tripszin felületén Arg193=S 2 Gly193=S 2 humán tripszin 4 humán tripszin 1

14 Arg193 Gly csere 1E-10 K i (M) T4 1E-08 T4 Arg193Gly 1E-06 T4 Arg193Gly benzamidin STI BPTI hpsti APPI Kanonikus inhibitorok T4 igen rezisztens természetes inhibitorokra soybean TI bovine pancreatic TI human pancreatic secretory TI Alzheimer precursor protein I

15 SGCI inhibitorok SGTI (SGCI var.) szerepe lehet a humán tripszin 4-nek SGTI Alzheimer prekurzor fehérje (100kDa) Minn, A. és mts.1998, 22, Xxx-Lys(Arg) b-amiloid peptidek e.g.a1-40, A1-42

16 Enzim-inhibitor komplex kötődési vizsgálatok 15 jelölt inhibitorral

17 Az SGTCI 1 H- 15 HSQC spektrumának részlete SGTI Lys-Arg SGCI SGTI GLY31 SGCI THR29 15 SGTI THR28 SGCI CYS28 SGTI CYS27 1 H SGTI LYS30 SGCI LEU30 SGCI LYS31 SGTI ARG29 SGCI ALA32

18 SGCI LEU30 15 SGCI CYS28 SGCI LYS31 1 H SGCI ALA32

19 SGCI Gly23 Gly7 Thr8 15 Gly20 Thr9 Asp22 Lys24 Lys11 Phe10 Cys17 Asn15 Asp12 Leu30 Lys13 Cys19 1 H

20 SGCI + 10% kimotripszin Gly23 Gly7 Thr8 Gly7 15 Gly20 Thr9 Asp22 Lys24 Lys11 Phe10 Cys17 Asn15 Asp12 Leu30 Lys13 Cys19 1 H

21 SGCI + 30% kimotripszin Gly23 Gly7 Thr8 Gly23 Leu30 15 Gly20 Gly20 Phe10 Phe10 Cys17 Cys17 Cys19 Asn15 Asp12 Asp12 Leu30 Lys13 Lys13 Cys19 1 H

22 SGCI + 50% kimotripszin Gly23 Gly7 Thr8 Gly23 Thr8 Gly7 Leu30 15 Gly20 Gly20 Phe10 Phe10 Cys17 Cys17 Cys19 Asn15 Asn15 Asp12 Asp12 Leu30 Lys13 Lys13 Cys19 1 H

23 SGCI + 70% kimotripszin Gly23 Thr8 Gly7 Leu30 15 Gly20 Phe10 Asn15 Asp12 Cys19 Cys17 Lys13 1 H

24 SGCI + 90% kimotripszin Gly23 Thr8 Gly7 Leu30 15 Gly20 Phe10 Asn15 Asp12 Cys19 Cys17 Lys13 1 H

25 éhány észlelt változás Gly23 Thr8 Gly7 Gly20 Phe10 Cys17 Cys19 Leu30 Asn15 Asp12 Lys13 Lys13 Asp12 Asn15 Leu30 Phe10 Cys17 Thr8 Gly7 Cys19 Gly20

26 Miért volt hasznos az MR? 1) Megállapítottuk, hogy a ligandkötődés az MR időskálán nem gyors, hanem közepesen lassú. 2) Behatároltuk a kötődésben résztvevő aminosavakat.

27 A dutpáz katalitikus mechanizmusának és ligandumkötésének vizsgálata dezoxiuridin-trifoszfát nukleotidohidroláz H O O O H jelöletlen ligandum, jelölt fehérje óriás (60kDa) O O O O O P O P O P OH O O P OH O O OH OH OH O H H H H H OH H OH O O dezoxiuridin-5 -trifoszfát HO P O P OH OH O együttműködésben Vértessy Beátával és munkatársaival (MTA SZBK Enzimológiai Intézet)

