Az AMPA glutamát-receptor antagonista GYKI mérsékli a konvulziók által kiváltott c-fos expressziót patkány agykéregben

Átírás

1 Szegedi Tudományegyetem Szent-Györgyi Albert Orvos- és Gyógyszerésztudományi Centrum Általános Orvostudományi Kar Az AMPA glutamát-receptor antagonista GYKI mérsékli a konvulziók által kiváltott c-fos expressziót patkány agykéregben Weiczner Roland VI. évfolyam 9. csoport Konzulens: Prof. Dr. Mihály András Ph.D., D.Sc. SZTE ÁOK Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet Szeged, március 1.

2 Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék Oldalszám Kivonat 3 Bevezetés 4 A c-fos protoonkogén, mint neuronális aktivitási marker 4 A 4-AP akut konvulziós modell jellegzetességei és a glutamát szerepe 5 A GYKI 52466, mint az AMPA-R szelektív, nemkompetitív antagonistája 7 Célkitűzés 10 Anyagok és módszerek 10 Állatok és kezelések 10 Immunhisztokémia 12 Az immunhisztokémiai adatok elemzése 13 Eredmények 14 A viselkedés-elemzés eredményei 14 A sejtszámlálás eredményei a vizsgált neocorticalis területeken 18 A sejtszámlálás eredményei a vizsgált allocorticalis területeken 20 Megbeszélés 21 Az AMPA-receptor gátlás szerepe a 4-AP-kiváltotta c-fos expresszióra: -a viselkedés-elemzés tanulságai 21 -az immunhisztokémia tanulságai a neocortexben 23 -az immunhisztokémia tanulságai az allocortexben 26 -a 4-AP-modell tanulságai 28 Köszönetnyilvánítás 29 Irodalomjegyzék 30 Mellékletek 44 2

3 Kivonat Kivonat Az ionotróp glutamát-receptorok közvetítésével aktiválódó intracelluláris fehérje-foszforilációs kaszkádok a c-fos transzkripciós faktor expressziójához vezetnek. Előző vizsgálatainkban igazolódott, hogy az N- metil-d-aszpartát (NMDA) -receptor antagonistái szignifikánsan csökkentik a c-fos expressziót a 4-aminopiridin (4-AP) kiváltotta konvulziókban. Jelen kísérletünkben azt vizsgáltuk, hogy van-e kapcsolat az α-amino-3-hidroxi- 5-metil-4-izoxazol-propionát (AMPA) alosztályú ionotróp glutamátreceptorok aktiválódása és a c-fos expresszió között 4-AP kiváltotta konvulziókban. Az AMPA-receptor antagonistájaként a GYKI jelzésű vegyületet alkalmaztuk, 50 mg/kg dózisban, intraperitoneálisan. Egyidejűleg mértük a görcstünetek látenciáját is. A c-fos expressziót a fehérje immunhisztokémiai lokalizálásával detektáltuk. Az immunreaktív sejtmagok területegységre eső számát morfometriai módszerrel mértük, adatainkon statisztikai próbákat végeztünk. AMPA-antagonista előkezelés után szignifikáns c-fos expresszió-csökkenést mértünk a hippocampus CA1, CA2 és CA3 piramissejt-rétegeiben, valamint a gyrus dentatus szemcsesejt-rétegében és hilusában 1 órával a 4-AP beadása után. Egy órás túlélési időt követően a parietalis neocortexben a kontrollhoz képest szignifikánsabban kisebb c-fos immunreaktivitást mértünk. Eredményeink azt igazolják, hogy az akut konvulziók mediációjában nemcsak az NMDA-, hanem az AMPA-receptorok is fontos szerepet játszanak. 3

4 Bevezetés Bevezetés A c-fos protoonkogén, mint neuronális aktivitási marker Az AP-1 (activator protein one) családba tartozó c-fos protoonkogén indukálható transzkripciós faktor (ITF) 20,33, amely különféle sejtmagi szabályzó folyamatokban vesz részt. Az ún. azonnali korai gének (immediate early genes, IEGs; közéjük tartozik a c-fos is) 24,62 termékei a genetikai információ átírásának szabályozásával befolyásolják az ún. késői hatású gének (late effector genes, LEGs) kifejeződését 20,33, ezáltal hatást gyakorolnak a sejtdifferenciációs 3,33 és sejtadaptációs folyamatokra 23,33, különös tekintettel szerepükre az idegrendszer érési 26,75,81 és alkalmazkodási 33,36 folyamataiban; valamint az idegrendszeri plaszticitásban 33,81 és a neurodegenerációban 32,33. Habár a c-fos által szabályozott gének mibenléte és pontos szerepe még nem teljesen tisztázott 23,36,99, a jelátviteli rendszer és azok az intracelluláris útvonalak, amelyen keresztül a c-fos génexpresszió létrejön, ismertek 33,62. Elsősorban a membrán-depolarizáció, Ca 2+ -influx, camp és néhány növekedési faktor játszik lényegi szerepet a c-fos expresszió befolyásolásában, többnyire intracelluláris, jórészt kalcium-függő proteinkináz kaszkádok közvetítésével 10,25,30, 70,100. A központi idegrendszeri görcstevékenység alapvető jellegzetessége a speciális idegsejt-aktivitási mintázat, a fenntartott, ismételt szinkronizált idegsejt-tüzelés, az ún. burst firing létrejötte 44. Az elektrofiziológiai módszerekkel követhető sejtaktivitással 71,72,97 jól korrelál 44 a c-fos mrns transzkripciója, és ez a minőségi összefüggés teszi az érintett idegsejtek 4

5 Bevezetés magjában megjelenő Fos proteint a központi idegrendszeri görcstevékenység 10,62,75,76,95,96, azaz a neuronális aktivitás érzékeny 33, bár nem fajlagos 20 markerévé. A 4-AP akut konvulziós modell jellegzetességei és a glutamát jelentősége A 4-aminopiridin (4-AP) egy olyan K + -csatorna gátló nitrogéntartalmú heterociklusos vegyület (1. ábra), amely elsősorban a IK(A) és a IK(V) csatorna-típusokon 1. ábra. A 4-AP molekulamodellje fejti ki hatását 1. A klasszikus görcskísérleti farmakonnak számító 54,72 4-AP farmakokinetikai 9,46 és farmakodinámiás 71,55,97 tulajdonságai elég jól ismertek, beleértve humán toxicitást 85 és a korábbi, többnyire sikertelen humán gyógyászati felhasználásra történt igyekezeteket 4,41,48 is. Az elhúzódó neuronális repolarizáció megnöveli a neurotranszmitter-felszabadulást 90,68,42 (kiemelve a glutamát-felszabadító hatást 42,69 ) valamint erősíti a gátló és serkentő posztszinaptikus potenciálokat 69,71,72. A 4-AP intraperitonealis beadása után generalizált görcstevékenység jön létre 54,69. Laboratóriumunk előző kísérletei azt igazolták, hogy a 4-AP helyi 57,58 vagy szisztémás beadását 54,56 követően gyors, erős, és hosszan tartó c-fos expresszió jön létre a neocortexben és a hippocampusban 54,56. A 4-AP hatásmechanizmusa alapján ez a következmény membrándepolarizációnak és fokozott Ca 2+ -beáramlásnak tulajdonítható 68,69,71,72,97. A Ca 2+ -influx legfontosabb útvonalai a feszültség-függő Ca 2+ - csatornák 21,22,93 illetve az NMDA-receptor-ioncsatornák 13,14,31,35,64 ; 5

