(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU000003T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 003 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: A61K 31/47 (06.01) A61P 29/00 (06.01) C07D 2/26 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO PCT/EP 0/412 () Elsõbbségi adatok: 04MI IT (72) Feltalálók: Felicetti, Patrizia, Roma (IT); Fincham, Christopher Ingo, Pomezia (IT); Giolitti, Alessandro, Firenze (IT); Maggi, Carlo Alberto, Firenze (IT); Quartara, Laura, Firenze (IT); Rossi, Cristina, Pomezia (IT) (73) Jogosult: Istituto Luso Farmaco d Italia S.p.A., Peschiera Borromeeo (IT) (74) Képviselõ: dr. Török Ferenc, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Nem peptid bradikinin antagonisták és az ezeket tartalmazó gyógyszerészeti készítmények (7) Kivonat A találmány bradikinin (BK) B2 receptor speciális antagonistájaként aktivitással rendelkezõ nem peptid vegyületekre vonatkozik. A vegyületek kémiailag úgy jellemezhetõek, hogy rendelkeznek egy ciklusos csoporttal alfa-szubsztituált aminosavrésszel és egy tetraalkilammónium-csoporttal. HU 003 T2 A leírás terjedelme oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 A találmány tárgya A jelen találmány kvaterner ammóniumcsoportot tartalmazó, a bradikinin (BK) B2 receptor speciális antagonistájaként aktivitással rendelkezõ nem peptid vegyületekre vonatkozik, valamint az ezeket tartalmazó gyógyszerészeti készítményekre és ezek alkalmazására minden olyan állapot kezelésére, amely magában foglalja a bradikinin B2 receptorok aktiválását A találmány háttere A bradikinin (BK) a kininekhez tartozik, és a kallidinnel és T¹kininnel együtt alkotják a kininek emlõsökben is elõforduló alcsoportját. A kininek, mint fájdalom- és gyulladásközvetítõk (mediátorok), a központi és a perifériás idegrendszerben egyaránt fontos szerepet játszanak. Közelebbrõl a bradikinin egy nonapeptid (H¹Arg 1 -Pro 2 -Pro 3 -Gly 4 -Phes ¹Ser 6 -Pro 7 -Phe 8 -Arg 9 ¹OH) melyet a test fiziopatológiás állapotban termel. Két kininreceptor típus létezik, a B1 és a B2. A B1 receptor fõ jellemzõje, hogy inkább indukálható, mint konstitutív. A szövetekben gyulladásos és stresszes állapotokban fejezõdik ki. Másfelõl a B2 egy konstitutív receptor, normál körülmények között minden szövetben jelen van, és a gyulladásos folyamatokban közvetítõként mûködik. A bradikinin és a kallidin fehérjeprekurzoraikból (kininogénekként ismertek) képzõdnek a kininogenázoknak nevezett proteolitikus enzimek hatására. Ezek között a fõszerepet a kallikreinek játsszák, amelyeket ha egyszer leadja a prekurzor, akkor csak rövid ideig képesek hatásukat kifejteni, mivel a cirkuláló enzimek sorozata és az általánosságban kininázokként definiált membránok gyorsan elpusztítják azokat. Ezen kininázok egyike a C¹végzõdés argininjénél hasítja a bradikinint, létrehozva a dez-arg-bk¹t, ami a B1 receptor agonistájaként mûködik. A bradikinin B1 és B2 receptorok aktiválása az érfali izmok relaxációját és ennek következtében vérnyomáscsökkenést eredményez, növeli az erek áteresztõképességét, a belek és a légzõszervek simaizomzatának összehúzódását okozza, stimulálja a fájdalomérzõ neuronokat, módosítja az ionos hámszöveti kiválasztást, nitroxidtermelést, és különbözõ sejttípusokból leukociták és eikozanoidok révén citokin kiválasztását eredményez. Következésképpen a BK receptorok antagonista vegyületei gyógyszerek új típusának tekinthetõk, melyek várhatóan különbözõ rendellenességek esetében aktívak. A fenti antagonisták lehetséges gyógyászati alkalmazásai a gyulladásos, allergiás és autoimmun rendellenességek, mint az asztma és krónikus hörghurut (az irritáló anyagok által kiváltott is), allergiás, vazomotorikus és vírusos nátha, krónikus elzáródásos tüdõelégtelenség (obstructive pulmonary disease, COPD), reumás ízületi gyulladás, a bél krónikus gyulladásával járó