A Liparis loeselii aktív védelmét célzó aszimbiotikus és szimbiotikus nevelése és szimbionta gombapartnereinek molekuláris azonosítása

Átírás

1 A Liparis loeselii aktív védelmét célzó aszimbiotikus és szimbiotikus nevelése és szimbionta gombapartnereinek molekuláris azonosítása Szakdolgozat Készítette: Illyés Zoltán biológus hallgató Témavezető: Dr. Bratek Zoltán Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar, Növényélettani Tanszék Budapest

2 2

3 Bevezetés Napjainkban az évmilliók alatt kialakult élőlénytársulások az emberi tevékenység következtében tűnnek el és a mesterséges környezet egyre fokozódó térhódítása egyre kisebb életteret biztosít a speciális igényekkel rendelkező, szűk tűrésű növényfajoknak. A jelenkori kipusztulási hullám csak a földtörténeti természeti katasztrófák okozta kihalási hullámokhoz hasonlítható. A védett növényfajok egyedszámának csökkenése populációik genetikai leromlását is eredményezi. Ezen negatív folyamatok lelassításában vagy akár megállításában a konzervációs törekvések mellett egyre nagyobb hangsúlyt kap az aktív természetvédelem, ezen belül is az aktív fajvédelem. Az orchideák kiemelt csoportja a természetvédelemnek. Hazánk közel hatvan orchideafajának mindegyike védelem alatt áll és tizenhárom faj fokozott védelemben részesül. Speciális élőhelyigényüket sajátos, teljes mértékben gombákhoz kötött fejlődésük eredményezi. A hagymaburok (Liparis loeselii (L.) Rich) egyik legveszélyeztetettebb, fokozottan védett lápi orchideánk. Hideg mikroklímájú láprétekhez és úszólápokhoz kötődik. Életfeltételeit háborítatlan meszes, tőzeges és állandó vízellátottságú láprétek biztosítják. Hazánktól északra (pl. Csehország) többezres állományokat alkot, a szubmediterrán övben viszont már csak szórványosan és kis egyedszámban fordul elő hidegebb élőhelyekre szorulva. Hazánkban élőhelyeinek felszámolása sodorta ezt a törékeny orchideát a kipusztulás szélére. Első hazai lelőhelyéről, Budapesten a Városligetből már az 1900-as évek elején kipusztult. A múlt század közepén a Hanságból és Fertőd (Eszterháza) környékéről került elő, majd ezen állományai is eltűntek. Kisebb megszakításokkal, de 1938 óta jelenléte folyamatosan kimutatható volt a kis-tómalmi lápréten (Sopron). Jelenleg négy hazai elfordulása ismert, melyek közül két helyen kis egyedszámban fordul elő: Kis-Tómalom (Sopron), Vajai-tó (Vaja), további két helyen pedig százas nagyságrendű állományt alkot: Soroksári-Duna, 3

4 Velencei-tó (Dinnyés). A velencei-tavi madárrezervátum úszólápjain első ízben Balogh Márton talált rá 1969-ben, később még a tó mintegy tizenöt további úszólápján regisztrálta elfordulását. Az 1980-as évek közepétől 2000-ig L. loeselii egyedek észlelése nem történt. A tó 1990-es évek elején bekövetkezett részleges kiszáradása, és ennek következményeként bekövetkező úszólápi tőzegmineralizálódás szinte teljesen kizárja annak lehetőségét, hogy a L. loeselii populáció túlélhette ezt a krízist. A Duna-Ipoly Nemzeti Park nemzetközi projektet indított a L. loeselii visszatelepítési lehetőségeinek vizsgálatára. E projekt célja a faj ökológiai igényeinek részletesebb megismerése, a potenciális élőhelyek rehabilitációs lehetőségeinek felmérése és a mesterségesen nevelt növényekre épülő visszatelepítés tudományos megalapozása ben a növényt újra felfedeztük a velencei-tavi madárrezervátum úszólápjain, 2001-ben pedig több száz töves populációjára bukkantunk (Balogh et al. 2002). Munkámban a hagymaburok aszimbiotikus és szimbiotikus in vitro szaporításával kapcsolatos kísérleteimről számolok be. Célul tűztem ki egy hatékony ex situ szaporítási eljárás kidolgozását, mellyel a jövőben természetes populációit leszünk képesek megerősíteni. Az orchideák aszimbiotikus szaporítási eljárásainak Liparis loeselii-re való specifikálásán kívül szimbionta gombapartnerének izolálását és ennek molekuláris taxonómiai módszerekkel való azonosítását végeztem el, ezzel előkészítve a szimbiotikus nevelési kísérleteket. A növénygomba kultúra létrehozásakor szerzett tapasztalatok pedig újabb hasznos ismereteket szolgáltatnak az orchidea-mikorrhiza kutatás ma is aktuális kérdéseihez. 4

5 Irodalmi áttekintés Az Orchidea-típusú mikorrhiza Az Orchidaceae család közismerten rendkívül fajgazdag (hozzávetőleg faj alkotja), melyek közt számos (kb. 150) részben vagy teljesen heterotróf faj is található. A családban túlnyomó többségben vannak a trópusi fajok, melyek jobbára epifiton életmódot folytatnak. A nem trópusi fajok többségükben talajlakók. Az orchideák számos egyedi jellegzetessége közül leginkább a mag sajátos tulajdonságait és a növény obligát mikorrhizaképzését érdemes kiemelni. 1. ábra: L. loeselii magok. A csökevényes szuszpenzorral rendelkező embriót a nagy elhalt sejtekből álló külső maghéj veszi köröl A magok igen kicsik, tömegük 0,3-14 µg, differenciálatlanok és szokatlanul nagy számban termelődnek (1. ábra). A magok annyira kevés tartaléktápanyagot (fehérje, lipid, cukor, esetenként keményítő) tartalmaznak, hogy az nem képes fedezni a fotoszintézis megindulása 5

6 előtti differenciálódás energiaigényét. Az orchideáknak tehát ezen életszakaszukban szükségük van a gombapartnerek által biztosított tápanyagra (szénforrás, vitaminok, növekedési faktorok). A csíranövény kapcsolata a gombával a talajban alakul ki, azaz a magok nem hozzák magukkal az anyanövényről szimbiontájukat. A heterotróf fajok egész életükben a gomba segítségével szerzik meg a tápanyagokat. A kifejlett, fotoszintetizáló orchideák gyökérzetében is szinte kivétel nélkül találtak mikorrhizált részt (Niewieczerzalowna 1932). Az Orchidea-típusú mikorrhiza endomikorrhiza, mert a gomba kizárólag az orchideagyökér kortikális sejtjeinek belsejében hozza létre mikorrhiza képletét. A mikorrhizált gyökérszakasz hossza (illetve a mikorrhizált sejtek százalékos aránya) igen változó, és egyes szerzők szerint éves ciklust követ. A terresztris orchideák gyökerei rövidek, gyakran vastagodottak, húsosak, a gyökérszőr kevés, a felvételi folyamatokhoz szükséges felületet ilyenkor a talajt átszövő gombamicélium biztosítja. Számos talajlakó orchidea kedvezőtlen körülmények között akár évekig a földben marad, hajtást nem képez (pl.: Goodyera repens, Limodorum abortivum), a tápanyagellátásukat ilyenkor szimbiontájuk biztosítja. Az epifiton fajok gyökereinek mikorrhizáltsága lényegesen alacsonyabb és többnyire csak a szubsztrátummal érintkező oldalai kolonizáltak. A gombapartner morfológiája és rendszertani helyzete Az orchideákat mikorrhizáló gombák steril tenyészeteinek létrehozása számos nehézséggel jár (Vértényi és Bratek 1996). A mikorrhizált gyökérrészekből izolált gombák a mesterséges mikorrhizálási kísérletek szerint a morfológiai bélyegeik alapján közös csoportot alkotó Rhizoctonia forma-nemzetség (Mycelia sterilia) fajai. A Rhizoctonia forma-nemzetség jellegzetességei: a fiatal hifák áttetszők, oldalágaik hegyesszögben erednek, míg az idősödő hifák megbarnulnak, elágazódásuk szöge megnő. 6