6 Bevezetés amelyeket ebben a modellben az elsősorban preszinaptikusan 69,71,90 ható 4-AP által létrehozott membrán-depolarizáció (lényegében a repolarizáció késleltetése révén) nyit meg. Az epileptiform idegrendszeri tevékenység kórélettani alapjának tartják az idegsejt-működés kóros, túlzott mértékű összehangolását ( oversynchronisation ), valamint az egyes gátló és serkentő tényezők közti egyensúly felborulását 71,72,97. Az epilepszia kezelésében jelenleg használatos gyógyszerek a gátló működések erősítésének elvén hatnak 16,47,49, a folyamat serkentő oldala kurrens kutatási témák alapjául szolgál 13,14,15,49,64,78,87, de a gyakorlati terápiás felhasználás még várat magára. Irodalmi adatok 13,14,64 arra utalnak, hogy a glutamát elsődleges szerepet játszik a 4-AP által kiváltott görcsfolyamat kialakulásában, terjedésében és fenntartásában. Mind az NMDA-, mind a nem-nmdaalosztályú ionotróp glutamát- receptorok alapvetőek a 4-AP in vivo 69 és in vitro 68 görcskeltő hatásának létrehozásában, az AMPA-receptorok inkább a görcstevékenység elindításában és kevésbé a fenntartásában, az NMDAreceptorok főként a görcstevékenység fenntartásában és továbbterjedésében játszanak fontos szerepet 7. Ennek megfelelően a glutamátreceptor agonisták prokonvulzív hatását 37,64 ; a glutamát-receptor antagonisták antikonvulzív hatását számos in vivo 15,87 és in vitro 17,27 epilepszia-modellben igazolták. 6

7 Bevezetés A GYKI 52466, mint az AMPA-R szelektív, nemkompetitív antagonistája A GYKI (= 1-(4-aminofenil)-4-metil-7,8-metiléndioxi-5H- 2,3-benzodiazepin HCl) (2.a. ábra) egy erős, szelektív, nem kompetitív, nagy valószínűséggel alloszterikus antagonistája 5,18,19,66,78 az AMPAalosztályú ionotróp glutamát-receptornak (2.b. ábra). Magyar fejlesztésű (Gyógyszerkutató Intézet, Budapest) 2,3-benzodiazepin 27,28,86,94. C H 3 O N O N H C l N H 2 b a 2. a-b. ábra. a. A GYKI molekulamodellje. b. A AMPA-receptor 3D hatású modellje Elektrofiziológiai vizsgálatok igazolták 5,18,19,66,78, hogy a kainát- és AMPAreceptorokra gyakorolt erőteljes gátló hatása mellett (ugyanakkor a kainát-receptorokkal szembeni affinitás legalább egy nagyságrenddel kisebb, mint az AMPA-receptorokkal szembeni 19,66 ) a GYKI gyakorlatilag nem befolyásolja az NMDA-receptor-függő áramokat, nincs hatással a metabotróp glutamát-receptorok mediálta intracelluláris Ca 2+ - szint emelkedésre, nem fejt ki moduláló hatást a GABA A -receptorokon sem 19. A GABA A -receptorokon ható 1,4-benzodiazepin diazepam alkalmazása nem befolyásolta a nem-nmda-receptoriális válaszokat; illetve az 1,4-benzodiazepin-antagonista flumazenil nem módosította a GYKI blokád hatását. A GYKI sem befolyásolta a GABA A -válaszokat, jelezve azt, hogy nem rendelkezik a hagyományos benzodiazepinek 7

8 Bevezetés hatásával. A patch-clamp eredményekből továbbá arra következtetnek, hogy a GYKI az egyéb nemkompetitív hatásmechanizmusú AMPAantagonistákkal szemben nem nyitott-csatorna gátlószer. Mivel a GYKI egészsejt- és ún. excised patch modellben is azonos gátló hatást fejtett ki, az alaphatásban nem valószínűsíthető valamilyen citoplazmatikus másodlagos hírvivő szerepe sem. A feszültség-függés hiánya a gátló hatásban azt sugallja, hogy a GYKI kötőhely a transzmembrán elektromos mezőn kívül esik, talán a receptor-csatorna egy részletén vagy egy szorosan kapcsolódó molekulán 19 található. A spontán szinaptikus áramok tanulmányozása alapján igazolódott, hogy a GYKI képes gátolni a nem-nmda-receptor szinaptikus ingerületátvivő anyag-felszabadulásra adott válaszát. Sejtkultúrán végzett elektrofiziológiai vizsgálatok 18 igazolták továbbá azt is, hogy a feltételezett alloszterikus kötőhely az AMPA-receptoron nem azonos a tiocianát ill. a ciklotiazid modulációs hellyel sem. A AMPA-receptor kinetikájának vizsgálatával 5 arra a következtetésre jutottak, hogy a GYKI hatás kifejtésének lehetséges módja a deszenzitizációsreszenzitizációs folyamat, a csatornazárási frekvencia, ill. a deaktiváció megnyújtásában keresendő. Ampakinnel végzett AMPA-receptor-modulációs kísérletben 5 a GYKI csökkentette a csúcsáramot, többszörösére nyújtotta meg a csúcsáram eléréséhez szükséges látencia-időt, csökkentve ezzel a befelé irányuló áram időegységre eső növekedését. Nagy valószínűséggel a GYKI bifázisos hatással rendelkezik a glutamát-kiváltotta áramokra, 8

9 Bevezetés ugyanis hippocampalis szeletek CA1 piramissejtjein végzett patch-clamp során 10 µm alatti koncentráció esetén a steady-state áram növekedését, míg ennél magasabb koncentráció esetén a steady-state áram és vele párhuzamosan a csúcsáram csökkenését hozta létre. A magasabb koncentrációban adott GYKI olyan mértékben lassítja a csatornanyitás kinetikáját, hogy a receptor gyakorlatilag nem működik, kivéve, ha egyidejűleg egyéb, a deszenzitizációt gátló modulátorok, pl. ciklotiazid vagy ampakinek is jelen vannak. Az alacsonyabb koncentráción megfigyelhető pozitív modulátoros hatás ennek megfelelően a csatorna nyitási frekvenciájának megnövekedéséből, vagy a zárási frekvencia csökkenéséből is adódhat. Mindez a hatásbeli diverzitás felveti annak a lehetőségét, hogy az AMPA-receptorok különböző aktivitási állapotba kerülhetnek attól függően, hogy a receptor-alegységek hány modulátormolekulát kötöttek meg. Így jöhet létre a GYKI koncentrációfüggő receptoriális hatása is. Egy másik elmélet szerint a GYKI az egyes receptor-alegységeken több kötőhelyen is hat, a koncentrációtól függően. Harmadik fontos szempont lehet az is, hogy a GYKI gátló hatása jelentősen különbözhet a receptor alegységösszetételétől függően, az első posztnatális héten ugyanis jelentős változás következik be az alegység-összetételben, és ennek következtében a receptorkinetikában is, amelyet egyes korábbi tanulmányokban használt fiatal sejtkultúrák esetében kapott eredmények értékelésekor nem mindig vettek figyelembe. További eltérések 9

10 Bevezetés magyarázatául szolgálhat a patológiás körülmények között megváltozott extracelluláris milieu, különös tekintettel az emelkedett glutamát-szintre. Célkitűzés Előző vizsgálatainkban 87 (2. számú melléklet) igazolódott, hogy az NMDA-alosztályú ionotróp glutamát-receptor nemkompetitív antagonista vegyületeivel történt előkezelés szignifikáns mértékben csökkenti a c-fos expressziót az általunk vizsgált allo- és neocorticalis területeken. Jelen kísérleteink célja az volt, hogy megvizsgáljuk a másik, igen jól karakterizált 14,35,51,53,59,60,63 glutamát-receptor, az AMPA-receptor gátlásának hatását a 4-AP kiváltotta akut konvulziókban a c-fos expresszióra patkány neo- és allocortexben. Anyagok és módszerek Állatok és kezelések Kísérleteinket g testtömegű hím Wistar patkányokon végeztük, a hatályos jogszabályoknak és etikai elveknek megfelelően. A kísérletek elvégzésére írásos engedélyt kaptunk az SZTE ÁOK Állatkísérletes Etikai Bizottságától. Az állatok az állatházi elhelyezés során ad libitum jutottak élelemhez és vízhez. A kezelt állatcsoportokban (2x10 állat 1 illetve 3 óra túlélési idővel a görcskeltő beadásától számítva) 50 mg/ttkg GYKI (IVAX GYKI Kft., Budapest) i.p. előkezelést végzetünk (a vegyület speciális oldékonysági tulajdonságai miatt 10

