(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA

Átírás

1 !HU000004T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 004 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E (22) A bejelentés napja: (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP A (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP B (1) Int. Cl.: C12N /06 (06.01) C12N /08 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 0006 PCT/EP 04/0009 () Elsõbbségi adatok: PCT/EP03/ WO (72) Feltalálók: KREMER, Bernd, Karl, Friedrich, 247 Kiel (DE); Fändrich, Fred, 24 Kiel (DE); Schulze, Maren, Wittenberger Passau (DE) (73) Jogosult: Blasticon Biotechnologische Forschung GmbH, 263 Kiel (DE) (74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Öntoleranciát indukáló autológ monocitaeredetû sejtek és azok alkalmazása gyógyászati készítményekben (7) Kivonat A találmány tárgyát monocitaeredetû sejtek képezik páciens megzavart öntoleranciájával kapcsolatos betegségek, különösen autoimmun betegségek és allergiák megelõzésére és/vagy kezelésére, és a sejteket tartalmazó gyógyászati készítmények. Ezek a sejtek autológok azon páciens vonatkozásában, akinek azokat beadják. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás autológ szabályozó T¹sejtek létrehozására és/vagy szaporítására. HU 004 T2 A leírás terjedelme 34 oldal (ezen belül 12 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

2 1 HU 004 T2 2 A találmány tárgyát monocitaeredetû autológ sejtek képezik, amelyek képesek immunológiai öntolerancia kiváltására páciensben. Ezeket a sejteket ezt követõen STIC -nek ( self-tolerance inducing cells ) nevezzük. A találmány tárgyát képezik továbbá STIC alkalmazása gyógyászati készítményekben megzavart öntoleranciával kapcsolatos betegségek, elõnyösen autoimmun betegségek és allergiák megelõzésére és/vagy kezelésére. A találmánnyal kapcsolatban az autológ kifejezés azt jelzi, hogy a STIC¹ek azon páciens vérébõl származó monocitákból származnak, akinek a STIC-eket beadjuk. Kimutattuk, hogy a találmány szerinti sejtek képesek szabályozó T¹sejtek (Treg cd4++ ) indukálására. A találmány tárgyát képezi tehát szabályozó T¹sejtek indukálása és/vagy in vitro elõállítása. Az immunrendszer védi a szervezetet a potenciálisan patogén antigénektõl, mint például mikroorganzimusoktól, míg normálisan nem reagál magának a szervezetnek az alkotóelemeivel; azaz az egészséges immunrendszer tolerálja a saját antigéneket. Megzavart öntolerancia akkor fordul elõ, amikor specifikus adaptív (szerzett) immunválasz alakul ki saját antigének ellen. Az idegen antigének elleni adaptív immunválasz normál következménye az antigénnek a szervezetbõl való kiürülése. Amikor az adaptív immunválasz saját antigének ellen alakul ki, azonban általában lehetetlen az immuneffektor mechanizmusok számára, hogy teljesen eliminálják az antigént, ily módon fenntartott válasz alakul ki. Ennek következménye az, hogy az immunitás effektor útvonalai krónikus gyulladásos szöveti sérülést okoznak, amely halálos is lehet (lásd Immuno Biology, The Immune System In Health and Betegség, kiad.: Garland Publishing, 01, 13. fejezet, old.). Az adaptív immunválaszok antigénspecifikus T¹ és/vagy B¹sejtek aktiválásával iniciálódnak, és úgy vélik, hogy az autoimmunitás is ugyanígy iniciálódik (Immuno Biology, mint fent, 01. old.). A találmány egy elõnyös megvalósítási módjának tárgya autoimmun betegségek kezelése és/vagy megelõzése STIC¹et tartalmazó gyógyászati készítmények alkalmazásával. Az autoimmun betegségek két fõ mintázatát lehet megkülönböztetni. Olyan betegségek, amelyekben az autoimmunitás megjelenése a szervezet specifikus szerveire korlátozódnak, szervspecifikus autoimmun betegségekként ismertek, míg a szisztémás autoimmun betegségekben a szervezet számos szövete érintett. A szervspecifikus autoimmun betegségek példái közé tartozik a Hashimoto-thyroiditis és Graves-betegség, amelyek elsõsorban a pajzsmirigyet érintik, és az I¹es típusú cukorbetegség, amely a hasnyálmirigyszigeteket érinti. A szisztémás autoimmun betegségek példái a szisztémás lupus erythematosus és az elsõdleges Sjogren-szindróma, amelyben olyan különbözõ szövetek, mint például a bõr, vesék és agy mindegyike érintett lehet (lásd Immuno Biology, mint fent, 03. old.). 4 0 Vannak olyan autoimmun betegségek, amelyekrõl elsõsorban azt gondolják, hogy a T¹sejtek közvetítik, például az inzulinfüggõ cukorbetegség, reumatoid arthritisz és sclerosis multiplex, míg más esetekben a sejtfelszíni vagy mátrix antigének elleni ellenanyagok kialakulása játszik domináns szerepet, mint például autoimmun hemolitikus anémia, autoimmun trombocitopenia purpura, Goodpasture-szindróma, pemphigus vulgaris vagy akut reumás láz; egy még másik csoport az immunkomplex betegségek, amelyekben a T¹sejtek és B¹sejtek egyaránt részt vesznek, mint például a kevert esszenciális cyroglobulinemia, szisztémás lupus erythematosus vagy reumatoid arthritisz (lásd Immuno Biology, mint fent, ábra az 02. oldalon). A találmány egy további megvalósítási módjának tárgya allergiák kezelése gyógyászati készítményekbe kiszerelt találmány szerinti STIC-ekkel. Újabban azt javasolták, hogy a szabályozó T¹sejtek fontos szerepet játszanak az immun-homeosztázis szabályozásában, azaz bármilyen fertõzõ vagy antigénfüggõ cél elleni szervezett immunválaszban, beleértve az öntoleranciát is, lásd Takeshi Takahashi és Shimon Sakaguchi, International Review of Cytology, 2, old. (03); Shimon Sakaguchi, Vox Sang 83, 1 3. old. (02), Kathryn J. Wood és Shimon Sakaguchi, Nature Reviews Immunology, old. (03). Amint Takahashi és mtsai. (mint fent, 1. oldal, kivonat) megállapítja, gyûlik a bizonyíték arra, hogy a önreaktív T¹sejtek T¹sejtek-közvetítette domináns szabályozása hozzájárul az immunológia öntolerancia fennmaradásához, és annak megváltozása vezethet az autoimmun betegségek kialakulásához. Az ilyen szabályozó T¹sejt-populációk elkülönítésére tett kísérletek feltárták, hogy a CD4 + -populációban található CD + sejtek a normális naiv állatokban beleértve az embereket is rendelkeznek a szabályozó aktivitással. A CD + plusz CD4 + szabályozó T¹sejteket a normális csecsemõmirigy termeli, mint a T¹sejtek funkcionálisan elkülöníthetõ alpopulációját. Ezek kritikus szerepet játszanak nemcsak az autoimmunitás megakadályozásában, de a különféle immunválaszok szabályozásában is. A T¹sejt-közvetített autoimmun betegségek mellett az immunrendszer B¹sejt-kompartmentje kiválthat autóagresszív betegségeket, amelyek a saját sejtek (beleértve a hízósejteket), szövetek és szervi szerkezetek elleni ellenanyagok termelõdésével kapcsolatosak. Jól ismert, hogy a B¹sejt aktiválása a T¹sejtes segítségtõl függ, oly módon, hogy a segítõ T¹sejtek stimulálják a klonális B¹sejt-expanziót a specifikus antigének prezentálása után. Az antigének fragmentált allergénekbõl származhatnak, és azután a T¹sejtekben kismolekulás peptidekké processzálódhatnak. Ezek azután MHC-függõ módon prezentálódhatnak az antigénspecifikus aktiválás érdekében. Az egyrészrõl allergiás betegségekhez vezetõ, másrészrõl megzavart öntoleranciát indukálni képes specifikus allergének (lásd fent) által okozott szabályozatlan vagy túlzott B¹sejt-aktiválás megakadályozása érdekében a szabályozó T¹sejtek képesek megzavarni 2