7 A hifák átalakulhatnak vékony falú, sárgásbarnás színű moniliform sejtekké (2. ábra), melyek kétféle kitartóképletté alakulhatnak tovább. Szétdarabolódásuk klamidospórákat, osztódásuk, elágazódásuk és aggregálódásuk mikroszkleróciumokat hoz létre. 2. ábra: Aggregálódó moniliform sejtek Az izolátumok egy része bizonyos körülmények között képes ivaros formát, bazídiumot produkálni. Warcup és Talbot (1980) jelentős számban azonosította az orchideákkal együtt élő Rhizoctonia fajok ivaros (teleomorf) alakjait, melyek a Tulasnella, a Ceratobasidium, a Sebacina, a Thanatephorus és az Ypsilonidium nemzetségekbe tartoznak. Az ivartalan (anamorf) alakok egyik lehetséges csoportosítása a sejtmagok száma alapján történik: a kétmagvú Rhizoctoniák között a Rhizoctonia repens (teleomorf: Tulasnella calospora) és a Rhizoctonia goodyerae-repentis (teleomorf: Ceratobasidium cornigerum), a sokmagvú Rhizoctoniák közül a Rhizoctonia solani (teleomorf: Thanatephorus cucumeris) fajokat izolálták gyakrabban, de előkerültek még a R. anaticula, R. stahlii, R. mucoroides fajok is. Moore (1987) a dolipórus szerkezete alapján csoportosította az anamorfokat, a Rhizoctonia, az Epulorhiza, a Ceratorhiza és a Moniliopsis nemzetségekbe. Az orchideák leggyakoribb mikorrhiza gombái a Ceratorhiza és az Epulorhiza nemzetségekhez tartoznak (Currah et al. 1997). A Rhizoctonia a Helicobasidium purpureum, a Moniliopsis a Thanatephorus cucumeris, az Epulospora a Tulasnella calospora, a Ceratorhiza a Ceratobasidium cornigerum ivartalan alakja. Sneh et al. (1991) Rhizoctonia monográfiája az orchideákból 7

8 kitenyésztett gombák anamorfjait anasztomózis-csoportokba osztja (csak az azonos csoporthoz tartozó fajok hifái képesek kizárólag egymással fúzionálni, azaz anasztomózisokat képezni) és a következő fajokat illetve anasztomózis-csoportokat említi: R. repens, R. anaticula (AG-A, AG-C, AG-E, AG-I), R. solani (AG 5, AG 6). Az ivaros és ivartalan alakok klasszikus rendszerezése tehát alapjaiban már megoldottnak tekinthető (Andersen és Stalpers 1994), a biokémiai és molekuláris-genetikai vizsgálatok pedig - pl. DNS-fragment analízis (Vilgalys és Gonzalez 1990), enzimanalízis (Sweetingham et al. 1986) - lehetővé teszik a további részletek feltárását. Nagyszámú további izolátum vizsgálata alapján lehet majd érdemben állást foglalni az egyes szimbionta gombafajok növénypartnerrel kapcsolatos specifitásáról. Ausztrál orchideák szimbiontáival végzett vizsgálatokban (Warcup 1988) egyes mikorrhizagombákat számos gazdanövényen megtaláltak, másokat viszont csak egy, vagy néhány közeli rokon orchideafajon. Mikorrhizaoltásokkal sem sikerült egy-egy orchideafajra specializálódott gombafajt kimutatni, sőt gabonafélékre patogén R. solani izolátummal is sikeresen tudtak csíranövényt fertőzni, és növekedését serkenteni (Masuhara et al. 1993). Az orchideák arbuszkuláris mikorrhiza-képzésére csupán egyetlen adat van (Hall 1976). Nehezen értelmezhető az orchideák gyökereiből esetenként izolált aszkuszos gombák, és egyéb gombák (Armillaria mellea, Fomes sp., stb.), valamint az ún. pszeudomikorrhizás gombák, Leptodontidium orchidicola, Phialocephala fortinii stb. (Currah et al. 1989) jelenléte. Molekuláris biológiai módszerek az orchidea-típusú mikorrhiza kutatásában Az utóbbi évtizedekben új lehetőségek nyíltak a rendszertan területén. Biokémiai és molekuláris biológiai módszerek jelentek meg az addig hagyományosnak nevezhető, 8

9 morfológiai bélyegek alapján történő elválasztások mellett. A morfológiai jellegek vizsgálata általában egyszerűbb és olcsóbb, viszont sok, általuk fel nem tárható információ nyerhető a molekuláris technikákkal, ezért mindkét módszer egyidejű alkalmazása fontos lehet (Mitchell et al. 1995). Az azonosítás és rendszerezés terén, molekuláris szinten a fehérjék és nukleinsavak szekvenciája és szerkezete áll az érdeklődés középpontjában. A génekben mind a fehérjék, mind az RNS-ek szekvenciája kódolva van, ezenkívül az RNS-ekkel való műveletek sok buktatót rejtenek magukban, ezért a DNS vizsgálata terjed legdinamikusabban világszerte. Ehhez nagy segítséget nyújtanak az utóbbi másfél évtizedben kifejlesztett PCR (polymerase chain reaction) technikák. A PCR készülékek segítségével a DNS molekulák adott szakaszai nagy számban fel-szaporíthatók (amplifikálhatók), majd különféle módszerekkel vizsgálhatóak. A legtöbb információ a különböző szakaszok direkt szekvenálásából nyerhető (White et al. 1990), de sok egyéb módszer is létezik az amplifikált DNS régiók vizsgálatára. Ezek közül megemlítendő a DNS-hibridizáció és egyéb, vele rokon technikák; a RAPD, ahol véletlenszerűen választott primerekkel sokszorosítanak fel genomi szakaszokat, és azok mintázatából nyernek információt; valamint az RFLP (Restrection Fragment Length Polymorphism) technikák, amelyekben amplifikált régiók restrikciós endonukleázokkal emésztett fragmentjeinek mintázatát vizsgálják (Hibbett 1992, Rygiewicz és Armstrong 1992). Azon gének szekvenciái adnak összehasonlítható eredményeket, amelyek különböző taxonokban ugyanazt a funkciót látják el, nagyjából hasonló az evolúciós sebességük és egy kópiában vannak jelen egy genomban, vagy úgy viselkednek. Néhány egyéb gén mellett az rrns molekulákat kódoló rdns régiók tesznek eleget legjobban ezen kritériumoknak (Mitchell et al. 1995). 9

10 A gombákban (és más eukariótákban is) az rrns gének (3. ábra) szerveződése jellegzetes, a 18S, az 5,8S és a 25/28S (S: Swedberg-féle centrifugális ülepedési állandó) rrns-ek génjeiről a transzkripció során egyetlen RNS molekula íródik át, mely tartalmazza a gének közötti nem kódoló régiók másolatát is, amelyek később kivágódnak (Hibbett 1992). Ez a transzkripciós egység, egymás után elhelyezkedve a kromoszómán, sok példányban található meg a genomban, de egy kópiaként evolválódik (Mitchell et al. 1995). 3. ábra: Az rrns gének szerveződése gombákban (Vilgalys (1998) alapján módosítva) A transzkripció során egy kópia készül az ETS (external transcribed spacer) régiótól kezdődően a 28S génnel bezárólag. Az IGS (InterGenic Spacer) régió át nem íródó része (NTS: non-transcribed spacer) tartalmazhatja az 5S rrns génjét is, ám ez taxononként változó, sokszor ez a gén egészen máshol helyezkedik el (Bruns et al. 1991, Hibbett 1992). Azt, hogy mely lokusz milyen taxonómiai kategóriák összehasonlítására alkalmas, elsősorban bázissorrendjének változékonysága szabja meg. Az rdns kódoló régiói konzervatívabbak, evolúciójuk sokkal lassúbb, mint a nem kódoló, elválasztó szakaszoké, ezért a különböző régiók, taxonok közötti összehasonlítása más-más rendszertani szinteken vezethet eredményre. A sejtmagi rrns gének szekvenálása és RFLP vizsgálata főleg faj feletti szinten eredményes. A nem kódoló régiók közül leggyakrabban az ITS szakaszt (ITS1 + 5,8S rdns + ITS2) vizsgálják, amely főként nemzetség- és fajszinten szolgáltat információt (Bruns et al. 1991). 10