betegségek (Crohn-betegség és fekélyes vastagbélgyulladás), glomerulonephritis, pikkelysömör, bõrkiütések, akut és krónikus hólyaggyulladás; fibrózissal jellemezhetõ degeneratív rendellenességek, mint a májzsugorodás, glomerulopátiák és tüdõfibrózis, érelmeszesedés; fájdalomcsillapító hatásának köszönhetõen akut és krónikus fájdalmak kezelésében egyaránt, például égés, fejfájás, rovarcsípés, rákos betegek krónikus fájdalmai; szív- és érrendszeri rendellenességek, mint a szeptikus, allergiás és poszttraumás sokkok, máj-vese szindróma okozta májzsugorodás; rákellenes és antiangiogenetikus gyógyszerként; alacsony vérnyomás és hajhullás kezelésében. Az irodalomból a bradikinin B2 receptorának különbözõ peptid és nem peptid antagonistái ismertek. A WO iratban olyan vegyületek nagy családját mutatják be, melyek antagonista aktivitást mutatnak bradikinin B2 receptorán. A találmány szerinti vegyületeket, bár beletartoznak a WO iratban bemutatott általános képletbe, az említett dokumentumban nem írták le, és nem jellemezték. A találmány részletes ismertetése A találmány nem peptid vegyületekre vonatkozik, amelyek nagy affinitást és antagonista aktivitást mutatnak a B2 receptor irányában, és amelyek az alábbi (I) általános képlettel rendelkeznek, ahol R jelentése hidrogén vagy metilcsoport; W jelentése egyszeres kötés vagy oxigénatom; n=3 X jelentése hidrogén vagy egy NR 1 R 2 aminocsoport, amelyben R 1 és R 2 egymástól függetlenül hidrogén vagy a metil¹, etil¹, n¹propil¹, izopropilcsoport közül választott; Y jelentése NR 3 R 4 R kvaterner ammóniumcsoport, ahol R 3,R 4,R egymástól függetlenül lehet a metil¹, etil¹, n¹propil¹, izopropil¹, n¹butil¹, izobutil¹, n¹pentil-csoport közül választott, és ezek gyógyszerészetileg elfogadható savval képzett sói. Elõnyösen az (I) vegyületek szervetlen vagy szerves savakkal sóvá alakítottak, ahol a sav a sósav, hidrogén-bromid, hidrogén-jodid, kénsav, foszforsav, ecetsav, trifluor-ecetsav, propionsav, oxálsav, almasav, maleinsav, borostyánkõsav, malonsav, aszparaginsav, glutaminsav közül választott. Továbbá a királis centrum jelenléte miatt a találmány mindkét enantiomert vagy azok bármely arányú keverékét, beleértve a racém elegyet is, magában foglalja. Az (I) képlet szerinti vegyületek in vivo és in vitro egyaránt nagyobb antagonista aktivitást mutatnak a B2 receptor irányában, mint a WO iratban ismertetett, szerkezetileg nagyon hasonló analógok. (I) 2

3 Elõnyösek azok az (I) általános képletû vegyületek, amelyekben n=3; X jelentése hidrogén vagy NH 2 csoport; Y jelentése N(CH 3 ) 3 + kvaterner ammóniumcsoport; a többi szubsztituens a fentebb meghatározottaknak megfelelõ. Különösen elõnyösek azok az (I) képletû vegyületek, amelyekben R jelentése hidrogén vagy metilcsoport; W jelentése oxigénatom; n=3; X jelentése hidrogén vagy NH 2 csoport; Y jelentése N(CH 3 ) 3 + kvaterner ammóniumcsoport. A találmány tárgyát képezõ vegyületek a jól ismert szintetikus eljárásokkal elõállíthatók. Elõnyösen az (I) általános képlet szerinti, fentebb meghatározott vegyületeket megfelelõ kondenzációs reagensek jelenlétében a (II) általános képletû, a WO iratban ismertetett módon elõállított intermedier () képletû vegyülettel (II) () vagy annak származékával, amelyben a karboxilcsoport megfelelõen aktivált, végzett kondenzációjával állítjuk elõ. A szintézis eljárást az 1. reakcióvázlaton mutatjuk be. 1. reakcióvázlat A (2) képlet szerinti vegyületet a J. Med. Chem. 01, 44, közleményben leírt módon a megfelelõ toluolszármazék brómozásával állítottuk elõ, amelyet pedig a J. Fluorine Chemistry, 00, 1, 8 89 közlemény alapján készítettünk el. 60 Az elsõ lépés a (4) szulfon-amid-kötés kialakítására vonatkozik a (2) és (3) intermedierek kondenzációjával. Ezt a reakciót szobahõmérsékleten, elõnyösen acetonitril/víz (2:1) elegyében, nátrium-hidrogén-karbonát (NaHCO 3 ) jelenlétében hajtjuk végre. A reakció a ben- 3