3 1 HU 004 T2 2 a T¹sejt-asszociált B¹sejt-aktiválódást, és megakadályozni a túlzott és szabályozatlan ellenanyag-termelést. Az autoimmun betegségekhez hasonlóan az allergiás betegségek tehát befolyásolhatók és szabályozhatók a szabályozó T¹sejtek (CD4 + /CD + T¹sejtek) mennyiségének növelésével. Közelebbrõl, EAE-ban ( experimental allergic encephalomyelitis ) szenvedõ egerekben kimutatták, hogy a betegség mérséklõdött néhány héttel azután, hogy CD4b T¹sejteket adtak be ezeknek az állatoknak, és hogy a kúra a betegség további indukálása elleni rezisztenciával jár együtt [Bach, J. F., Regulatory T Cells under Scrutiny, Nature Reviews Immunology 3: old. (03); Lando, Z. és mtsai., Effect of cyclophosphamide on suppressorcell activity in mice unresponsive to EAE, J. Immunol. 123: old. (1979)]. Ezek a hatások hasonlóak a NOD egerekben mutatótokhoz, amelyekben az autoimmun cukorbetegség lefolyása megállítható CD4 + -sejtek beadásával, ami az egerek további védelméhez vezet az autoimmun betegségek újbóli megjelenése ellen (Bach, J. F., mint fent). Az autoimmun reakciókkal együtt járó allergiás betegségek példái az összes nem saját fehérje, és a szervezetbe bejutó szerves és szervetlen anyagok által indukált allergiák minden típusa. Különösen fontosak ebben a vonatkozásban a pollen által indukált allergiák, mint például szénanátha, és allergének, mint például drogok, vegyszerek, vírusok, baktériumok, gombák, por, élelmiszer-komponensek, fémek, gázok, állati szervezetek komponensei, mint például bõr hámladék és szõr, és állati exkrétumok által indukált allergiák. Mindeddig nem voltak elérhetõk hatásos terápiás szerek a megzavart öntolerancia miatti betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére. A szervspecifikus autoimmun betegségek esetében általában szubsztitúciós kezelést, transzplantációt vagy gyulladásellenes szerekkel, mint például kortizonnal végzett tüneti kezelést alkalmaznak. A szisztémás autoimmun betegségek esetében gyakran immunszuppresszív szereket alkalmaznak kezelésként. Nyilvánvalóan ezek a terápiák sok szempontból problémásak, és súlyos mellékhatásokkal járnak. Úgy becsülik, hogy a populációnak akár %¹a is érintett az autoimmun betegségek által (Sakagushi, mint fent, 1. old., bal oldali oszlop). Tehát szükség van hatásos módozatokra a megzavart öntoleranciával együtt járó betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére, amelyek könnyen használhatók és amelyek nem járnak együtt az ilyen betegségek kezelésében eddig alkalmazott eljárásokkal és szerekkel kapcsolatos egészséget veszélyeztetõ mellékhatásokkal és magas költségekkel. Tehát a találmány alapját képezõ probléma javított módozatok biztosítása az öntoleranciával együtt járó betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére. A probléma megoldására gerincesekbõl, elõnyösen emlõsökbõl, elõnyösebben emberekbõl származó autológ monocitaeredetû öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) alkalmazását javasoljuk. Ezek a sejtek az alább ismertetett találmány szerinti eljárással nyerhetõk, 4 0 amely eljárás a szabályozó T¹limfociták (CD4 + /CD + T¹sejtek) mennyiségének növelésére képes módosított sejteket eredményez egy személy szervezetében. Megközelítõleg sejt/testtömeg¹kg (BW) beadása után ezek a sejtek alkalmasak a megzavart öntoleranciával együtt járó betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére. M. Lopez és mtsai. [European Cytokine Network,. kötet, 4. szám, old. (1994)] beszámolnak autológ vér monociták alkalmazásáról az autológ makrofágok számának növelésére, rák immunterápiás vizsgálatokban történõ újrainfúzióhoz. Az autológ makrofágok magas számának újrainfúziója jól tolerált volt, és nem figyelték meg a TNF-alfa, IL 6 vagy oldható CD 14 szintjének növekedését a páciensek plazmájában (413. oldal, bal oldali oszlop, 1. és 2. bekezdés). Az ábrák rövid ismertetése 1. ábra: GM 7 eredeti monocitikus sejtekhez való kötõdési kapacitásának áramlási citometriás meghatározása a sejtek találmány szerinti módosítása elõtt (bal oldali grafikon) és után (jobb oldali grafikon). Az x tengely mutatja a kötõdött sejtek számát. 2. ábra: CD14 + monociták kevert limfocita tenyészete B egyén (GM 7 : szürke oszlop; GM 7 + : fekete oszlop), válaszoló sejtek MHC-diszharmonikus A donorból, és B donorból származó besugárzott sejtekbõl a CD14 + /GM 7 + és CD14 + /GM 7 sejtek szuppresszor aktivitásának összehasonlítására. 3. ábra: A CD14 + -monociták és CD2 + -lymfociták és a TAIC-ként ható CD 14+/CD3 + -sejtek mennyiségének meghatározása a monocita frakcióban, annak meghatározására, hogy a sejtek tisztítása befolyásolja¹e a monociták dúsítását a tenyésztés kezdetekor az immunszuppresszív CD14 + /CD3 + -sejtek kialakulásakor. 4. ábra: PHA-stimulált limfociták (PhaLy) és TAIC ( Mo+Ly vagy Mo ) kevert limfocita tenyészete, elõinkubálva két kísérletben indolamin-2,3-dioxigenáz (IDO) inhibitorával (1 MT) az 1 MT-nek a TAIC szuppresszor aktivitására gyakorolt hatásának meghatározására.. ábra: GM 7-expresszió áramlási citometriás meghatározása páciensek vérében operáció után a TAIC injektálása után (bal oldali ábra) és elõtt (jobb oldali ábra), a TAIC-nak az in vivo GM 7-expresszióra gyakorolt hatásának meghatározására vérsejtekben. 6. ábra: Nátrium-dextrán-szulfáttal (DSS) indukált krónikus kolitiszben szenvedõ egerek vastagbélmetszeteinek H & E festése, amelyek egy kezeletlen 3. állatcsoport (6A/B. ábra), egy elsõ, STIC¹el a 3

4 1 HU 004 T2 2 DSS-kezelést követõ +1. napon kezelt állatcsoport (6C/D. ábra), egy negyedik, a +1. napon kontrollsejtekkel kezel állatcsoport (6E. ábra) és egy STIC¹el a +7. napon kezelt állat (6F. ábra) vastagbelének az állapotát illusztrálják. (2, nagyítás a 6A/C/E. ábrákon; nagyítás a 6B/D/F. ábrákon). 7. ábra: Nátrium-dextrán-szulfáttal (DSS) indukált krónikus kolitiszben szenvedõ egerek testtömegének változása egy háromhetes idõszakban a DSS-kezelés vége után. Az 1. csoport állatait ( ) STIC¹el kezeltük a +1. napon, a 2. csoport állatait ( ) STIC¹el kezeltük a +7. napon, a 3. csoport állatai ( ) kezeletlenek voltak, míg a 4. csoport állatait ( ) kontrollsejtekkel kezeltük a +1. napon. Az értékek csoportonként 7 egértõl kapott átlagértékek, a standard deviáció mindig ±% alatt van. 8. ábra: Nátrium-dextrán-szulfáttal (DSS) indukált krónikus kolitiszben szenvedõ egerek vastagbélmetszeteinek hisztokémiai értékelésének eredményei. Az 1. csoport állatait STIC¹el kezeltük a +1. napon, a 2. csoport állatait STIC¹el kezeltük a +7. napon, a 3. csoport állatai kezeletlenek voltak, míg a 4. csoport állatait kontrollsejtekkel kezeltük a +1. napon. (0 érték=egészséges nem feltûnõ lelet; 1 érték=minimális kolitisz; 2 érték=közepes kolitisz; 3 érték=súlyos kolitisz; és 4 érték=ulceratív kolitisz, a teljes nyálkahártya roncsolásával kísérve). 9. ábra: A krónikus kísérletes kolitisz CD62L + /CD4 + SCID transzfer modell egereinek testtömegváltozása az egerek tömegéhez viszonyítva 6 héttel a kísérlet kezdete után, amikor azok a sejtterápiát kapták. Az 1. csoport állatait ( ) STIC¹el kezeltük 6 hét után, a 2. csoport állatai ( ) nem voltak kezelve, és a 3. csoport állatait ( ) kontroll sejtekkel kezeltük 6 hét után. Az értékek csoportonként 6 egértõl kapott átlagértékek, a standard deviáció mindig ±% alatt van.. ábra: A vastagbél hosszának (A. ábra) és a lép tömegének (B. ábra) mérése STIC¹et kapó egerek (1. csoport); kezeletlen kontroll egerek (2. csoport) és kontroll sejteket kapó egerek (3. csoport) esetében a krónikus kísérletes kolitisz CD62L + /CD4 + SCID transzfer modelljében. Az értékek átlagértékek ±SEM. 11. ábra: A krónikus kísérletes kolitisz CD62L + /CD4 + SCID transzfer modell egerek hisztokémiailag festett vastagbélmetszeteinek értékelése hat héttel a 4 0 sejtek átvitele után. Az 1. csoport állatai STIC¹et kaptak, a 2. csoport állatai kezeletlenek voltak és nem kaptak sejtinjekciót, míg a 3. csoport állatai kontrollsejteket kaptak. Az értékek átlagértékek ±SEM. (0 érték=egészséges nem feltûnõ lelet; 1 érték=minimális kolitisz; 2 érték=közepes kolitisz; 3 érték=súlyos kolitisz; és 4 érték=ulceratív kolitisz, a teljes nyálkahártya roncsolásával kísérve). 