Az É lő S e j t S z a b á l y o z o t t Ca2+

Átírás

1 Az É lő S e j t S z a b á l y o z o t t Ca2+ P e r m e a b il it á s a : Ca2+ I n f l u x F a k t o r PhD ÉRTEKEZÉS Dr. Csutora Péter Programvezető: Dr. Kellermayer Miklós egyetemi tanár Témavezető: Dr. Miseta Attila egyetemi adjunktus Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Klinikai Kémiai Intézet 2001

2 TARTALOM I. Rövidítések... 4 ii. Bevezetés... n Az clö sejtek Ca2* homeosztázisa...d Ca2" mtiux mechanizmusok...6 A kapacitatív C.a2+ influx mechanizmusa... 7 Ismereteink a CIF-ről A Ca2+ influx következményei III. Kérdésfelvetés...17 IV. Anyag és módszer...19 V. Eredmények számú közlemény: Glükóz-b-íosztat es Ga-' ionok együttes kompartmentalizációja. Rövid összefoglalás...24 A közlemény teljes szövege és ábrái számú közlemény: A Ca2+ influx faktor izolálása és hatásainak vizsgálata emlős és kétéltű sejteken. Rövid összefoglalás...33 A közlemény teljes szövege és ábrái számú közlemény: Ca2+ influx mechanizmusok aorta simaizomsejtekben. Rövid összefoglalás...40 A közlemény teljes szövege és ábrái számú köziemén}': A Ca2+ influx faktor egy nonszelektív membráncsatornát is aktivál limfocitákban. Rövid összefoglalás...47 A közlemény teljes szövege és ábrái számú közlemény: A Ca2+ influx faktor szintézise valószínűleg az endoplazmatikus hálózatban történik. Rövid összefoglalás...79 A közlemény teljes szövege és ábrái További eredmények 96

3 VI. Összegzés VII. Köszönetnyilvánítás... VIII. Referenciák IX. A pályázó közleményei... 1io 3

4 I. RÖVIDÍTÉSEK ATP cadpi [Ca-4]i CIP CPM EGTA ELISA adenozin trifoszfát ciklikus ADP-ribóz intracolluláris kalcium ion koncentráció Ca-'4influx faktor counts per minute ethylene glycol-bis(p-aminoethyl ether)-tetraacetic acid enzyme-linked immunoassay endoplazmatikus retikulum Glc-6-P P K;V. ICKAN IL-2 IP3 IP3R HPLC NAADP NF-AT R/R SR TG TRP glükóz-6-foszfát calcium release activated calcium current calcium release activated non-selective cation current interleukin-2 inozitol 1,4,5-trifoszfát inozitol 1,4,5-trifoszfát receptor high performance liquid chromatography nikotinsav dinukleotid foszfát nuclear factor of activated T-cells fluoreszcencia változás a kiindulási értékhez viszonyítva szarkoplazmatikus retikulum thapsigargin transient receptor potential 4

5 II. B E V E Z E T É S "(Gilbenlmg) Adott biológiai jelenség magyarázatára felállított, kulunjéie Számos intracelluláris jelátviteli mechanizmus a citoplazma Ca2+ szintjének szabályozásán alapul [1]. A Ca2+ ionok szerepének megismeréséhez először azt kell tudnunk, hogy mennyi az élő sejtek valós Ca2+ tartalma. Lángfotometriás mérések tanúsága szerint a sejtek Ca2+ tartalma sejtvízre vonatkoztatva 1-2 mmol/1 [2], tehát megegyezik az exti aeellulárisan található Ca2 mennyiségével. Ez u módszer azonban nem veszi figyelembe sem a sejten belüli kompartmentalizációt, sem pedig az ionizált (szabad) és kötött állapotban lévő Ca2+ ionok viszonyait. A fluoreszcens Ca2+ indikátorok megjelenésével kiderült, hogy nem stimulált sejtekben a citoplazma szabad Ca2+ szintje ([Ca2+],) rendkívül alacsony, a 10'7 M-os tartományban van. Ez a koncentráció érték azonban csak a jéghegy csúcsa, ugyanis a citoplazmában lévő Ca2+ ionok több, mint 99%- a fehérje természetú pufferekhez van dinamikusan kötve (parvalbumin, calbindin-d, calretinin), és így láthatatlan a kelátor természetű fluoreszcens indikátorok (pl. Fura-2, Fluo-3) vagy kemilumineszcens fehérje indikátorok (pl. aequorin) számára [3, 4], A lángfotometriásan mérhető és a citoplazmában található szintek különbsége, vagyis a sejten belüli Ca2" 99%-a az endoplazmatikus (ER), illetve izomban a szarkoplamatikus (SR) hálózatban helyezkedik el, nagyrészt fehérjékhez és chaperone-okhoz (calreticulin [5], calnexin [6], calmegm [7], junctate [8]) kötve. Újabb érdekes eredmények azt mutatják, hogv ezek a fehérjék nemcsak raktárként működnek, hanem dinamikusan részt vesznek a Ca2+ influx mértékének regulálásában is [9]. Talán kevésbé ismert a 5

6 mitokondriumok szerepe a Ca2+ homeosztázisban, azonban újabb adatok szerint ezek aktívan részt vesznek a [Ca2+1. szint ingadozásainak térbeli és időbeli szabályozásában, a dinamikus Ca2, tárolásban, és az EK felé való negatív és pozitív visszacsatolásban [10). áldoz, a Ca2+ ionokat specializált ATPáz fehérjék a sejten kívülre, illetve az Ca2* influx mechanizmusok A Ca2+, mint intracelluláris jelátvivő molekula akkor fejtheti ki sokrétű hatását, amikor az extracelluláris térből a sejtbe áramlik, és a [Ca2+]i fluoreszcens indikátorokkal mérve 100 nm-ról 1000 nm-ra emelkedik. A másodlagos folyamatok beindulásában több tényezőnek van szerepe, így számít a Ca2+ influx amplitúdója, sebessége, és tér-idő mintázata is [11, 12]. Kiváltó okát tekintve alapvetően három különböző Ca2+influx mechanizmus létezik: 1) Legtöbbet a membrán depolarizáció által szabályozott Ca2+ válaszról tudunk, amely az ingelékeny sejtek (ideg- és izomsejtek) fő Ca2+ influx mechanizmusa. Itt az extracelluláris Ca2+ beáramlása a sejtbe a feszültségfüggő L-típusú Ca2+ csatornák és a ryanodine receptorok közös munkájának eredménye. 2) Receptoron keresztül beindított direkt Ca2+ influx. Ilyen módon hat az ATP, glutamát, ac.etilkolin, diacil-glicerol [13], vagy az arachidonsav [14], amelyek másodlagos jelátvitel nélkül, közvetlenül is képesek Ca2+ permeabilitás fokozódást okozni egyes sejtekben. 3) Kapacitatív Ca2+ influx. Definícióját tekintve a kapacitatív Ca2+ válasz is egy receptoron keresztüli, de indirckt válasz, amelyben a Ca2* influx-ot megelőzi egy jelátviteli kaszkád rendszer beindulása, és annak hatására a Ca2+ ionok kiáramlása az ER/SR-ból [15, 16, 17], Nem 6

7 ingerlékeny sejtekben ez a mechanizmus a [Ca2+], emelésének legfontosabb módja, és ennek áhalőnn^nn elfogadott modelljét ismertetem részletesen. A kapacitatív Ca-Jt milux mechanizmusa Amikor a sejtet serkentő ágens hozzákötődik receptorához, a sejten belül egy G-proteinhez vagy tirozin kinázokhoz kapcsolt folyamat hatására inozitol 1,4,5-trifoszfát (IP3) keletkezik, amely az ER felszínén lévő receptorához kötődve annak Ca2+ csatornáit megnyitja, és a Ca2+ ionok kiáramlónak a citoplazmába (1. ábra) [18]. Hasonló módon aktiválódik néhány talán kevésbé fontos, az ER membránban található fehérje is, amelyek szintén a Ca2" kiürítésével válaszolnak a stimulusra [11]. Ezt igen hamar követi egy másodlagos Ca2+ beáramlás, amely során a sejt környezetéből a megnyíló úgynevezett kapacitatív csatornákon át a Ca2+ ionok a sejtbe áramlanak [15, 16, 17]. Az így létrejövő megemelkedett [Ca2+]j szint számos biológiai folyamat kulcsfontosságú része, és hiányában nem jöhet létre például a T-sejtek aktiválása [19, 20], a citokinek termelése [21], az inzulin [22] és a nyál [23] szekréciója, az ivarsejtek fertilizációja [24], a trombociták granulumainak kiürítése [25, 26], az erek összehúzódása [27], és zavart szenved a szív fejlődése is [28]. A kapacitatív Ca2+ influx kiváltása kísérleti körülmények között lehetséges IP3 nélkül is, ugyanis egy thapsigargin (TG) nevű molekula irreverzibilisen bénítja az ER Ca2+ ATPáz-át, és hatására a Ca2+ ionok az ER-ból a citoplazmába áramlanak [29, 30]. Hasonlóan működik néhány TG-analóg molekula is (ciklopiazonsav [26, 31], terc-butil-benzohidrokinon [31, 32]). A TG hatásának elemzésével ismertté vált, hogy a kapacitatív Ca2+ influx beindításához egy megfelelő mértékű, a küszöböt meghaladó ER depléció szükséges [33], 7

8 1. ábra: Ca2+jelátvitel nem-ingerlékeny sejtekben Jelmagyarázat Plazma membrán: G, G-protein; NCX, Na+/Ca2+cserélő fehérje; PMCA, plazma membrán Ca2+ATPáz; R, receptor; RTK, receptor tirozin-kináz; SOC, storeoperated Ca2* channel (kapacitatív Ca2+csatorna); AV, membrán depolarizáció Citoplazma: AA, arachidonsav; cadpr, ciklikus ADP-ribóz; CIF, Ca2+influx faktor; DAG, diacil-glicerol; IP3, inozitol trifoszfát; LPA, lizofoszfatidilsav; NAADP, nikotinsav dinukleotid foszfát; PLC, foszfolipáz C; PtdIns(4,5)Pa, foszfatidil-inozitol difoszfát; SIP, szfingozin-1-foszfát; TG, thapsigargin ER/SR: IP3R, inozitol trifoszfát receptor; NAADPR, nikotin sav dinukleotid foszfát receptor; RYR, ryanodine receptor; SCaMPER, szfingolipid Ca2+médiáit protein az ER membránban; SERCA, SR/ER Ca2+ATPáz Mitokondrium: CC, citokróm C; NCX, Na"/Ca2* cserélő fehérje; PTP, permeability transition pore (egyfajta Ca2* pórus).