11 Anyagok és módszerek oldószerként dimetil-szulfoxid (DMSO 5,39,52,78,79 ) és élettani sóoldat 1:1 arányú elegyét használva, ez a továbbiakban 50% DMSO jelzéssel szerepel; az oldat koncentrációja 6,67 mg/ml volt). A kontroll állatcsoportok (2x10 állat 1 illetve 3 óra túlélési idővel a görcskeltő beadásától számítva) a megfelelő oldószer-mennyiséget kapták a GYKI oldat helyett. Az alkalmazott görcskeltő szert, a 4-AP-t (Sigma, St. Louis, MO) élettani sóoldatban oldottuk fel (0,67 mg/ ml koncentrációban) és intraperitoneálisan (i.p.) 5 mg/ttkg dózisban adagoltuk, 15 perccel a GYKI oldat illetve az oldószer beadását követően. Megelőző vizsgálatainkban a fenti 4-AP-dózis görcskeltőnek bizonyult 54,56. A 15 perces várakozási idő a GYKI farmakokinetikai jellemzőiből adódik 79. Egy további kontrollcsoport (10 állat) a GYKI megfelelő dózisú oldatát és a 4-AP oldószerét kapta, tehát görcskeltőt nem (1. táblázat). A kísérlet végén, azaz 1 illetve 3 óra túlélési idő (ez az az intervallum, amelyben a Fos-fehérje azonosítható, illetve expressziója maximális a c-fos-t expresszáló neuronokban 24,56,96 ) leteltével az állatokat dietil-éterrel elaltattuk és szíven keresztül 250 ml, 0,1M ph 7,4 foszfátpufferes sóoldattal (PBS) perfundáltuk, ezt követően 300 ml 4%-os ph 7,4 foszfát-pufferes paraformaldehiddel fixáltuk. Az agyakat a fixálás befejeztével gyorsan kivettük, majd a fent használt fixálóban további 24 órát posztfixáltuk (hűtőben, +4 C-on). Ezt követően az agyakat egy éjszakán át 30%-os szukrózoldatban (0,1M foszfát-pufferes, ph 7,4) szobahőmérsékleten krioprotektáltuk. Fagyasztó mikrotóm (Reichert-Jung 11

12 Anyagok és módszerek Cryocut 1800) segítségével 24µm vastagságú coronalis síkú sorozatmetszeteket készítettünk, ezeken a c-fos expresszió detektálására, azaz a Fos fehérje lokalizálására immunhisztokémiát végeztünk. Állatcsoport Egyedszám (db) 4-AP (1h) 10 GYKI + 4-AP (1h) 10 4-AP (3h) 10 GYKI + 4-AP (3h) Oldószerkontroll Előkezelés Görcskeltő Túlélés A GYKI oldószere (50% DMSO) 50 mg/ ttkg GYKI i.p. A GYKI oldószere (50% DMSO) 50 mg/ ttkg GYKI i.p. 50 mg/ ttkg GYKI i.p. 5 mg/ ttkg 4-AP i.p. 5 mg/ ttkg 4-AP i.p. 5 mg/ ttkg 4-AP i.p. 5 mg/ ttkg 4-AP i.p. A 4-AP oldószere (élett. sóold.) i.p. 1 h 1 h 3 h 3 h 1 ill. 3 h 1. táblázat. Az egyes kezelési csoportok jellemzőinek áttekintése. A kísérletek során megfigyeltük az állatok viselkedését 54,56, pontosan rögzítettük a generalizált tónusos-klónusos roham (GTCS) jelentkezésének időpontját a 4-AP beadásától számítva, az esetleges ismételt görcstevékenységet, az állatok túlélését (2. táblázat). Immunhisztokémia Az immunfestés során poliklonális c-fos ellenanyagot és az avidinbiotin-streptavidin-peroxidáz-módszert alkalmaztuk. A metszeteket 2% H 2 O 2 (1 ml) és 0,5% Triton X-100 (9 ml) összetételű oldatban előkezeltük, ezt követően 20%-os NPS-ben (normal pig serum), majd avidin- végül biotin-oldatban blokkoltuk. Az immunfestés további részében a metszeteket elsődleges c-fos antitesttel (1:2000; nyúlban termeltetett; 12

13 Anyagok és módszerek Santa Cruz Biotechnology, CA), másodlagos antitesttel (biotinilált GAR=goat-anti-rabbit; 1:400; Jackson Immuno-Research, PA) inkubáltuk. A másodlagos antitest kimutatására 1:1000 hígítású STA-PER hozzáadása történt. A peroxidáz-reakciót nikkel kloridot tartalmazó diamino-benzidin tetrahidroklorid (Sigma) oldattal lokalizáltuk, a kémiai folyamat fekete reakció-terméket eredményezett. Az immunhisztokémiai adatok elemzése Állatonként 5 metszeten (a megfelelő sztereotaxikus koordináták 67 alapján kiválasztva az egymásnak megfelelő coronalis síkokat az egyes állatok metszetei közül) kvantitatív analízist végeztünk. A vizsgált agyterületeken (a neocortex S1Tr régiója, az Ammon-szarv CA1, CA2 és CA3 régiók stratum pyramidaléja, a gyrus dentatus (hilus és stratum granulosum) megszámoltuk az immunfestett idegsejt-magokat Nikon Eclipse 600 mikroszkóphoz csatlakoztatott SPOT RT Slider digitális kamerával (1600 X 1200 dpi 8 bitben), az Image Pro Plus 4 morfometriás szoftvert (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) használva. A háttér kivonása után a küszöböt úgy állítottuk be, hogy az immunjelölt sejtmagvak jól felismerhetőek legyenek. A számlálási területeket a kamera négyszögletes látómezőjében jelöltük ki. A neocortexben a sejtszámlálást 10x objektív használatával végeztük, a vizsgált területe (1,2 mm 2 ) az összes neocorticalis laminát tartalmazta (I VI) a pia matertől a kéregalatti fehérállomány kezdetéig, a sejtszámokat 1 mm 2 -re 13

14 Anyagok és módszerek normalizáltuk. A második sejtszámlálás során a neocortexben rétegenként (I-VI) megszámoltuk az immunfestett sejtmagokat 98. A hippocampusban, a sejtszámlálást 40x objektív használatával végeztük, az adatokat itt is 1 mm 2 -re normalizálva. A CA1 3 régiókban a lemért területek (0,05 mm 2 ) a stratum pyramidalét tartalmazták. A gyrus dentatus hilusát Amaral 2 szerint jelöltük ki. A stratum granulosum szemcsesejtjeit a gyrus egészén számoltuk meg. A gyrus dentatus stratum molecularéja nagyon kevés Fos-immunjelölt sejtmagot tartalmazott, ezért ezt a réteget nem vizsgáltuk. Az azonos nagyításokkal kapott sejtszám-adatcsoportokat statisztikai analízissel értékeltük. A Fospozitív sejtmagok számának különbségét a GYKI előkezelt és a kontroll állatcsoportok esetében egyutas variancia-analízis (ANOVA), és az azt követően elvégzett Bonferroni post hoc teszt alapján határoztuk meg statisztikailag. Az elemzés során 0,05-ös szignifikancia-szintet használtunk. A statisztikai próbákat az SPSS 9.0 szoftverrel végeztük el 56,87. Eredmények A viselkedés-elemzés eredményei A 4-AP intraperitonealis beadását követően jól megfigyelhetőek és időben is jól követhetőek a jellegzetes viselkedésbeli változások 54,56,79,87. Kezdeti tünetek közé tartozik a fokozott exploráló mozgás, a mosakodási rituálé, a vibrissa- és a rágóizmok tremora (3.a. ábra). Ezt követően az egész test izomzatában észlelhető a generalizált tremor, az izmok 14