12. ábra: A krónikus kísérletes kolitisz CD62L + /CD4 + SCID transzfer modell egerek vastagbélmetszeteinek H & E festése, amely a 2. csoport két kezeletlen állata (12A/B. ábra), a kontroll sejtekkel kezelt 3. csoport két állata (12C/D. ábra) és a STIC¹el kezelt 1. csoport két állata (12E/F) vastagbelének az állapotát illusztrálják. (0 nagyítás) A találmány összefoglalása A monocitaeredetû autológ öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) elõállítására szolgáló eljárás alapvetõ lépései az alábbiak: (a) monocitákat izolálunk azon páciens vérébõl, akinek a sejteket be kell adni; (b) a monocitákat megfelelõ tenyésztõ tápközegben szaporítjuk, amely növekedést segítõ szerként makrofág-kolóniastimuláló faktort (amelyet a leírásban ezentúl M¹CSF-nek nevezünk) tartalmaz; (c) a monocitákat ¹interferonnal (amelyet a leírásban ezentúl ¹IFN-nek nevezünk) stimuláljuk; és (d) a c) lépésben kialakult öntoleranciát indukáló sejteket kinyerjük a sejteknek a tenyésztõ tápközegtõl való elválasztásával. Hasonló eljárást ismertetnek a DE számú német szabadalmi bejelentésben és a WO 04/ számú nemzetközi közzétételi iratban. A fent említett korábbi szabadalmi bejelentésekben az elõállított sejteket transzplantátumelfogadást indukáló sejteknek (TAIC) nevezik. Azokat allogén donor szövet elfogadásának indukálására alkalmazzák a recipiensben. Nagy jelentõsége van annak, hogy a DE és PCT/EP03/071 bejelentésekben ismertetett TAIC¹ek a donor monocitáiból származnak, és a transzplantátum befogadásának érdekében adják be azokat a recipiensnek. Ez azt jelenti, hogy a TAIC¹ek allogének a TAIC¹el kezelendõ személy szempontjából. Ezzel szemben a jelen találmány az autológ kezelés koncepcióján alapszik; ez azt jelenti, hogy a megzavart öntoleranciától, különösen autoimmun betegségektõl és/vagy allergiáktól szenvedõ személyt öntoleranciát indukáló sejtekkel (STIC) kezeljük, amelyek autológ monocitákból származnak. Tehát, míg a TAIC és STIC egyaránt monocitákból származnak lényegében ugyanazon folyamat révén, a TAIC allogén a kezelt páciens szempontjából, míg a STIC autológ ebben a vonatkozásban. 4

5 1 HU 004 T A STIC elõállítására szolgáló eljárás vonatkozásában kimutatják, hogy a ¹IFN-sel történõ stimuláció döntõ lépést jelent (lásd a 2. példát). A találmány szerint a monocitaeredetû öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) kifejezés azt a sejt populációt jelenti, amelyet a fent ismertetett eljárás (d) lépésében nyerünk ki. Ez a sejtpopuláció a monocitákból származó sejtek mellett amelyek öntolerancia indukálására hatásosak limfocitákat is tartalmaz, lásd a 4. példát, valamint opcionálisan továbbá olyan sejteket is, amelyek a mononukleáris sejt frakcióból származnak, mint például granulociták. A monocitákból származó sejtek mennyisége a STIC-populációban elõnyösen 0 90%, elõnyösebben 70%, a teljes sejtszámra vonatkoztatva. A találmány szerinti értelemben a teljes sejtszám kifejezés alatt a kérdéses sejtpopulációban található élõ sejtek mennyiségét értjük. Ezt a mennyiséget a tripánkék festékkizárási módszerrel határozhatjuk meg, mivel ez a festék lehetõvé teszi az élõ sejtek optikai eszközökkel történõ megkülönböztetését a nem élõ sejtektõl. A STIC¹t általában 4 6 sejt per testtömegkilogram, elõnyösen sejt per testtömegkilogram mennyiségben alkalmazzuk öntolerancia indukálására. Az STIC beadását többször is végrehajthatjuk. A találmány szerinti STIC kockázatmentesnek bizonyult rosszindulatú daganatok kialakulása szempontjából, mind állati tesztekben, mind tenyészetben; ez egy olyan eredmény, amelytõl eltérõre semmiképpen sem lehetett számítani az eredeti monocitaeredetû sejtek természete miatt, amelyekbõl a találmány szerinti sejtek származnak. Amint alább részletesen ismertetjük, további optimalizált öntolerancia-indukáló tulajdonságú sejt-szubpopulációk izolálhatók a STIC-ben jelen lévõ sejtek frakciójából, amelyek monocitákból származnak. Az eredeti sejtek (monociták) ¹interferonnal történõ in vitro tenyésztését követõen STIC¹ek alakulnak ki, amelyek sejtek olyan szubpopulációját tartalmazzák, lásd a 3. példát, amelyek kötik a GM 7 monoklonális ellenanyagot, amelyet DSM ACC42 hibridóma sejtvonal expresszál. A GM 7 monoklonális ellenanyag egy IgG2a izotípusú immunglobulin ellenanyag, amely a kappa-izotípust mutatja. Ezen ellenanyag jellemzõ tulajdonsága az erõs kapacitása a találmány szerinti tenyésztõ körülmények között módosított monociták kötésére, mivel az eredeti monocitikus sejteket nem ismeri fel, azaz az ellenanyag kötõdése az eredeti sejtekhez nem megy végbe (lásd a 3. példát). Ezenfelül önkéntessel demonstráltuk, hogy a GM 7 nem köti a humán sejteket a perifériás vérben, lásd az. ábrát. Amint a WO 04/ számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetik, az ellenanyagot egérnek TAIC-kal (ami a STIC-nek felel meg) a szakember számára ismert eljárásokkal történõ immunizálásával állították elõ (Davis, W. C., Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols, kiad.: New York: Humana Press Inc. Totowa, 199). Azután hibridóma sejtvonalat állítottak elõ az ellenanyagot termelõ B¹sejtek és az egérbõl származó mielóma sejtek fuzionáltatásával. Ilyen sejtvonalak elõállítására alkalmazott eljárások ismertek a szakterületen [Davis, W. C., Methods in Molecular Biology: Monoclonal Antibody Protocols, kiad.: New York: Humana Press Inc. Totowa, (199) Kohlerr G. Milstein, C., Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 6, old. (197)]. A GM 7 ellenanyagot termelõ hibridóma sejtvonal letétbe lett helyezve a Budapesti Szerzõdés szerint a DSMZ-nél (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultur GmbH, Braunschweig, Germany) a DSM ACC42 letéti szám alatt. Az 1. ábrán bemutatjuk a GM 7 kötési kapacitását áramlási citometriával meghatározva monocitikus sejtekhez találmány szerinti in vitro módosítás után. Látható, hogy a mononukleáris sejtfrakcióból közvetlenül nyert CD14-pozitív monociták nem kötik a GM 7 ellenanyagot (a szürkén jelzett felhõ egybevág a nem jelzett ellenanyagkontrollal). Ezzel szemben az M¹CSF jelenlétében végzett tenyésztést és ¹IFN¹al történõ stimulálást követõen a monociták egy része olyan antigént expresszál, amelyet felismer a GM 7 monoklonális ellenanyag. A GM 7 monoklonális ellenanyagot K¹IgG 2a izotípusúnak jellemeztük. A találmány szerinti eljárás ennek megfelelõen változáshoz vezet a módosított monociták sejtmembránján az antigénexpresszió fenotípusos mintázatában (1. ábra). A GM 7 monoklonális ellenanyag specifikusan köti azt a sejtpopulációt, amely a találmány szerinti eljárással elõállított sejtek közül a leghatékonyabb öntolerancia-indukáló sejteket indukálják (lásd az. ábrát). Tehát a találmány egy elõnyös megvalósítási módjának tárgya ilyen STIC, amely képes a GM 7 ellenanyaghoz való kötõdésre. Ezeket a sejtek a továbbiakban STIC GM7 -nek nevezzük. A GM 7 ellenanyag tehát a találmány szerint egy rendkívül hatékony és könnyen kezelhetõ ágenst képvisel öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) szelektálására és tisztítására. Az ellenanyag révén lehetséges a találmány szerint homogén és nagyon hatékony STICpopuláció létrehozása. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a fent ismertetett találmány szerinti eljárás c) lépésben kialakult öntoleranciát indukáló sejtek, amelyek a GM 7 ellenanyaghoz kötõdõ antigént expresszálnak, akár közvetlenül kiszelektálhatók a tenyésztõ tápközegbõl a c) lépés után, vagy azokat a sejteknek a tenyésztõ tápközegtõl a fenti találmány szerinti eljárás d) lépése szerinti elválasztása után nyert sejtpopulációból szelektálhatók ki, a DSM ACC42 hibridóma sejtvonal által termelt GM 7 ellenanyaghoz való kötéssel. A találmány szerinti STIC¹ek kiszelektálásához az ellenanyagot érintkezésbe hozzuk a mintával olyan körülmények között, amely lehetõvé teszi az ellenanyag kötõdését a mintában jelen lévõ öntoleranciát indukáló sejtekhez. A kötési reakcióban keletkezõ reakciókomplexeket azt követõen elválasztjuk a mintától. Ebbõl a célból az ellenanyagot immobilizálhatjuk egy hordozóanyagra a mintával való érintkeztetés elõtt, például hozzáköthetjük kromatográfiás célra alkalmas mátrixhoz, vagy úgynevezett mágneses gyöngyökhöz. Ez az eljá-