4 2 3 4 zolgyûrûn lévõ klór és bróm cseréjével játszódik le: a keletkezõ termékek elegyét közvetlenül használtuk fel a következõ reakciólépésben. A (6) észterszármazék a halogénszármazék elegy () diszubsztituált hidroxi-kinolinnal, kálium-karbonát (K 2 CO 3 ) és kálium-jodid (KI) jelenlétében, refluxáló acetonban végbemenõ reakciójában keletkezik. Az () képlet szerinti vegyületet, például 2,4-dimetil- 8-hidroxi-kinolint, amelyben R 4 =R =CH 3, a WO96639 iratban leírtak szerint állítottuk elõ. A (6) képlet szerinti metil-észtert bázikus körülmények között (7) karbonsavvá hidrolizáltuk, amit (8) Bocpiperazinnal a (9) intermedierré kondenzáltuk. A kondenzációs reakciót a peptidszintézis ismert eljárásának megfelelõen hajtottuk végre, a karboxilrészek aktiválására hidroxi-benzo-triazolt, kondenzálóreagensként 1¹etil-3-(3 -dimetil-propil)-karbodiimidet, és a kondenzálóreagens mennyiségére vonatkoztatva három ekvivalens mennyiségben tercier amint, nevezetesen diizopropil-etil-amint alkalmaztunk. A (II) vegyület elõállításhoz a (9) intermedierrõl lehasítottuk a Boc-csoportot sósav (4N) dioxános oldatával, és a hidroklorid helyett a szabad amint izoláltuk. A (11) származékot a () intermedier és a (11) aminosav kondenzációjával állítottuk elõ a (9) vegyület (7) vegyületbõl való elõállításánál ismertetett eljárással. A (11) intermedierben jelen lévõ bármely Boc-csoport eltávolítható sósav (4N) dioxános oldatával, így megkapjuk a végterméket. Abban az esetben, ha a trialkil-ammónium-csoport nincs jelen egyik kereskedelmi forgalomban kapható intermedierben sem, a megfelelõ aminból ismert eljárásokkal szintetizálható (Rapoport et al, J. Org. Chem., 1977, 42, ; Chen et al, J. Biochem., 1978, 6, 0 2). A találmány szerinti vegyületek minden olyan rendellenesség kezelésében alkalmazhatók, ahol a bradikininreceptor aktiválását blokkolni vagy csökkenteni kell. Különösen alkalmasak gyulladásos, allergiás és autoimmun rendellenességek, mint az asztma és krónikus hörghurut, allergiás, vazomotorikus és vírusos nátha, krónikus elzáródásos tüdõelégtelenség (COPD), reumás ízületi gyulladás, a bél krónikus gyulladásával járó betegségek (Crohn-betegség és fekélyes vastagbélgyulladás), glomerulonephritis, pikkelysömör, bõrkiütések, akut és krónikus hólyaggyulladás, májzsugorodás, glomerulopátiák és tüdõfibrózis, érelmeszesedés; akut és krónikus fájdalmak egyaránt, szeptikus, allergiás és poszttraumás sokkok, máj-vese szindróma okozta májzsugorodás; alacsony vérnyomás és hajhullás kezelésében vagy rákellenes és antiangiogenetikus gyógyszerként. Terápiás alkalmazáshoz a találmány szerinti vegyületeket gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval/kötõanyaggal megfelelõen formulázni kell. Elõnyösek azok a gyógyszerészeti formák, melyek orális adagolásra alkalmasak, például tabletták, kapszulák, granulátumok, porok, oldatok, szuszpenziók, szirupok és hasonlók. Ezen gyógyszerészeti készítmények a hagyományos eljárásokkal elõállíthatók az ismert hozzávalók, például ligandok, lazítóanyagok, kenõanyagok, töltõanyagok, stabilizátorok, hígítóanyagok, színezõanyagok, ízanyagok, nedvesítõszerek és egyéb, a terület szakemberei által ismert kötõanyagok felhasználásával. Az orális készítmények a nyújtott hatóanyag-leadású formulákat is magukban foglalják, például bélben oldódó tablettákat vagy granulátumokat. A szilárd orális készítmények a hagyományos keveréssel, töltéssel vagy préseléssel készíthetõk el. A folyékony orális készítmények lehetnek például vizes vagy olajos szuszpenziók vagy oldatok, emulziók, szirupok, vagy száraz termékként biztosíthatók, melyeket használat elõtt vízzel vagy más alkalmas hordozóval kell újra kialakítani. Az adagolás a beteg korának és általános állapotának, a betegség vagy rendellenesség természetének és súlyosságának, és az adagolás