9 Ez idő szerint a kapacitatív Ca2+ influx aktiválásának pontos részletei nem ismertek, így többek között az sem, hogy milyen módon jut el az információ az ER kiürüléséről a plazma membrán Ca2+ csatornáihoz. Három fő, egymást nem teljesen kizáró elmélet létezik, amely ezt a folyamatot próbálja magyarázni: 1) az ER IP3 receptorai és a plazmamembrán közötti fizikai kapcsolat segít a csatornák aktiválásában; 2) vezikuláris transzport mechanizmusok; 3) egy jelátvivö molekula (Ca2" influx faktor, GIF) jut el az ER-ból a plazmamebránhoz, amely ott a csatornák megnyílását eredményezi. ad 1) Az első, konformációs kapcsolás elmélet szerint fizikai kontaktus van az ER membránjában található IP3 receptorok és a plazma membrán Ca2+ csatornái között, és az IP3 receptorához való kötődése egyúttal a kapacitatív Ca2+ influx-ot is kiváltja (2. ábra) [18]. Az elmélet igazolását hátráltatja, hogy a kapacitatív Ca2i csatornák pontos molekuláris mibenléte még ma sem pontosan ismert, és a fehérjeszekvencia hiányában nemigen lehet ko-purifikációs és egyéb sejt- és molekuláris biológiai kísérleteket tervezni. Pár éve kiderült, hogy a Drosophila melanogaster fényre érzékeny membráncsatornái egyben Ca2+ csatornák is (transient receptor potential channel, TRP), és azóta ezen csatornák kutatására terelődött a hangsúly [34, 35], Kimutatták, hogy emlős sejtbe bejuttatott izolált TRP csatornák kapcsolódhatnak az IP3 receptorokhoz, és ez a kapcsolat beindíthatja a Ca2+ beáramlását a sejtbe [36, 37], További kutatások az aktin citoszkeleton rendszer szerepére utalnak a kapacitatív Ca2+ influx létrejöttében [38, 39]. A konformációs kapcsolás hipotézis legnagyobb hiányossága, hogy az IP3-tól független folyamatokat (szfingozinok, egyéb aktivátorok, 1. ábra) és a farmakológiás szerek hatását (pl. TG) nem tudja kielégítően magyarázni. 2. ábra: a konformációs kapcsolás elmélet

10 ad 2) Xenopus laevis oocitákon végzett kísérletek azt mutatták, hogy vezikuláris transzportért felelás egyes fehérjéket (pl. SNAP-25) blokkolva gátolni lehetett a kapacitatív Ca2* influx létrejöttéi [40]. Innét eredt a hipotézis, mely szerint vezikulák szállítják az aktivátort vagy magát a Ca2* csatornát a membránhoz, es ezek membránba épülése váltja ki a Ca- 4 beáramlást. Később hasonló eredményeket mutattak be emlős vese sejteken is, azzal a kiegészítéssel, hogy a vezikulák képződését blokkoló brefeldm-a nem bénította teljesen a Ca-'* mílux-ot [41]. Bár ez a hipotézis kétségtelenül érdekes, a kapacitatív Ca-'* beáramlással kapcsolatos, évek alatt gyűjtött kísérleti adatok csalt kevés részével kompatibilis. Roger Tsien, az első közlemény [40] senior szerzője egy általam is hallgatott konferencián maga is bevallotta, hogv a folyamatért felelős vezikulákat nem tudták kimutatni, és egyre gyűlnek az ellenérvek a hipotézis ellen. 3) A harmadik elmélet - melynek vizsgálatával magam is foglalkoztam - azt mondja, hogv- miután a Ca2* ionok az ER-ból kiáramlónak, egy kis molekulasúlyú másodlagos jelátvivő keletkezik az ER-ban, és ez diliuzioval vagy más módon eljut a plazma membránhoz, ahol közvetlenül a Ca2* csatornákra hatva megnöveli a plazma membrán Ca2* permeabilitasat (1. ábra) ben a fent már említett Roger Tsien tollából származó Nature cikk számolt be elsőként arról, hogy TG-al kezelt sejtek savas extraktuma egy másik sejt Ca2+ beáramlását idézi elő [42], Az aktív frakcióban található jelátvivő molekulát Ca2* influx faktornak (GIF) nevezték el. Míg más jelátvivők és enzimeik kutatása nagy erőkkel folyik (foszfolipázok, inozitol-metabolitok, protein kmázok), addig a CIF kutatását mindössze maroknyi kutató választotta témájául. Ennek legfőbb oka, hogy az egyébként brilliáns Tsien elkövetett egy sajnálatos hibát. Az általa készített, és tisztaságban a mi mai preparátumunktól messze elmaradó extráktól egy olyan sejttípuson tesztelte, amely purmerg receptorokat is expresszal, es valószínűleg eg\ szennyezőanyag ezen receptorok extrac.elluláris aktiválásával Ca2* mfluxot idézett elő. Tsien ezt közleményében úgy magyarázta, hogy magának a CIF-nek van 10

11 extracelluláris aktivitása, amely kiváltotta a tudományos élet kétkedését, hiszen ez ellentétes a CIF, mint intraeelluláris jelátvivő feltételezett mechanizmusával. A következmeny egyerteimu voit, es nemcsak a szerző ezen munkájával, hanem az egész CIF ötlettel szemben is ellenérzés alakult ki. Thomas es Haniey 1995-ben egy jobban tisztított CIF preparátummal állt elő, ám voltage clamp bioassay-ük sok kívánnivalót szint változását [43, 44]. A tudományos körök hozzáállása egy kissé megváltozott, amikor e disszertációban részletezett eredményeimet bemutattam az 1998-as Experimental Biology kongresszuson (San Francisco, CA, USA), majd a Ca-+ jelátvitel kutatóinak rendezett zártkörű Gordon konferencián (Henniker, NH, USA) es PNAS cikkünk visszhangja egyértelműen bátorító, és számos kollaboráció indult be CaJ+ jelátvitelt kutató munkacsoportokkal. Kutatásaink eredményei meggyőzően támogatják a CIF létezését, és választ adnak a CIF hatásmechanizmusának sok részletére is. A leírtakhoz ugyanakkor azt is hozzá kell tennem, hogy a három elmélet közül jelenleg az első hipotézis a legnépszerűbb, annak ellenére, hogy eddig nem tudtak direkt bizonyítékkal szolgálni, hogy az igazi Ca2" csatornák is kapcsolódnak az ER bizonyos membrán fehérjéihez. A legtöbb kutatócsoport ezen dolgozik, és bár a CIF létezését egyikük sem tudja cáfolni, nehezen tudják beilleszteni gondolatmenetükbe. A CIF után kutató munkacsoportok jelenlegi legfőbb célja, hogy az extraktumokból tökéletes tisztaságú CIF-et izoláljanak, majd ebből a pontos szerkezetét meghatározzák. Amint a CIF szerkezete ismertté válik, hamar bebizonyítható lesz, hogy a konformációs kapcsolás kutatóinak modellrendszereiben szerepet játszik-e a CIF aktivitás emelkedése vagy 11

12 Ismereteink a CIF-ről sokat. A Tsien által karakterizált CIF - mint említettem - számos nonspecifikusan aktív szennyeződést is tartalmazott, így az általa használt biokémiai szeparációs technikák eredményeit kellő óvatossággal kell kezelnünk. Tőle tudjuk a következő jellemzőket [42, 45): kis molekulasúly, kb Da, nem fehérje természetű, negatív töltésű, foszfatázzal elbontható, erősen saválló molekula. Hanley és munkatársai Tsien alapötletéből merítve 1995-ben kidolgoztak egy új izolációs technikát, amely egy csak intracelluláris aktivitással rendelkező, tehát valódi CIF-et eredményezett. A szerkezet megismerésére irányuló, többféle megközelítéssel végzett kísérleteik a következő eredményeket hozták [44, 46, 47, és személyes kommunikációk]: a CIF hőstabil (100 C, 2 óra), alkalikus ph-ra igen érzékeny, spektroszkópia glükóz nyomait mutatta ki, UV-érzékeny ( nm, 5 perc), aktivitása nem csökken savas depurinációra, érzékeny hidrazin-kezelésre, amely a pirimidin és ribóz struktúrákat roncsolja, a szerves kémiai meghatározások közül negatív Dischereakciót (dezoxiribonukleotidok) mutat, de pozitív az Euler- Hahn- (ribonukleotidok), Lowry-foszfatáz- (foszfátok) és a naftol-rezorcinol-kénsav-reakciót (cukrok) illetően. 12

13 Mindezek alapján valószínűsíthető, hogy a CIF egy foszforilált nuideotid -cukor, amply feltételezés saját izolációs kísérleteinkkel és HPLC illetve egyéb tisztítási továbbíejlesztesemk eredményével is koinpaiibilis. Hasonló molekulák, például a cadpr [48, 49] vagy a NAADP [49] ismert Ca-f j elát vivő molekulák, de ezek az ER depiéeiójái okozzák, míg a CIF egy/ ezt követő mechanizmus része. Meg kell említenem, hogy időnként megjelenik egy-egy közlemény, amelyben leírnak egv Ca~+ permeabilitást fokozó új molekulát, és így a CIF-et megtalálnak vélik. Később kiderül, hogy ezek a molekulák valójában nem a kapacitatív Cai+ influx aktivátorai, hanem egy receptoron keresztül közvetlen, nem kapacitatív Cai+ beáramlást okoznak (pl. arachidonsav [14]), vagy' pedig a CIF hatását megelőző folyamatokba avatkoznak be, amely később az igazi CIF szintéziséhez vezet (pl. 5,6- epoxi-eikozatriénsav [50]). Ezek a molekulák nem izolálhatok tíz ismert CIF tisztítási lépésekkel, szobahőmérsékleten hamar elbomlanak [50], stb., így a CIF szerkezetének megismerése felé vezető úton szerepük csekély. 13