11 Az egyre nagyobb számban izolált orchidea szimbionta gombák nemzetségeinek rokonsági viszonyairól, melyeket eddig csak morfológiai alapon, valamint anasztomózis csoportokba sorolással tudtak rendszerezni, ITS szekvenciájuk analízisével pontosabb információk nyerhetők (Kuninaga et al. 1997, Gonzalez et al. 2001). Az egyre növekvő számú ITS szekvencia pedig lehetőséget kínál újabb izolátumok szekvencia alapon történő taxon szintű besorolásához. Az orchideák aszimbiotikus szaporításának lehetőségei Az orchidea magvak nagyon aprók és rendkívül kevés tartaléktápanyagot tartalmaznak (Arditti et al. 1979). A glioxiszómák hiánya miatt a lipidek hasznosítása nem lehetséges. A keményítőszemcsék felhasználásával sem képes a növény a leveles fotoszintetizáló állapotig eljutni. Képes azonban pusztán nedves közegben is megkezdeni a differenciációt, mely során a mag megduzzad, majd a maghéj felreped és vékony gyökérszerű képletek (rhizoidok) alakulnak ki. Ez a képződmény az ún. protokorm. Abban az esetben, ha cukrok felvehető állapotban állnak a protokorm rendelkezésére, számos faj esetében gombapartner nélkül is tovább fejlődik a levelek, vagy esetenként a virág képződéséig. A felvehető cukor lehet D- glükóz, D-fruktóz, szacharóz, nem alkalmasak viszont az L-cukrok, és a szerves savak sem (Harley és Smith 1983). A gomba cukoranyagcseréjében fontos trehalóz (diszacharid) szinte mindig, a mannitol (redukált monoszacharid) pedig csak egyes fajoknál (Purves és Hadley 1976) képes tovább lendíteni a protokorm fejlődését. A szénhidrátok mellett vitaminok (főleg B), növekedési faktorok és aminosavak is szükségesek az aszimbiotikus nevelés során. Történeti érdekesség, hogy 1914-ben Galambos Mária aszimbiotikus módszerrel a világon először nevelt fel kifejlett orchidea növényeket. Azóta is születnek jelentős eredmények 11

12 hazánkban (Szendrák és Eszéki 1993). A terresztris orchideák aszimbiotikus nevelése még napjainkban is nagy kihívást jelent. Az orchideák szimbiotikus szaporításának lehetőségei Az aktív Rhizoctonia törzsek hatására a magok nagyobb számban csíráznak ki, és nő a csírázás sebessége is. A már kialakult protokormot fertőzik a gombahifák a protokorm rhizoidjain (Rasmussen et al. 1990), vagy a szuszpenzor sejtjein keresztül (Clements 1988). Egyes vizsgálatok alapján a szuszpenzor sejtjein keresztül történő kolonizáció nem vezet szimbiózishoz (Rasmussen 1990). A gyökér kortikális sejtjeibe, ill. a protokorm sejtjeibe bejutó hifa felszaporodva, elágazódva és feltekeredve egy "hifa-gombolyagot", un. pelotont képez (4. ábra). 4. ábra: Orchidea gyökér kortikális sejtjei pelotonokkal A peloton hifái és a gazdasejt plazmalemmája között csak egy vékony szénhidrátréteg található, ennek anyaga kallóz, pektin és kevés cellulóz (Peterson és Currah 1990). Hasonló szénhidrátsapka fogja körül a parazita gombák behatoló hausztóriumait is. E szénhidrát réteg a peloton képződésének befejeződése után még tovább vastagszik, jellegzetes elektrontranszparens, anilinkékkel jól festhető réteget képez. A peloton nem állandó képlet a 12

13 gyökér sejtjeiben, hifái idővel ellaposodnak, majd a peloton zsugorodni kezd, a hifák degenerálódnak, végül a peloton szinte teljesen eltűnik. Hadley és Williamson (1971) szerint a pelotonok képződése és eltűnése a Dactylorhiza purpurella esetében óra alatt lejátszódhat. Bár bizonyítani nem sikerült, sokan a peloton degenerálódását nem tápanyaghiánnyal, hanem a gazdasejtek védekező reakciójával magyarázzák. Ezt támasztja alá a degenerált pelotonokat tartalmazó sejtekben a savas foszfatáz aktivitás növekedése (Williamson 1973). Feltehetően a gomba lízisében van szerepe a kitináz és a β(1,3)glükanáz aktivitásnak (Zengming és Zhong 1990). A protokorm fertőzött sejtjei fiziológiailag aktívak, nagy számú mitokondriumot, jól fejlett endoplazmatikus retikulumot, diktioszómákat és különböző méretű vakuólumokat tartalmaznak. A gazdasejtekben a magok térfogata és a DNS mennyisége is megnő (Williamson 1970). Megjegyzendő, hogy megfigyeltek kolonizálatlan gyökerek sejtjeiben is nagymértékű (4 vagy 8-szoros) poliploidiát. A gyökércsúcshoz közeli sejtekben (európai terresztris orchideáknál a csúcstól számított 1-2 cm-en belül) nincs fertőzés, csak a távolabb fekvő gyökérrészek kortikális sejtjeiben. A mikorrhizált gyökérrész sejtjeinek egy része nem tartalmaz pelotont, ezekben a sejtekben mindig találunk keményítőszemcséket. A pelotont tartalmazó sejtekben viszont nincs keményítő. A növény gomba segítségével történő felnevelése csak akkor lehetséges, ha nincs jelen könnyen hozzáférhető szénforrás és a felhasználható nitrogén mennyisége is csekély, különben a gomba parazitálja a növényt (Smith 1967, Beyrle et al. 1991). Orchideák magvetésénél alkalmazott táptalajok Az orchideák steril szaporításának kezdete Knudson (1946) nevéhez fűződik, aki mesterséges táptalajt állított össze steril magvetéshez, melyet még ma is alkalmaznak kiegészítésekkel (Yam és Weatherhead 1988, Stenberg és Kane 1998). Az elmúlt évek alatt igen nagyszámú, 13

14 egymástól eltérő táptalajformulát írtak le, melyek alkalmasak orchideák in vitro tenyésztéséhez. Vannak közöttük, melyek ásványi só és cukor egyszerű keverékéből állnak, de vannak nagyon bonyolult összetételűek is, melyek szerves adalékanyagokat, növekedésszabályozó anyagokat (hormonokat), vitaminokat és egyéb járulékos alkotóelemeket is tartalmazhatnak (Thompson 1977). A receptek összeállításánál olyan kérdésekre keresik a választ, mint hogy miért előnyösebb az egyik só a másiknál, vagy miért fontos egy adott ion koncentrációja (Kishi és Takagi 1997). A jelenlegi kutatások abba az irányba haladnak, hogy tisztázzák ezeket a pontokat, illetve olyan összehasonlító tanulmányok készüljenek, amelyek alapján javaslatot lehet tenni az optimális táptalaj formulára a különböző orchideanemzetségek és fajok in vitro tenyésztéséhez (Stenberg és Kane 1998). Thompson (1977) szerint a legtöbb termesztő üzemben használt táptalajok gerincét a jól ismert Knudson C [KC] tápoldat adja, amelyet gyakran kiegészítenek valamilyen szerves adalékanyaggal, mint pl. banánpéppel, annak érdekében, hogy ellensúlyozzák a közeg meglehetősen alacsony tápanyagtartalmát, különösen a redukált nitrogén alacsony koncentrációját. Az ELTE Botanikus Kert Orchidea laboratóriumában is folynak kísérletek a KC táptalaj módosítására. Jó eredményeket értek el a kálciumszint csökkentésével és egyúttal az ammónium-ionok koncentrációjának növelésével. Ez a módosított formula [melynek jelölése KCM] további vizsgálatok tárgyát képezi (Eszéki és Györváry 2000). Fast (1976) európai orchideák szaporításához állított össze tápközeget, amelynek számos módosított változatát trópusi orchideák magvetéséhez és szaporításához is használják. Az ELTE Botanikus Kert Orchidea laboratóriumában a magvetésekhez a wroclawi egyetemen módosított Fast táptalajt használnak [F]. E receptnél külön megjegyezhető az alacsony 14