útjának és típusának megfelelõen határozható meg. Szabályként, felnõtt humán páciens orális adagolásakor a találmány szerinti vegyületek általános napi adagolása 1 00 mg, elõnyösen 0 mg tartományba esik, egyszeri, vagy részletekre osztott adagokban. Az alábbi példák segítségével részletesebben mutatjuk be a találmányt. Példák 1. példa [4¹(S)-Amino--(4¹{4¹[2,4-dikloro-3¹(2,4-dimetil- kinolin-8-il-oxi-metil)-benzolszulfonil-amino]- tetrahidropiran-4-karbonil}-piperazin-1¹il)--oxopentil]-trimetil-ammónium-klorid-dihidroklorid [az (I) általános képlet szerinti vegyület, amelyben R=CH 3, W= O, X=NH 2, n=3, Y=N(CH 3 ) 3 + Cl ], A vegyületet a 2. reakcióvázlaton bemutatott úton állítottuk elõ. 2. reakcióvázlat 4

5 Általános eljárások: analitikai HPLC: áramlás: 1 ml/perc; mozgófázis: A 0,1%¹os trifluor-ecetsav vizes oldat, B 0,1%¹os trifluor-ecetsav acetonitriles oldat; oszlop: Zorbax Eclipse XDB C8, mikron, 0 4,6 mm. (2) intermedier: 2,4-diklór-3-bróm-metilbenzolszulfonil-klorid ml klór-szulfonsavahoz 4,8 ml 2,6-diklór-toluolt adagoltunk cseppenként két óra alatt, mágneses keverés mellett, szobahõmérsékleten. Az adagolás befejezése után az elegyet C hõmérsékletre melegítettük 2 órára, így bíborszínû oldatot kaptunk, melyet lehûtöttünk és óvatosan, erõteljes keverés mellett jeges vízre öntöttük (0, l). A kivált fehér szilárd anyagot szûrtük, porítottuk, vízzel mostuk, KOH felett szárítottuk majd n¹hexános mosással tisztítottuk, 0 ml oldószert adagolva erõteljes keverés mellett. Az elegyet szûrtük, a szilárd anyagot eldobtuk, az oldószer szárazra párlásával kaptuk a 2,4-diklór-3-metil-benzolszulfonil-kloridot, mint fehér kristályos szilárd anyagot. Kihozatal: 8%. HPLC tisztaság: 86% (% B 3%/percnél, Rt=19,7 min). 1 H NMR (CDCl 3 ): (ppm) 2,6 (s, 3H), 7, (d, 1H), 7,9 (d, 1H); ESI(+) MS: m/z 260 [M+H] +. Ezt az intermediert a következõ körülmények között brómoztuk: mmol 2,4-diklór-3-metil-benzolszulfonilkloridot oldottunk fel acetonitrilben. 2 ekvivalens NBS¹t adagoltunk szobahõmérsékleten keverés mellett az NBS teljesen feloldódásáig. Végül 0,1 ekvivalens azobiszizobutironitrilt (AIBN) adagoltunk az elegyhez és körülbelül 6 óra idõtartamra 70 C hõmérsékletre melegítettük. Az oldatot elpárologtattuk, a maradékot etilacetáttal felvettük, vízzel és %¹os NaHCO 3 ¹al mostuk, száraz Na 2 SO 4 fölött szárítottuk és szûrtük. A szerves fázis elpárologtatásával nyert viszkózus, világos színû folyadékot petróleum-éterrel vettük fel. A maradékot szûrtük, az oldat a (2 ) vegyületet világos színû kristályos szilárd anyagként biztosítja HPLC tisztaság: 9% (0% B %/percnél, Rt=18,72). 1 H NMR (CDCl 3 ): (ppm) 4,8 (s, 2H), 7,8 (d, 1H), 8,08 (d, 1H); ESI(+) MS: m/z 338,1 [M+H] +. (3 ) intermedier: 4¹amino-tetrahidropirán-4- karbonsav-metil-észter-hidroklorid 4-Amino-tetrahidropirán-4-karbonsav-hidrokloridot (0,02 mol) 13 ml CH 3 OH-ban szuszpendáltunk, 60 C hõmérsékletre hûtöttük és keverés mellett cseppenként SOCl 3 ¹t (3 ekvivalens) adagoltunk. Az adagolás befejezte után az elegyet hagytuk szoba-hõmérsékletûre melegedni, majd fokozatosan forrpontig melegítettük, hogy tiszta oldatot kapjunk (körülbelül 2 óra), amit lehûtöttünk, a maradékot szûrtük és vákuum alatt koncentráltuk. Kihozatal 80%. Tisztaság (NMR): 8%. 1 H NMR (DMSO-d 6 ): (ppm) 1,91 2,04 (m, 4H), 3,78 (s, 3H), 3,60 3,8 (m, 4H), 9,00 (s, 3H). ESI(+) MS: m/z 160,1 [M+H] +. (4 ) intermedier: 4¹(3¹bróm-metil-2,4-diklór- benzolszulfonil-amino)-tetrahidropirán-4- karbonsav-metil-észter A (3 ) intermediert (1,1 ekvivalens) 4 ekvivalens K 2 CO 3 ¹al együtt vízben feloldottuk. Ezt az oldatot 1 ekvivalens ( mmol) (2) intermedier acetonitriles oldatához adagoltuk és szobahõmérsékleten addig kevertük, míg csapadék képzõdött (4 óra). Az oldószert elpárologtattuk és a maradékot etil-acetátban és 0,1 M¹os HCl-ben (1/1) feloldottuk. A szerves fázist elválasztottuk és Na 2 SO 4 fölött szárítottuk. Az oldószert elpárologtattuk, a kapott szilárd anyagot ciklohexánnal mostuk, ezáltal fehér szilárd anyagot kaptunk, amelyben klór/bróm származékok vannak /1 arányban jelen. Kihozatal: 60%. HPLC tisztaság: 88% [% B 3%/percnél; Rt=14,11 (Br) és 14,47 (Cl)]. 1 H NMR (CDCl 3 ): (ppm) 1,81 1,99 (2H, m), 2,07 2,2 (2H, m), 3,49 3,71 (7H, m), 4,81 (1,H, s, [Br]), 4,94 (0,3H, s, [Cl]),, (1H, széles s),