14 A Ca-Minflux következményei A sejten be'lüi meglehetősen sok folyamat függ a C?.-H mindenkori szintjétől, illetve a kapacitativ Ca2+ influx hatására bekövetkező Ca-"j, emelkedésétől. Ezekre részben már hivatkoztam, részben pedig alább ismertetem: Intracelluláris Ca~* függő folyamatok: Troponin C 1=2 Izomkontrakció Miozin könnyű lánc kináz (MLCK) Calcineurin Prolileració Transzkripciós faktorok Fertilizáció Ca2+/calmodulin dependens Tanulás és memória protein kináz (CAMK) Immunvédekezés Ion csatornák F> Szekréció Synaptotagmin Membrán ingerlékenység Foszforiláz kináz ^ Metabolizmus Annexinek ^ Vezikula közlekedés Sejtosztódás. Adenilát kináz E> Kapcsolat más szignál Ciklikus ADP foszfodiészteráz mechanizmusokkal Nitrogén monoxid szintet áz (NOS) Protein kináz C (PKC) Prolin-gazdag kináz (PYK2) Inozitol trifoszfát 3-kináz S Í00 család <=> Sejtosztódás Tumorinvázió Mitokondriális enzimek o ATP szintézis Szteroid szintézis Caspase enzimek <=> Apoptózis Fontos megjegyezni, hogy különböző amplitúdójú, sebességű és téridő mintázatú Ca2~ influxok más és más folyamatokat indítanak be. 14

15 Hosszú ideig tartó [Ca2+]i emelkedések például egy NF-AT nevű, míg a rövid [Ca2+]i emelkedések egy másik, NF-kB nevű transzkripciós faktort aktiválnak [12]. Jó példa erre az IL-2 szintézise. Ahhoz, hogy az IL-2 termelés a limfocitákban beinduljon, egy tartós, legalább 40 percen át tartó 1 pm-os [Ca2+]i emelkedésre van szükség, míg a T-sejtek teljes aktiválódása csak 2 órás emelkedett [Ca2+]i hatására következik be [21]. Az NF-AT családba tartozó fehérjék szabályozzák a T-sejtek, B- sejtek, NK-sejtek, néhány makrofág, és sok más, nem immun jellegű sejt működését [19]. Stimuláció nélkül, amikor az intracelluláris Ca2+ szintje alacsony, az NF-AT a citoplazmában található, foszforilált formában (3. ábra). A kapacitatív Ca2+ beáramlás hatására létrejövő hosszan tartó FK ábra: az IL-2 szintézis aktiválása limfocitákban [Ca2+]i emelkedés a megfelelő foszfatázt, a calcineurin nevű fehérjét aktiválja, amely az NF-AT-t defoszforilálja. A calcineurin-nf-at komplex a sejtmagba vándorol, ahol az NF-AT beindítja az IL-2 szintéziséhez szükséges gének transzkripcióját [51, 52]. Amint a [Ca2+], újra lecsökken, a calcineurin-nf-at komplex szétválik, egy kináz enzim újra foszforilálja az NF-AT fehérjét, amely ekkor újra kijön a sejtmagból a citoplazmába, és a transzkripciós faktorok aktív állapota megszűnik. Miután a calcineurin aktivitásához szükség van az emelkedett intracelluláris Ca2+ szintre, nem meglepő, hogy a plazma membrán kapacitatív Ca2+ csatornáinak blokkolói gátolják a T-sejtek aktiválódását és IL-2 termelését [53, 54]. Leírtak

16 továbbá egy primer immunzavart, amelyben a T-sejtek képtelenek kapacitatív Ca-+ beáramlásra [55], és ennek következtében nem is tudnak aktiválódni [56]. A felfedezés, miszerint a jól ismert Cyclosporin-A és FK- 506 immunoszuppresszánsok a calcineurin foszfatáz aktivitását gátoljál-:, jól demonstrálja az NF-AT jelentőseget az immunrendszer koordinált működésében [57]. Eleinte azt hitték, hogy a kapacitatív Ca- " influx csak iiziologias és gyógyszerrel indukálható folyamatok része, de nem vesz részt pathológiás állapotok kialakulásában és fenntartásában. Később egyre több összefüggést ismertek fel a [Ca2*], és egyes kórképek pathomechanizmusa között. Napjainkban már bizonyos, hogy a kapacitatív Ca-* influx csökkenése vagy túlzott aktivitása is szerepet játszik a diabetes [58], diabeteses szövődmények [59, 60, 61], cardiomyopathiák [62, 63], pancreatitis [64], és psoriasis [65] kialakulásában, vagy például az idegsejtek trauma utáni kóros működésében [66]. Legújabb eredmények szerint ugyanez a folyamat kapcsolatos egyes m align us tumorok kialakulásával [67], az Alzheimer-kórban mefigyelhető amiloid lerakódással [68], de azt is leírták, hogy a kapacitatív Ca2+ influx gátolja a renin szekrécióját [69], Mindezek a példák tovább hangsúlyozzák a kapacitatív Ca2+ influx és annak feltételezett aktivátorai, így a CIF kutatását. 16

17 III. KÉRDÉSFELVETÉS Az élő sejtek Ca2+homeosztázisának megismerésével kapcsolatban végzett munkánk során a következő fő kérdésekre kerestük a választ: 1. Ismert, hogy az ER Ca2* raktárai nemcsak fehérje természetűek, hanem dinamikus Ua- kotesre kepes az EK néhány kis molekulája is, így az nyálát, szukeinát. vagy a glükóz-fi-foszfát (Glc-b-P) [70]. Vajon ezek csak a már bejutott Ca2+ kötésében vesznek részt, vagy pedig membrán transzportjuk során segítik is a Ca2+ felvételét az ER-ba, egyfajta együttes kompartmentalizációt létrehozva? 2. A Hanley által izolált CIF extraktum Xenopus laevis oocitákba injektálva Ca2* dependents Cl csatornákat aktivált. Vajon az így mérhető Ck áramok valódi Ca2+ influx következményeként jönnek-e létre? Lehet-e egy olyan biológiai assay-t kifejleszteni, amely direkt módon mutatja a CIF hatására bekövetkező Ca2+mozgásokat? 3. Melyek a CIF injektálását követően megfigyelhető Ca2+ influx főbb jellemzői? Hasonlít-e ez az influx korábban leírt Ca2+hullámokra? 4. Milyen sejtekből lehet CIF-et izolálni? A CIF és az általa stimulált folyamat univerzális, vagy csak bizonyos sejtekre jellemző? Milyen módon lehet aktiválni a sejteket a CIF termelésének beindításához? Melyek a fiziológiás stimulátorok? Egyáltalán a CIF de novo szintetizálódik, vagy' az ER-ban aktív formában raktározódik nyugvó, nem aktivált sejtekben is? 5. Lehet-e a Ca2+ influx intracelluláris morfológiájából következtetni a CIF termelésének helyére? Biokémiát frakc.ionálással vagy egyéb módon elkülöníthető-e tíz a sejtalkotó vagy celluláris kompartment, amelyben a CIF szintetizálódik? 17

18 6. Mi a CIF kémiai szerkezete, ill. milyen szeparálási technikákkal lehet az aktivált sejtekből a lehető legtisztább C!F-ct kinyerni? 7. Mi a CIF hatásmechanizmusa, pontosan milyen csatornákon fejti ki hatásai? Csak egy fajta vagy több csatornán is hat? ila a csatornán közvetlenül hat, vajon a hatás reverzibilis? Blokkolható-e a csatorna úgy, hogy a CIF sem képes megnyitni? 8. Működhet-e a CIF az inozitol-rendszertől függetlenül? Kell-e az IPa receptorok membránhoz való kapcsolódása a CIF hatásához? Beleillik-e a CIF a konformációs hipotézisbe, vagy esetleg cáfolja azt? 9. Vannak-e olyan pathológiai folyamatok és betegségek, amelyek a CIF működésének vagy mennyiségének kóros voltán alapszanak? 18

19 IV. ANYAG ÉS MÓDSZER A disszertációt képező közlemények az alább felsorolt metodikai leírásokat tartalmazzák. Ezek közül a legfontosabbakat részletesen is ismertetem a listát követően. EK mikroszömák izolálása 1,5 Fényszóródáson alapuló membrántranszport mérés 1 45Ca-felvétel meghatározás 1 [Ca-'+], mérés homogén fluoreszcens spektroszkópiával 1 Glc-6-P felvétel és hidrolízis enzimatikus mérése 1 CIF izolálás intakt sejtekből 2, 3, 4, 5 GIF izolálás lizált sejtekből és ER mikroszómákból 5 Xenopus oocita preparálás?. b CIF aktivitás mérés Xenopus oocitákban 2, 3, 5 CIF aktivitás mérés whole cell patch clamp technikával 2, 4 CIF aktivitás mérés izolált patch clamp technikával 2,3,4 CIF diffúzió és Ca2+hullámok modellezése 2, 5 Simaizomsejt preparálás aortából 3 Permeabilizált trombocita CIF bioassay 3 CIF tisztítás HPLC-vel 3, 4 A CIF - szerepéből és feltételezett szintetikus mechanizmusából adódóan - olyan sejtekből nyerhető ki, amelyekben előzőleg az ER Ca2^ tartalmát kiürítettük. Ennek elérésére emlős primér sejtek (humán T- sejtek, trombociták, patkány pankreász béta-sejtek, érfali simaizomsejtek, szívizomsejtek) vagy kultúrák (Jurkat humán T-limfóma sejtek, J774 makrofágok, HeLa sejtek) esetében a már sokszor említett thapsigargin (TG) nevű növényi alkaloidot használtuk, amely irreverzibilisen bénítja az ER Ca2+ ATPáz-át, és így a leak csatornán át az ER Ca2+ ionjai a 19

