1. A TESTFOLYADÉKOK ÉLETTANA

Átírás

1 1. A TESTFOLYADÉKOK ÉLETTANA A vér, mint speciális kötıszövet, sejtekbıl és sejtközötti állományból áll. Ez utóbbi a vérplasma, míg a sejtek a vér alakos elemeit alkotják. A vérplasma 90%-a víz. Valódi és kolloidális oldott állapotban tartalmaz gázokat, elektrolitokat, bomlástermékeket, tápanyagokat, hormonokat. Fontosabb ionjai: Na +, K +, Cl -, Ca 2+, Mg 2+, HCO - 3. Nagy molekulájú anyagai a plasmaproteinek, immunglobulinok, glükoproteidek, steroidok. Ezen kívül vérfehérjéket, más szerves anyagokat is tartalmaz. A vérfehérjék: a fibrinogén (kb.5%), albumin (kb. 60%) és a globulinok (35%). A vérplasmában különbözı fehérje bomlástermékek, zsírok, lipoidok (koleszterin), cukor, tejsav, különbözı hormonok, véralkohol, oxigén és széndioxid is található. A fibrinogén a véralvadásban játszik fontos szerepet. Az albumin viszonylag kis molekulasúlyú fehérje, a vér ozmotikus koncentrációjának fenntartásában, illetve tartalék fehérjeként jelentıs. A globulinok (α, β és γ) a szervezet védekezésében fontosak. Termelıdésük fokozódásával a szervezet védekezı képessége megnı a fertızı betegségekkel szemben. A vér alakos elemei a vértérfogat 45%-át adják. A sejtes elemek és a vérplasma aránya a hematokrit érték, ami férfiakban 42-47%, nıkben %. Vörösvértest (erythrocyta). Emlısökben magvatlan sejtek, innen van a vörösvértest elnevezés. A vörösvérsejtetképzés a vöröcsontvelıben történik, melynek intenzitását egy a vesében termelıdı hormon, az erythropoetin szabályozza. A hormon oxigényhiány (hypoxia) hatására termelıdik, s a véráram útján jut el a vöröscsontvelıbe. A vörösvértestek mérete kb. 7 µm. Számuk férfiakban 5,0-5,5 millió/mm 3, nıkben 4,5-4,8 millió/mm 3. A normál értéknél alacsonyabb vörösvértest szám esetén vérszegénységrıl beszélünk. Fehérvérsejtek (leukocyták). Festékanyagot nem tartalmazó, mindig magvas sejtek. Számuk 1 mm 3 vérben Felosztásuk történhet annak alapján, hogy a sejtek plasmájában található-e szemcse (granulum) vagy sem. Ennek alapján a fehérvérsejtek lehetnek szemcsézetlen plasmájú agranulocyták, és szemcséket tartalmazó granulocyták. Az agranulocyták további két alcsoportra, a lymphocytákra és a monocytákra oszthatók. Vérlemezkék (thrombocyták). Magvatlan 2-4 µm nagyságú tojásdad formájú plasmatörmelékek. Számuk: /mm 3. Élettartamuk 9-11 nap. Szerepük a véralvadásban van. A kísérletekhez szükséges vért, illetve hemolimfát a különbözı fajokból az alábbi módszerekkel nyerhetünk.