15 Eredmények folyamatos faszcikulációja, a végtagok egyre gyakrabban jelentkező klónusai (3.b. ábra). Jellegzetes a végtagokban bekövetkező tónusváltozás, a hátsó végtagok abdukált tartása, valamint az ujjak legyezőszerű szétterpesztése is megfigyelhető (3.c. ábra). a b c d e f 3. a-f ábra. A 4-AP-indukálta generalizált görcstevékenység jellegzetes stációi. Részletes magyarázat a szövegben. Az erősödő motoros tünetek végül a vad futás - nak (wild running) nevezett fenoménhez vezetnek, majd egy igen frekvens klónusokkal (3.d. ábra), sokszor a humán clavor epilepticus -nak megfelelő hangadással bevezetett erőteljes, teljes testet érintő tónusos fázis következik (GTCS= generalised tonic-clonic seizure) (3.e. ábra). A végtagok extendált tartásban vannak, hiperszaliváció figyelhető meg, időnként exkrétumok is 15

16 Eredmények ürülnek. A tónusos fázis oldódásával inkább klónusossá válik a görcstevékenység (3.f. ábra), az állat ilyenkor tenebrózus, gyakran ebben az oldalra dőlt, folyamatosan klonizáló állapotban marad percig, majd magához tér. Az esetek egy részében újabb GTCS is jelentkezhet. Elektrofiziológiai mérésekkel 42 is egybevág az a tapasztalat, hogy a görcstevékenység mintegy min után fokozatosan megszűnik, az állatok perc eltelte után regenerálódnak, egy részük azonban a görcstevékenység alatt vagy után, annak következményeként elpusztul. A grand mal -nak megfelelő GTCS jelentkezése időben jól és egyértelműen rögzíthető, ezáltal biztos szempontja lehet a tünettani értékelésnek. A GTCS jelentkezési látenciája (a görcskeltő beadásától számítva), az esetleges újabb GTCS jelentkezése, a megfigyelési időn belül bekövetkezett elhullás, azaz a túlélési ráta voltak viselkedés-elemzésünk ún. kemény mutatói (2. táblázat). 1. GTCS 1. GTCS 2. GTCS A túlélés Állatcsoport látenciája előfordulás előfordulása aránya (%) (min) a (%) (%) 4-AP (1h) 26, GYKI + 4-AP (1h) 44, AP (3h) 34, GYKI + 4-AP (3h) 54, táblázat. A viselkedés-elemzés eredményeinek összefoglalása. Részletes magyarázatok a szövegben. Az egy órás túlélési idejű állatcsoportok között a GYKI előkezelés hatására az első GTCS jelentkezésének a görcskeltő 4-AP beadásától számított látenciaideje megnyúlt (bár ez a változás statisztikai összevetésben nem bizonyult szignifikánsnak) (4. ábra); illetve a GTCS jelentkezése az előkezelés nyomán 1/8-ára esett vissza a kontrollal 16

17 Eredmények összevetve (5. ábra). Sem a kezelt, sem a kontroll állatoknál nem jelentkezett ismételt GTCS, a GYKI előkezelt állatok 100%-a túlélte az 1 órás megfigyelési időt, ugyanakkor a kontroll csoportban a görcstevékenység során az állatok 20%-a elhullott. 4-AP (1 h) GYKI + 4-AP (1 h) 4-AP (3 h) GYKI + 4-AP (3 h) 26,13' 34,53' 44,0' 54,5' ábra. Az első GTCS jelentkezésének átlagos látenciaideje (percben) az egyes kezelési csoportokban a görcskeltő beadásától számítva. 10% 4-AP (1 h) 80% GYKI + 4-AP (1 h) 20% 90% 4-AP (3 h) GYKI + 4-AP (3 h) 5. ábra. A GTCS jelentkezésének aránya az egyes kezelt és kontroll állatcsoportokban, az érintett állatok %-ában. A három órás állatok esetében szintén megnyúlt az első GTCS jelentkezésének látenciája (ez sem szignifikánsan) (4. ábra), illetve a GTCS előfordulási aránya a kontrollcsoporttal összevetve közel 1/5-ére csökkent (5. ábra). Mindezeken felül, a kontroll állatcsoportban 5x gyakoribb volt az ismételt nagyroham előfordulása, valamint a kezelt csoporttal összevetve, ahol a 3 órás túlélés 100% volt, a GYKI

18 Eredmények előkezelésben nem részesült állatok fele elpusztult a három órás követési idő alatt. A sejtszámlálás eredményei a vizsgált neocorticalis területeken A GYKI előkezelés hatására az 1 h túlélési idejű állatcsoportban szignifikánsan csökkent a c-fos-immunreaktív (IR) sejtmagok száma a kontrollhoz képest (6. ábra). oldószer (50% DMSO) + 5 m g/kg 4-AP (1 h) 50 m g/kg GYKI m g/kg 4-AP (1 h) c-fos IR sejtmagok száma / mm 2 c-fos IR sejtmagok száma / mm * a 6. a-c ábra. A GYKI előkezelés hatása a neocortexben 1 órás túlélési időnél. a. A c-fos immunreaktív (IR) sejtmagszám a kontroll és a kezelt állatcsoportban. Reprezentatív kis nagyítású neocortexmetszetek a kontroll (b) és a kezelt (c) állatokból * I II III IV V VI * b * a * c I II III IV V VI oldószer (50% DMSO) + 5 mg/kg 4-AP (1 h) 50 mg/kg GYKI mg/kg 4-AP (1 h) 7. a-b. ábra. A GYKI előkezelés hatása a neocortexben 1 órás túlélési időnél: laminánkénti analízis. a. A c-fos immunreaktív (IR) sejtmagszám a kontroll és a kezelt állatcsoportban az egyes neocorticalis laminákban. b. Reprezentatív kis nagyítású neocortexmetszet a laminák szemléltetésére. b 18

19 Eredmények A neocortex rétegenkénti elemzéséből kapott eredmény szerint szignifikáns expresszió-csökkenés igazolódott a neocorticalis I, IV, V, VI laminákban. A másik két (II, III) laminában mutatkozó egybevágó tendencia nem adott statisztikailag jelentős különbséget (7. ábra). c-fos IR sejtmagok száma / mm 2 oldószer (50% DMSO) + 5 mg/kg 4-AP (3 h) 50 mg/kg GYKI mg/kg 4-AP (3 h) * a 8. ábra. A GYKI előkezelés hatása a neocortexben 3 órás túlélési időnél. a. A c-fos immunreaktív (IR) sejtmagszám a kontroll és a kezelt állatcsoportban. Reprezentatív kis nagyítású neocortexmetszetek a kontroll (b) és a kezelt (c) állatokból. A 3 h túlélési idejű állatcsoportokban a GYKI előkezelés szignifikáns módon megnövelte a c-fos-ir sejtmagok számát (8. ábra). b c c-fos IR sejtmagok száma / mm * * * * I II III IV V. VI a * I II III IV V VI oldószer (50% DMSO) + 5 mg/kg 4-AP (3 h) 50 mg/kg GYKI mg/kg 4-AP (3 h) 9. a-b ábra. A GYKI előkezelés hatása a neocortexben 3 h túlélési időnél: laminánkénti analízis. a. A c-fos immunreaktív (IR) sejtmagszám a kontroll és a kezelt állatcsoportban az egyes neocorticalis laminákban. b. Reprezentatív kis nagyítású neocortex-metszet a laminák szemléltetésére. b 19