20 citoplazmába áramlanak. CIF-et sikeresen izoláltunk élesztőből is (Sacchciromyces cereinsiae), itt azonban a TG helyett genetikai úton egy. a TG hatásának megfelelő fenotípussal rendelkező mutánst használtunk, amelyben a PMR1 gén kiütése révén hiányzik az ER/Golgi Ca- ATPáz-a, és így nem képes az ER/Golgi Ca^ szekvesztralasara [7 1j. A GIF izolálását kisebb módosításokkal a már leírt módszerrel végeztük [11 j. Röviden, a TG nal kezelt emlős (2 pm, 15 min, 25 C) vagy mutáns élesztő sejteket sósavval extraháltuk (200 mm, 30 min, 25 C), majd az extraktumot centrifugáltuk, és a felülúszót neutralizálás után BaCb-al kezeltük (10 mm) a vicinális foszfátok (pl. IPj) kicsapása érdekében. Újabb centrifugálás után a felülúszót liofilizáltuk, majd az így kapott pelletet 100%-os metanolban extraháltuk (15 perc, rázás). A felülúszót centrifugálás után Sep-Pak Vac Cis (1 ccj oszlopon tisztítottuk, majd heszárítás után (N) gáz, 30 C) 100 mm-os ecetsavban feloldottuk, és 30 kda filteren ultrafiltráltuk. Az így kapott extrakt CIF aktivitását - ha nem tisztítottuk tovább - ebben az állapotban meghatároztuk a Xenopus oocita bioassay segítségével. A molekula pontos szerkezetének megismerése érdekében a fent vázolt tisztítás nem elegendő, további szeparálásra és fiziko-kémiai illetve műszeres analízisre van szükség. További tisztításhoz az ecetsavas extraktot először BioGel P-2 (Bio-Rad) gél-kromatográfiás oszlopon futtattuk 100 mm-os ecetsavat használva eluensként. Az oszlopról 0.5 mles frakciókat nyertünk, amelyekből UV abszorbanc.iát és CIF aktivitást mértünk. A CIF aktivitás a frakcióban található, míg meglehetősen sok szennyező anyag eltávozik a és frakcióval. Az aktív frakciókat kombináltuk, majd az extrakt további tisztítását anioncserélő HPLC oszlop segítségével végeztük el. Erre a célra egy Keystone Partisii 10 SAX oszlopot választottunk, melyet mások sikeresen használtak nukleotid foszfátok szeparálására. Lineáris sógrádiensünk mm ammonium dihidrogén -foszfátból állt, melynek ph-ját lineárisan 2.8-ról 3.7-re növeltük a futás során. 1 ml-es frakciókat nyertünk, melyekből CIF 20

21 aktivitást mértünk. Hasonlóan a P-2 oszlophoz ez a lépés is sok UV-pozitív szennyeződést eltávolít. A CIF a 24. és 25. frakcióban található legnagyobb koncentrációban, itt a só koncentrációja kb. 280 mm, amely dialízissel eltávolítható (100 és 500 Da zsákok). További tisztításra reverz-fázisú HPLC-t, kémiai sótalanítást, és más módszereket használtunk. A kromatográfiás és egyéb tisztítás mellett azt is szükségesnek láttuk, hogy egyszerű fiziko-kémiai és enzimatikus vizsgálatokat végezzünk a CIF sajátosságainak meghatározására. Az extraktumok CIF aktivitásának mérése Xenopus oocitákban Albínó Xenopus laevis békákból a hasfalon át sebészeti módszerrel oocitákat nyertünk. Az oociták follikuláris szövetét kollagenáz segítségével eltávolítottuk, majd egyszerre kb. 25 oocitába sztereomikroszkóp alatt 14 ni 5 mm-os Fura-2 fluoreszcens Ca2+ indikátort injektáltunk. A bioassay-t egy Olympus IX-70-es invertált fluoreszcens mikroszkóp segítségével végeztük el (4. ábra), amely fel volt szerelve digitális kamerával és gyors filter-váltóval (340 és 380 nines filterek a rációmetrikus Fura-2 fluoreszcencia mérésére). Két órát vártunk, hogy az injektálás helye teljesen bezáródjon, majd egy-egy oocitát Ca2+-mentes médiumban egy házilag készített 4. ábra: a CIF aktivitás mérése cellában a mikroszkóp tárgyasztalára helyeztünk, és az oocitába a tárgyasztalra szerelt és CIFextraktummal megtöltött injektor tűjét beleböktünk. Ezt követően 10 percen keresztül, 3 másodperces időközönként egy-egy képet készítettünk 21

22 340 illetve 380 nm-es gerjesztésnél, 510 nm-es emissziós filteren át. A kezdettől számítva kb. 30 másodpere után 5 mm Cn2+-nt adtunk a médiumhoz, további 1 perc után pedig 14 ni CIF extraktot injektáltunk az oocitába. A 10 perc elteltével számítógép segítségével elemezi ük a fluoreszcens arany (340/380) növekedését. Ha az extraktunk tartalmazott CIF-t, akkor kb %-os növekedést kaptunk a Ca2+hozzáadása előtti emelkedést okoztak. Alternatív módszerként végeztünk aktivitás mérést radioizotóp módszerrel is, a 45Ca izotóp beáramlását mértük, és eredményeink megfelelnek a várakozásoknak Xenopus oocitába szteromikroszkóp alatt 14 ni CIF-et injektáltunk. Ezt követően az oocitákat óvatosan egy 1 gci 45Ca-ot és 10 mm Ca2+-ot tartalmazó médiumba helyeztük. 15 perc inkubálás után az oocitákat izotópmentes médiumban háromszor mostuk, majd egyenként szcintillációs csövekbe raktuk, 1 M NaOH-ban feloldottuk, a feloldódott anyagot neutralizáltuk, és 3 ml szcintillációs koktél hozzáadása után béta-számlálóban a radioaktivitást megmértük. A nonspec.ifikus 45Ca-kötődés mind vad típusú élesztőből nyert extrakt, mind kontroll puffer beinjektálása után kb. 190 CPM, mely CIF aktivitású extrakt injektálását követően 15-szörösére emelkedik. Az extraktumok CIF aktivitásának mérése elektrofiziológiai módszerekkel Kollaborációban végeztünk whole cell voltage clamp és patch clamp méréseket mind a CIF aktivitásának meghatározására, mind pedig az ionszelektivitás, gátolhatóság, stimulálási kinetika vizsgálatára. Target sejtként használtunk szövettenyészeti RBL (rat basophilic leukemia), Jurkat, és egér aorta simaizomsejteket, valamint primér frissen izolált humán perifériás T-sejteket. A Ca2t hullámok számítógépes elemzése A CIF által kiváltott Ca2r influx elemzését nemcsak a mikroszkóposán iryert adatokból végeztük el, hímem egy kollaborációban készült számítógépes szimulációs modellt is alkalmaztunk. Ez a modell 22

23 egy komplex rendszert állított fel, amely a GIF és a Ca2t inonok diffúzióján alapult. A számítások figyelembe vették a GIF számított és a Ca2+ ionok mert düíuzios együtthatóit, a GIF feltételezett termelési és lebomlási kinetikáját, a GIF molekulák méretét, interakcióit a citoplazmávai a diffúzió során, az oocitak geometriai viszonyait, es más paramétereket, (az alkalmazott egyenleteket és paramétereket a 2. számú közlemény ismerteti). A modellprogram által elkészített görbék meglepően jól illeszkedtek a CIF által kiváltott Ca2' hullámok kísérletesen kapott morfológiai képéhez, amely a modell felállítása során megadott és feltételezett paraméterek helyességét mutatja. Lejárt szavatosságú, transzfúzióra már nem alkalmas intakt humán trombocitákból a szokásos módon CIF extraktot izoláltunk. Egy máisik tasak sejtéit ultrahangos szonikálással feltártunk, majd a feltárt sejteket kezeltük TCi-nal extrahálás előtt. Egy harmadik megközelítésként trombocitákból homogenizálás után grádiens-ultracentrifugálással ER mikroszómákat nyertünk. A mikroszómákat egy intracelluláris állapotokat megközelítő sóoldatba helyeztük, melyhez ATP-t és glükózt is adtunk. TGkezelés után az ER mikroszómákat ultracentrifugálással eltávolítottuk, majd a felülúszót extraháltuk és annak CIF aktivitását megmértük. 23

24 V. EREDMÉNYEK 1, számú közlemény Ebben a közleményben a Glc-6-P és Ca-+ ionok sejten belüli együttes kompartmentalizációjának kérdésköréi tanulmányoztuk. Mikroszómákat izoláltunk patkány szívből (SR), májból (ER) és agyból (ER), majd azt vizsgáltuk, hogy ezek a mikroszomak in vitro milyen mértekben veszik fel a Gic-ó-P-ot. Májsejtekben a glükóz-u-íászíaíáz aktivitás magas, szemben az agysejtekkel és a szívizomsejtekkel, amelyeknek nem feladata a glükóz exportja, és így glükóz-6-foszfatáz aktivitásuk is alacsony. A hipotóniás oldatban tartott mikroszómák Glc-6-P felvételét zsugorodásuk jelzi, amelynek mértékét a fényszórás változásának detektálásával határoztuk meg. Mindhárom típusú mikroszóma szelektíven veszi fel a Glc -6-P-ot, más cukrok és kémiailag rokon anyagok nem jutnak át a membránjukon. Megfigyeléseink szerint a Glc-6-P felvétele megnöveli az ATP-dependens Ca2+ szekvesztráció mértékét, amelyet fluoreszcens Ca-+ mérésekkel határoztunk meg. Továbbá, a mikroszómák gyors filtrációja után végzett enzimatikus méréseink megmutatták, hogy ez a folyamat fordítva is igaz, tehát Ca-+ionok és ATP hozzáadása fokozza a Glc-6-P importot az ER/SR mikroszómákba. Ennek eredményeként a passzív ekvilibriumnál akár 3-4-szer magasabb Glc-6-P koncentráció is kialakulhat a mikroszómákban. Ez a Glc-6-P koc.entráció emelkedés nem jelentkezett, ha csalt Ca2+ vagy csalt ATP volt jelen, és akkor sem, ha a Cai+ ionok és ATP mellé TG-t vagy egy Cai4 ionofórt, ionomycin-t adtunk. Ezek az adatok megmutatták, hogy glükóz-6-foszfatáz aktivitástól független, Glc-6-P-szelektív transzport fehérje működik az ER/SR membránjában. Eredményeink ezen kívül alternatív hipotézisként is szolgálnak annak magyarázására, hogy intakt sejtekben az extracelluláris glükóz szint növekedésekor miért alakul ki fokozott Ca-4szekvesztráció az ER/SR-ban. 24