6 1 HU 004 T rás lehetõvé teszi az öntoleranciát indukáló sejtek szelektálását és koncentrálását nagy térfogatú mintából. Az öntoleranciát indukáló sejtek kinyeréséhez az ellenanyag és az öntoleranciát indukáló sejtek közötti kötést megszüntetjük a reakciókomplexek mintából történõ izolálása után. Ezt a szakterületen ismert eljárásokkal hajthatjuk végre, mint például kompetitív leszorítással vagy sóoldatokkal végzett mosással. Megfelelõ eljárásokat ismertetnek például Utz U. és mtsai. [ Analysis of the T¹cell Receptor repertoire of human T¹cell leukémia virus type¹1 (HTLV 1) Tax-specific CD8+ Cytotoxic T Lymphocytes from patients with HTLV 1 associated disease: Evidence for the oligoclonal expansion, J. of Virology Feb. 1996, old.]. Ezenfelül a GM 7 monoklonális ellenanyag lehetõvé teszi a találmány szerinti monocitaeredetû öntoleranciát indukáló sejtek minõségi és mennyiségi meghatározását a páciens vérében és/vagy szöveti mintáiban in vitro. A reakciókomplexek kialakulását a mintában amely az öntoleranciát indukáló sejtek jelenlétét és adott esetben mennyiségét jelzik ismert eljárásokkal detektáljuk. A reakciókomplexek detektálásához ebben az esetben lehetséges a GM 7 ellenanyag kapcsolása ( jelölés ) például közvetlenül detektálható molekulához, amely például kovalensen van kötve az ellenanyaghoz. Megfelelõ detektálható molekulákat nagyszámban leírtak a molekuláris diagnosztika területén, közéjük tartoznak többek között fluoreszcens festékek, mint például fluoreszcein-izotiocianát vagy tetrametil-rodamin-- izotiocianát, lumineszcens festékek, radioaktívan jelzett molekulák és enzimek, mint például peroxidázok (vö.: Lottspeich, F., Zorbas, H., Bioanalytik, kiad.: Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg Berlin, 1998). Az ellenanyag detektálása függ a jelölésre választott molekulától. A találmány szerint a GM 7 ellenanyagot a fluoreszcein-izotiocianát (FITC) fluoreszcens molekulához kapcsoltuk oly módon, hogy az ellenanyag detektálását áramlási citometriával és/vagy fluoreszcens mikroszkópiával detektálhassuk. Ellenanyagok FITC¹el történõ jelölésére szolgáló eljárások ismertek a szakterületen dolgozó szakember számára. Más megoldásképpen a reakciókomplexet detektálhatjuk kétlépéses eljárásban is másodlagos ellenanyagok alkalmazásával. Ebben a vonatkozásban a GM 7 ellenanyagot egy további jelzett ellenanyaggal való reakcióval detektálhatjuk (vesd össze: Lottspeich, F., Zorbas, H., Bioanalytik, kiad.: Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998). Ez a kétlépéses detektálási eljárás számottevõen érzékenyebb, mint a találmány szerinti ellenanyag kötésének közvetlen jelölése, mivel számos jelzett másodlagos ellenanyag kötõdhet a GM 7 ellenanyaghoz (szignál-amplifikáció). A GM 7 ellenanyag ennek megfelelõen lehetõvé teszi a STIC detektálását a STIC¹el kezelt páciens perifériás vérében, például monitorozás formájában, ami alatt a perifériás vérben található sejtek számát specifikus idõközönként meghatározzuk. A szakember számára nyilvánvaló, hogy elõ lehet állítani monocitákból származó STIC elleni monoklonális ellenanyagokat nem humán gerincesekbõl is, különösen fõemlõsök és sertések találmány szerint módosított monocitáiból származók ellen. Ebben a vonatkozásban a megfelelõ gazdaállatok immunizálását és a megfelelõ hibridóma sejtvonal létrehozását a fent a humán eredetû STIC esetében ismertetett módon hajtjuk végre. A találmány egy különösen elõnyös megvalósítási módjának tárgya a találmány szerinti STIC egy alpopulációja, amely együtt expresszálja a sejtfelszínén a CD 3 és CD14 antigéneket. Ezeket a sejteket a továbbiakban STIC CD3+/CD14+ -nek nevezzük. Amint alább részletesebben ismertetjük, ezekrõl a sejtekrõl kimutattuk, hogy szabályozó T¹limfociták kialakulását indukálják. A CD3 és CD 14 felszíni antigéneket együtt expresszáló STIC-eket közvetlenül kiszelektálhatjuk a fent ismertetett találmány szerinti eljárás c) lépésében kialakult sejtek közül, vagy azokat a sejteknek a tenyésztõ tápközegtõl a fent említett találmány szerinti eljárás d) lépése szerinti elválasztása után szelektálhatjuk ki, vagy más megoldásképpen az STIC GM7 populációból szelektálhatjuk ki azokat. Ezenfelül a PCT/EP03/071 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésbeli TAIC¹ra hivatkozva kimutattuk, hogy a leírásban fent ismertetett eljárással elõállított sejtek erõsen expresszálják a Foxp3, CTLA4 és Integrin E 7 géneket (lásd például 6. példát, amely a PCT/EP03/071 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés 12. példájának felel meg). Ezzel szemben ezek a gének nem vagy csak kismértékben expresszálódnak az eredeti monocitákban. A Foxp3, CTLA4 és Integrin E 7 gének felülszabályozása tehát a STIC CD3+/CD14+ sejtek jellemzõje. Amint a 6. példában tárgyaljuk, a FoxP3, CTLA4 és Integrin E 7 markerek expresszióját korábban csak szabályozó T¹limfocitákon írták le. A felszínükön a CD4 és CD antigéneket expresszáló T¹limfociták szabályozó T¹limfociták egy alpopulációja, amelyek szuppresszor sejteknek is neveznek. A funkciójuk a szervezet immunválaszának a szuppresszálása. Közelebbrõl, a Foxp3¹at specifikus transzkripciós faktornak találták, amely a szabályozó T¹sejtek kialakulásának génszabályozásra szolgál, és amely specifikusan expresszálódik ezeken a sejtekben. A találmány szerint elõnyös, hogy a STIC CD3+/CD14+ -sejtek legalább 1 9, elõnyösebben legalább 9, és különösen elõnyös módon legalább 1 8 g Foxp3-RNS¹t expresszálnak per g totál-rns. A CTLA4¹t hasonlóképpen a szabályozó T¹limfociták, különösen CD4/CD-pozitív T¹limfociták szabályozó funkciója detektálásának markerének tekintik (lásd a 6. példában idézett szakirodalmat). A találmány szerint a STIC CD3+/CD14+ -sejteket elõnyösen legalább 7, elõnyösebben legalább 3 6 és különösen elõnyös módon legalább 6 g CTLA4-RNS¹t expresszálnak per g totál-rns. Az integrin E 7 ¹t amely az epitéliális kadherint ismeri fel nemrégiben Lehmann és mtsai. [PNAS 99, old. (02)] nagyon hatékony szabályozó T¹limfociták új markereként írták le, amely kölcsönhatásba lép az epitéliális környezettel. Az integrin 6