15 sókoncentráció, továbbá peptont tartalmaz, melyet a fiatal növények mint nitrogénforrást (aminosavak) hasznosítanak (Eszéki 1996). Az orchidea magok csíráztatásánál szükség van szerves nitrogén forrásokra, ugyanis a magok olyan kis méretűek, hogy nem képesek a szervetlen N források felhasználására, azaz az aminosavak megfelelő szintézisére. A leggyakrabban használt aminosavak a táptalajban a következők: alanin, aszparagin, cisztein, glutamin, glicin, arginin, lizin stb. (Jámborné 1993). Murashige és Skoog (1962) eredetileg dohány szövettenyésztéséhez kifejlesztett tápközege [MS] nagyon hatékonynak bizonyult orchideafajok számára is. Nagyon magas nitrogén- és káliumtartalma, számos különféle növekedésszabályozó anyagot és vitaminokat is tartalmaz (Thompson 1977). Sókoncentrációját a legtöbb szerző magasnak találta, ezért különféle csökkentéseket alkalmaztak, a legtöbben fél makroelem töménységet használnak (Zel et al. 1988, Mante et al. 1989). Az Arditti és Ernst (1984) által megvizsgált 37 különböző tápoldat közül az MS bizonyult a legmagasabb ásványisó tartalmúnak. Megállapításaik szerint ez a közeg 136-szor töményebb, mint azoknak a fatörzseknek a kimosódó nedve, melyekkel az epifiton orchideák protokormjai természetes élőhelyükön találkoznak. Az orchideák magvetésénél alkalmazott táptalajokat gyakran egészítik ki növényi eredetű természetes növekedésserkentőkkel, melyek egyik csoportját a könnyezési nedvek alkotják. Ezek nagy biológiai aktivitásúak, részben cukortartalmuk, részben ásványi anyag- és növekedésserkentő (hormon és vitamin) tartalmuk miatt (Mándy 1987). Másik csoportját a terméskivonatok alkotják. Terméskivonatokat nagyon kis méretű explantátumok életben tartásához használnak. A természetes kivonatok közül a kókusztej bizonyult a leghatásosabbnak a kultúrák növekedésében (Richter 1982). A kókusztej kedvező hatását Datura-embriókultúrákon figyelték meg először. Hatása elsősorban citokinin-aktivitásában rejlik: serkenti a sejtosztódást, de nem hat a sejtek megnyúlásos növekedésére (van Overbeek et al. 1941). A kókusztej egymagában is hat a szövetek növekedésére, de serkentőkkel és más 15

16 kivonatokkal együttesen alkalmazva szembetűnő a hatása. Aránylag tömény oldatban (10-30 %) fejti ki hatását, amely friss állapotban, de autoklávozás után is megmarad (Maróti 1976). A kókusztejet a még éretlen termésből nyerik, a táptalajhoz ml/l töménységben adagolják (Richter 1982). Egyes szerzők növényi hormonok, például benzaminopurin (BA), kinetin, naftilecetsav alkalmazásával érnek el jó eredményeket. Steele (1995) citokinint érett magok esetében adott a táptalajhoz, éretlen magvaknál nem alkalmazott hormonkezelést. Orchidea magok sterilizálásának módjai A magvetéshez éretlen magtokokat használva, melyek még nem repedtek fel, sterilnek tekinthető magvakkal dolgozhatunk. Az érett magtokokon lehetnek vékony repedések, vagy esetleg már fel is nyíltak a bordák mentén, így a magok már érintkezhettek a szabad levegővel. Ez azt jelenti, hogy megfertőződhettek a levegőben terjedő spórákkal, vagyis innentől kezdve nem tekinthetők sterilnek. A még ép, fel nem nyílt termésekből steril körülmények között kinyert magok fertőtlenítés nélkül vethetők (Richter 1982). Ebben az esetben, előzőleg magát a termést kell fertőtleníteni, úgy, hogy a leszedett magtokokat alkoholba mártva denaturált szesz égő lángja fölött áthúzzuk. Így a felületen megtapadt baktérium- és gombaspórák jó része elpusztul a magvak károsodása nélkül (Eszéki 1996). Az orchideamagvak sterilizálásánál nagyon fontos a helyes sterilizálószer, annak töménysége és a fertőtlenítés idejének helyes megválasztása (Jámborné 1993). Mivel a magok nem élnék túl az autoklávozást, ezért fertőtlenítésükhöz valamilyen vegyszeres kezelést kell alkalmazni (Thompson 1977). A leggyakrabban használatos a klórmeszes oldat, de arra figyelni kell, hogy csak valóban friss és légmentesen zárt klórmész alkalmazható (Thompson 1977). 16

17 Az oldat készítésekor a kimért port a szükséges vízzel össze kell keverni egy üvegben, amit azután ajánlott egy gumidugóval lezárni. Az oldatot jól fel kell rázni, majd hagyni leülepedni. Az oldat leszűrésére legalább fél órás állást követően kerül sor. Erre azért van szükség, mert a klórmész nem oldódik fel tökéletesen és egy fakó, fehéres szuszpenziót ad. Ezt leszűrve egy tökéletesen tiszta, halványzöld színű folyadék lesz. Az átszűrt oldatot tartalmazó üveget rögtön le kell zárni és sötétben tartva még aznap fel kell használni (Richter 1982). Az elkészített oldathoz detergenst is adnak, melynek koncentrációja 100 ppm-nél nagyobb nem lehet a magok roncsolása miatt. A fertőtlenítő oldatokhoz adott nedvesítőszerek (pl. Tween 80, Tween 20) növelik az oldat hatékonyságát, amire azért lehet szükség, mert vannak olyan magvak, melyek maghéjában levegő van és ezek a magok nehezebben áztathatók (Jámborné 1993). Thompson (1977) a klórmeszes oldatot 100 g / 100 ml töménységben ajánlja alkalmazni. Eszéki (1996) orchideamagok sterilizálásához a 10 g klórmeszet 90 ml desztillált vízben javasolja feloldani, majd 30 perces állás után szűrni. A sterilizálás időtartama orchideamagvaknál általában 8-10 perc (Eszéki 1996). Thompson (1977) szerint erősen szennyezett magvak esetén szükséges a sterilizálás idejét percre meghosszabbítani, azért, hogy a legtöbb baktérium- és gombaspóra elpusztuljon, és ez rendszerint még nem árt az orchideamagvaknak. A magok sterilizálásának legelterjedtebb módja a következő: a kémcsövekbe helyezett száraz magokhoz 5-10 ml sterilizáló oldatot adnak. A kémcsöveket ezután gumidugóval lezárva 2-3 percen keresztűl intenzíven rázatják, majd a megfelelő idő elteltével a fertőtlenítő oldatot leöntik a magvakról (Richter 1982, Eszéki 1996). Egyes szerzők ezt követően 2-3-szor ismételt steril desztillált vizes öblítést is javasolnak (Thompson 1977, Jámborné 1993). 17