25 E Glucose-6-Phosphate and Ca2+ Sequestration Are Mutually Enhanced in Microsomes From Liver, jr Brain, and Heart I: ^ jyiicrosornes prepared ^from three rat ^tissues were presence of ATP. This enhancement was not s^en in ^microphate^pec íf i cit y ^ fcttie^ irenspor t^itixtcess* d i ffered ^G -6- tions oahe anion^)^ was that*the permeating^anions preand ATP, a level^of intrarmcrosomal^g-6-p approach mg buffering because these onions have relatively modest asso- 6^P'exceeded the' equlí ib^fum^lu^by three- totourfold" presence of Ca2+or ATP alone or in the presence of a 0ne P ssib e mechanism for ^enhancement is that intralu- ATPase by influencing the release of Ca2+frerri the enzyme expíanaponvo r^ the e'rihar^'ed'^sequ^^reatlo^cff Ca ^nglng f r o ^ 4T ? 1998eMUlar 9lUC S 'S re S6d' Diabetes findings suggesuhat in intact cells variations in^theconcen- plasm that permeable to the ER/SR membrane may influ- Slum (ER)/sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ 6-P), has been shown in permeabilized pancreatic p-cells amount of Ca2* sequestered by ER/SR microsomes in the remains unexplored. This is due in part to the assumptio S j y e ^ storage disease; P morganic phosphate; SR, sarcopiasm.c reticulum. changed by hyperglycemia (21,22) and glycogenolysis (23) 874 DIABETES, VOL. 47, JUNE

26 26

27 TABLE 1 G-6-P hydrolysis by liver, brain, and cardiac microsomes Source of microsomes G-6-P hydrolyzed (nmol min 1 mg protein) Liver i 9.5 Brain of 0.3 mol/l Ba(OH)2. After neutralization with o/mol/l ZnS0, performed in the absence of Ca2* and ATP. Incktding^ither or both of these had no significant effect on G-6-P hydrolysis rates. mmol/l'for G-6-P, F-6-P, GNH2-6-P, and 2dG-6-P; 50 mmol/l for KCl, ing was followed by a decrease nearly as rapid as that seen for KCl. This recovery was not seen with the K+salts of F- 6-P, 2dG-6-P, and glucosamine-6-phosphate (GNH2-6-P). Intermediate levels of permeation were observed with microsomes by G-6-P confirms previous data reported by Fulceri etal. (30). The permeability of the liver ER membrane to G-6-P has neogenesis. As reported by others (14,31%ie*iver displays natively, a subpopulation of brain microsomes may be nonpermeable to G-6-P (31). While this possible heterogeneity is not apparent by light scattering at lower concentrations of G- reported by Hume et al. (33) with fetal adrenal microsomes and Forsyth et al. (32) in brain, demonstrate that permeability to G-6-P is a much more widely distributed property of ER membranes than would be expected if it were solely coupled A selective permeability to G-6-P can also be detected SR/ER m^cro^mits^quesiation^f Ca^by SR/ER micro* meation of G-6-P ^cross^er^membranes^might be indirectly that only about one-tenth the level of G-6-P hydrolysis is seen for permeability to G-6-P in light-scattering assays. The data shown in Fig. 2 demonstrate that cardiac microsomes are somes were incubated with 100 pmoi/l ^Ca2* in the absence of ATP, almost no 45Ca2+was associated with the microsomes solutes, sucrose, F-6-P, and GNH2-6-R In direct contrast with in the presence of 45Ca2+and 1mmol/l ATP, the additional pressequestered by the microsomes from -40 to 300 nmol/mg pro- were as permeable to 2dG-6-P as they were to G-6-P. Microsomes were also prepared from rat brain. Again, a was clearly*distinct from that to sucrose and GNH2-6-P, G-6-P*that can be sequestered by brain microsomes. Alter- 27

28 FIG. 2. Changes in the intensity of light scattering by rat cardiac microsomes in response to various solutes. Cardiac microsomes (SO pg/ml) were equilibrated in 5 mmol/l Pipes (ph 1.0) until a stable light- m r Ús U jtes^bra h- 5<microsonies (80 5 G-6-P, 2dG-6-P, F-6-P, and GNH.-6-P; 50 mmol/l for KCl, NaH2P04, and 1mmol/l ATP was added to the solution, a nearly immediate decrease in the free Ca2+ present outside the microsomes was seen (Fig. 4). Nearly all this decrease was dependent on buffering of the extramicrosomal Ca2+ by the added ATP that enhanced C.a2+sequestration' In addition, the selectivity for F-6-P and 2dG-6-P gave each tissue a unique profile of permeabilities. Additional experiments were carried out at lower levels of extramicrosomal free Ca2* (-1 pmol/l) with cardiac and brain Again, F-6-P enhanced sequestration in brain but not cardiac microsomes. The enhancement of sequestration in cardiac microsomes was linear with extramicrosomal Ca2+(Fig. M) and G-6-P concentrations of 3 mmol/l or less (Fig. 85). In the presence of Ca2+ and ATP, G-6-P is accumulated crosomal concentration. As a third approach to examining the permeation of ER and SR microsomes by G-6-R rapid filtration assays were carried out in which the levels of G-6-P such as F-6-P or 2dG-6-P was iddedtogether extramicrosomal Ca2+ beyond that seen in the presence of ATP alone was observed. Under these incubation conditions, additional sequestration is due to the import of GP-6-P into the lumen of the ER, its effect there on ER Ca2+ ATPase effiined using mag-fum-2. The decrease seen at 25 pmol/l After a rapid filtration protocol, the trapped microsomes When the filtration experiments were carried out with G- nearly immediate. Also in contrast to the results with liver microsomes, 2dG-6-P was as effective as G-6-P in enhancing A comparable series of experiments was carried outwith brain microsomes (Fig. 6). Again, G-6-P enhanced the level of Ca2+sequestration, and in this tissue both 2dG-6-P and F- protein were observed in all three microsome preparations (Fig. 9), although in liver this value was seen only at an incu bation time of 1min. Using an estimate of 4 pl/mg protein for from 1 to 4 min. Quite different results, however, were 28

29 nmo(mc) FIG. 4. ATP-dependent sequestration of extramicrosomal calciurn by mmol/l' of either G-6-P, F-6-P, or 2dG-6-P was added to the reaction mixincluded along with G-6-P (Fig. 10). In all three tissues, the peak values for G-6-P were at least three times the values seen in the absence of ATP and Ca2+. tinguishablep(data not shown). ^ some" incubated in 25 mmol/l G-6-P. In the are shown (Fig. 10), with comparable results being seen with liver microsomes (data not shown). Neither of these cantly higher than that seen in the presence of G-6-P alone. level of G-6-pPwas not significantly different at 1 min, but a modest enhancement was seen after 3 min. As might be and ATP and also in the presence of thapsigargin or ionomycin. In both cases, the accumulation of G-6-P was significantly less than that seen in the incubation containing only G-6-P, Ca2+, and ATP. FIG. 6. ATP-dependent sequestration of extramicrosomal calcium by or 1mmol/l ATP together with either 5 mmol/l G-6-P, 2dG-6-P, or F-6- tive of three experiments. 29

30 fndort ind varying concentrations of calcium(0-2.5 pmol/l). A dosage of 1mmol/l ATP alone (C) or 1mmol/l ATP with 5mmol/l G-6-P ( ) cally. For each tissue, the time course of G-6-P accumulation was determined. The highest levels of G-6-P sequestration were seen at plement ing these findings is the report by Gerin et al. (17). They found a human cdna that encodes a 46 kda transporters. In two patients with GSD 1b, mutations in this pro- Earlier studies demonstrating that G-6-P was effective in The results reported here demonstrate that microsomes preway íotg -Ír The independence of G-6-P import and glucoseo ^ G ^ Ía Ío s s the ER membrane (14,17). This contrasts port model (18,19), in which there is no transport of G-6-P Bánhegyi et al. (20) recently provided biochemical sup- ATP. Our data provide further support in three ways. First, in somes for a given extramicrosomal [G-6-P] than had previously been observed. These data also suggest that in the presence of Ca2+and ATP, the hydrolysis of G-6-P, at least in some tissues, is not limited by G-6-P transport. Third, our ATP - -F each have a distinctive permeation selectivity for sugar phosphates, suggesting the possibility of multiple isoforms of the pmo7/reg TA5 antl'mmol^ A T ^ cois-vho^phatase^ene were found by Lei et al. (37? in glycogen storage disease (GSD) type 1a patients, but not in a closely related form of the disease (GSD 1b), in which DIABETES, VOL. 47, JUNE