7 1 HU 004 T2 2 E 7 RNS expressziójának a STIC CD3+/CD14+ -sejtekben a találmány szerint elõnyösen legalább 1 12, elõnyösebben legalább 1 11, és különösen elõnyös módon legalább 1, és legelõnyösebben legalább 1 9 g mennyiségûnek kell lennie per 1 g totál- RNS. Amint a 6. példa táblázatában bemutatjuk, a találmány szerinti sejtek közvetlen együtt-tenyésztése limfocitákkal a szabályozó T¹limfociták, különösen a limfocita-populáció CD4 + /CD + sejtjei számának szignifikáns növekedéséhez vezet, a Foxp3, CTLA4 és Integrin E 7 gének erõs felülszabályozásával. A példa továbbá demonstrálja, hogy ez a hatás nem figyelhetõ meg, ha a találmány szerinti sejtek közvetetten vannak együtt tenyésztve limfocitákkal. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a szabályozó T¹limfociták kialakulásának és/vagy szaporításnak találmány szerinti sejtekkel való stimulálása részt vesz az öntolerancia ezen sejtek általi indukálásában. A 7. példa (amely a PCT/EP03/B71 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés 13. példájának felel meg) igazolja a találmány szerinti sejtek részvételének hipotézisét immunválasz szuppressziójának indukálásában, hivatkozva a PCT/EP03/071 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés TAIC-jára (lásd fent). Ebben a példában a recipiens állatokból származó limfocitákat inkubáltunk a megfelelõ donor állatból származó immunszuppresszív sejtekkel in vitro, A tolerancia indukálásához a donoreredetû TAIC¹al elõinkubált recipiensbõl származó limfocitákat injektáltunk az állatokba TAIC helyett. A donorspecifikus toleranciát növelni tudtuk ezen a módon, míg azokban az állatok, amelyeknek donoreredetû TAIC¹al nem elõinkubált recipiens limfocitákat adtunk be, nem alakult ki tolerancia. A találmány szerinti STIC¹et alkalmazhatjuk gyógyászati készítményként. A fent ismertetett találmány szerinti eljárás d) lépésében nyert sejteket közvetlenül alkalmazhatjuk. Az így kapott populációk teljes sejtszámának körülbelül 0%¹át limfociták és granulociták alkotják, amelyek az eredeti monocitaizolátumból erednek (mononukleáris sejtfrakció). Ezek a sejtek támogatják a találmány szerinti monocitaeredetû STIC kialakulását a tenyésztési lépésben (lásd a 4. példát); és nem zavarják az öntolerancia indukálását, ha a találmány szerinti STIC¹et gyógyászati készítményként alkalmazzuk. Azonban a találmány egy tovább elõnyös megvalósítási módja szerint a STIC GM7 és/vagy STIC CD3+/CD14+ szubpopulációkat izolálhatjuk a találmány szerinti eljárással (lásd fent) kapott STIC populáció összességébõl, és alkalmazhatjuk öntolerancia indukálásra. Tenyésztõ tápközegben (lásd a 2. példát), a STIC és/vagy a STIC GM7 és/vagy a STIC CD3+/CD14+ legalább 48 órán keresztül eltarthatók anélkül, hogy az öntoleranciát indukáló hatásukat elvesztenék. A gyógyászati készítményben való alkalmazásra a például humán AB0-kompatibilis szérumban (univerzálisan alkalmazható) felszuszpendált STIC és/vagy a STIC GM7 és/vagy STIC CD3+/CD14+ szubpopulációkat intravénásan vagy rövid transzfúzióval adhatjuk be. 4 0 Ebben a vonatkozásban gyógyászati készítmények tartalmazhatnak találmány szerinti STIC¹et kombinálva hagyományos gyulladásellenes ágensekkel és/vagy hagyományos immunszuppreszánsokkal, mint például szteroidok, elõnyösen kortizon, metotrexát, ciklofoszfamid, azatioprin, ¹amino-szalicilsav (¹ASA), TNF¹ ellenanyagok, ¹interferon és B¹sejt ellenanyagok, mint például Rituximab, szervspecifikus vagy szisztémás autoimmun betegségek kezelésére. Ezenfelül a találmány szerinti STIC¹et alkalmazhatjuk allergiák kezelésére kombinálva antihisztaminokkal, teofilinkészítményekkel, ¹mimetikumokkal, szteroidokkal, elõnyösen kortizonnal, és kromoglicinsavval. A találmány részletes leírása A találmány szerinti eljárás kiindulási sejtjei autológ vérmonociták, azaz azon páciens vérébõl származó monociták, akinek a találmány szerinti sejteket be kell adni. Elõnyösen az autológ monociták humán vérbõl származnak. A monocitákat bármilyen izolálási eljárással nyerhetjük, különösen leukaforézissel, vagy a teljes vér mononukleáris frakciójából ( buffy coat ). A leukaforézis különösen elõnyös. A leukaforézis általános kifejezés egy többlépéses eljárásra, kereskedelmi forgalomban beszerezhetõ aferézis készülék alkalmazásával, ahol humán pácienstõl teljes vért vesznek le, frakciókká választanak el, és a frakciókat, kivéve a mononukleáris sejtes frakciót, visszaadják a humán páciensnek. Ezt az eljárást például az EP B1 számú európai szabadalmi iratban tovább részletezett módon hajthatjuk végre. Más megoldásképpen a vért elõször elválaszthatjuk antikoagulánssal végzett szokásos kezelés után plazmára és fehér- és vörösvérsejtekre, a szakterületen ismert eljárások alkalmazásával, elõnyösen centrifugálással. A centrifugálás után a plazma a felülúszóban lesz jelen, és alatta van egy réteg, amely az összes fehérvérsejtet tartalmazza. Ezt réteget buffycoat -nak is nevezzük. Ez alatt van a vörösvérsejteket tartalmazó fázis (hematocrit). A találmány szerinti eljárás vonatkozásában a mononukleáris sejtfrakciót elõször izoláljuk, és elválasztjuk a monociták kinyeréséhez, például ismert eljárásokkal végzett centrifugálással. Egy elõnyös eljárási megvalósítási mód szerint a mononukleáris sejtfrakciót limfocita-elválasztási közegre (Ficoll Hypaque) visszük fel, és lecentrifugáljuk (lásd az 1. példát). Az 1. példa ismerteti a találmány egy elõnyös megvalósítási módját, ahol az eritrocitákat és elpusztult sejteket, amelyek esetleg még mindig a mononukleáris sejtfrakcióban találhatók, elválasztjuk centrifugálással, és a fehérvérsejtek, köztük a monociták izolátumként vannak jelen az elválasztási közegen. Azután a fehér fázist óvatosan lepipettázhatjuk, és a monociták izolátumban való dúsítására ismételten lecentrifugáljuk és megmossuk. Az eljárás folyamán a monociták a centrifugacsõ alján gyûlnek össze a limfociták egy részével. A találmány szerinti eljárás egy különösen elõnyös megvalósítási módjában a monocitákat tartalmazó izolátum elõállítására való körülményeket úgy szabályoz- 7

8 1 HU 004 T2 2 zuk, hogy az izolátum körülbelül 0% limfocitát tartalmazzon a monociták mellett, a teljes sejtszámra vonatkoztatva. Elõnyösen az izolátum körülbelül 0 90%, különösen elõnyös módon körülbelül 70% monocitát és körülbelül 0%, különösen elõnyös módon 0% limfocitát tartalmaz, mindegyiket a teljes sejtszámra vonatkoztatva, ahol a különbséget opcionálisan granulociták adják. Amint a 4. ábrán bemutatjuk, a nagyságrendileg %-ban a teljes sejtszámra vonatkoztatva jelen lévõ limfociták az eredeti monociták M¹CSF-sel és ¹interferonnal történõ tenyésztése folyamán szignifikánsan nagyobb mennyiségû CD3/CD14 duplán pozitív STIC kialakulásához vezet, mint amikor csak néhány limfocita (körülbelül %) van jelen (lásd a 3. ábrát). Megfelelõ mennyiségû STIC elõállításához elõször a monociták szaporításának lehetõvé tételére van szükség. Ebbõl a célból a monociták esetében alkalmas ismert tenyésztõ tápközeget alkalmazhatunk; azonban a tápközegnek tartalmaznia kell az M¹CSF növekedési faktort (makrofágkolónia-stimuláló faktor). Az M¹CSF¹et (más néven CSF¹1) monociták, fibroblasztok, limfociták és endotéliális sejtek termelik. Az M¹CSF koncentrációja tápközegben elõnyösen 2 g/l tápközeg, elõnyösebben 4 6 g/l és különösen elõnyös módon g/l. Elõnyösen a tenyésztõ tápközeg nem tartalmazza a granulocita-makrofág kolonia-stimuláló faktort (GMCSF), mert a STIC hozama csökkentett ezen faktor jelenlétében. Ezt követõen vagy egyidejûleg a sejteket ¹IFN¹el kell stimulálni, azaz azokat ¹IFN jelenlétében kell tenyészteni. A monociták ¹IFN¹el történõ stimulálása egy kezdeti szaporítási fázis után történik, amely 3 6 napig tart a növekedési faktort tartalmazó tenyésztõ tápközegben. Elõnyösen az M¹CSF jelenlétében végzett tenyésztés kezdete utáni 4. napon megkezdjük a ¹IFN stimulációt, és ezt a stimulációt folytatjuk elõnyösen órán keresztül, elõnyösebben 48 órán keresztül inkubálási körülmények között, azaz 37 C¹on és % CO 2 atmoszférában. A ¹IFN koncentrációja a tápközegben 0,1 ng/ml, elõnyösen 1 ng/ml és különösen elõnyösen ng/ml lehet. A ¹IFN stimulációt egyidejûleg kezdhetjük a monociták szaporításával a növekedési faktort tartalmazó tenyésztõ tápközegben. Azonban 3 6 napon keresztül tartó kezdeti szaporítási fázis utáni stimuláció elõnyös, amint fent jeleztük. A sejtek szaporítása és ¹IFN¹el történõ stimulációja összességében elõnyösen nem tart tovább, mint 8 nap. Mindenestre a ¹IFN kezelést úgy hajtjuk végre, hogy a szaporítási fázis után legalább 24 órán keresztül tartson, maximum 72 órán keresztül, elõnyösen 48 órán keresztül. A sejtek szaporítási és stimulációs periódusa következésképpen összesen elõnyösen 4 8 napig tart. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint a szaporítást és ¹interferon stimulációt a 2. példában ismertetett módon hajtjuk végre oly módon, hogy a monocitákat elõször a növekedési faktort tartalmazó 4 0 tenyésztõ tápközegben szaporítjuk, és a ¹IFN¹t hozzáadjuk a tenyésztõ tápközeghez 3 6 nappal késõbb, olyan mennyiségben, hogy a tápközeg 0,1 ng/ml, elõnyösen 1 ng/ml és különösen elõnyösen ng/ml koncentráció alakuljon ki. Elõnyösen a találmány szerinti eljárást olyan tenyésztõedényekben hajtjuk végre, amelyek felszínét elõzõleg magzati borjúszérummal (FCS) vagy elõnyösen humán AB0-kompatibilis szérummal vontuk be (lásd a 2. példát). Az FCS-sel történõ bevonás a tenyésztõedény felszínének FCS-sel való bevonásával történik az alkalmazást megelõzõen, amit egy néhány órás kölcsönhatási periódus követ, például 4 72 órán keresztül, elõnyösen 1248 órán keresztül és különösen 24 órán keresztül, és a felszínhez hozzá nem tapadt FCS megfelelõ módon történõ eltávolítása. A humán AB0-kompatibilis szérummal történõ bevonást ugyanilyen módon hajtjuk végre. A tenyésztési lépés alatt a sejtek leülepszenek a tenyésztõedény aljára körülbelül 24 óra elteltével. Az adhezív tulajdonságaik miatt a monociták és az eljárás alatt a monocitákból keletkezõ STIC¹ek hozzátapadnak a tenyésztõedény aljához. Ha, amint a 2. példában ismertetjük, a tenyésztõt tápközeget lecseréljük a tenyésztés folyamán, a felülúszót elõször óvatosan távolítjuk el, például pipettázással vagy dekantálással, és azt követõen friss tenyésztõ tápközeggel töltünk be. Elõnyösen azonban a fenékhez tapadt sejteket nem vagy csak óvatosan mossuk, oly módon, hogy a jelen lévõ limfocitákat ne távolítsuk el. A letapadt sejtek eltávolítását mechanikai úton végezhetjük, például éles sejtkaparóval vagy spatulával. A találmány szerinti eljárás egy elõnyös megvalósítási módja szerint azonban a sejtek teljes eltávolítását megfelelõ enzimmel, mint például tripszinnel történõ kezeléssel végezzük (lásd a 2. példát). A tripszin oldatot (0,1 0,0 g/l, elõnyösen 0,0 g/l) hagyjuk hatni a sejteken 2 percig 39 C¹on, elõnyösen 37 C¹on, % CO 2 jelenlétében. Az enzimaktivitást azután szokásos módon blokkoljuk, és a szabadon lebegõ STIC-eket szokásos módon centrifugálással kinyerjük. Azután azok alkalmasak azonnali alkalmazásra, opcionálisan felszuszpendálva megfelelõ közegben, például PBS-ben. Azonban azokat több napig is eltarthatjuk, különösen megközelítõleg 2¹3 napig, tápláló tápközegben (lásd a 23. példát), ahol ez a tároló tápközeg nem tartalmazza a növekedési faktort és a ¹interferont sem. A sejteket STIC-ként tárolhatjuk ilyen tápláló tápközegben legalább 48 órán keresztül. Hosszabb idõszakon keresztül történõ tároláshoz a sejteket mélyfagyaszthatjuk. Élõ sejtek mélyfagyasztására szolgáló protokollok ismertek a szakterületen, vö. Griffith M. és mtsai., ( Epithelial Cell Culture, Cornea, Methods of tissue engineering, szerk.: Atala A. és Lanza R. P., kiad.: Academic Press 02, 4. fejezet, old.). Egy elõnyös szuszpenziós közeg a találmány szerinti sejtek mélyfagyasztására AB0-kompatibilis szérum vagy FCS, mindkettõ kiegészítve DMSO-val. A találmány egy megvalósítási módja szerint a c) vagy d) lépésekben kinyert öntolerancia-indukáló sejte- 8

9 1 HU 004 T2 2 ket tovább tisztíthatjuk azokra a sejtekre, amelyek kötõdnek a GM 7 ellenanyaghoz, hogy STIC GM7 szubpopulációt nyerjünk. Az ilyen tisztításra szolgáló eljárásokat részletesen ismertetünk fentebb. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint olyan sejteket szelektálunk ki a STIC-populációból, amelyek együtt expresszálják a sejtfelszínükön a CD 3 és CD 14 antigéneket. Ilyen sejtek kiszelektálására alkalmas eljárások ismertek a szakterületen. Ilyen eljárások példái a Fluorescent-Activating Cell Sorting (FACS), az Immuno Magnetic Bead Sorting és a Magnetic Activated Cell Sorting (MACS), vagy az úgynevezett Rosetting Method [lásd Gmelig- Meyling F. és mtsai., Simplified procedure for the separation of human T¹ and non-t-cells, Vox Sang. 33, 8. old. (1977)]. A STIC CD3+/CD14+ STIC-szubpopuláció kiszelektálása közvetlenül a fent ismertetett találmány szerinti eljárás c) vagy d) lépése után történhet, vagy a STIC GM7 - szubpopulációból. Az utóbbi végrehajtási út azt jelenti, hogy a STIC CD3+/CD14+ sejtek lépésenkénti dúsítása történik. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint magukat a találmány szerinti STIC CD3+/CD14+ szubpopuláció sejtjeit alkalmazzuk autoimmun betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény elõállítására. Ilyen autoimmun betegségek példái: Reumatikus betegségek autoimmun jellemzõkkel, különösen reumatoid artritisz, SLE, Sjogrenbetegség, szkleroderma, dermatomiozitisz, polimiozitisz, Reiter-szindróma; cukorbetegség; a vér és véredények autoimmun betegségei, különösen autoimmun hemolitikus anémia (AIHA), autoimmun thrombocytopenic purpura (ITP), antifoszfolipíd ellenanyag szindróma, vaszkulitisz (polyarteritis nodosa csoport, Wegener-féle granulomatózis, hiperszenzitivitásos vaszkulitisz, óriássejtes arteritisz) szisztémás lupus erythematosus, kevert esszenciális cyroglobulinémia; a máj autoimmun betegségei, különösen autoimmun hepatititsz, elsõdleges biliáris cirrózis és elsõdleges szklerózisos kolangitisz; a pajzsmirigy autoimmun betegségei, különösen a Hashimoto-betegség, Graves-betegség; a központi idegrendszer autoimmun betegségei, különösen sclerosis multiplex, miaszténia grávisz; és bullózus bõrbetegségek, különösen pemphigus vulgaris, pemphigus vegetans, pemphigus foliaceus, Senear-Usher szindróma és Brazilian pemphigus. A STIC hasznosságát öntolerancia indukálására egerekben mutatjuk meg autoimmun betegségre hasonlító mesterségesen indukált kolitisz két modelljében (lásd a 8. és a 9. példát). Ezek a modellek a nátrium-dextrán-szulfát (DSS)- indukált krónikus kolitisz (8. példa) és a krónikus kolitisz CD62L + /CD4 + SCID transzfer modellje egerekben 4 0 (9. példa). Az egerekben mindkét modellben krónikus kolitisz alakul ki, olyan tünetekkel, amelyek hasonlítanak a humán colitis ulcerosára. Mindkét modellrendszerben a STIC¹ek beadása röviddel a betegség megjelenése után a kolitisz tipikus tüneteinek a szuppresszálásához vezet, összehasonlítva a kezeletlen állatokkal vagy olyan állatokkal, amelyeket STIC¹et nem tartalmazó kontroll sejtekkel kezeltünk (lásd a 8. és a 9. példát). Amint fent tárgyaltuk, a túlzott immunreakciók szerepet játszanak az allergiák kialakulásában is. Bach és mtsai. (mint fent) kimutatták, hogy CD4 + sejtek, amelyek CD4 + /CD + sejtek szubpopulációját tartalmazzák, enyhíthetik a kísérletes allergiás enkefalomielitisz (EAE) elõrehaladását. Mivel, amint a leírásban bemutatjuk, a STIC¹ek beadása a CD4 + /CD + T¹sejt-populáció növekedésének indukálását eredményezi, a sejtek hasznosak allergiák kezelésére is. Ily módon a találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint STIC¹et tartalmazó gyógyászati készítményeket alkalmazunk