2 1.1. Vérvétel nyúlból Nyúlból legegyszerőbben a fül széli vénájából nyerhetünk vért. A véna fölött a bırt xilolba vagy toluolba mártott vattával bedörzsöljük, ezáltal az ér kitágul, jól kidomborodik. A tőt a fül hegye irányában a vénába vezetjük, óvatos szívással néhány ml vért nyerhetünk. Kisebb mennyiségő vért vehetünk olyan módon, hogy a vízszintesen tartott fül vénáját megszúrjuk, és a kifolyó vért Hagedorn pipettába szívjuk Vérvétel emberbıl (lsd. etikai szabályok emberre vonatkozó része) Kis mennyiségő vért legegyszerőbben ujjbegybıl vehetünk. A bal kéz középsı ujját zsíroldó, fertıtlenítı oldattal bedörzsöljük, majd annak elpárolgása után steril tővel 3-4 mm mélységig megszúrjuk. Az elsı vércseppet letöröljük, a továbbiakat használhatjuk kenetkészítéshez, vérsejtszámláláshoz, stb. Nagyobb mennyiségő vért a vena cubitibıl nyerhetünk. Ezt a mőveletet azonban csak megfelelı egészségügyi szakképesítéssel rendelkezı személy végezheti. A vér alvadását megakadályozhatjuk, ha a levett vért alvadásgátlóval (pl. 3.8 % Na-citráttal) 1 : 4 arányban keverjük. Vizsgálatok: 1. A vörösvérsejtek süllyedési sebességének mérése Anyagok és eszközök: Westergreen csı A vizsgálatot alvadásgátolt vérrel végezzük. Fecskendı segítségével az 1 : 4 arányú citrátos vért Westergreen pipettába (1. ábra) fecskendezzük a 0 jelig. (A pipetta 300 mm hosszú, a 0 jel a pipetta aljától 200 mm-re van.) A vért tartalmazó pipettát gumi alátét segítségével Westergreen állványba helyezzük. A vörösvérsejtek nagyobb fajsúlyuk miatt süllyedni kezdenek, így a véroszlop a fölötte lévı plazmától jól elkülöníthetı. A vörösvérsejtoszlop magasságát 1 és 2 óra múlva leolvassuk, és a 2 érték felének átlaga adja a vérsüllydést. 2

3 1. ábra: Westergreen állvány, Westergreen csövekkel A süllyedés normál értéke férfiakban 2-6 mm, nıkben 3-10 mm/óra. A plazmaglobulinok mennyiségének szaporodásával járó állapotok növelik a vérsejtsüllyedést (terhesség, akut és krónikus fertızés, daganatos megbetegedések), mert a globulinok a vörös vérsejtek felszínén adszorbeálódnak, és azok agglutinációját segítik elı. A süllyedési sebesség fokozódása az albumin/globulin arány megváltozását jelzi. A normális albumin% / globulin% fehérje kvóciens éertéke 1,5. 2. A vér fajsúlyának mérése Anyagok és eszközök: rézszulfát (CuSO4 Ms: 159,6g), desztillált víz, kémcsövek, szemcseppentı Az emberi vér, a plazma ill. a vérsejtek átlagos fajsúlya 1,0595, 1,0269 ill.1,0964 (SI: 1059, 1026 ill kg/m 3 ). A plazma fajsúlya a plazma fehérjetartalmától függ, a vér és a plazma fajsúlyviszonyából pedig a vér hemoglobin tartalmára lehet következtetni (lsd. a 2. ábra nomogrammját). Ezért a Phillips és munkatársai által kidolgozott, egyszerően végrehajtható fajsúlymeghatározási eljárásnak nagy gyakorlati jelentısége van. A módszer azon a jelenségen alapul, hogy ha fehérjetartalmú oldatot rézszulfát oldatba cseppentünk, a csepp felszínén réz-proteinát-réteg képzıdik, amely másodpercre megakadályozza a folyadékcserét a csepp belseje és az oldat között. Ha a csepp fajsúlya az oldatéval megegyezik, másodpercig lebeg. Ha 3

4 könnyebb felszáll, ha nehezebb lesüllyed. Az eljárás kivitelezéséhez réz-szulfátoldatsorozatot készítünk, és megkeressük azt az ismert fajsúlyú oldatot, amelyben a vér ill. plazmacsepp lebeg. A rézszulfát oldatsorzatot 1,100 fajsúlyú törzsoldat hígításával készítjük. A törzsoldathoz 170 g kristályos rézszulfátot 1002 ml vízben oldunk fel. Az így kapott oldat fajsúlya 1,100, melyet piknométerrel leellenırizünk. Adott fajsúlyú oldatot úgy készítünk, hogy a törzsoldatból annyi ml-t mérünk be 10 ml-es kémcsıbe, hogy az a kívánt fajsúlyérték utolsó két számjegyénél 1-el kisebb legyen. Pl es fajsúlyú oldathoz 3,9 ml CuSO 4 oldatot mérünk ki, majd ezt desztillált vízzel 10 ml-re feltöltjük. A gyakorlat kivitelezése: az alvadásgátolt vért fecskendıbıl vagy szemcseppentıbıl kb. 1 cm magasságból az 1,060 fajsúlyú oldatba cseppentjük. Ha a csepp felszáll alacsonyabb, ha lesüllyed magasabb fajsúlyú oldattal folytatjuk a vizsgálódást, amíg meg nem találjuk azt az oldatot, amelyben a csepp lebeg. Ennek a fajsúlya megegyezik a vér fajsúlyával. Centrifugálás után ugyanezt az eljárást megismételjük a plazmával. Itt az 1,020 ill. az 1,030 fajsúlyú oldatokkal kezdjük az eljárást. 3. A szérum fehérjetartalmának meghatározása 3.1. Plazmafehérje meghatározás fajsúly alapján A fajsúly és fehérjetartalom közti összefüggést a 2. ábrán látható nomogrammból lehet leolvasni. 4