20 Eredmények A laminánkénti elemzésben is szignifikáns növekedés mutatható ki a kontrollal összevetve a neocorticalis II, III, IV, V és VI laminában (a lamina I-ben meglévő azonos tendencia nem bizonyult szignifikánsnak) (9. ábra). A sejtszámlálás eredményei a vizsgált allocorticalis területeken Az egy órás csoportban a GYKI előkezelés hatására szignifikáns IR-csökkenést mértünk a hippocampus CA1, CA2, CA3 areáiban, a gyrus dentatus stratum granulosumában. A hilusban megfigyelt csökkenő tendencia nem volt szignifikáns mértékű (10. ábra). c-fos IR sejtmagok száma / mm * * * CA1 CA2 CA3 GD HILUS oldószer (50% DMSO)+ 5 mg/kg 4-AP (1 h) b CA2 c CA3 CA1 50 mg/kg GYKI mg/kg 4-AP (1 h) 10. a-c ábra. A GYKI előkezelés hatása az allocortexben 1 órás túlélési időnél. a. A c-fos immunreaktív (IR) sejtmagszám a kontroll és a kezelt állatcsoportban. Reprezentatív kis nagyítású hippocampus-metszetek a kontroll (b) és a kezelt (c) állatokból. * a c h GD Összevetve a GYKI előkezelés hatását a kontroll csoporttal három órás túlélési időnél elmondhatjuk, hogy a gyrus dentatus szemcsesejt-rétegének kivételével (ahol a kontrollal egybevetve szignifikáns növekedés látható) nem eredményezett érdemi változást a c- fos-ir sejtmagok számában (11. ábra). 20

21 Eredmények c-fos IR sejtmagok száma / mm a CA1 CA2 CA3 GD HILUS oldószer (50% DMSO) + 5 mg/kg 4-AP (3 h) 50 mg/kg GYKI mg/kg 4-AP (3 h) * b c CA2 CA3 h CA1 11. a-c ábra. A GYKI előkezelés hatása az allocortexben 3 órás túlélési időnél. a. A c-fos immunreaktív (IR) sejtmagszám a kontroll és a kezelt állatcsoportban. Reprezentatív kis nagyítású hippocampus-metszetek a kontroll (b) és a kezelt (c) állatokból (h=hilus). GD Azokban az állatokban, amelyek a GYKI előkezelés után a 4- AP oldószerét (élettani sóoldatot) kaptak, tehát görcskeltőt nem, a kizárólag élettani sóoldatot kapott állatokkal összevetve a GYKI önmagában a c-fos génexpresszióra gyakorolt hatásával, semmi különbséget nem tapasztaltunk. Megbeszélés Az AMPA-receptor gátlás szerepe a 4-AP-kiváltotta görcstevékenységre: a viselkedés-elemzés tanulságai A GYKI előkezelés hatására megnyúlt az első GTCS kialakulásáig eltelt idő, alig fordult elő ismételt GTCS; általában kevesebb GTCS jelentkezett, az állatok túlélése pedig 100%-os volt. Az állatok jól tolerálták a magas GYKI dózis mellékhatásaként jelentkező kezdeti, percen belül szűnő, fokozott izomtónus-csökkenést, 21

22 Megbeszélés bágyadtságot, a légzés-amplitúdó és légzésfrekvencia mérsékelt csökkenését, amelyek a vegyületcsoport jellegzetes központi izomlazító hatásának 28,78,79,80 a következményei, és az izomrelaxáns hatások a görcsvédelemben még bizonyos szempontból előnyösek is. Ennek a hatásprofilnak tulajdonítható az is, hogy az előkezelt állatcsoportban jelentkező rohamok többségében a klónusos összetevő volt túlsúlyban, ez arra enged következtetni, hogy a tónusos fázis csökkentésében a vegyület hatékonyabb. Erre utalnak az irodalmi adatok is 79 : magasabb koncentráció szükséges a klónusos görcsforma csökkentéséhez, mint a tónusos komponensek mérsékléséhez (12. ábra). a görcsök %-ában Clonusok előfordulása GYKI dózisa (mikromol/kg) a a görcsök %-ában Tonusos rohamforma előfordulása GYKI dózisa (mikromol/kg) 12. a-b ábra. A GYKI dózis-hatás görbéi. A klónusos (a) ill. a tónusos rohamformák (b) előfordulása a görcsök százalékában az emelkedő GYKI dózis függvényében. Forrás: 79. b Mindazonáltal, kedvező tüneti és túlélési tapasztalatok ellenére, a fő célt, a teljes görcsvédelmet ez a vegyület sem biztosítja, további dózisemelés pedig a légzőizmok működésének gátlása révén (ahogy a klasszikus 1,4-benzodiazepineknél is) légzésmegállást hozna létre. A GYKI intraperitoneális bejuttatása után számított 15 és 45 perc között éri el a plazmaszintjének maximumát, majd többé-kevésbé lineáris farmako- 22

23 Megbeszélés kinetikát mutatva mintegy perc után esik vissza plazmaszintje gyakorlatilag nullára (13.a ábra). Ezzel párhuzamosan, a görcstevékenységre gyakorolt mérséklő hatása beadását követő 15 és 60 perc között maximális. Ekkor a seizure score, amely a tünettan súlyos-ságát méri, alacsony (utalva a görcsvédelemre), de nem minimális, tehát nem ad teljes protekciót. Ahogy a farmakon plazmaszintje csökken, úgy növekszik a seizure score is, tehát a protektív hatás fokozatosan lecseng, gyakorlatilag két óra elteltével már elhanyagolhatóvá válik (13.b ábra). se szint (mikrog/ml) A GYKI se szint időbeli változása 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, idő (min) a seizure score A GYKI antikonvulzív hatása b idő (min) 13. a-b ábra. a. A GYKI plazmaszintjének változása az idő függvényében. b. A GYKI hatásának változása az idő függvényében (seizure score-ban megadva, azaz a magasabb pontszámok kifejezettebb görcstevékenységet jelentenek). Forrás: 79. Az AMPA-receptor gátlás szerepe a 4-AP-kiváltotta c-fos expresszióra: az immunhisztokémia tanulságai a neocortexben A viselkedés-elemzés konzekvenciáinak megfelelően a c-fos-ir sejtmagok neocorticalis számából arra következtethetünk, hogy a GYKI előkezelés szignifikáns génkifejeződést csökkentő hatása, azaz a görcstevékenység sejtszintű hatásának mérséklése kizárólag az egy órás túlélési idejű állatok esetében érvényesül. Az immunhisztokémiai adatok értékelésében két tényezőt emelünk ki: a helyet és az időt. A neo- 23