allergiák megelõzésére és/vagy kezelésére. Gyógyászati készítmények találmány szerinti élõ STIC-eket tartalmazhatnak, amelyeket a találmány szerinti eljárás d) lépésében nyerhetünk, felszuszpendálva gyógyászatilag elfogadható hordozóban, elõnyösen körülbelül sejt/ml, és elõnyösebben körülbelül 1 6 sejt/ml mennyiségben a készítményre vonatkoztatva. A találmány egy további elõnyös megvalósítási módja szerint magukat a találmány szerinti STIC GM7 szubpopuláció sejtjeit alkalmazzuk megzavart öntoleranciával kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény elõállítására. A találmány egy megvalósítási módja szerint ilyen gyógyászati készítmény találmány szerinti élõ STIC GM7 sejteket tartalmazhat, amelyek kötõdnek a GM 7 ellenanyaghoz, felszuszpendálva gyógyászati hordozóban, elõnyösen körülbelül sejt/ml, és elõnyösebben körülbelül 1 6 sejt/ml mennyiségben a készítményre vonatkoztatva. A találmány legelõnyösebben megvalósítási módja szerint az ilyen gyógyászati készítmény találmány szerinti élõ STIC CD3+/CD14+ sejteket tartalmazhat, amelyek együtt expresszálják a CD 3 és CD14 antigéneket, elõnyösen körülbelül 7 sejt/ml, és elõnyösebben körülbelül 6 sejt/ml mennyiségben a készítményre vonatkoztatva. A fent ismertetett gyógyászati készítmények a találmány szerinti sejteket fiziológiásan jól tolerált közegben felszuszpendálva tartalmazhatják. Megfelelõ közeg például a Ringer-oldat, fiziológiás sóoldat vagy % humán albuminoldat vagy hasonlók. A találmány szerinti STIC-eket tartalmazó gyógyászati készítményeket különbözõ utakon keresztül adhatjuk be a betegség által érintett testtájék(ok) függvényében. A találmány elõnyös megvalósítási módjaiban a gyógyászati készítményeket intravénásan, intraportálisan, szubkután, intradermálisan, intraperitoneálisan vagy intratekálisan adhatjuk be. A gyógyászati készít- 9

10 1 HU 004 T2 2 ményeket továbbá közvetlenül a specifikus szervbe, mint például a májba vagy izomba adhatjuk be, inhalálással vagy a testüregekbe. A hatóanyagként STIC¹et tartalmazó gyógyászati készítményeket alkalmazhatjuk autoimmun betegségek megelõzésére is, olyan esetekben, amikor ismert a betegség kialakulásáért felelõs gén. Ha egy személyt egy vagy több autoimmun betegséggel kapcsolatos gént hordozónak diagnosztizálunk, a betegség kialakulását megakadályozhatjuk monocitákból származó STIC beadásával az élet korai stádiumában. A találmány egy elõnyös megvalósítási módja szerint autológ STIC¹et tenyésztünk együtt autológ limfocitákkal és a gén által expresszált peptiddel. Ez a megfelelõ géntermékre specifikus autológ szabályozó T¹limfociták kialakulásához vezet. Ezeket a szabályozó T¹limfocitákat újra beadhatjuk a személynek, amint a 7. példában ismertetjük (amely megfelel a WO 04/ számú nemzetközi közzétételi irat 13. példájának). A találmány egy további megvalósítási módja szerint a STIC¹et alkalmazhatjuk olyan esetek megelõzésre is, ahol az autoimmun betegség szakaszosan fordul elõ, mint például reumatoid artritisz esetében. Ha a STIC¹et tartalmazó gyógyászati készítményt a betegség elsõ vagy egy következõ megjelenése után adjuk be, a további megjelenéseket megakadályozhatjuk. A találmány szerinti sejtkészítmények élõ STIC¹et tartalmazhatnak, amelyeket a találmány szerinti eljárás d) lépésében nyerünk. Más megoldásképpen a készítmények a STIC GM7 sejtek szubpopulációjába tartozó sejteket tartalmazhatnak, amelyek kötõdnek a GM 7 ellenanyaghoz, vagy STIC CD3+/CD14+ sejteket, amelyek együtt expresszálják a CD 3 és CD14 antigéneket a sejtfelszínükön. A készítmények a sejteket elõnyösen körülbelül legalább 1, elõnyösebben legalább és legelõnyösebben legalább 1 6 sejt/ml mennyiségben tartalmazhatják, folyékony hordozóközegben felszuszpendálva. A közeg lehet sejttenyésztõ tápközeg vagy a sejtek által jól tolerált transzport közeg, mint például % humán albumin oldat. Más megoldásképpen a készítményben található sejtek mélyfagyasztva lehetnek megfelelõ tárolóközegben, mint például RPMI 0% humán albumin oldattal és % DMSO-val. Végezetül a találmány tárgyát képezi olyan eljárás, ahol a találmány szerinti öntoleranciát indukáló sejteket (STIC, STIC GM7 vagy STIC CD3+/CD14+ ) autológ szabályozó T¹limfociták in vitro létrehozására vagy szaporítására alkalmazunk. Amint a 6. példában (amely a WO 04/ számú nemzetközi közzétételi irat 12. példájának felel meg) bemutatjuk, a STIC-nek megfelelõ TAIC közvetlen in vitro együtt-tenyésztése limfocitákkal szabályozó T¹limfociták, különösen CD4 + /CD + limfociták szignifikáns proliferációjához vezet. Tehát lehetséges szabályozó T¹limfociták, különösen CD4 + /CD + limfociták létrehozása és/vagy szaporítása egy személy monocitáiból származó STIC¹ek és autológ limfociták közvetlen együtt tenyésztésével. A találmány szerinti értelemben a közvetlen együtt tenyésztés azt jelenti, hogy a STIC-eket és limfocitákat 4 0 közvetlen fizikai kontaktusban tenyésztjük együtt ugyanabban a tápközegben, mint ahogyan az idézett 6. példában bemutatjuk. Ebben az eljárásban a tápközeg elõnyösen a megfelelõ sejteket, azaz STIC¹et és limfocitákat körülbelül azonos sejtszámmal tartalmazza, és mindegyik mennyisége elõnyösen legalább 1, elõnyösebben legalább legelõnyösebben legalább 1 6 sejt/ml folyékony hordozóközegben felszuszpendálva; a közeg sejttenyésztõ tápközeg vagy a sejtek által jól tolerált transzport közeg, mint például % humán albumin oldat lehet. Az együtt tenyésztést elõnyösen fiziológiás körülmények között végezzük, körülbelül 37 C¹on, például inkubátorban, elõnyösen körülbelül 3 napon keresztül, elõnyösebben 4 napon keresztül. A 7. példában (amely a WO 04/ számú nemzetközi közzétételi irat 13. példájának felel meg) kimutattuk, hogy a transzplantátum elfogadását nemcsak a donor monocitáiból létrehozott TAIC recipiensnek történõ beadásával indukálhatjuk, hanem recipiens limfocitáknak a recipiensnek történõ újrabeadásával is, amelyeket elõzõleg közvetlenül együtt tenyésztettünk in vitro donor monocitákból fent ismertetett módon elõállított TAIC¹al. Hasonlóképpen öntoleranciát indukálhatunk olyan autológ limfociták páciensnek történõ beadásával, amelyeket korábban közvetlenül együtt tenyésztettünk a páciens saját monocitáiból elõállított STIC¹el. A találmány egy további megvalósítási módja szerint tehát szabályozó T¹limfociták állíthatunk elõ in vitro akezelendõ személybõl származó limfocitákból, a személy limfociátinak közvetlen együtt tenyésztésével a személy monocitából származó STIC-ekkel. Az együtt tenyésztett limfociták visszaadása a recipiensnek öntolerancia indukáláshoz vezet, amint a 7. példában bemutatjuk. Az így elõállított szabályozó T¹limfocitákat FACS¹al izolálhatjuk, amint a leírásban ismertetjük (lásd fent), és gyógyászati készítményben alkalmazhatjuk megzavart öntoleranciával kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére, ahol a sejtek gyógyászatilag elfogadható hordozóban vannak felszuszpendálva, amint fent ismertettük. A találmányt a továbbiakban részletesebben ismertetjük példákon keresztül. Ha nem definiáljuk a példákban, az alábbi összetételû tápközegeket és anyagokat alkalmazzuk: 1. Penicillin/sztreptomicin oldat: 000 egység penicillin G nátriumsójaként és 00 pg sztreptomicin sztreptomicin-szulfát per ml fiziológiás nátrium-klorid-oldat (NaCl 0,8%) (Gibco katalógus szám: 1122). 2. Tripszin-EDTA 0, g tripszin és 0,2 g EDTA (4 Na)/l 3. RPMI 16 [1, folyékony (1187)] L¹Glutamint tartalmaz Az RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 16¹es közegek dúsított kiszerelések, amelyeket széles körben alkalmazhatunk emlõssejtek esetében.