5 2. ábra: Nomogramm a vér fajsúlyának Phillips Van Slyke-féle meghatározásához meg: A plazma fehérjetartalma és a fajsúly összefüggését a következı egyenlet adja g % fehérje = (fajsúly 1,007) x k A k faktor értéke: A szérumfehérjék elválasztása elektroforézissel Az emberi plazmafehérjék mennyisége g/l. Ebbıl g/l az albuminok mennyisége. Régebben kisózással tudták az albumint a többi 5

6 plazmafehérjétıl, a globulin frakciótól elkülöníteni. Ma az egyszerőbb és gyorsabb elektroforézis módszerét használják, amellyel a plazmafehérjék albumin, és számos globulin frakcióra különíthetık. A módszer lényege, hogy a fehérjék elektromos térben töltésüknek megfelelıen elmozdulnak. A vándorlási sebességet az oldat ph-ja, valamint a fehérjék izoelektromos pontja határozza meg (3. ábra). Mennél nagyobb a kettı közti eltérés, annál gyorsabb a vándorlás. COOH NH 3 + kation anion 0 ph 14 COO- NH 2 3. ábra: A fehérjék amfoter karaktere A gyakorlatban az elválasztást ph 8,0 feletti pufferban végzik. Ilyenkor az alacsony izoelektromos pontú albumin vándorol a leggyorsabban az anód felé. A közel azonos izoelektromos pontú fehérjék közel azonos sebességgel vándorolnak, és közel azonos helyen sőrősödnek. Igy a globulinoknak négy frakciója különíthetı el, amelyeket görög betővel jelölünk. α 1, α 2, β és γ globulinok. 4. ábra: Festett elektroforetogramm Az elektroforézis történhet szabadon ill. oldatban, vagy sokkal gyakrabban, speciális hordozó segítségével. Ilyenkor a fehérjeoldatot hordozóra viszik, és 6

7 elektromos térben futtatják (4. ábra). Hordozóként használhatnak papírt, cellulózacetát membránt, poliakrilamid, agar- vagy keményítı gélt. Futtatás után a lemezt megfestik amidofekete 10B festékkel, vagy savanyú fuxinnal. Így a fehérjefrakciók jól elkülöníthetık egymástól. A festési eljárások denzitometriás ill. fotometriás méréssel kombinálva mennyiségi vizsgálatokra is felhasználhatók. A különbözı csíkok által kötött festék mennyisége arányos a zónákban található fehérjemennyiséggel. Az egyes fehérjefrakciók relatív koncentrációja az emberi szérumban: frakció régi egység SI egység albumin % g/l α 1 globulin 2,5-5 % 1,4-3,2 g/l α 2 globulin 7-13 % 4,2-7,7 g/l β globulin 8-14 % 5,6-8,8 g/l γ globulin % 9,1-14,7 g/l 5. A vörösvérsejtek ozmotikus viszonyainak vizsgálata Anyagok és eszközök: NaCl Ms: 58,44g, desztillált víz, dietil-éter, kémcsövek, fızıpoharak, fénymikroszkóp A vörösvérsejtek membránja féligáteresztı hártya, a víz és a benne oldott sók ionjai számára szabadon átjárható. A vérplazmánál nagyobb ozmotikus koncentrációjú (hiperozmotikus) oldatba helyezve vizet veszítenek, ezért zsugorodnak. A plazmánál hígabb, (hipozmotikus) oldatban a vízfelvétel miatt megduzzadnak, majd memránjuk felreped, és tartalmuk kifolyik. Ez a jelenség a vörösvérsejtek hemolízise. Hemolízis bekövetkezhet a membránt károsító anyagok pl. szerves oldószerek hatására is. A gyakorlat kivitelezése: Tegyünk egy csepp vért az alábbi oldatokba: 1. humán fiziológiás (0,9 %-os) NaCl oldat 2. 0,4 %-os NaCl oldat 3. desztillált víz 7