24 Megbeszélés cortexben kapott eredményeink elemzésében nagy segítséget nyújt az IRsejtmagok számának rétegenkénti analízise. Jellegzetes, hogy az általános, minden laminában érvényesülő IR-redukció mellett az I, IV, V és VI neocorticalis rétegekben következett be szignifikáns mérséklődés. Ez arra utal, hogy ezekben a laminákban dominálnak az AMPAerg kapcsolatok, azaz itt lehet hatékony az AMPA-receptor antagonizmus. Irodalmi adatok szerint 35,84 az AMPA-receptorok többsége a lamina II-III ill. V-VI sejtjein található. A thalamusmagvak principális relésejtjeinek rostjai a neocorticalis III-IV; az intralaminaris és kapcsolódó struktúrákból érkező axonok a neocorticalis V-VI laminában végződnek, valamint patkányban (és más fajokban is) az axonok harmadik csoportja a neocorticalis lamina I-be fut be 35. Az immunfestések tanulsága szerint a glutamát-pozitív rostok leginkább a neocorticalis lamina III-IV-ben végződnek. A szinapszisok immunjelölése alapján elmondható, hogy mind AMPA-, mind NMDA-receptoriális jel megfigyelhető a thalamocorticalis szinapszis posztszinaptikus oldalán, bár az AMPA-jel inkább a thalamicus, az NMDA-jel inkább a corticocorticalis szinaptikus morfológiához köthető. Az egyes AMPA-receptor alegységek lokalizációját 73 tekintve, a legerősebb immunfestődést GluR1 esetében a neocorticalis V-VI, GluR2/3 esetében a II-VI, GluR4 antitesttel gyengébb jelölést kaptak a II-VI-os laminákban. Ezekben a laminákban az AMPAerg kapcsolatok preszinaptikus összetevőjét a neocorticalis neuronokon végződő, jórészt glutamáterg thalamocorticalis afferensek adják 84,91. A thalamocorticalis szervezőkör szerepét erősíti meg az az irodalmi adat is 55, mely szerint a rcbf (regional 24

25 Megbeszélés cerebral blood flow, regionális agyi vérátáramlás) ictalis növekedése a 4- AP-modellben jelentős mértékű a thalamus és a cortex területén. A neocortexben kapott 3 órás adatok jól korrelálnak a tünettannal, a GYKI plazmaszintjének változásával, de felvetnek egyéb lehetőségeket is. Az adaptációs változások szempontjából három óra eltelte hosszú idő, főleg, ha gyors, pontos szabályzó mechanizmusokat, egy előre szintetizáltan rendelkezésre álló fehérje-készletet veszünk figyelembe. Feltételezzük, hogy a farmakológiai AMPA-receptor gátlás következtében, mintegy kompenzációs mechanizmusként a glutamáterg szinapszisokban szenzitizációs folyamat játszódik le. Fokozott szintézis révén, vagy a már meglévő receptor-készlet felhasználásával a posztszinaptikus membránokba AMPA-receptor alegységek helyeződnek ki, ez tulajdonképpen adaptive upregulation. Mindezek tovább görgetik a glutamát excitotoxikus hatásait. Ez szolgálhat alapul a GYKI plazmaszintjének, azaz gátlóhatásának lecsengését követő rebound - effektusnak. Az extracelluláris glutamát mennyiség ilyenkor nem csökken, ugyanis a görcstevékenység a GYKI antagonizmus elmúltával is fennáll, az érintett szinapszisok pedig az ismertetett folyamat lévén szenzitizálódtak. Következményesen tehát növekszik a posztszinaptikus neuronális aktivitás, és ez a folyamat jól követhető egy érzékeny markerrel, a c-fos-expresszió kvantitatív értékelésével. A kóros idegsejtaktiválódás következtében a gátlósejtek működése is jelentősen károsodik 35, ugyanakkor olyan génexpressziós változások jönnek létre, amelyek fokozzák az AMPA-receptorok Ca 2+ -permeabilitását 70. A GYKI 25

26 Megbeszélés blokád nem érinti az NMDA-funkciókört, így annak működése teljes, ugyanakkor az AMPA-oldalon lejátszódó változások is tovább görgetik a folyamatot. A három órás előkezelt állatcsoportjainkban tehát, jelezve a gyors és érzékeny idegrendszeri modulációt, emelkedett c-fosimmunreaktivitást mérünk. Az AMPA-receptor gátlás szerepe a 4-AP-kiváltotta c-fos expresszióra: az immunhisztokémia tanulságai az allocortexben Ismeretes, hogy a görcstevékenység mediálásában, gyakran kiindulópontként is, a különböző allocorticalis területek fontos szerepet töltenek be 24,34,50,93,96. Az AMPA-receptoriális mediáció kiemelt szerepére utal az egyértelmű, még a neocorticalisnál is nagyobb mértékű, szignifikáns immunreaktivitás-csökkenés a hippocampus CA1, CA2 és CA3 szektorainak stratum pyramidaléjában, valamint a gyrus dentatus stratum granulosumában. A hilaris interneuronok, ingerület-átvivő anyag szempontjából is igen különböző neuron-populációkat reprezentálnak 34,50. Jellegzetes a GYKI farmakokinetikai és farmakodinámiás ismérveinek megfelelően az, hogy a neocortexhez hasonlóan, a 3 órás túlélési idejű előkezelt csoportban már nem tapasztalható immunreaktivitás-redukció. Mindazonáltal immunreaktivitás-növekedés sem, ellentétben a neocortexszel. Ez a különbség jól tükrözi a különbségeket az egyes agyi struktúrák között: a neo- és allocorticalis területeken eltérő az egyes ionotróp glutamát-receptorok eloszlása, alegység-összetétele és részvétele az ingerület-átvitel szervezésében. Az AMPA-receptor alegység 26

27 Megbeszélés lokalizáció tekintetében 8,63,73,74 a GluR1-festődés a legerősebb a CA1 stratum oriens et radiatumban, a CA1 és CA3 stratum lacunosummolecularéban, valamint a gyrus dentatus stratum molecularéjában. A GluR2/3 immunjelölődés sokkal arányosabban oszlott meg a hippocampusban, ebből a szempontból eltűnt a különbség a CA1 és a CA3 szektor között. A fősejteket tekintve a jelölődés csökkenő sorrendje: CA3 piramissejtek=mohasejtek> CA1 piramissejtek> szemcsesejtek. A GluR4 esetében a legintenzívebb jelölődés a CA1 stratum oriens et radiatum területén, valamint a gyrus dentatus stratum molecularéjában látható, kiemelten festődtek még a hilaris mohasejtek. Kiemelt mechanizmus az allocortex, a hippocampus esetében is a szinapszisok nagyfokú plaszticitása, akár a görcstevékenység során, főleg számításba véve a cortex kapcsán ismertetett elveket, mint például az előre szintetizáltan meglévő, szinaptikus felszínhez közeli, gyors kihelyeződésre képes AMPAalegység-készletet 8,29,63. A rcbf mérés során 55 kifejezett növekedést a gyrus dentatus területén tapasztaltak, jelezve az entorhinalis cortexen át az isocortexből eredő szinaptikus aktivációt. Valóban, 3 órás túlélésnél megnövekedett c-fos-immunreaktivitást mértünk a gyrus dentatus szemcsesejt-rétegében, jelezve a masszív entorhinalis input jelentőségét. Az isocortex felől jövő aktiváció, tehát az a c-fos-válasz, amely a neocortexben mért 3 órás eredményeknek is megfelel, ugyanakkor nem tapasztalható a hilusban illetve az Ammon-szarv szektoraiban. Mindez jól tükrözi az allocortex neocortextől eltérő funkcióit és szabályzómechanizmusait a GYKI blokád kapcsán. 27