31 'ns-pho^hatase, brain and heart, suggest that G-6-P itself s enhancing the function of the SR/ER Ca2* ATPase. C J ^ q u T s m a ^ ÍÍe trate for G-6-P in liver than in brain or heart. This may reflect the hiqh throughput of G-6-P required foreffectiveglycogenoivsis or gluconeogenesis. Second, the additional sequestration of Ca2+seen with G-6-P is a relatively slow process in liver brain and cardiac micrnsomps, the added sequestration is nearly immediate. This is likely due to increased densities of the SR/ER Ca2* ATPases in the latter tissues. depolarization are intact (26). Data from studies of the GSDs also support a relationship between G-6-P import and Ca2* sequestration Symptoms These same symptoms are apparent in GSD 1b, but in addition there is a functional defioinncy in the immi ine system particularly in phagocytic cells such as neutrophils and macroimpairment in the ability of these cells to phagocytose. Interestingly, neutrophils from patients with GSD 1b, but not GSD the import of G^-P is critical to the ability of at least some cells to sequester Ca2*, and the Ca2* results in GSD 1b might fnttepresence of Ca2* and ATP. Passive equilibrium dictates that in a typical experiment, the intramicrosoma! free [G-6-Pj will be at most 5 mmol/l. We assume that the remaining mmol/l G-6-P is complexed with Ca2*. The Ca27G-6-P assocition of total sequestered Ca2+in the presence of 5 mmol/l G- In summary, the hypothesis that led to these experiments is that G-6-P import into the ER is critical to effective intracellular Ca2t sequestration and signaling. This contrasts with the view that Ca2f-binding proteins within the ER/SR are, in conjunction microsomes (38) in the presence of a permeating anion. ^The capacity of theer to^import G-6-P, and tlje r^sultinj lnternabona aprougpramtroject Grant (to R.B.M.) and lowship (to P.Y.C.). This^s a contribution from the Fifty 50 Foods Diabetes Interdisciplinary Research Program. We thank Sherry Crittenden for expert secretarial assistance. tional sequestration of cytoplasmic Ca2* by the ER (24). The decrease in [Ca2+], in response to increasing glucose has also been observed by us (25) and others (26,27) in cell types that 2. Chu A, Bick RJ, Tate CA, Van Winkle WB, EntmanML: Anion effects on in vitro ^ í ^ f ^ t o n o f s e uesteredca^b lucose has viously been suggested to result from changes in a localized pool of glycolytically generated ATP and concomitant alterations in the rate of ATP hydrolysis by the SR/ER Ca2* ATPase (26,27). However, assuming that the ER/SR lumenal volume is -10%, the accessible cytoplasmic volume (39), and that cytoplasmic Ca2* buffering is 99% effective (39,40), a physiologically relevant 100 nmol/l change in [Ca2*], would be achieved by a 100 pmol/l change in total Ca2+sequestered in Chau 264: , 1S89 9 PP 9?? anion efflux and calcium transport. Ann NYAcadSci , 1980 the sarcoplasmic reticulum ATPase. J Bio^Chcm279:43^ , 1995 response to hyp^rglycemia/hyperinsulinem ia (22) or glycogen 880 DIABETES, VOL. 47, JUNE

32 15 field BC, Chou JY: Glucose-6-phosphatase dependent substrate transport in the glycogen storage disease type-la mouse. Nat Genet 13: , Fulceri R.^ellomo G, Gamberucci A, Scott HM, Burchell A.^ened^tti A: S/oc/tmi 7286: , 1992 "» r e 268: , 1993 'C'en' 9'yCC>9enSt ra9e A' JBl0,Chem dle^'type lb. FEBsf.ett 419: , 1997 ^ Bánhegyi G, Marcolongo P, Fulceri R, Hinds C, Burchell A, Benedetti A: 21. Lorenz! M, Toledo S, Boss GR, Lane MT, Montisano DF: The polyol pathway concentrations' Diabetologia 30: , !2. Rothman DL, Magnusson I, Cline G, Gerard D, Kahn CR, Shulman RG, Shul-!3. Salmons S, Jarvis JC, Mayne CN, Chi MM, Manchester JK, McDougal DB, Lowry OH: Changes in ATP, phosphocreatine, and 16 metabolites in muscle stimulated for up to 96 hours.,4m7/%s7o/271:c1167-c1171, 1996 Btochem 7272: , P P P 39. Tse FW, Tse A, Hilie B: Cyclic Ca2 changes in intracellular stores of lations. Proc Natl Acad Sci 75491: , Zhou Z, Neher E: Mobile and immobile calcium buffers in bovine adrenal chromaffln cells. J Physiol469: , Gitzelmann R, Bosshard NU: Defective neutrophil and monocyte functions in 6. Zhang C, Paul RJ: Excitation-contraction coupling and relaxation in porcine DIABETES, VOL. 47, JUNE

33 2. számú közlemény Kzen közleményünk számít GIF kuictirisuiik első jelentős beszámolójának. A már leírt izolálást technikára építve GIF' extraktumot izoláltunk humán.jurkat T-limíoma sejtekből, amelyeknek ER Ca-,4ATPáz- át előzőleg TG-nal bénítottuk az ER Ca2" koncentráció csökkentése céljából. Hasonló motion tisztítottunk GIF' et egy mutáns élesztőből is, amelynek ER/Golgi Ca2+ATPáz enzime genetikai manipuláció következtében hiányzik. Az így izolált CIF extraktumok tesztelésére egy bioassay-t fejlesztettem ki, amely során a CIF-eket fluoreszcens Ca2" indikátorral feltöltött albínó Xenopus laevis oocitákba injektáltuk, majd a Ca24 influx mértékét direkt fluoreszcens és konfokális mikroszkópiás képalkotó eljárással detektáltuk. A Ca2+ hullámok az injektálás pontján indultak, még akkor is, ha az oocrták saját ER-át centnfugalással elkülönítettük a többi sejt alkotótól és az injektálás helyétől. Kontroll sejtekből készített extraktok nem okoztak [Ca2+], emelkedést, és az sem, ha az aktív CIF-et extracellulárisan adtuk az oocitához. A [Ca2+]i növekedés függött az extracelluláris Ca2+ koncentrációjától, de nem függött az IP3 rendszer épségétől, amely mutatja, hogy a CIF közvetlenül a plazma membrán csatornáin fejti ki hatását. A CIF hatására bekövetkező [Ca2+]i emelkedés elemzésére készített számítógépes modell kompatibilis egy kb. 700 Da molekulasúlyét jelátvivő molekula diffúziójával és hatásaival. Whole cell patch clamp méréseink azt is megmutatták, hogy az oocitában aktívnak mért CIF preparátumok Jurkat sejteken egy Ca24 szelektív csatornát nyitnak meg (Ic.kac), amely lényegesen gyorsabban aktiválódik, mint amikor a patch pipetta Ca2+ kelátort vagy IP:t-ot tartalmaz. 33

34 Calcium influx factor is synthesized by yeast and mammalian cells depicted of organellar calcium stores peter Csutora*. Zhengchang Sut, Hak Yo.ng Kim*. A ndrej Bugrim, Kyle W. Cunningham 1, Richard Nuccitellk Joel L. Keizer, Michael R. IIanley", J. Edwin Blalock7, and Richard B. Makói iase* Communicated by Roger Y. Tsien. University of California, San Diego, La Jolla. Í.A, November 17, 1996 (recenetl for reviewaugust ix l wot ABSTRACT Depletion of endoplasmic reticulum Ca2* stores leads to the entry of extracellular Ca2+ into the s S S S s S S S been definitively established. Two hypotheses have been put forward to explain this signaling. One argues that a physical association between the ER and the plasma membrane maybe involved (9), whereas the other -invokes adiffusible messenger 0.7)-... Calcium Influx' Factor (CIF) by Randriamampita8 and Tsien wi h Thapsíga rg in^'a'selective^inhibitor of the ER Ca2* ATPase were unaffected (IRA "l faltotthd^onlj1^lwnamcron!jled i/abh to elicit CY* aedvatedcd+fuinnur\vaddition, ICrac, a Ca2+ release^ understanding of this molecule s action in several ways. First, ited by CIF in Xenopus oocytes'using Ca2"-sensitive dyes. The 700T)a messenger and can be modeled by a simulation in free Ca2^ ([Ca2*],). The initial phase of this response is often caused by the generation of S S+ltfdm4tLtdnÍopSlasmic íeticulum (ER). This depletion of ER Ca2" stores is generally ^followed by an influx of capaata!í f f l or sce-op'er'atet( 3 ) ^ ' e n i This second phase of Ca2- mobilization is required forjefilling intracel- HatiÜnd t S V " interleukin-2 (4). P The signal transduction cascade that leads to the opening of oocyte s'e^an^dm^nct^ro^tha't cauled by IP,. Third, we document that yeast genetically depleted of organellar Ca2* produce a CIF that elicits Ca2' influx in Xenopus oocytes and IfRAC (16). MATERIALS AND METHODS Acid extracts were prepared from thapsigargin-treated and untreated Jurkat cells as described (14). Briefly, 1.5 x 107cells Salt Solution containing'du mm Hepes, ph 7.2. Stimulation for Ca2" influx (5-7) nor the nature of the signal that conveys the message of ER Ca2t depletion to these channels (1, 8) has ml of Hanks Balanced Sah Solution. The suspension was extracted with 0.15 ml of 1 M HC1 for 30 mm at room accordance with 18 U.S.C solely to indicate this fact. 121

35 i : Cell Biology: Csutora a <t/.,s " m lfefnuoís mixing for 20 min. The methanol extrád wai f nh'd on a Sep-Pak Vac C18 cartridge, and the cartridge was!«hed with 0.8 ml methanol. The combined methanol cluatcs Jere dried at 3(LC under N^gasjind resuspended in 50 pi ot SheTdata shown'were routinely performed amhis point in the ^ livit> ^lutcd 1'lon'8 Partisil 10 SAX column as a single peak 25% through a linear salt and ph gradient from 5 to 750 mm (NH4)ITP04and from ph 2.8 to 3.7, respect ive ly). ^Th e^e(.p TSlthe ^cuve LEHELT r : wild-type (YR98: MATaade2 his3-ts200 leu2-3, U21ys2-\201 ura3-52) andpmrl (YR122: MATa«rfe2 /.ÚJ-A200 Ieu2-3,U2 fys2-á201pmrl-^l:±eu2 «ra3--52) yeast cells. Yeast rells^(30 Proc. Natl. Acad. Set. USA 96 (1999) parameters used: spherical bolus of CIF (radius = 100 gm, centered 300 pm (Fig. lf)^or 100 jam (Fig^C^fromjnemu S, a?i r= ícm/s.vserca = 0.1 gm/s, Ashrca MM, k = pmol/s-pm- (Hg. It, extracellular [Ua- j - 5 mm) and h - i.26-10"pmoi/s-pm (Fig. _C, cxtracc.- lular [Ca: ' ] = 10 mm). See ref. 19 for formalism. Conventional whole-cell recording was performed by a List LPC-7 patch clamp amplitier (List Medical Electronic, Darmstadt, Germanvj. Pipettes were fire polished to ptoduee a tip resistance of 3-5 MO.. The cvtoplasmic-likc pipette solution contained 150 mm CsAspartate or CsGlutamate/2 mm MgCl;/1 mm LaCL/lU mm CsEGlA (tree [Ca; ] ~ 20 nmvu'i mm Hopes nil 7? adjusted with CsOFLThe bath MgCL/4.5 mm KC1/10 mm glucosc/10 mm Hopes, ph!a adjusted with NaOII. Solution changes in the chamber were achieved by a gravity-feed system and were completed in Uem recording of current'cell wire'held at ^ V.'a'nd^he signal was digitized at 20 khz and recorded on VCR tape. For display, the signal was filtered at 1,000 Hz by an eight-pole low-pass Bessel filter (Model 900, Frequency Devices, Haverhill, MA). A 320-ms voltage ramp from to +100 mv was ^^experim ents, the cells were held at 0 mv after whole-cell a 260-ms voltage step to -80 mv at a frequency of 0.2 Hz. The currents were sampled a n khz and filtered at 1 khz by the genase^heywere injected wifh L4 rd o'f 5 mm Furád free acid RESULTS visible in the optical plane. jszrjzjsg ('Se i * S, *»Pp u c & ípkddts-ice r a m S s ensyi P h o S AZ). 340/380 n n S o a l 7= 0. Fiira-2 imaging at low magnilicalion a lb in ^ Y ^ Fura-2 (20). A time comse^ohhe re E e 'to IthatÍuhe*'time of Ejection i^shown as a series of of thosethowne(figedl Q 0 C f Ca^ from secre t G pa^thwav^organthes^ís^achfe ve ctvv ^ mutation^ot^the Cat * ATPfa' etrnc q Cp results ^ telae'fated copy albino oocytes were injected with 4 nl of 10 mm Oregon Green Bapta-1 dextran (Molecular Probes)cAfter 30 mim they 30^mYhick op^cal^ec^ons b^usíng^h^letca (Deerfield, IL) TCS-NT computer system. Simulations used the overture software (Los Alamos diffúzon equatolr for<[cif]irn0ds,[cad ]l in a sphere of 1 mm EquaTi o n s' are f 3X/ őí = T v t7 T S dx,hf i,s n 'o,,m Ca; 7ATPase (SERCA) pumping into the ERj and CIFinduccd influx = /c[cif]/(xt + [GIF]) at the surface. The across'thetoiytetfi'ghb). We fouli that oocyte responses maxi ma 1^ v <al u e' c o r re s p o n d e d ^to anlnjection'of 35,000 cell were not active (Fig) 1C). Application of cell extracts to the exterior of oocytes failed to trigger Ca: influx (Fig. 1C), suggesting that the putative CIFs arc membrane impermeinauxrelated issue is whether the primary activity of the! h p ec5i dp tss 35