8 4. 3 %-os NaCl oldat 5. néhány csepp étert vagy benzint tartalmazó fiziológiás sóoldat Vizsgáljuk meg az oldatok színét, majd mikroszkóp segítségével a vérsejtek alakját. A fiziológiás sóoldatban változást nem tapasztalunk. A 0,4 %-os sóoldat színe a vérsejtek duzzadása miatt valamivel sötétebb lesz, a vérsejtek alakja gömbölyőre duzzad. A 3 %-os sóoldat a vérsejtek zsugorodása miatt valamelyest világosabb lesz, a vérsejtek alakja buzogányfejre emlékeztet. A desztillált víz és az étert vagy benzint tartalmazó oldat a vérsejtek hemolízise miatt átlátszó, lakkfesték jellegő vörös színt mutat. 6. A vörösvérsejtek ozmotikus rezisztenciájának meghatározása Anyagok és eszközök: NaCl Ms: 58,44g, desztillált víz, kémcsövek A vérplazma ozmotikus koncentrációjánál hígabb oldatban a vörösvérsejtek megduzzadnak, majd hemolizálnak. Minél hígabb oldatban következik be a hemolízis, annál nagyobb a vérsejtek ozmotikus rezisztenciája. Az ozmotikus rezisztenciát azzal a legkisebb NaCl koncentrációval jelöljük, amelynél a vörösvérsejtek még éppen nem hemolizálnak. Ez az érték a minimális rezisztencia. Az az oldatkoncentráció amelynél a hemolízis teljessé válik, a maximális rezisztencia értéke. Az elıbbi értéke egészséges embernél 0,46-0,42 %-os, az utóbbi 0,34-0,30 %-os NaCl oldatnak felel meg. A gyakorlat kivitelezése: Tíz kémcsıbe mérjünk 4-4 ml 0,70, 0,65, 0,60, 0,55, 0,50,0,45, 0,40, 0,35, 0,30, 0,25 és 0,20 %-os NaCl oldatot! Az oldatokat 1 %-os NaCl törzsoldat hígításával készítjük úgy, hogy sorba bemérünk 2,8, 2,6, 2,4, 2,2, 2,0, 1,8, 1,6, 1,4, 1,2 és 1,0 ml törzsoldatot, és azt desztillált vízzel 4 ml-re egészítjük ki. Ezután minden kémcsıbe 1-1 csepp vért cseppentünk, összerázzuk a kémcsövek tartalmát, majd két óra hosszat állni hagyjuk azokat. Ezalatt a vérsejtek leülepednek, és a felülúszó színtelen marad. Míg azokban a kémcsövekben amelyekben bekövetkezett a hemolízis, a folyadék pirosra festıdik. Kezdıdı hemolízis esetén a felülúszó sárgás színő. Ennek az oldatnak a koncentrációja adja meg a minimális rezisztencia értékét. Annak a kémcsınek a NaCl koncentrációja, amelyben üledék nem látható, és az oldat színe vörös, a maximális rezisztencia értékét adja meg. A vörösvérsejtmembrán anyagcserezavarok vagy genetikai okok miatt bekövetkezı károsodása mindkét ozmotikus értéket magasabb NaCl koncentráció felé tolja el. 8