18 Anyag és módszer Liparis loeselii A magvetési kísérletekben felhasznált L. loeselii magok a bevezetőben már említett három hazai állomány közül az újonnan felfedezett, legnagyobb egyedszámú, velencei-tavi populációból származtak. Az 5-25 cm magas növény május végén, június elején virágzik. Laza fürtvirágzatát 2-10 sárgászöld virág alkotja (5. ábra). Az érett magtokok a szeptember végi magszórást megelőzően kerültek begyűjtésre 2001 és 2002-ben. Vetésig a magokat hűtve (5 o C) tároltam, ugyanis magasabb hőmérsékleten az orchideák magjai gyorsan elvesztik csírázóképességüket. A magok egy részét a magvetést megelőző két hétben mélyhűtőben (-20 o C) tároltam. Az így előkezelt magokat az első aszimbiotikus csíráztatási kísérletben használtam fel. 5. ábra: Liparis loeselii virágzó egyed a 2001-ben felfedezett velencei-tavi populációból (2001. május 18.) Alkalmazott szimbionta gombatörzsek A szimbiotikus nevelési kísérletekhez számos hazai orchideáról izolált szimbionta gombatörzs állt rendelkezésre. Liparis loeselii gyökeréből három izolátummal is rendelkezünk (O-318, O- 18

19 36, X/9a). Mivel egyre több kutatási eredmény szól amellett, hogy az orchidea fajok és potenciális szimbiontáik között nincs szoros fajspecifitás, ezért a szimbiotikus szaporítási kísérleteimben egy másik, Dactylorhiza incarnata gyökeréből izolált gombatörzset (VII/17d) is alkalmaztam. A mikorrhizaképző gomba izolálása és az izolátumok fenntartása A szimbiotikus kultúrák előkészítéséhez használt két gombatörzs (X/9a, VII/17d) izolálásánál a gyökérszegmens technikát alkalmaztam (Vértényi és Bratek 1996). A lemosott gyökereket 3 percig 0,1 %-os AgNO 3 oldatattal fertőtlenítettem, majd 0,5 1,0 cm-es darabokra vágtam és burgonyakeményítős táptalajra (Potato Dextrose Agar, PDA) helyeztem. A gombatáptalajon kifejlődő szimbionta gombákat izoláltam, majd ugyancsak PDA táptalajon tartottam fent a tiszta törzseket. A PDA táptalaj összetétele: burgonyapehely 3 g/l, glükóz 10 g/l, agar 15 g/l. A gombatörzsek azonosítása molekuláris módszerrel DNS kivonása a gombatörzsekből A DNS kinyerésében néhány módosítással Kårén et al. (1997) módszerét alkalmaztam. A gombatörzseket rázatott folyadékkultúrában szaporítottam föl. A leszűrt micélium-szövedéket 50 C-on, szárítószekrényben szárítottam meg. Ebből az anyagból vettem mintánként mg tömegű mennyiséget a DNS kivonáshoz. A mintákat kis méretű dörzsmozsarakban dörzsöltem el, kvarchomok és folyékony nitrogén jelenlétében. Az eldörzsölt anyagot 1,5 mles Eppendorf-csövekbe vettem fel, µl 2 %-os CTAB lízis pufferben (lízis puffer: 2 % CTAB, 100 mm Trisz-HCl, 1,4 M NaCl, 20mM EDTA). A csöveket 65 C-os vízfürdőben inkubáltam percig, közben percenként keveréssel homogenizáltam. Ezt követően 19

20 a mintákat centrifugába tettem és rpm fordulatszámon, 10 perc alatt lecentrifugáltam a törmeléket. Minden centrifugálás szobahőmérsékleten zajlott. A fehérjéket kloroformos kicsapással távolítottam el, két lépésben. A mintákhoz egy térfogat (kb. 600 µl) kloroformot adtam, majd alaposan összeráztam és rpm fordulatszámon, 15 percig tartó centrifugálással elválasztottam a vizes és a kloroformos fázist. A DNS-t is tartalmazó vizes fázist új, tiszta csőbe pipettáztam, a fehérjetartalmú kloroformos fázist elöntöttem. Ezután ezt a lépést megismételtem. A vizes fázisú felülúszóból a DNS-t két - két és fél térfogat 20 C-os abszolút etanollal csaptam ki. A kicsapott DNS-t egy éjszakán át 20 C-on tartottam, hogy elősegítsem a DNS kiválását, majd rpm fordulatszámon, 30 percig centrifugáltam. A felülúszó elöntése után a DNS csapadékot háromszor mostam a következő módszerrel: 200 µl 70 %-os, -20 Cos etanolt adtam a csapadékhoz, majd rövid keverés után 7000 rpm fordulatszámon, 5 percig centrifugáltam, végül az alkoholos felülúszót elöntöttem. Ezt a mosási eljárást tehát még kétszer megismételtem. Végül az alkoholt leöntöttem a csapadékról és az eppendorf-csöveket kiszárítottam, így eltávolítottam a mintából az alkoholt. Végezetül a csapadékot ph=8 értékű µl ultratiszta Milli-Q vízben (Millipore) vettem föl. PCR reakció és gélelektroforézis Mivel ultratiszta vizet használtam a DNS oldására és vízben a DNS oldódása nem tökéletes, ezért az inhomogén oldatból több különböző hígítással végeztem a PCR reakciót, így közelítve a reakció optimális templát koncentrációját. 20

21 Az amplifikációhoz a Perkin Elmer cég GeneAmp PCR System 2400 típusú készülékét használtam (6. ábra), amelyben maximum 24 darab, 0,2 ml-es PCR cső használható. A PCR elegyek végső térfogata minden esetben 50 µl volt. A reakcióelegyek összetételéről tájékoztat az 1. táblázat. 6. ábra: GeneAmp PCR System 2400-as készülék 1. táblázat A PCR elegyek és a mastermix térfogata és összetétele Kiindulási koncentráció 1 reakcióelegy (µl) steril ultratiszta víz 8,75 reakciópuffer 10 RB 5 dntp mix mm 5 MgCl 2 25 mm 4 primer 1 10 µm 1 primer 2 10 µm 1 Taq polimeráz 5 u/µl 0,25 mastermix térfogat 25 templát DNS-oldat térfogat 25 Teljes térfogat 50 Elsőként a DNS templátot, vagyis a mintákat mértem be a PCR csövekbe, és a térfogatot steril Milli-Q vízzel kiegészítettem 25 µl-re. Ezután a mastermixet, azaz a PCR elegyek DNS templátot nem tartalmazó, a megfelelő reakciókörülményeket biztosító, azonos alapoldatát készítettem el, minden összetevőt belemérve, az enzim kivételével. Végül a Taq DNS polimeráz enzimet is hozzáadtam a mastermix-hez, és rövid keverés után ebből az 21

22 alapoldatból adtam minden csőhöz szintén 25 µl-t. A reakcióelegyekben 2 mm volt a végső Mg 2+ koncentráció. Az enzim számára a polimeráz reakció megkezdéséhez szükséges oligonukleotidokként az ITS1 (5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ) - ITS4 (5 - TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ) eukariótákhoz univerzálisan használt primerpárt alkalmaztam, amely a teljes ITS régió felszaporításához használatos (Gardes et al. 1991, Vilgalys 1998). A reakció során beállított paraméterekről a 7. ábra nyújt tájékoztatót. 7. ábra: Az amplifikáció folyamán alkalmazott hőmérsékletek előzetes denaturáció denaturáció primerkötés DNS szintézis végső szintézis eltartás 94 o C 94 o C 4 perc 30 mp 30 mp 72 o C 72 o C 51 o C 30 mp* 7 perc 30 mp 4 o C 33 ciklus * +1 mp ciklusonként A polimeráz enzim aktiválásához és a templát DNS nagyfokú denaturációjának eléréséért az első ciklus beindítása előtt 4 és fél percig tartó, 94 C-os inkubációt alkalmaztam, ezen kívül a Taq polimeráz ciklusonként csökkenő aktivitását a szálszintézis idejének ciklusonkénti 1 másodperces növelésével ellensúlyoztam. A reakció végeztével (kb. 2 óra múltán) a mintákat azonnal vizsgáltam gélen. A gélelektroforézishez Horizon típusú futtató rendszert (Gibco BRL) használtam. A gél elkészítéséhez és futtató pufferként egyaránt 0,5 Trisz-bórsav-EDTA (TBE) puffert használtam. A gél 1 % agaróz tartalmú volt. A kb C-ra visszahűtött agarózoldathoz adtam hozzá a DNS kimutatására használt etidium-bromidot, 100 ml gélhez 16 µl mennyiségben (0,5 mg/ml törzsoldatból). A mintákból 5 µl-t kivéve és ehhez 1 µl 6 LB jelzőpuffert adva, ezeket a 6 µl térfogatú keverékeket juttattam a mintafelvevő zsebekbe. A 22