28 Megbeszélés Az AMPA-receptor gátlás szerepe a 4-AP-kiváltotta c-fos expresszióra: a 4-AP-modell tanulságai Előző vizsgálatainkban a 4-AP-nel létrehozható akut kémiai konvulziós modell jól reprodukálhatónak, a tünettan és a sejtek szintjén egyaránt könnyen követhetőnek bizonyult 54,56,87. A modell szempontjából különösen fontos szempont, hogy a 4-AP nem közvetlenül a glutamát-receptorokon hatva váltja ki a generalizált konvulziót. A görcstevékenység során létrejövő speciális neuronális aktivációt a c-fos génexpresszió érzékeny, kiválóan detektálható és lokalizálható markerként morfológiai és statisztikai szempontból is 24,33,44,56,87 mérhetővé teszi. A c-fos génexpresszió jól vizualizálható molekulárbiológiai módszerrel, PCR (polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció) segítségével az RNS szintjén 87, illetve Western blottal 58 vagy immunhisztokémiával 56 a géntermék, a Fos protein szintjén. Korábbi kísérleteinkben feltérképeztük a c-fos génexpresszió időbeli változásait 56, valamint vizsgáltuk a 4-APindukálta görcs-tevékenység befolyásolásának farmakológiai lehetőségeit, ezáltal információt nyerve az egyes mechanizmusokról, jelátviteli utakról, amelyek a c-fos génkifejeződést mediálják 87. Összhangban az irodalommal 20,33,77, előzően igazoltuk 87 az NMDA-receptoriális jelátvitel döntő szerepét a c-fos génexpresszió létrejöttében, a görcstevékenységben. Az NMDA-receptor antagonistáival történt előkezelés jelentősen, szignifikánsan redukálta ugyan a c-fos expressziót az általunk vizsgált neo- és allocorticalis területeken, de nem szüntette meg teljesen. Jelen vizsgálatainkban az AMPA-receptoron létrehozott antagonizmus szerepét 28

29 Megbeszélés vizsgáltuk meg. Eredményeink alapján arra következtethetünk, hogy a görcstevékenység mediációjában az NMDA-receptorok mellett az AMPAreceptorok is jelentős szerepet játszanak. A GYKI előfutára egy dinamikus fejlesztés alatt álló, szelektív vegyületcsaládnak 28,80, amelyek között számos jövőbeli reményteljes gyógyszerjelölt is lehet 86,94. Különböző tanulmányok jelzik a vegyület ischaemiában 6,11,83 illetve glutamát-excitotoxicitásban 45,65 kifejtett neuroprotektív, egyéb modellekben igazolt antinociceptív 88 és gyulladás-csökkentő 88 hatását. A jó véragy-gát permeabilitással bíró 7,19 GYKI (bizonyított antikonvulzív profilja 7,12,43,52,82 ellenére) későbbi klinikai alkalmazását megnehezíti speciális oldékonysága (bár per os is bevihető), mellékhatásai és kedvezőtlen farmakokinetikájából adódó korlátozott védőhatása. További vizsgálatainkban célunk részletesebben (AMPA-receptor kettős festéses, kolokalizációs immunhisztokémiai módszerekkel) feltérképezni az egyes speciális neuronpopulációk szerepét a görcsfolyamatban. Folytatva megkezdett farmakológiai-morfológiai munkánkat, a receptor-alegység immunjelölésekkel pedig részletesebb betekintést nyerhetünk az allo- és neocorticalis glutamát-szabályzókörök működésébe. Köszönetnyilvánítás Köszönetemet fejezem ki mindazoknak, akik segítséget nyújtottak a dolgozat elkészítéséhez. Köszönet illeti mindenek előtt Prof. Dr. Mihály Andrást konzulensi munkájáért és támogatásáért. Köszönettel tartozom 29

30 Megbeszélés Dukai Márta asszisztensnőnek és Krisztinné Péva Beáta tudományos segédmunkatársnak a dolgozat megírásához nyújtott technikai segítségükért. A molekulamodelleket Dr. Fenyő Róbert rajzolta. A kísérleteinkben felhasznált GYKI szubsztancia Dr. Horváth Katalin, az IVAX GYKI Kft. kutatási igazgatójának nagylelkű adománya. Irodalomjegyzék 1. Alexander, S. P. H.; Peters, J. A. Receptor & ion channel nomenclature supplement. Trends Pharmacol. Sci. 11:1 120; Amaral, D. G. A Golgi study of cell types in the hilar region of the hippocampus in the rat. J. Comp. Neurol. 182: ; Andersen, H.; Mahmood, S.; Tkach, V.; Cohn, M.; Kustikova, O.; Grigorian, M.; Bezerin, V.; Bock, E.; Lukanidin, E.; Tulchinsky, E. The ability of Fos family members to produce phenotypic changes in epitheloid cells is not directly linked to their transactivation potentials. Oncogene, 21: ; Andreani, A.; Leoni, A.; Locatelli, A.; Morigi, R.; Rambaldi, M.; Pietra, C.; Villetti, G. 4-aminopyridine derivates with antiamnestic activity. Eur. J. Med. Chem. 35:77-82; Arai, A. C. GYKI has positive modulatory effects on AMPA receptors. Brain Res. 892: ;

31 Irodalomjegyzék 6. Arias, R. L.; Tasse, J. R. P.; Bowlby, M. R. Neuroprotective interaction effects of NMDA and AMPA receptor antagonists in an in vitro model of cerebral ischemia. Brain Res. 816: ; Barna, B.; Szász, A.; Világi, I.; Szente, M. Anticonvulsive effect of AMPA receptor antagonist GYKI on 4-aminopyridine-induced cortical ictal activity in rat. Brain Res. Bull. 51/3: ; Baude, A.; Nusser, Z.; Molnár, E.; McIlhinney, R. A. J.; Somogyi, P. High-resolution immunogold localisation of AMPA type glutamate receptor subunits at synaptic and non-synaptic sites in rat hippocampus. Neurosci. 69/4: ; Berger, S. G.; Waser, P.G.; Sin-Ren, A. C. Distribution of the 4- aminopyridine derivative 3-methoxy-4-aminopyridine in mice. Neuropharm. 28/2: ; Blendy, J. A.; Schmid, W.; Kiessling, M.; Schütz, G.; Gass, P. Effects of kainic acid induced seizures on immediate early gene expression in mice with a targeted mutation of the CREB gene. Brain Res. 681:8-14; Block, F.; Schmitt, W.; Schwarz, M. Pretreatment but not posttreatment with GYKI reduces functional deficits and neuronal damage after global ischemia in rats. Journ. Neur. Sci. 139: ; Borowitz, K. K.; Gasior, M.; Kleinrok, Z.; Czuczwar, S. J. The noncompetitive AMPA/kainate receptor antagonist, GYKI 52466, 31

32 Irodalomjegyzék potentiates the anticonvulsant activity of conventional antiepileptics. Eur. J. Pharm. 281: ; Chapman, A. G. Glutamate receptors in epilepsy. Prog. Brain Res. 116: ; Conti, F.; Weinberg, R. J. Shaping excitation at glutamatergic synapses. TINS 22/10: ; Czuczwar, S. J.; Borowicz, K. K.; Kleinrok, Z.; Tutka, P.; Zarnowski, T.; Turski, W. A. Influence of combined treatment with NMDA and non-nmda receptor antagonists on electroconvulsions in mice. Eur. J. Pharm. 281: ; Dailey, J. W.; Jobe, P. C. Anticonvulsant drugs and the genetically epilepsy-prone rat. In: Neurobiology of antiepileptic drugs. Feder. Proc. 44/10: ; Dóczi, J.; Banczerowski-Pelyhe, I.; Barna, B.; Világi, I. Effect of a glutamate receptor antagonist (GYKI 52466) on 4-aminopyridineinduced seizure activity developed in rat cortical slices. Brain Res. Bull. 49/6: ; Donevan, S. D.; Rogawski, M. A. Allosteric regulation of α-amino-3- hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionate receptors by thiocyanate and cyclothiazide at a common modulatory site distinct from that of 2,3-benzodiazepines. Neurosci. 87: ; Donevan, S. D.; Rogawski, M. A. GYKI 52466, a 2,3- benzodiazepine, is a highly selective, noncompetitive antagonist of AMPA/ kainate receptor responses. Neuron. 10:51-59;