36 Cell Biology: Csutora cl id. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 123 ^Fta. 1. (A) Pscudocolored ratiometric images^of an albino A'enopM.^oocytc preloaded with^f tra-2 aftchnjccdon^au^=j) of^l4 ni of acid ^extract asafunction of increasing concentrations of the yeast extract inthe absence ( ) and presence (A) of 2mMLaCk The data inc and D refer to opposite side (rightmost curve). Measurements arc8fromthe oocyte's plasma membrane M thepoint of%nctsn ^ in nm ^c*ind^^!ndem^re^a^to^sl^om1jur<kar^)^nd^»)r/nyeasí0filaia^noi showi^also showíf (lj) ís\^ í^mtilared^ogre»iott»f [Ca^]! increases due to a diffusible C1F (19). tions are relevant. First, the magnitude of the responses to thedponsesrcen to the positiv^preparations Second, thí was 10mM." (A) Time course of Alexa 594 fluoresced At /= 0 the dye is visible in the pipette" (n - 4). (B) Time course showing [Ca- *]! as _ fessed by fluorescence of Oregon Green Bapta-1 dextran (n^= 5). (C) Simulation of a confocal image modeling C.V, increases from 150to C$0

37 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1999) pj^hanides (23. 24). Whereas thcmodcst Ca-' i responses to P ^ j evelsof the putative ClFs are up to75% inhibited hv Fa3', ^ otheíresults also argue against an fp3-like release from : stores. First, the increascren [Or *!, elicited hv these extracts L coinjcctlon of'hcpann'at levels^!'block ' }p mediated Ca2 release from intracellular stores (25) had i no effect on Ca2' influx evoked by the putative yeast CIF (Fig. 1C) Third, coinjcction of 0.3 ntg/ml of IG9, polyclonal antibody to the IP, receptor that blocks IP,-induced f a2 afreanjection of the Jurkat extract depicted in Fig. 1/1 in 11 adjacent 80-prmsegments that span the breadth of the cell (Fig. IE) The progression of a 40% increase in fluorescence ratio across the segments was highly reproducible, averaging in multiple trials approximately 4Mm/sec near the injection site and decreasing to less than 1pm/see near the opposite pole (Fig. IF). Next, we constructed a simulation based simply on nldriy, r,,nf vast majority of ER to a relatively narrow band (17). Fig. 3/1 [Ca2;], increases irfresponse to IP anti thaps,garg,n were FIR-enriched band (A.B., P.C.. R.B.M.. and J.E.K.. manuscript in preparation). The localization of the ER was also confirmed by immunofluorescence using an antibody specific for the ER injection of thepmrl extract on the side of the oocyte opposite activity of which is to elicit Ca2+ influx at the plasma mcm- ~700-Da CIF, a remarkable correspondence to the experiwin}ected with?a 759-Da fluorescent marker, Alexa 594 dextran. Alexa 594 was selected for this experiment because its as well Alexa 594Ppread from the point of Injection evenly across the section at a rate of approximately 2-3 Mm/sec (Fig. 2/1). Increases in [Ca2+]i (Fig. 2B) also spread from the point oocyte. The progressionrate of this [Ca2^ increase was nearly identical to that seen with Alexa 594. These data are consistent oocyte in a manner similarpto Alexa 594, but in which the influx of Ca2+ across the plasma membrane triggered by CIF remains characteristics of Ca2* in the cytoplasmic environment (19). A described^s^ slrwn ' i'njdg. ^C,*1and again a high level1if These increases did not* depend on extracellular YCa2+ and comparable to that of Alexa 594. As with the much larger increases seen at the sections' peripheries, this apparent rereceptor antibody (data nert shown). Injections of Ca2* (27)' IP3(18, 28), cyclic ADP ribose (29), and nicotinic acid adenine dinucleotidc phosphate (NAADP) (29). even at high conccn- (dx no^shownl^ch^ wa^itiem^ ^hc" ccntev^^x oocyte. Only very modest (V responses ematmlmg I'n.m I rom the images shown ind and Ő. Extracellular Ca21wash mm. {!)) relative to the FR-enriched hand IIA Times to reach afluorescence

38 Cell Biology: Csutora et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 125 n K ' S Compart^ Í a n d e ^ " ='l4)and pmrl the ER band (Fig. 3D). Increase,n [Ca'*j, that progressed across the breadth of the cell were seen (Fig. 3C) that were cj+] began near the ^injection site and spread across the sfc^ca^'xnne^wvpeíformed whole-cell patch clamp recordings of Jurkat T cells. When the pipette solution contained the Ca2+ chelator EGTA, with or without wild-type activation With IF, depends on [IP,] ^3ij, e».n at 5Gr l,i IF., activation with CIF was at least as rapid (data not shown). The nearly immediate activation of ICrac by pmrl yeast extracts is consistent with a model in which CIF is active in the signaling cascade at a step downstream of IP3. DISCUSSION These data demonstrate that a CIF prepared from either mammalian or yeast cells depleted of ER/Golgi Ca!* elicits levels of sequestered Ca2 were devoid of CIF activity. Since a CIF activity was first described (10), its mode of action and lectively,* the daja presented here provide^ substantial new ilistypc yeas^cxtract had no iffect on the kinetics of acti- La2* (Fig. 4/1). It was inwardly rectified with a reversal potential near +60 mv (Fig. 45), was less permeable to Ba2* than Ca2+, had a 1,000-fold selectivity for Ca2* over Na+ but evidence that a direct activation of Ca2 entry is primarily responsible for the increases in [Ca2 ], we observe. First, achieved by Ca2*, thapsigargin. IPj, cyclic ADP ribose, or acdvattd^^pi). o r thapsigargin (FT 24^ The probability of an 'iprhke^conta n n ^ tin; kck of^effee^heparin Virtuallydklentical results0were semi with GIF preparations ^^Ve'quandtafed Íhe^hÍeJcouíse^of the activation of ICrac by dialysis of the cytosol with either wild-type or pmrl yeast extracts or with IP-,. The times to achieve an ICrac of 7.5 PA in Jurkat T cells by wild-type yeast oocytes^and is faithfully mimicked bypthc simulation with a reaching0ts0pa b^l^sec. Although the time constant" of