6 7,47 7,3 (1H, m), [7,49 (d, J 8, Hz, X=Br), 7,1 (d, J 8, Hz, X=Cl], 7,91 7,98 (1H, m), [7,94 (d, J 8, Hz, X=Br), 7,96 (d, J 8, Hz, X=Cl]. (6 ) intermedier: 4¹[2,4-diklór-3¹(2,4-dimetil-kinolin- 8-il-oxi-metil)-benzolszulfonil-amino]- tetrahidropirán-4-karbonsav-metil-észter ( ) kinolint (0,48 mmol) és LiOH¹t (2, ekvivalens) szobahõmérsékleten nitrogén alatt metil-etil-ketonban (MEK) összekevertünk. A keveréket 90 percig nitrogén alatt kevertük. A (4) intermediert MEK/száraz DMF (2/1) elegyében (42 ml, 12 ml/mmol) feloldottuk, és a kinolint tartalmazó oldatot keverés mellett cseppenként a reakcióelegyhez adagoltuk. A keverést 16 órán át fenntartottuk. A reakcióelegyet vákuum alatt koncentráltuk, a maradékot etil-acetátban (0 ml, 0 ml/mmol) feloldottuk. A szerves fázist ph=4,2 pufferoldattal (3 0 ml) mostuk, Na 2 SO 4 felett szárítottuk, szûrtük és vákuum alatt koncentrálva sárga olajat kaptunk. Kihozatali 33%. HPLC tisztaság: 77% (% B, 3%/percnél; Rt=9,4). 1 H NMR (DMSO-d 6 ): (ppm) 1,80 1,9 (m, 4H), 2,6 (s, 3H), 2,64 (s, 3H), 3,32 3, (m, 2H), 3,42 3, (m, 2H), 3,60 (s, 3H),,7 (s, 2H), 7, (s, 1H), 7,39 (d, 1H), 7,0 (dd, 1H), 7,67 (d, 1H), 7,78 (d, 1H), 8,02 (d, 1H), 8,77 (széles s, 1H); ESI(+) MS: m/z 3,1 [M+H] +. (7 ) intermedier: 4¹[2,4-diklór-3¹(2,4-dimetil-kinolin- 8-il-oxi-metil)-benzolszulfonil-amino]- tetrahidropirán-4-karbonsav A (6 ) képletnek megfelelõ intermediert THF-ben feloldottuk és ekvivalens LiOH 1M¹os vizes oldatát adagoltuk hozzá. Az elegyet 4 órán keresztül C hõmérsékleten kevertük, majd az oldószert elpárologtattuk. A maradékot vízben oldottuk és 0,1 M¹os HCl¹t adtunk hozzá ph=4 eléréséig. A vizes fázist diklór-metánnal extraháltuk, a szerves fázist Na 2 SO 4 fölött szárítottuk. Az oldószert elpárologtattuk, sárga szilárd maradékot kaptunk. Kihozatali 90%. HPLC tisztaság: 99% (% B, 3%/percnél; Rt=7,72). 1 H NMR (DMSO-d 6 ): (ppm) 1,7 1,90 (m, 4H), 2,6 (s, 3H), 2,64 (s, 3H), 3, 3,3 (m, 2H), 3,38 3,0 (m, 2H),,8 (s, 2H), 7, (s, 1H), 7,37 (d, 1H), 7,46 (t, 1H), 7,67 (d, 1H), 7,7 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 8,64 (széles s, 1H). ESI(+) MS: m/z 39,1 [M+H] +. (9 ) intermedier: 4¹terc-butoxi-karbonil-((4¹(2,4- diklór-3¹(2,4-dimetil-kinolin-8-il-oxi-metil)- benzolszulfonil-amino)-tetrahidropirán-4-karbonil)- piperazin-1¹il) A (7 ) intermediert (1,3 mmol) és HOBt¹t (1,1 ekvivalens) szuszpendáltunk 0 ml száraz DMF-ben egy 0 ml¹es gömblombikban nitrogén alatt. Az elegyet +4 C hõmérsékletre hûtöttük, és EDCl.HCl¹t (1,1 ekvivalens) adagoltunk hozzá keverés mellett. A keverést 4 C hõmérsékleten egy órán át folytattuk, majd DI- PEA¹t (2 ekvivalens) és Boc-piperazint (1 ekvivalens) adtunk az elegyhez, és keverés mellett hagytuk szobahõmérsékletre melegedni. 12 óra múlva az oldószert elpárologtattuk, a maradékot ml DCM-ben oldottuk és a szerves fázist NaCl-oldattal ( ml) mostuk és Na 2 SO 4 fölött szárítottuk. Az oldószert elpárologtattuk és a kapott olajat Varian Mega Bond (flash master system) 70 g¹os oszlopon (etil-acetát, Rf=0,0) tisztítottuk, így sárga szilárd anyagot kaptunk. Kihozatal: 96%. HPLC tisztaság: 98% (% B, 3% B/percnél, Rt=11,14). 