23 PCR termékek ellenőrzéséhez 5,5-7,5 V/cm fajlagos feszültség mellett percig hagytam vándorolni a DNS mintákat az agaróz gélben. A futtatási idő letelte után a gélt UV fénnyel átvilágítva, 595±50 nm-en áteresztő interferenciaszűrőt alkalmazva, digitális, hűtött CCD kamerával fényképeztem le, a WinView/32 és az Image-Pro Plus kameravezérlő és képfeldolgozó programok segítségével. A fotókat szabad szemmel, ill. a Phoretix-1D gélkiértékelő program felhasználásával vizsgáltam. PCR termékek tisztítása, szekvenálás A PCR termékek tisztítását ultraszűrő membrán (Amicon membrán, Millipore) segítségével végeztem. A tisztítás során a megfelelő pórusméretű ultraszűrő membrán visszatartja a PCR termék DNS molekuláit, míg a fölösleges kismolekulájú anyagok (dntp, oligonukleotidok, sók) átcentrifugálhatók, végül a DNS a membránról lemosható. A tisztítás eredményét mindkét esetben a már említett módon gélelektroforézissel ellenőriztem. A szekvenáló reakcióhoz a BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit-et (Applied Biosystems) használtam. A szekvenáló elegy összetétele a 2. táblázatban látható. 2. táblázat: A szekvenáló reakcióelegyek összetétele. kit 3 µl higító puffer 5 2,5 µl PCR termék 4-8 µl primer 30 pmol víz a maradék összesen 20 µl A szekvenáló kit tartalmazza a fluoreszcens nukleotidokat (dntp és ddntp), a DNS polimerázt (módosított Taq) és egyéb segédanyagokat. A gélelektroforézis eredményétől 23

24 függően az egyes mintákból 4-8 µl mennyiséget használtam, a végső térfogatot steril ultratiszta vízzel állítottam be 20 µl-re. A reakció során beállított paramétereket a 8. ábra tartalmazza. 8. ábrat: A szekvenáló reakció körülményei denaturáció primerkötés DNS szintézis eltartás 96 o C 10 mp 60 o C 50 o C 4 perc 5 mp 4 o C 28 ciklus A szekvenáló reakcióelegyekből a jelölt DNS-t 50µl 96 %-os etanollal és 2µl 3M Na-acetáttal csaptam ki, majd keverés és rövid szobahőmérsékletű inkubálás után 20 percig rpm fordulatszámmal centrifugáltam. A felülúszó eltávolítása után etanollal mostam a DNS-t, majd a csapadékot PCR-készülék segítségével 90 C-on kiszárítottam. A mintákat formamid tartalmú pufferben denaturáltam, a kapilláris gélelektroforézis ABI PRISM 310 Genetic Analyser, illetve 3100 Genetic Analyser készülékben (Applied Biosystems) történt. A szekvenciák ellenőrzése és adatbázisba helyezése A kromatogram formájú DNS-szekvenciákat a Chromas program felhasználásával ellenőriztem. Az ellenőrzött szekvenciákhoz hasonló, már leközölt adatokat a nemzetközi adatbázisokban (GenBank, EMBL) a BlastN (Altschul et al. 1997), illetve a Fasta33 (Pearson és Lipman 1988) programok segítségével kerestem, a DNS szekvenciák pontos illesztését pedig a ClustalW (Thompson et al. 1994) programmal végeztem. A szekvenciákat az európai nemzetközi adatbázisban (EMBL) helyeztem el. 24

25 Az aszimbiotikus csíráztatási kísérletekben felhasznált táptalajok Az első csíráztatási kísérletben a L. loeselii magokat négy különböző táptalajra vetettem el. Az alkalmazott táptalajok a wroclawi egyetemen módosított Fast [F], a Van Waes és Debergh (1986) [DEB], kókusztejjel kiegészített DEB tápalaj [DK], valamint egy kizárólag kókusztejet, mint természetes serkentő anyagot tartalmazó [ZAK] (Borris 1969) táptalajok voltak (3. táblázat). A második csíráztatási kísérletben az F és DEB táptalajok mellett a Murashige és Skoog (1962) [MS], felére csökkentett makroelem tartalmú MS [MS1/2] és 10-5 M BA (citokinin) tartalmú ugyancsak felére csökkentett makroelem szintű MS [MS1/2+BA] táptalajokra vetettem a L. loeselii magjait (3. táblázat). Ezenkívül desztillált vízbe is vetettem magokat. A szimbiotikus csíráztatási kísérletben alkalmazott táptalaj A szimbiotikus csíráztatási kísérlet során a táptalajra a növény magjai mellett, a szimbionta gomba is felkerül. Az alkalmazott csökkentett glükóz tartalmú táptalaj a Pfeffer agar [P] (Weber és Webster 2001) volt (3. táblázat). A gomba a táptalaj felszínére helyezett 2 5 cm-es autoklávozott szűrőpapírra került (9. ábra). 9. ábra: Szimbiotikus orchidea magvetés Petri-csészébe 25

26 3. táblázat: Az aszimbiotikus és szimbiotikus csíráztatási kísérletekben felhasznált táptalajok Összetevők (mg/l) Makroelemek MS MS1/2 F DEB DK ZAK P Ammónium-nitrát NH 4 NO , Kálium-nitrát KNO Kálium-klorid KCl , Kálcium-klorid CaCl 2 x 2H 2 O Ca(NO 3 ) 2 x4h 2 Kálcium-nitrát O , Magnézium-szulfát MgSO 4 x 7H 2 O , Kálium-foszfát KH 2 PO , Mikroelemek Kálium-jodid KI 0,83 0,83 0, ,83 Bórsav H 3 BO 3 6,2 6,2 6, ,2 Mangán-szulfát MnSO 4 x 4H 2 O 22,3 22,3 22, ,3 Cink-szulfát ZnSO 4 x 7H 2 O 8,6 8,6 8, ,6 Na 2 MoO 4 x Nátrium-molibdenát H 2 O 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25-0,25 Réz-szulfát CuSO 4 x 5H 2 O 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025-0,025 Kobalt-klorid CoCl 2 x 6H 2 O 0,025 0,025 0, ,025 Vas forrás Vas-szulfát FeSO 4 x 7H 2 O 27,8 27,8-27,85 27,85-27,8 FeNaEDTA 37,3 37,3 16,66 37,25 37,25-37,3 Vitaminok Inozit Nikotinsav 0,5 0,5 0, Piridoxin HCl (B 6 ) 0,5 0, Tiamin HCl (B 1 ) 0,5 0,5-0,5 0,5 - - Fólsav ,5 0,5 - - Biotin (H-vit.) - - 0,01 0,05 0, Aminosavak Glicin Glutamin ,3 102,3 - - Egyéb Kazein Pepton Élesztőkivonat Növekedésserkent ő Kókusztej (ml/l) Szénhidrát Szacharóz (g/l) , Fruktóz (g/l) Glükóz (g/l) 1 Agar (g/l)