28 DS javító mechanizmusok H timin O CH 3 DS polimeráz építi be a DS-be a dutp/dttp koncentráció függvényében O H 2 ártatlan helyettesítés H O O Base Excision Repair Uracil eliminálása a DS-ből O citozin oxidativ dezaminálás mutagén 500/nap/genom uracil

29 Timinmentes sejthalál és kemoterápia dutpáz (antagonisták) OH CH 2 O C H C COOH CH 2 H CH 2 DS dutp dutpáz Fluoruracil (FdUMP) dump TS H 2 H CH 2 COOH 5, 10 -metiléntetrahidrofolát DHF reduktáz metotrexát dttp dtdp dtmp dihidrofolát OH CH 2 H O C H H C CH 2 COOH Programozott sejthalál előidézhető a dutp szint növelésével (dttp szint csökkentésével) antagonisták segitségével : dutpáz antagonisták Fluoruracil metotrexát H 2 H CH 2 COOH

30 A dutpáz szerkezete Szimmetrikus homotrimer, három aktív centrummal első röntgenszerkezet 1992 ature C alacsony elektronsűrűség Kovári és mts. J.Biol.Chem. (2004)

31 MW» 60 kda mit lát az MR? 15 dutpáznak csak a flexibilis részeit! Ala/Pro C HSQC: w/o ligands HSQC: w/dudp d 15 / ppm d 15 / ppm d 1H / ppm d 1H / ppm

32 15 MW» 50 dutpáznak kda mit csak lát a az flexibilis MR? részeit! Ala/Pro C -terminus: PSTDFADIPAAKKMK C-terminus (Motif 5): GEAGFGSTGVK 149 hozzárendelés 1 H- 15 HSQC-TOCSY 1 H- 15 HSQC-OESY G E A G F G S T

33 Inhibitor hatására a 5. motívum (C-terminális) Gly149-Thr156 része rendeződik ezek a jelek eltűnnek a 1 H- 15 HSQC spektrumból

34 HSQC I intenzitás Miért volt hasznos az MR? 1) Szerkezeti modell: - a 149 Gly- 156 Thr oktapeptidre - a konzervativ Phe és a dezoxiuridin kapcsolatára 1,0 0,8 0,6 2) allosztérikus modell az eukariota dutpáz szubsztrátkötésére dump, dudp, duppp független kötés dudp duppp számolt dudp számolt harmadenzim dudp Ser geag 0,4 0,2 0, c L / mm ligand konc. mm Dubrovay és mts. J.Biol.Chem 2004

35 Kalmodulin és egy vinca alkaloid analóg (KAR2) kötődésvizsgálata MR-rel A kalmodulin funkciója Ciklikus nukleotid metabolizmus apocam Ca 2+ -CaM Ca 2+ jel jelöletlen ligandum, jelölt átrendeződő fehérje (17kDa) Foszforiláció Citoszkeleton együttműködésben Ovádi Judittal és munkatársaival Ca 2+ Transzport Defoszforiláció

36 A kalmodulin szerkezete Ca 2+ mentes CaM Bax et al. at.struct.biol. (1995) Ca 2+ hatása - a domének hélixei átrendeződnek - a hidrofób régiók felszínre kerülnek Ca 2+ Ca 2+ kötött állapotban súlyzó alakú, a két globuláris domént középen továbbra is flexibilis α-hélix köti össze Chattopadhyaya et al. J.Mol.Biol. (1992)

37 Kalmodulin (CaM) antagonisták tipikus hatásmodellje kalmodulin 4Ca 2+ C EZIM E C C TFP TFP antagonisták: pl. -fenotiazinok (TFP; trifluorperazin) célfehérjék: - foszfodiészteráz - CaM függő kinázok -naftilszulfonamidok (W-7) - adenilát cikláz -egyes vinca alkaloidok CH 3 - foszfofruktokináz Cl - calcineurin - stb. SO 2 H(CH 2 ) 6 H 2 W-7 Vértessy és mts. Biochemistry, 1998, 37, (CH 2 ) 3 S TFP CF 3