1 H NMR (CDCl 3 ): (ppm) 1,4 (s, 9H); 1, 1,80 (m, 2H), 2,0 2, (m, 4H), 2,6 (s, 3H), 2,64 (s, 3H), 3,38 3,90 (m, H),,8 (s, 2H), 7, (s, 1H), 7, (s, 1H), 7,37 (d, 1H), 7,46 (t, 1H), 7,67 (d, 1H), 7,7 (d, 1H), 8,03 (d, 1H), 8,64 (széles s, 1H). ESI(+) MS: m/z 707,2 [M+H] +. (1 ) intermedier: (4¹(2,4-diklór-3¹(2,4- dimetil-kinolin-8-il-oxi-metil)-benzolszulfonil- amino)-tetrahidropirán-4-karbonil)-piperazin- 1¹il 0,62 mol (9 ) intermedierhez ml 4M¹os HCl/dioxán¹t adagoltunk és az elegyet 3 órán át kevertük. Az oldószert elpárologtattuk és a maradékot fagyasztva szárítottuk, hogy az (1 ) hidrokloridot sárga szilárd anyagként megkapjuk. Kihozatali 98%. HPLC tisztaság: 92% (% B, 3%/percnél; Rt=,34). 1 H NMR (D 2 O) (ppm) 1, 2, (m, 7H), 2,90 3, (m, 9H), 3, 3, (m, 9H), 6,0 (s, 2H), 7,60 8, (m, 8H), 8,9 (d, 1H). ESI(+) MS: m/z 609,1 [M+H] +. ( ) intermedier: (4¹terc-butoxi-karbonil-amino-4- karboxi-butil)-trimetil-ammónium mmol Boc-Orn-OH¹t szuszpendáltunk metanolban ( ml) és a szuszpenzióhoz 44 mmol izokarbamidot adagoltunk. A lombikot bedugaszoltuk és 2 napig szobahõmérsékleten kevertük. A kapott oldatot vékonyréteg-kromatográfiával ellenõriztük [eluens: CHCl 3 /CH 3 OH/NH 4 OH /4/6; Boc-Orn¹OH Ref=0,29; ( ) Rf: 0,11, detektálás KMnO 4 ]. A metanolt vákuumban elpárologtattuk, a maradékot 0 ml vízzel feltártuk és szûrtük. A gömblombikot és a szilárd anyagot vízzel (2 0 ml) mostuk és az összes vizes mosófrakciót egyesítettük, majd vákuum alatt koncentráltuk ( ml). A kapott szilárd anyagot (4,068 g) vízben ( ml) szuszpendáltuk, szûrtük (a karbamidnyomok eltávolítása érdekében) és FCC-vel (flash-oszlopkromatográfiásan) reverz fázisú LiChroprep RP 18 ( 63 mikron) oszlopon tisztítottuk. Az oszlopot (19 7 cm) 3%¹os CH 3 CN vizes oldatával eluáltuk és a frakciókat (körülbelül 0 ml) vékonyréteg-kromatográfiával elemeztük. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat (00 ml) egyesítettük, a CH 3 CN eltávolítására vákuum alatt koncentráltuk, fagyasztva szárítottuk, majd 0 ml abszolút etanolból elpárologtatással 442 mg fehér, erõsen higroszkópos szilárd anyagot kaptunk. Kihozatal: 16%. 1 H NMR (DMSO-d 6 ): (ppm) 1,38 (s, 9H) 1,8 1,7 (m, 4H), 3,03 (s, 9H), 3,29 (m, 2H), 3,4 (m, 1H), 6,49 (d, d, 1H); ESI(+) MS: m/z 27,2 [M+H] +. 6

7 (11 ) intermedier: [4¹(S)-terc-butoxi-karbonil-amino- -(4¹{4¹[2,4-diklór-3¹(2,4-dimetil-kinolin-8-il-oxi- metil)-benzolszulfonil-amino]-tetrahidropirán-4- karbonil}-piperazin-1¹il)--oxo-pentil]-trimetilammónium-klorid 1,2 mmol ( ) intermediert DMF-ben oldottunk és az oldathoz diciklohexil-karbodiimidet (1,2 ekvivalens) és HOBt¹t (1,2 ekvivalens) adtunk. Az elegyet percig kevertük, majd diizopropil-amino-metil-polisztirol (1, ekvivalens) és (1 ) intermediert (1 ekvivalens) adtunk hozzá. Az elegyet 24 órán át kevertük. A gyantát szûrtük, az oldószert elpárologtattuk és a maradékot vízben és etil-acetátban oldottuk. A vizes fázist elválasztottuk, és fagyasztva szárítottuk. A nyersterméket preparatív HPLC-vel tisztítottuk (oszlop: Vydac 218TP, C18, 0 mm, áramlás 60 ml/perc, gradiens 70% CH 3 CN/0,1% TFA 1 perc, UV¹detektor 2 nm¹en, gyûjtés 7 min), a kapott (11 ) intermediert fagyasztva szárítottuk, fehér szilárd anyagot kaptunk. Kihozatal: 46%. HPLC tisztaság: 98% (% B, 3%/percnél; Rt=7,68). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) : 1,4 (s, 9H), 1,8 1,4 (m, 6H), 1,9 1,8 (m, 2H), 2,81 (m, 6H), 3,08 (s, 9H), 3,70 3,18 (m, 7H), 4,01 3,6 (H, m), 4,7 4,4 (m, 1H),,9 (s, 2H), 7,2 (d, 1H), 7,90 7,43 (m, 4H), 8,02 (d, 1H), 8,8 (s, 1H). ESI(+) MS: m/z 863,2 [M+H] +. [4¹(S)-Amino--(4¹{4¹[2,4-diklór-3¹(2,4-dimetilkinolin-8-il-oxi-metil)-benzolszulfonil-amino]-tetrahidropirán-4-karbonil}-piperazin-1¹il)--oxo-pentil]-trimetilammónium-klorid, dihidroklorid 0,4 mmol (11 ) intermedierhez ml 4 M¹os HCl/dioxán¹t adagoltunk. Az elegyet 6 órán át kevertük, az oldószert elpárologtattuk és a maradékot fagyasztva szántottuk, így kaptuk meg fehér porként a végterméket. Kihozatali 87%. HPLC tisztaság: 98% (% B, 3%/percnél; Rt=,14). 