27 A magok sterilizálása és vetése A L. loeselii magok sterilizálásához klórmész oldatot használtam, amit Eszéki (1996) módszere alapján készítettem. Az oldatot 30 perc állás után szűrtem le, majd 2 csepp Tween 80-at adtam hozzá. A sterilizáláshoz a magvakat kémcsövekbe helyeztem el, majd az oldat hozzáadását követően a csöveket gumidugóval zártam le. A sterilizálási idő alatt a kémcsöveket folyamatosan rázattam, majd az áztatást követően az oldatot óvatosan leöntöttem a magokról, melyek így a kémcső belső falára tapadtak. A sterilizálás időtartama 10 perc volt. Az első aszimbiotikus csíráztatási kísérletben sterilizálást követő kétszeres desztillált vizes mosást alkalmaztam a magok egy részénél. A magvakat steril szike segítségével juttattam a táptalajra. A magok egyenletes eloszlása érdekében steril üvegbot segítségével 1-2 csepp desztillált vizet juttattam a táptalaj felszínére, majd a vízzel szétoszlattam a magokat. Tenyésztési körülmények Az első aszimbiotikus csíráztatási kísérlet beállításának helye és időpontja: ELTE Botanikus Kert Orchidea laboratórium, április 25. A kultúrákat 100 ml-es Erlenmeyer-lombikokban tartottam fenn. A magvetést követően a lombikokat sötétben, szobahőmérsékleten tartottam a csíranövények hajtáscsúcsának megjelenéséig (10. ábra). 10. ábra: Tömegesen csírázó L. loeselii magok DEB táptalajon 27

28 A második aszimbiotikus csíráztatási kísérlet beállításának helye és időpontja: ELTE Növényélettani Tanszék, november 19. A kultúrákat Petri-csészében tartottam fenn. Három csíráztatási körülményt állítottam be. A magok egy része sötétbe és szobahőmérsékletre került, egy másik része fényre, szobahőmérsékletre, a harmadik csoport pedig egy hónap időtartamra sötétbe és hűtőszekrénybe (4-6 o C) került. A hidegkezelést követően ezeket a magokat is szobahőmérsékletre tettem és továbbra is sötétben tartottam. A szimbiotikus előkísérlet beállításának helye és időpontja: ELTE Növényélettani Tanszék, december 16. A Pfeffer agarra oltott gombatörzsek sötétbe és szobahőmérsékletre kerültek. A kultúrákat Petri-csészében tartottam fenn. Az első aszimbiotikus csíráztatási kísérletben Debergh táptalajon előnevelt Liparis magoncokat a már gombával átszőtt Pfeffer agarra oltása után a fényre tettem (2003. január 23.). A szimbiotikus csíráztatási kísérlet beállításának időpontja és helyszíne: január 2., ELTE Növényélettani Tanszék. A Petri-csészében Pfeffer agarra vetett magok sötétbe és szobahőmérsékletre kerültek. A gomba táptalajra oltását követően is tart a sötétkezelés a növények jövőbeni hajtásképzéséig. A csíráztatási kísérletek kiértékelésének módszerei Az első aszimbiotikus csíráztatási kísérletben a magok csírázásának időpontját rendszeres sztereómikroszkópos vizsgálattal állapítottam meg. A hajtásképzés megindulásakor lombikonként megállapítottam a protokormok és hajtásos csíranövények együttes százalékos arányát, valamint a csírázás folyamán elhalt protokormok százalékos arányát. Párhuzamos minták kialakítása nem történhetett meg a 2001-ben gyűjtött magtokok kis száma miatt. A második csíráztatási kísérletben a Petri-csészékben indított kultúrák rendszeres vizsgálatával a csírázás megindulását pontosan detektáltam, majd a csírázási folyamatot két 28

29 időpontban csírázási százalékok számolásával követtem nyomon. A Petri-csészénkénti protokormok számát a Petri-csészék 1 cm 2 -es szektorokra bontásával és ezek szisztematikus vizsgálatával pontosan meg tudtam állapítani, az összmagszámmal együtt. 29

30 Eredmények ismertetése A szekvenciaanalízis eredményei A szekvenciák elemzését a három Liparis loeselii és egy Dactylorhiza incarnata gyökeréről izolált szimbionta gombatörzs felszaporított tenyészetből származó minta esetén végeztem el. Minden gombatörzsből két nyers szekvenciát kaptam, mivel mindkét DNS szálat megszekvenáltam. Erre azért volt szükség, mert a szekvelálási reakció során a Taq polimeráz aktivitásának csökkenésével a bázisok leolvasásának megbízhatósága folyamatosan romlik. Az ITS régió két irányból megkezdett feltárása viszont kiküszöböli ezt a problémát, mivel a két komplementer szekvencia egymással kiegészíthető. A szekvenátor által adott kromatogramokat a Chromas kiértékelő program segítségével vizsgáltam. A számítógép által meghatározott bázissorrendet néhol szükséges volt felülbírálni (11. ábra). Előfordultak a szekvenciában nem determinált, hiányzó, vagy éppen megkettőzött bázisok. Ezek kijavítása és a revertált komplementer szállal való kiegészítés után már a szekvenciák alkalmasak lettek a további analízisre. Az egyes gombatörzsek adatait a 4. táblázatban foglaltam össze. 11. ábra: A Chromas program által meghatározott bázissorrend javítása 4. táblázat: Gombatörzs Izolátum eredete Izolátum származási helye Hivatkozási szám O-318 Liparis loeselii Csehország AJ O-36 Liparis loeselii Csehország AJ X/9a Liparis loeselii Magyarország, Velencei-tó AJ VII/17d Dactylorhiza incarnata Magyarország, Szabadszállás AJ

31 A O-318 és O-36 törzsek ITS régiójának szekvenciája 100 %-ban megegyezett. Meghatároztam az ITS1, az 5,8S rrns gén, valamint az ITS2 szakaszok kezdetét és végét az EMBL adatbázisból vett Saccharomyces cerevisiae (AJ229057) szekvenciája alapján (a félkövéren írt adatok az 5,8S rrns gént jelölik): GTAATCGTCTTTGACGTTCTATCTCCATCGTCCTCGGGACGTTAAGGCGCTCTGGTCGAG GATAAACGACCCCTCTGACCGAGGTTAAACGGTTGCCAGTCTGTGTTACCTCCTCGGAGG CACACGTTAAAGATCGTTCCGCGTTGTGAGTCTAACACCAGTTGTAAACTTTACAACCGG CAGCGCTGGATCCCTTGGCACGTCATTCGATGAAGACCGTTGCAAATTGCGATAAAGTGA TGTGATGCGCAAGTCCACCACTTATACGTGAATCATCGAGTTGTTGAACGCATTGCACCG CGCCCTAAACCGGCTGCGGTATGCCCCTTTGAGCGTCATTGTATTCCTTCGGGAGTCTTT CCTTGCTGAAAGACCCGAGCTCGGAGTCCTCGGTCCTTTGGATCGTGTTCTCTCAGATGC GTCGCGCCGATCGCCTGATGGGTACTCTAATGCCTGAGCGTGGAGTCCCTTCGAGTTTGA GACGCGCTTGACCGGCCGTTGGGCTCGCGTCACCAAGTCCGCGTCCTCTTGGACGTCGGT ACTACAACGCA ITS1: (165 bp hosszú) 5,8S: (175 bp hosszú) ITS2: (211 bp hosszú) A X/9a törzs ITS régiójának szekvenciája az ITS1, 5,8S és ITS2 régiók határaival: GTAATCGTCTTTGACGTTCTATTTCCATCGTCCTCGGGACGTTAAGGTGCTCTGGTCGAG GATAAACGACCCCTCTGACCGAGGTTAAACGGTCGCTTTGCCTGTGTTACCTCCTTGGAG GCACACGTTAAAGATTGTTCCGCGTTGTGAGTCTAACACCAGTTGTAAACTTTCTACAAC CGGCAGCGCTGGATCCCTTGGCACGTCATTCGATGAAGACCGTTGCAAATTGCGATAAAG TGATGTGATGCGCAAGTCCACCACTTATACGTGAATCATCGAGTTGTTGAACGCATTGCA CCGCGCCCTAATCCGGCTGCGGTATGCCCCTTTGAGCGTCATTGTATTCCTTCGGGAGTC TTTCCTTGCTGAAAGACCCGAGCTCGGAGTCCTCGGTCCTTTGGATCGTGTTCTCTCAGA TGCGTCGCGCCGATCGCCTGATGGGTACTCTAATGCCTGAGCGTGGAGTCCCTTTGAGCT TGAGACGCGCTTGACCGGCCGTTGGGCTTGCGTCACCAAGTCCGCGTCCTTCTGGACGTC GGTACTACAACGCA ITS1: (166 bp hosszú) 5,8S: (177 bp hosszú) ITS2: (211 bp hosszú) 31