38 A kalmodulin modul reorientációja célfehérje vagy antagonista hatására C EZIM E C C összecsuklik, - az - és C-terminális közel kerül egymáshoz, - ám a D és az E α-hélixeket összekötő részről az alacsony elektronsűrűség miatt nincs szerkezeti információ

39 A komplikáció oka: A célfehérje vagy antagonista bekötése során mért kémiaieltolódásváltozás eredete kettős: - közvetlenül a kötődés által kiváltott változás - modul átrendeződés (reorientáció) által kiváltott változás

40 Vinca alkaloidok (bisindol) mint CaM antagonisták Catharantus (Vinca) roseus alkaloidjai (vinblasztin, vinkrisztin) VBL - sejtosztódásgátló hatás (kemoterápia) - célpontjuk a sejt mikrotubuláris hálózata - jelentős mellékhatások (neurotoxicitás) Vinblasztin KAR - In vivo kísérletekben ugyanolyan hatékonynak bizonyult, mint a természetes vinca alkaloidok - Mellékhatása jóval kisebb KAR-2 Orosz és mts. British J.Pharmacol. 1997, 121, 947 Orosz és mts. British J.Pharmacol. 1997, 121, 955 Orosz és mts. British J.Cancer 1999, 79, 1356

41 Ezért egy új kötőhelyet feltételezhetünk a kalmodulinon. EZIM TFP VBL C E C C KAR KAR-2

42 A kalmodulin 1 H spektrumának amid H és aromás tartománya A kalmodulin 1 H- 15 HSQC spektruma A kalmodulin 1 H spektrumának alifás tartománya l ( p p m ) l H 2. 4 ( p p m )

43 A kalmodulin és a KAR2 titrálása során kapott 1 H- 15 HSQC spektrumok összevetése l5 l H

44 CaM másodlagos szerkezeti elemei Röntgendiffrakciós vizsgálatokból nyert adatok Aminosavak, amelyek környezete megváltozik az alegységek átrendeződése miatt Aminosavak, amelyek a KAR2 közvetlen szomszédjai MRspektroszkópiai adatok Aminosavak, amelyek KAR2 megkötése során jelentős kémiaieltolódás-változást mutatnak A hélix B és C helix közti hurok E hélix F és G helix közti hurok 14 Glu 18 Leu 40 Gly 41 Gln 42 Asn, 81 Ser 84 Glu 87 Glu 91 Val 112 Leu 114 Glu 15 Ala 18 Leu 19 Phe 39 Leu, 41 Gln 68 Phe 71 Met 72 Met 80 Ala 84 Ile 85 Ile 88 Ala 109 Met 112 Leu 114 Glu 116 Leu 124 Met, 144 Met 145 Met 147 Ala 148 Lys 15 Ala 16 Phe 18 Leu 21 Lys, 27 Ile, 32 Leu 36 Met 39 Leu 40 Gly 53 Asn 81 Ser 91 Val 92 Phe 94 Lys 110 Thr 114 Glu 129 Asp 130 Ile 136 Val 137 Asp

45 Felulet, nmr syineyes alapjan (minden shift egzsyinu) video (no KAR2)

46 Felulet, nmr szinezes alapjan (ket szin) video ( KAR2 yes)

47 Miért volt hasznos az MR? 1) Megállapítottuk, hogy a ligandkötődés az MR időskálán gyors. 2) Behatároltuk a kalmodulin KAR2 kötésében részt vevő aminosavak jelentős részét. 3) Összhangban a krisztallográfiai adatokkal, egy új kötőhelyet azonosítottunk a kalmodulinon. 4)Igazoltuk, hogy a röntgen szerkezet és az oldatfázisú szerkezet igen hasonló lehet.

48 Legyen a komplexképződés sebességi együtthatója k (k 1 = k +1 legyen egyforma) A csere L és EL állapotok között akkor lassú, ha: k «2π ν L ν EL A csere L és EL állapotok között akkor gyors, ha: k» 2π ν L ν EL Ha pl. ν L ν EL = 2kHz, akkor k» 1, s -1