1 H NMR (DMSO-d 6 ) : 1,9 1,60 (m, 8H), 2,81 (m, 6H), 3,08 (s, 9H), 3,70 3,18 (m, 12H), 4,7 4,4 (m, 1H),,9 (s, 2H), 7,90 7,60 (m, 4H), 8,02 (d, 1H), 8, (s, 3H), 8,8 (s, 1H). ESI(+) MS: m/z 763,1 [M+H] példa (4¹(S)-Amino--(4¹(4¹(2,4-diklór-3-(2¹metil-kinolin- 8-il-oxi-metil)-benzolszulfonil-amino)- tetrahidropirán-4-karbonil)-piperazin-1-il¹)--oxopentil)-trimetil-ammónium-klorid, hidroklorid H NMR (DMSO-d 6 ) : 8,90 (1H, s), 8,47 8,34 (4H, m), 8,02 (1H, d), 7,81 (1H, d), 7,73 7,37 (4H, m),,62 (2H, s), 4,7 4,4 (1H, m), 4,01 3,6 (H, m), 3,43 3,18 (7H, m), 3,06 (9H, s), 2,78 2,61 (4H, m), 2,89 (1H, s), 1,97 1,60 (9H, m). HPLC: tr=9,26 perc. MS: [M] példa [¹(4¹{4¹[2,4-diklór-3¹(2,4-dimetil-kinolin-8-il-oxi- metil)-benzolszulfonil-amino]-tetrahidropirán-4- karbonil}-piperazin-1¹il)--oxo-pentil]-trimetilammónium-trifluor-acetát 1 H NMR (DMSO-d 6 ) : (ppm) 1,3 (s, 2H, m); 1,69 (m, 4H); 1,90 (m, 2H); 2,4 (t, 2H); 2,78 (m, 6H); 3,04 (9H, s); 3,23 3,7 (7H, m);,68 (2H, s); 7,38 8,18 (H, m); 8,04 (1H, d, J=8,42 Hz); 8,82 (1H, s). HPLC: t R =,6 perc. MS: [M] példa [4¹(S)-Amino--(4¹{1¹[2,4-diklór-3¹(2,4-dimetil- kinolin-8-il-oxi-metil)-benzolszulfonil-amino]- ciklopentán-karbonil}-piperazin-1¹il)--oxo-pentil]- trimetil-ammónium-klorid, dihidroklorid. 1 H NMR (DMSO-d 6 ) : 8,90 (1H, s), 8,48 (3H, s), 8,02 (1H, d), 7,9 7,63 (3H, m),,9 (2H, s), 4,7 4,4 (1H, m), 3,97 3,24 (H, m), 3,08 (9H, s), 2,9 2,61 (H, m), 1,97 1,72 (8H, m), 1,42 (4H, s); HPLC: t R =,88 min. MS: [M] + 747,2. Biológiai aktivitás A találmány szerinti vegyületek B2 receptor iránti affinitásának értékelését CHO-sejtekben kifejezett B2 receptorokhoz való kötéssel végeztük el, a Bellucci et al., Br. J. Pharmacol. 03, 1, közleményében ismertetett eljárás szerint; a kötési értéket pkiértékben kifejezve adtuk meg. Az antagonista aktivitást (pa2-ként kifejezve) B2 humán receptorral átfertõzött CHO-sejtekben a bradikininindukált inozittermelés inhibíciójával jellemeztük, a Bellucci et al, Br. J. Pharmacol. 03, 1, közleményében ismertetett eljárás szerint. A találmány szerinti vegyületek in vivo hatékonyságát tengerimalacban BK¹indukált hörgõgörcs (bronchospasm) inhibíciójával jellemeztük (Tramontana et al., J. Pharmacol. Exp. Therap., 296, 1 7, 01), mértük azt az it dózist (it=légcsövön keresztüli adagolás) (nmol/kg egységben), ami legalább 2 percre 80%-ban meggátolta a hörgõk összehúzódását. Példa W R X Y n pki pa2 it dózis WO033671, pld. kötés H NH 2 NHC(=NH)NH 2 3 8,7 8,4 0 WO033671, 63 pld. kötés CH 3 NH 2 NH 2 4 9,1 8,9 0 WO033671, 7 pld. kötés H NH 2 N(CH 3 ) 2 4 8,8 8,3 0 WO033671, 9 pld. kötés CH 3 NH 2 N(CH 3 ) 2 4 8,8 9,0 0 WO033671, 44 pld. kötés CH 3 NH 2 NHC(=NEt)NHEt 3,1 9,0 0 WO033671, 88 pld. kötés CH 3 N(CH 3 ) 3 N(CH 3 ) 3 4 9,7 8,2 1. példa O CH 3 NH 2 N(CH 3 ) 3 3,3,3 7

8 Táblázat (folytatás) Példa W R X Y n pki pa2 it dózis 2. példa O H NH 2 N(CH 3 ) 3 3,2 9, példa O CH 3 H N(CH 3 ) 3 3,1 9, 0 4. példa kötés CH 3 NH 2 N(CH 3 ) 3 3,1 9,4 0 A találmány szerinti elõnyös vegyületeket összehasonlítottuk a WO iratban bemutatott, szerkezetileg hasonló vegyületekkel. Meglepõ módon azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti vegyületek in vivo és in vitro aktivitása nagyobb, mint a WO iratban közölt szerkezetileg hasonló analóg vegyületeké. A humán receptorral átfertõzött sejtek antagonista aktivitás vizsgálata és az in vivo vizsgálat nagymértékben elõrejelzi a humán terápiás alkalmazásokban várható adagolást. Rövidítések it=légcsövön keresztüli adagolás; iv=intravénás adagolás; eq=ekvivalens; DCM=diklór-metán; MeOH=metanol; THF=tetrahidrofurán; DMSO=dimetil-szulfoxid; DMF=dimetil-formamid; AcOEt=etil-acetát; AcOH=ecetsav; TFA=trifluor-ecetsav; NBS=Na-bróm-szukcinimid; bpo=benzoil-peroxid; Boc=terc-butoxi-karbonil, HOBt=1- hidroxi-benzo-triazol; EDC=1-etil-3-(3 -dimetil-propil)-karbodiimid; DIPEA=diizopropil-etil-amin; HPLC=nagynyomású folyadékkromatográfia; TLC=vékonyréteg-kromatográfia; NMR=magmágneses rezonancia; ESI=elektronspray ionizáció; MS=tömegspektroszkópia; FCC=flashoszlopkromatográfia; Rt=retenciós idõ. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. (I) általános képletû vegyületek ahol R jelentése hidrogén vagy metilcsoport; W jelentése egyszeres kötés vagy egy oxigénatom; n=3 X jelentése hidrogén vagy egy NR 1 R 2 aminocsoport, amelyben R 1 és R 2 jelentése egymástól (I) függetlenül hidrogén vagy a metil¹, etil¹, n¹propil¹, izopropilcsoport közül választott; Y jelentése NR 3 R 4 R kvaterner ammóniumcsoport, amelyben R 3, R 4, R egymástól függetlenül a metil¹, etil¹, n¹propil¹, izopropil¹, n¹butil¹, izobutil¹, n¹pentil-csoport közül választott, és azok gyógyszerészetileg elfogadható sói, enantiomerjei és enantiomer keverékei. 2. Az (I) általános képletû vegyületek szervetlen vagy szerves savakkal képzett sói, amelyek a sósav, hidrogén-bromid, hidrogén-jodid, kénsav, foszforsav, ecetsav, trifluor-ecetsav, propionsav, oxálsav, almasav, maleinsav, borostyánkõsav, malonsav, aszparaginsav, glutaminsav sók közül választottak. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyületek, amelyekben W jelentése egyszeres kötés; n=3 X jelentése hidrogén vagy NH 2 csoport közül választott; Y jelentése N(CH 3 ) 3 + kvaterner ammóniumcsoport; a többi szubsztituens megegyezik az 1. igénypontban meghatározottakkal. 4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti vegyületek, amelyben R jelentése a hidrogén vagy metilcsoport közül választott; W jelentése oxigénatom; n=3 X jelentése hidrogén vagy NH 2 csoport közül választott; Y jelentése N(CH 3 ) 3 + kvaterner ammóniumcsoport; a többi szubsztituens megegyezik az 1. igénypontban meghatározottakkal.. A következõ, 3. igénypont szerinti vegyület: [4¹(S)-amino--(4¹{1¹[2,4-diklór-3¹(2,4-dimetilkinolin-8-il-oxi-metil)-benzolszulfonil-amino]-ciklopentán-karbonil}-piperazin-1¹il)--oxo-pentil]-trimetilammónium-klorid-dihidroklorid. 6. A következõ 4. igénypont szerinti vegyületek: [4¹(S)-amino--(4¹{4¹[2,4-diklór-3¹(2,4-dimetilkinolin-8-il-oxi-metil)-benzolszulfonil-amino]-tetrahidropirán-4-karbonil}-piperazin-1¹il)--oxo-pentil]-trimetil-ammónium-klorid-dihidroklorid; (4¹(S)-amino--(4¹(4¹(2,4-diklór-3-(2¹metil-kinolin- 8-il-oxi-metil)-benzolszulfonil-amino)-tetrahidropirán-4-karbonil)-piperazin-1¹il)--oxo-pentil)-trimetil-ammónium-klorid-hidroklorid; 8

9 [¹(4¹{4¹[2,4-diklór-3¹(2,4-dimetil-kinolin-8-il-oxi- metil)-benzolszulfonil-amino]-tetrahidropirán-4- karbonil}-piperazin-1¹il)--oxo-pentil]-trimetilammónium-trifluor-acetát. 7. Gyógyszerészeti készítmények, amelyek aktív összetevõként egy 1 6. igénypontok szerinti vegyületet tartalmaznak gyógyszerészetileg elfogadható segédanyagokkal együtt. 8. Egy 1 6. igénypontok szerinti vegyület alkalmazása gyógyszerészeti készítmények elõállítására, amelyek minden olyan állapot kezelésére alkalmasak, amelyek a bradikinin B2 receptorok aktiválásával kapcsolatosak. 9. A 8. igénypont szerint vegyületalkalmazás gyulladásos, allergiás és autoimmun állapotok kezelésére alkalmas gyógyszerészeti készítmények elõállítására.. A 8. igénypont szerint vegyületalkalmazás gyógyszerészeti készítmények elõállítására, amelyek asztma és krónikus hörghurut, allergiás, vazomotorikus és vírusos nátha, krónikus elzáródásos tüdõelégtelenség (COPD), reumás ízületi gyulladás, a bél krónikus gyulladásával járó betegségek (Crohn-betegség és fekélyes vastagbélgyulladás), glomerulonephritis, pikkelysömör, bõrkiütések, akut és krónikus hólyaggyulladás, májzsugorodás, glomerulopátiák és tüdõfibrózis, érelmeszesedés; akut és krónikus fájdalmak egyaránt, szeptikus, allergiás és poszttraumás sokkok, májzsugorodás okozta máj-vese szindróma, alacsony vérnyomás, hajhullás, rák és angiogenetikus betegségek kezelésére alkalmas. 9

10 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törõcsik Zsuzsanna fõosztályvezetõ-helyettes Windor Bt., Budapest