39 6Cell Biology: Csutora et al Brother agents that tirst release La írom stores. together, f,hese daatathce hs^!atcmb"a.'w ^ y ac,'ng t Ólty l were surprised that the Ca2~ influx activated bv the tative CIFs was not identical to the influx stimulated when the oocytes' Ca; ' scores are depleted (23, 24). This lattei influx disdnc^qf 'influx pathways in oocytes. Onl/one of those was Proc. Natl. Acad. Set. USA 96 (1999) We thank Michael Quick for his expertise and assistance with the thank Timothy Walseth for providing cyclic ADP ribose and NAADP. Scliolais Piogram/The Chicago Community Trust (K.W.C.), and re- CIF, a supposition supportedby CIF preparations from these cells (M.R.H., unpublished observation). This level of CIF concentrations aitaddh activated.0 This channel is responsible for the bulk of the mammalian cells, as CIF is able" ^activate bott ^ 3 ^ 3 Jngreparation, Z.S., P.C.^ITB.M., and TER).'5(ma^USCriP* in the fluorescence ratio became apparently after 30 min. dependent CL currents seen by DeLisle et al. in these cells mammalian cells lead to more rapid inactivation of the influx cytoplasm. This comparison suggests that cells with severely depleted Ca!i stores make far more CIF than is required for The finding that yeast that are unable to sequester Ca2+ in organelles of the secretory pathway make a putative CIF suggests that the mechanism for repletion of depleted Ca2+ evol in i cm.^th is f i rt di ng also "eh minates *t he" p os s to il U ha t thapsigargin is necessary for the CIF response, since a genetic responsible for store depletion. Although complete characterization of a CIF from any source has not yet been achieved, we 1Í 'such V'c on s er v at ion ^wo u1d ^appeal 'to 3erecore"the fundamental nature of Ca2* as a signaling molecule and the 54, Putnev,.!. VV. A Bird, G S J (1993) Cell 75, Clapham. D. R. f 19951Cell SO Rao, A., Luo, C. & Hogan, P. G. (1997) Ann. Rev. Immunol. 15, Clapham, D. E. (1996) Neuron 16, Birnbaumcr, L Zhu. X., Jiang, M Boulay, G Peyton, M al. (1996) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 93, Parekh, A. B. & Penner, R. (1997) Physiol. Rev. 77, Petersen, C. C. H. & Berridge, M. J. (1996) Ear. J. Physiol 432, Randriamampita, C. & Tsien, R. Y. (1993) Nature (London) 364, 11. Thastrup, 0.. Cullen. P. J Drobak, B. K Hanlev, M. R. & Dawson, A. P. (1990) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 87, Gilon, P Bird. G. J Bian, X Yakel. J. L. &Putney, J. W Jr. 13. Kim, H. Y Thomas, D. & Hanley, M. R. (1995) J. Biol. Client. 270, Thomas. D. & Hanlev. M. R. (1995) J. Biol. Chan. 270, Thomas, D Kim, H. Y. & Hanley, M. R. (1996) Biochem. J Hoth, M. & Penner, R. (1992) Nature (London) 355, Han. J.-K. & Nuccitelli, R. (1990)7. Cell Biol. 110, IS. Larabell, C. & Nuccitelli, R. (1992) Dev. Biol. 153, Jafri, M. S. & Keizer, J. (1995) Biophys. J. 69, Grynkiewicz. G Poenie, M. & Tsien, R. Y. (1985) J. Biol. Chem. 260, Rudolph, H. K Amebi, A., Fink, G. R Buckley, C. M Dorman, T. E LeVitre, J., Davidow, L. S Mao, J. I. & Moir, D. T. (1989) Cell 58, B. P. & Barritt, G. J. (1996) Cell Calcium 19, Yao, Y. & Tsien, R. Y. (1997) 7. Gen. Physiol. 109, Nuccitelli, R Yim, D. L. & Smart, T. (1993) Dev. Biol. 158, K. (1997) Science 278, ' 27. DeLisle, S. & Welsh, M. J. (1992) 7. Biol. Chem. 267, DeLisle, S Blondcl. O.. Longo. F. J.. Schnabel, W. E Bell, G. I. &Welsh, M. J. (1996) Am. J. Physiol. 270, C Lee. H. C. (1997) Physiol. Rev. 77, Jaconi. M.. Pvle. J Bortolon. R.. Ou. J. & Clapham. D. (1997) Curr. Biol. 7, Huang, Y. & Putney, J. W. (1998) 7. Biol. Chem. 273, , 39

40 Egészen a legutóbbi időkig úgy tartották, hogy kapachaiív CnJ influx csak nem ingerléken)- sejtekben fordul elő, és nem érinti az izom- és idegsejteket. Kollaborátoraink a közelmúltban leírtak egy 3 ps konduktivitású Ca2~ csatornát aorta simaizomsejtekben, amely az ER Ca-" raktárainak kiürítése után aktiválódik, vagyis kapacitatív Ca;" csat ornának tekinthető [Y2J. Sem CaA, 1F3, vagy más másodlagos jelatvivo molekula nem volt képes aktiválni ezt a csatornát izolált ínside-ont membrán patch preparátumokon. A jelen közleményben arról számolunk be, hogy- az áltálunk élesztőből és humán trombocitákból izolált GIF hozzáadása ezt a csatornát azonnal aktiválja, és a fiziológiás Ca2+ áramokkal megegyező elektrofiziológiai történéseket eredményez. Továbbá, permeabilizált, majd TCi-al kezelt trombociták hozzáadása izolált inside-out membrán patch preparátumokhoz szintén aktiválta a vizsgált csatornát, amely a permeabilizált trombociták által termelt in vivo CIF kiáramlásának eredményeként jött létre. Azt is bemutatjuk, hogy trombocitából izolált CIF extraktumokat FlPLC-vel tovább tudtunk tisztítani, és az így előállított különlegesen tiszta CIF frakciók mind Xenopus oocitákba injektálva, mind a fent ismertetett patch mérésekben aktívnak bizonyultak. Ezek az adatok dokumentálják az első fiziológiásán is működő kapacitatív Ca2+ csatornát és annak valószínű aktivátorát érfali

41 Calcium Influx Factor Directly Activates Store-operated Cation Channels in Vascular Smooth Muscle Cells* Published, JBC Papers in Press, June l^moo! DCH /jb c.m Elena S. Trepakovaf, Peter Csutorái, Dacia L. Huntoni, Richard B. Mnrcha«<*S, Richard A. Coheni, and Victoria M. BolotinatH Recently, we described a nov^3-ps Ca^-conducting tmsmc immediately upon application of Ca2^ influx Jurkat fells. In bioassay experiments depletion of Ca2+ stores in permeabilized human platelets resulted in the release of endogenous factor, which activated 3-pS cised from SMC and exposed to permeabilized platelets. The same 3-pS channels in excised membrane patches were also activated by acid extracts of CIF derived from human platelets with depleted Ca2+ stores, which also (CRAC) channels found in some nonexcitable cells (6, 7) and certain members of the TRP channel family (8-10). Recently, we found a novel Ca2' -conducting channel that is likely to be a native store-operated channel responsible for muscle cells (SMC ).2Poor cation selectivity of this 3-pS channel distinguishes it from the CRAC channel (6, 7), and although it resembles some channels from the TRP family, none of them 10). These^3-pS nonselective cation channels rarely opened in with BAIT A or by thapsigargin (TG,-induced inhibition of InsP4, GTPyS, camp, cgmp, ATP, and ADP) Activated these deficient in SERCA (ancf therefore depleted in organellal Depletion of intracellular Ca2+ stores activates store-operated (capacitative) Ca2" influx in a variety of nonexcitable cells (SOC)1in different cells as well as the mechanism of their CIF (12-15) or if conformational coupling with InsP3receptors in the stores is required for their activation (16-18). We also present in the plasma membrane of resting SMC or if the upon depletion of the stores (19, 20). nile Diabetes Foundation International. The costs of publication of this whhi18t.sichesecti'inb1734 solely to indicate this fact. UnihVostön University slhooíof Mediane.^l^Alban St.^X-lOR Boston, MA Tel.: ; Fax: ; Vb T f Ibbreviatbnshusl^are: SOC, store-operated channels; SMC, smooth muscle cells; TG. thapsigargin; SERCA, sarco/endoplasmic reticulum Ca2'-ATPase; GTPyS, guanosine 5 -O-ithiotnphosphatei; CIF, Ca2- influx factor; BAPTA, 1.2-bis-(2-aminophenoxy)ethane- AWy'JV'-tetraacetic acid; CRAC, Ca2 release-activated Ca2 channel, TRP, transient receptor potential, InsR,, inositol 1,4,5-ti iphos- lets with depleted Ca2' stores. This is the first evidence of lowing depletion of their Ca2* stores Teri

42 FIG. 1. CIF from pmrl yeast activates single channel currents in in- SMC1brfőreVnd afterappl "ca^on of OT {open ba > 13'l j J.rt f th^ n>. m.1 beínn g f ^ mmnacl^conditions) recorded at Jndb points3histograms0 cafcuílatedrcfoerntealh S is s ls S UOmMSNa0Clt,armM CaV (O), 140 mm NaCl, 10 mmcacl, ( 0). Each point is an average of three to seven experiments. the pipette or bath solutions (instead of EGTA). The pipette solutions Íryps^nfnhMtor í^mg/mvu-h treitmeít at M'C), píaced^n coverslips ^in 1%Dulbecco modified Eagle medium (Life Technologies, Inc.) Ca2" -dependent CL and K* currents, respectively. In control experiobtained from^he regional Red Cross following 5-7 days of storage! Unstimulated platelets were kept at room temperature. The Ca2' Sylgard (Dow Corning Corp.) and polished to assistance of Mil (when filled with high sodium pipette solution). pclamp 6 software (Axon Instruments) was used for data acquisition and analysis. Data was performed using a Keystone Scientific Partisii 10 SAX column conducted at C. time to Illustrate the time-course of channel activity. The amplitude of described (12i Changes in intracellular Ca2' were measured on an EGTA (ph 7.4;. In some experiments Ca2' (1 or 10 mm) was added to

43 CIF Directly Activates Store-operated, Channels 1 KH.PO.. S mii KH.CO,. 20 m.mhepes (ph 7.1), 2 mmmg ATP^ TPa^gi5e^ t1tn/ra^staen1^ permeabiuze^tuh öit^g/mi anyui»sr«y» ^ y»a 5 g thf number of experiments in the text. Statistical significance was p < 0.05 were considered to be significant. To assess the posstble mechanism of activation of the^3-ps with little or no single channel^ activity were excised from S e Ő f m S r Í n ^ in 16 of 18 experiments (Fig. 1). ^though the single channel be clearly resolved (Fig. la). The histograms of the current amplitude (Fig. 16) revealed the presence of several (two to to^thelnside of membrane). Suspension of permeabiuzed platelets (^at a fng slngle^htnnel current amplitudes. CIF-activatod channels had the same electrophysiological characteristics as Urose^pre- BAPTA and TG in intact SMC.2The IN relationship of the ductance of 3.3 ± 0.4 ps (n = 7) in the absence of extracellular Ca2', and 3.2 ± 0.2 ps (n = 6) and 3.1 ± 0.4 ps (n = 3) in the presence of 1and 10 mmof Ca2r, respectively. The dependence which did not change at negative, but significantly increased at lets (Fig. 2a), and^he activity that of native store operative 3-pS channels.2thus, CIF exwhkh dfno/produce CIF (12), did not activate 3-pS channels the 3-pS channel^ was moninels in the patch (NP0wasll.OlO r before and^o.oll ± nets in the isolated patch (in five If six experiments),'and at the peak of activity NP0reached 0.23 ± 0.06 (at -100 mv, n = 5). The time course and peak activity of the channels in this bioassay system were similar to the time course of TG-induced in'excisec^memlirane6{latches from SMC^? The first senes of expenments was designed to bioassay CIF produced by human platelets during depletion of their Ca2- channel could be blocked by a high concentration of La3' (2 m.m) applied from the cytoplasmic sidemn - 5, Fig^ 26;. The4 3