32 A VII/17d törzs ITS régiójának szekvenciája az ITS1, 5,8S és ITS2 régiók határaival: TGAATAAATTTAGAGTTGGTTGTTGCTGGCTTTAATACCTGAAGCATGTGCACACCTTCT CTTTAATCCACACACCCCTGTGAACTTGTGAGGCAGTAAGGGAGAGAGGTCTTTAACCGG GCCTGATCCTTTGCTGCCTGCTTAATTACACAAACTCATTTTATTTTAAACTGAATGTAA ATTGATGTAACGCATCATTTAATTACAAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATC GAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATC ATGAAATTCTCAAAGTAAAATCTTTTTGTTAATTCAATTGGTTTGACTTTGGACTTGGAG GTCTTTGCAGATTTAATTATCTGCTCCTCTTAAATTTATTAGCTGGATCTCAGTATATGC TTGGTTCCACTCGGCGTGATAAGTTATCACTCGCTGAGGACACTTGTAATAAAGTGGCCA GGAAATGCAGATGAACCGCTTCTAATGGTCTATTAAATTAGACAAAATTTAATTTCAAGA ITS1: (206 bp hosszú) 5,8S: (156 bp hosszú) ITS2: (238 bp hosszú) 32

33 A Liparis loeselii gyökeréről izolált két különböző ITS szekvenciájú gombatörzs igen nagy hasonlóságot mutat (12. ábra). 12. ábra: Az O-36 és a X/9a gombatörzsek ITS régiójának összehasonlítása ClustalW program segítségével. A pontok azonos bázisokat jelölnek ITS1 O-36 GTAATCGTCTTTGACGTTCTATCTCCATCGTCCTCGGGACGTTAAGGCGCTCTGGTCGAG 60 X/9a...T...T O-36 GATAAACGACCCCTCTGACCGAGGTTAAACGGTTGCCA-GTCTGTGTTACCTCCTCGGAG 119 X/9a...C..TTT.C...T O-36 GCACACGTTAAAGATCGTTCCGCGTTGTGAGTCTAACACCAGTTGT 165 X/9a...T ,8S O-36 AAACTTT--ACAACCGGCAGCGCTGGATCCCTTGGCACGTCATTCGATGAAGACCGTTGC 58 X/9a...CT O-36 AAATTGCGATAAAGTGATGTGATGCGCAAGTCCACCACTTATACGTGAATCATCGAGTTG 118 X/9a O-36 TTGAACGCATTGCACCGCGCCCTAAACCGGCTGCGGTATGCCCCTTTGAGCGTCATT 175 X/9a...T ITS2 O-36 GTATTCCTTCGGGAGTCTTTCCTTGCTGAAAGACCCGAGCTCGGAGTCCTCGGTCCTTTG 60 X/9a O-36 GATCGTGTTCTCTCAGATGCGTCGCGCCGATCGCCTGATGGGTACTCTAATGCCTGAGCG 120 X/9a O-36 TGGAGTCCCTTCGAGTTTGAGACGCGCTTGACCGGCCGTTGGGCTCGCGTCACCAAGTCC 180 X/9a...T...C...T O-36 GCGTCCTCTTGGACGTCGGTACTACAACGCA 211 X/9a...TC A két szekvencia közti különbséget alábbi táblázatban részletezem: O-36 ~ X/9a transzverzió (bázis) tranzíció (bázis) inzerció/deléció (bázis) eltérés ITS ,4 % 5,8S 1-2 1,7 % ITS ,4 % összesen 17 3,1 % 33

34 A X/9a ITS régiójának szekvenciájához hasonló, már leközölt adatokat a nemzetközi adatbázisokban (GenBank, EMBL) a BlastN program segítségével kerestem, majd a leghasonlóbb szekvenciával ClustalW program segítségével illesztést hajtottam végre. Egy Epulorhiza (AJ313446) faj (EPU) szekvenciája csupán 1,4 %-ban tért el (13. ábra). Ezt a gombát pedig Szingapúrban egy Diplocaulobium enosmum nevű trópusi orchidea gyökeréről izolálták. 13. ábra: A X/9a gombatörzs és az AJ hivatkozási számú Epulorhiza faj (EPU) ITS régiójának összehasonlítása ClustalW program segítségével. A pontok azonos bázisokat jelölnek ITS1 X/9a GTAATCGTCTTTGACGTTCTATTTCCATCGTCCTCGGGACGTTAAGGTGCTCTGGTCGAG 60 EPU X/9a GATAAACGACCCCTCTGACCGAGGTTAAACGGTCGCTTTGCCTGTGTTACCTCCTTG-GA 119 EPU...C...T..TC X/9a GGCACACGTTAAAGATTGTTCCGCGTTGTGAGTCTAACACCAGTTGT 166 EPU...C ,8S X/9a AAACTTTCTACAACCGGCAGCGCTGGATCCCTTGGCACGTCATTCGATGAAGACCGTTGC 60 EPU X/9a AAATTGCGATAAAGTGATGTGATGCGCAAGTCCACCACTTATACGTGAATCATCGAGTTG 120 EPU X/9a TTGAACGCATTGCACCGCGCCCTAATCCGGCTGCGGTATGCCCCTTTGAGCGTCATT 177 EPU...C ITS2 X/9a GTATTCCTTCGGGAGTCTTTCCTTGCTGAAAGACCCGAGCTCGGAGTCCTCGGTCCTTTG 60 EPU...T X/9a GATCGTGTTCTCTCAGATGCGTCGCGCCGATCGCCTGATGGGTACTCTAATGCCTGAGCG 120 EPU X/9a TGGAGTCCCTTTGAGCTTGAGACGCGCTTGACCGGCCGTTGGGCTTGCGTCACCAAGTCC 180 EPU...C X/9a GCGTCCTTCTGGACGTCGGTACTACAACGCA 211 EPU

35 A két szekvencia közti különbséget alábbi táblázatban részletezem: X/9a ~ EPU transzverzió (bázis) tranzíció (bázis) inzerció/deléció (bázis) eltérés ITS ,0 % 5,8S - 1-0,6 % ITS ,9 % összesen 8 1,4 % A VII/17d jelű törzs rokonsági viszonyának kiderítését is a BlastN program segítségével végeztem el. Egy Ceratobasidium (AF472285) faj (CER) bizonyult a leghasonlóbbnak, melynek anamorf alakja egy Rhizoctonia faj (14. ábra). Szekvenciája 10,4 %-ban tért el az általam izolált gomba ITS régiójának szekvenciájától (Az ITS1 régió első 16 bázisa, valamint az ITS2 régió utolsó 9 bázisa hiányzik a Ceratobasidium sp. esetében). Ezt a gombát pedig Puerto Ricoban egy epifiton Psychilis monensis nevű trópusi orchidea gyökeréről izolálták. 14. ábra: A VII/17d gombatörzs és az AF hivatkozási számú Ceratobasidium faj (CER) ITS régiójának összehasonlítása ClustalW program segítségével. A pontok azonos bázisokat jelölnek ITS1 VII/17d TGAATAAATTTAGAGTTGGTTGTTGCTGGCTTTAATACCTGAAGCATGTGCACACCTTCT 60 CER A...C.CCT.G--..GG VII/17d CTTTAATCCACACACCCCTGTGAACTTGTGAGGCAGTAAGGGAGAGAGGTCTTTAACCGG 120 CER...C...A...A A..G..G.C...TT.. 98 VII/17d GCCTGATCCTTTGCTGCCTGCTTAATT-ACACAAACTCATTTTATTTTAAACTGAATGTA 179 CER CTT.T..TT..CC...T..A...T VII/17d AATTGATGTAACGCATCATTTAATTAC 206 CER