33 Irodalomjegyzék 20. Dragunow, M.; Currie, R. W.; Faull, R. L. M.; Robertson, H. A.; Jansen, K. Immediate-early-genes, kindling and long-term potentiation. Neurosci. Behav. Rev. 24: ; Fragoso-Veloz, J.; Massieu, L.; Alvarado, R.; Tapia, R. Seizures and wet-dog shakes induced by 4-aminopyridine, and their potentiation by nifedipine. Eur. J. Pharm. 178: ; Gasior, M.; Borowicz, K.; Kleinrok, Z.; Starownik, R.; Czuczwar, S. J. Anticonvulsant and adverse effects of MK-801, LY , and GYKI in combination with Ca 2+ channel inhibitors in mice. Pharm. Biochem. Behav. 56/4: ; Gebhart, C.; Breitenbach, U.; Tuckermann, J. P.; Dittrich, B. T.; Richter, K. H.; Angel, P. Calgranulin S100A8 and S100A9 are negatively regulated by glucocorticoids in a c-fos-dependent manner and overexpressed throughout skin carcinogenesis. Oncogene, 21: ; Gass, P.; Herdegen, T.; Bravos, R.; Kiessling, M. Induction of immediate early gene encoded proteins in the rat hippocampus after bicuculline-induced seizures: Differential expression of KROX-24, fos and jun proteins. Neuroscience 48: ; Greenberg, M. E.; Ziff, E. B. Signal transduction in the postsynaptic neuron. Activity-dependent regulation of gene expression. In: Cowan, W. M.; Südhof, T. C.; Stevens, C. F., eds. Synapses. Baltimore: The Johns Hopkins University Press; 2001:

34 Irodalomjegyzék 26. Gubits, R. M.; Hazelton, J. L.; Simantov, R. Variations in c-fos gene expression during rat brain development. Molec. Brain Res.; 3: ; Gulyás-Kovács, A.; Dóczi, J.; Tarnawa, I.; Détári, L.; Banczerowski- Pelyhe, I.; Világi, I. Comparison of spontaneous and evoked epileptiform activity in three in vitro epilepsy models. Brain Res., 945: ; Hámori, T.; Sólyom, S.; Berzsenyi, P.; Andrási, F.; Tarnawa, I. Structural analogues of some highly active non-competitive AMPA antagonists. Bioorg.& Med. Chem. Lett. 10: ; Hampson, D. R.; Huang, X. P.; Oberdorfer, M. D.; Goh, J. W.; Auyeung, A.; Wenthold, R. J. Localisation of AMPA receptors in the hippocampus and cerebellum of the rat using an anti-receptor monoclonal antibody. Neurosci. 50/1:11-22 ; Hardingham, G. E.; Arnold, F. J. L.; Bading, H. Nuclear calcium signalling controls CREB-mediated gene expression triggered by synaptic activity. Nat. Neurosci. 4/3: ; Hardingham, G. E.; Bading, H. The Yin and Yang of NMDA receptor signalling. Trends in Neurosci. 26/2:81-89; Herdegen, T.; Waetzig, V. AP-1 proteins in the adult brain: Facts and fiction about effectors of neuroprotection and neurodegeneration. Oncogene 20: ; Herdegen, T.; Leah, J. D. Inducible and constitutive transcription factors in the mammalian nervous system: Control of gene 34

35 Irodalomjegyzék expression by Jun, Fos and Krox, and CREB/ATF proteins. Brain Res. Rev. 28: ; Henze, D. A.; Urban, N. N.; Barrionuevo, G. The multifarious hippocampal mossy fiber pathway: a review. Neurosci. 98/3: ; Hicks, T. P.; Conti, F. Amino acids as the source of considerable excitation in cerebral cortex. Can. J. Physiol. Pharmacol. 74: ; Hoffmann, G. E.; Lyo, D. Anatomical markers of activity in neuroendocrine systems: are we all fos-ed out? Journ. Neuroendocr. 14: ; Hou, Y-N.; Cebers, G.; Terenius, L.; Liljequist, S. Characterisation of NMDA- and AMPA-induced enhancement of AP-1 DNA binding activity in rat cerebellar granule cells. Brain Res. 754:79-87; Hwa, G. G. C.; Avoli, M. The involvement of excitatory amino acids in neocortical epileptogenesis: NMDA and non-nmda receptors. Exp. Brain Res. 186: ; Jacob, S. W.; Herschler, R. Pharmacology of DMSO. DMSO Org. Publ ; Jones, R. S. G.; Lambert, J. D. C. The role of excitatory amino acid receptors in the propagation of epileptiform discharges from the entorhinal cortex to the dentate gyrus in vitro. Exp. Brain Res. 80: ;

36 Irodalomjegyzék 41. Jones, E. G.; Heron, J. R.; Foster, D. H.; Snelgar, R. S.; Mason, R. Effects of 4-aminopyridine in patients with multiple sclerosis. Journ. Neur. Sci. 60: ; Kovács, A.; Mihály, A.; Komáromi, Á.; Gyengési, E.; Szente, M.; Weiczner, R.; Krisztin-Péva, B.; Szabó, Gy.; Telegdy, Gy. Seizure, neurotransmitter release, and gene expression are closely related in the striatum of 4-aminopyridine-treated rats. Epil. Res. 55: ; Kubová, H.; Világi, I.; Mikulecká, A.; Mareš, P. Non-NMDA receptor antagonist GYKI suppresses cortical afterdischarges in immature rats. Eur. J. Pharm. 333:17-26; Labiner, D. M.; Butler, L. S.; Cao, Z.; Hosford, D. A.; Shin, C.; McNamara, J. O. Induction of c-fos mrna by kindled seizures: Complex relationship with neuronal burst firing. J. Neurosci. 13: ; Lees, G. J.; Leong, W. In vivo, the direct and seizure-induced neuronal cytotoxicity of kainate and AMPA is modified by the noncompetitive antagonist, GYKI Brain Res. 890:66-77; Lemeignan, M.; Millart, H.; Lamiable, D.; Molgo, J.; Lechat, P. Evaluation of 4-aminopyridine and 3,4-diaminopyridine penetrability into cerebrospinal fluid in anesthetized rats. Brain Res. 304: ; Lukasiuk, K.; Pitkänen, A. GABA A -mediated toxicity of hippocampal neurons in vitro. Journ. Neurochem. 74/6: ;

37 Irodalomjegyzék 48. Lundh, H. Therapeutic applications of aminopyridines in diseases of neuromuscular transmission. Ismeretlen forrás. 49. MacDonald, R. L.; McLean, M. J.; Skerritt, J. H. Anticonvulsant drug mechanisms of action. In: Neurobiology of antiepileptic drugs. Feder. Proc. 44/10: ; Maglóczky, Zs.; Wittner, L.; Borhegyi, Zs.; Halász, P.; Vajda, J.; Czirják, S.; Freund, T. F. Changes in the distribution and connectivity of interneurons in the epileptic human dentate gyrus. Neurosci. 96/1:7-25; Malinow, R.; Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25: ; Marinelli, S.; Gatta. F.; Sagratella, S. Effects of GYKI and some 2,3-benzodiazepines on hippocampal in vitro basal neuronal excitability and 4-aminopyridine epileptic activity. Eur. J. Pharm. 391: 75-80; McBain, C. J.; Freund, T. F.; Mody, I. Glutamatergic synapses onto hippocampal interneurons: precision timing without lasting plasticity. TINS, 22/5: ; Mihály, A.; Bencsik, K.; Solymosi, T. Naltrexone potentiates 4- aminopyridine seizures in the rat. J. Neural. Transm. (GenSect) 79:59 67; Mihály, A.; Shihab-Eldeen, A.; Owunwanne, A.; Gopinath, S.; Ayesha, A.; Mathew, M. Acute 4-aminopyridine seizures increase the regional cerebral blood flow in the thalamus and neocortex, but not 37