9 7. A vér hemoglobin tartalmának meghatározása A hemoglobin koncentráció változásai összefüggenek a hematokrit, illetve vörösvérsejtszám változásaival. A hemoglobin koncentráció fokozódik a vörösvérsejtszám bármilyen okból történı növekedése, vagy a plazmavíz mennyiségének csökkenése esetén. Az anémiák bármelyik formája, illetve a plazmavíz térfogatának növekedése a hemoglobintartalom csökkenését vonja maga után. A vér hemoglobin tartalmának normál értékei: férfiban: g/l nıben: g/l 7.1. Hemoglobinmeghatározás fotometriás úton, Drabkin reagens segítségével Anyagok és eszközök: kálium ferricianid (K 3 Fe(CN 6 ) Ms: 422,4g, kálium-cianid KCN Ms: 66,11g, kálium-hidrogén-karbonát KHCO 3 Ms: 100,1g, desztillált víz, fotométer A vér teljes hemoglobin koncentrációja meghatározható, ha a vér teljes hemoglobin tartalmát kálium-ferricianid hozzáadásával methemoglobinná (hemiglobin) alakítjuk, majd káliumcianid hozzáadásával cián-hemoglobinná alakítjuk át, amelynek fényelnyelési maximuma 540 nm-en mérhetı. A Drabkin reagens összetétele: 0,2 g Kálium-ferricianid ( K 3 Fe(CN) 6 ) 0,05 g Kálium-cianid (KCN) 0,14 g Kálium-dihidrogén foszfát (KH 2 PO 4 ) v. kálium-hidrogén-karbonát (KHCO 3 ) desztillált vízzel 1000 ml-re kiegészítve Az oldatot ph 7 körüli értéken kell tartani. Savas közegben ugyanis HCN (ciánhidrogén) gáz szabadul fel, ami az egyik legerısebb méreg. A Drabkin oldat fényérzékeny, ezért sötét üvegben kell tárolni. Mivel a kálium-cianid erısen mérgezı, ügyeljünk arra, ne hogy fölszívjuk, vagy a bırünkre kerüljön. Pipettázni csak ballonnal szabad! A gyakorlat kivitelezése: Kémcsövekbe 5 ml Drabkin reagenst mérünk, majd 20 µl vért pipettázunk ismételt bemosással a reagenshez (a pipettára kívülrıl rátapadt vért letöröljük). Vakpróbaként az oldatot használjuk, vér nélkül. A vért tartalmazó mintát jól összerázzuk, majd 15 9

10 perc állás után 540 nm-en fotometráljuk. A hemoglobin koncentráció megállapítása pontosan ismert hemoglobin tartalmú, hasonlóan kezelt vér (standard vér) extinkciójával való összehasonlítás alapján történik. A standard vér hemoglobin tartalmának meghatározása történhet a vastartalom mérése, vagy az oxigénkapacitás meghatározása alapján. Kevésbé pontos, de tájékozódó vizsgálat céljára elfogadható, ha a standard oldat extinkcióját 0,4-nek vesszük,amely 149 g/l hemoglobintartalomnak felel meg. Ennek alapján a meghatározni kívánt vér hemoglobin tartalma a következı képlet segítségével számítható ki: E minta Hb. konc. g/l = x 149 ( g/l ) Estandard Hemoglobin koncentráció emelkedés csontvelıi erytropoesis hormon fokozódása (hypoxia, vörösvérsejt daganatos burjánzás), illetve plazmavíz csökkenés (exsiccosis) esetén történhet. Csökkenés különbözı anémiákban, illetve plazmavíz térfogat emelkedés során alakulhat ki. 8. A vér PH-jának meghatározása Anyagok és eszközök: ph-mérı, ph-papír, desztillált víz A gyakorlat kombinált üvegelektróddal vagy erre a célra használatos ph papírral történik (5. ábra). A ph-mérı készülék üvegelektródját desztillált vízzel alaposan lemossuk, a nedvességet szőrıpapírral leitatjuk. Az üvegelektródot ph 4-es oldatba merítjük, majd a készülék mutatóját ph 4 értékre állítjuk. Az oldatból kivéve desztillált vízzel alaposan lemossuk, majd a mőveletet ph 9-es oldattal is elvégezzük. A készülék kalibrálása után az elektródot a vizsgálni kívánt oldatba merítjük, majd a mért értéket leolvassuk. Használat befejeztével az üvegelektródot híg sósavba merítve tartjuk. 10

11 5. ábra: ph mérésére alkalmas digitális készülék, illetve hagyományos indikátor papír 11