11 HU 004 T2 Komponens Molekulatömeg Konc. (mg/l) Molaritás (nm) Szervetlen sók Kalcium-nitrát (Ca(NO3)2 4H2O) 236 0,00 0,424 Kálium-klorid (KCl) 7 0,00, Magnézium-szulfát (MgSO4) 1 48,84 0,7 Nátrium-klorid (NaCl) 8 00,00 3,44 Nátrium-bikarbonát (NaHCO3) 84 00,00 23,800 Nátrium-foszfát (Na2HPO4) ,00,63 További komponensek Glukóz ,00 11, Glutation, redukált 7 1,0 0,0032 Fenolvörös 398,00 0,01 Aminosavak L-Arginin 174 0,00 1, L-Aszparagin 132 0,00 0,379 L-Aszparaginsav 133,00 0,0 L-Cisztein-dihidroklorid 313 6,00 0,6 L-Glutaminsav 147,00 0,136 L-Glutamin 146 0,00 2,0 Glicin 7,00 0,133 L-Hisztidin,00 0,0967 L-Hidroxi-prolin 131,00 0,3 L-Izoleucin 131 0,00 0,382 L-Leucin 131 0,00 0,382 L-Lizin-hidroklorid 146,00 0,219 L-Metionin 149,00 0,1 L-Fenil-alanin 16,00 0,0909 L-Prolin 1,00 0,174 L-Szerin,00 0,286 L-Treonin 119,00 0,168 L-Triptofán 4,00 0,024 L-Tirozin-dinátrium, ¹dihidrát ,00 0,1 L-Valin 117,00 0,171 Vitaminok Biotin 244 0, 0,008 D-kalcium-pantotenát 477 0, 0,000 Kolin-klorid 1 3,00 0,0214 Fólsav 441 1,00 0,0022 i-inozitol 180,00 0,194 Niacinamid 122 1,00 0,0081 p-amino-benzesav (PABA) 137 1,00 0,0072 Piridoxin HCl 6 1,00 0,0048 Riboflavin 376 0, 0,000 Tiamin HCl 337 1,00 0,0029 B12-vitamin 1 0,00 0, Referencia: Moore G. E., és mtsai., J. A. M. A. 199, 19. old. (1967) 11

12 1 HU 004 T PBS (Dulbecco-féle foszfát-pufferelt sóoldat) vö. J. Exp. Med. 98, 167. old. (194): Komponens KCl 0,2 KH2PO4 0,2 NaCl 8,00 Na2PHO4 1,. Ficoll Hypaque: Limfocitaelválasztási közeg (szacharóz/epiklórohidrin-kopolimer Mg 0 000; sûrûség 1,077, nátrium-diatrizoáttal beállítva). 6. L¹Glutamin Folyadék: 29,2 mg/ml 7. Makrofág-kolóniastimuláló faktor (M¹CSF) Rekombináns humán M¹CSF E. coli-ból; monomer (18, kda) 1 aminosav-oldallánc, beleértve az N¹terminális metionint; 37 kda molekulatömegû homodimerként van jelen; (SIGMA katalógusszám: M 618) 8. ¹Interferon ( -IFN) Rekombináns humán ¹IFN E. coli-ból; kda fehérje, amely 143 aminosav-oldalláncot tartalmaz (CHEMICON katalógusszám: IF002) 9. Nátrium-dextrán-szulfát Sigma-Aldrich 313, só, molekulatömeg: kda 1. példa Monociták elválasztása teljes vérbõl A teljes vért két különbözõ módszerrel vettük le humán páciensektõl: a) Leukaforézis: a leukaforézist COBE Spectra aferézis rendszerrel (Gambro BCT, Lakewood, CO, USA) hajtottuk végre mononukleáris módban (MNZ) a gyártó utasításai szerint (COBE Spectra Version 4.7/.1/6.0/7.0). b) vér komponensek hagyományos elválasztása: 40 ml teljes vért összekevertünk háromkamrás zacskóban 63 ml stabilizátor oldattal, amely minden liter vízben 3,27 g citromsavat, 26,3 trinátrium-citrátot,, g dextrózt és 22,22 nátrium-dihidroxi-foszfátot tartalmazott, hogy elkerüljük a vér koagulációját és tápláljuk a sejteket. Az oldat ph¹ja,6,8 volt. A vér komponenseinek elválasztásához éles centrifugálást hajtottunk végre a véren 00 rpm¹el 7 percen keresztül C¹on. Ez a sejtes és nem sejtes komponensek három rétegbe való rétegzõdését eredményezte. A zacskónak az erre szolgáló összenyomó készülékben történõ alkalmazásával az eritrocitákat azután átnyomtuk az alsó zacskóba, a plazmát átnyomtuk a felsõ zacskóba, és az úgynevezett buffy-coat a középsõ zacskóban maradt és megközelítõleg 0 ml térfogatot tartalmazott. g/l 4 0 Mindkét eljárással a frissen kinyert 0 ml mennyiségû sejtfrakciót azután két ml¹es részre osztottuk, és ml Ficoll Hypaque elválasztóközegre rétegeztük, amelyet elõzõleg két 0 ml¹es Falcon-csõbe tettünk. Ezt a készítményt percen keresztül centrifugáltuk 00 rpm¹en fékezés nélkül. Azután a mononukleáris sejtfrakcióban még mindig jelen lévõ eritrociták és elpusztult sejtek a Ficool-fázis alatt voltak, míg a fehérvérsejtek, beleértve a monocitákat, el voltak szeparálódva a Ficoll¹on fehér középsõ fázisként. Ezt követõen a fehér középsõ fázist, beleértve a monocitákat, óvatosan eltávolítottuk pipettázással, és összekevertük ml foszfátpufferelt sóoldattal (PBS). Ezt azt azután háromszor lecentrifugáltuk percen keresztül 1800 rpm¹en fékezéssel, a felülúszót pipettázással eltávolítottuk mindegyik centrifugálási eljárás után, és friss PBS¹t adtunk. A centrifugacsõ (Falcon-csõ) alján összegyûlt sejtcsapadék tartalmazta a mononukleáris sejtfrakciót, azaz a monocitákat. c) A 8. és 9. egérkísérletekhez (amelyeket genetikailag azonos egerekkel végeztünk) szükséges monocitákat szingenikus donor egerek lépébõl nyertük. A lépeket kispórusú szitán nyomtuk át kis nyomással, és az így elválasztott sejteket újra elszuszpendáltuk PBSben. A felszuszpendált lépsejteket rárétegeztük ml Ficoll Hypaque-elválasztási közegre, amelyet elõzõleg 0 ml¹es Falcon-csövekbe tettünk. Az eljárást azután a fent ismertetettel azonos módon folytattuk. 2. példa A monociták szaporítása és módosítása A monociták tenyésztését és szaporítását az alábbi összetételû tenyésztõ tápközegben hajtottuk végre: RPMI 16 tápközeg Magzati borjúszérum (FCS), vagy alternatív megoldásként AB0-kompatibilis szérum Penicillin/Sztreptomicin oldat Teljes térfogat 4 ml 0 ml ml 00 ml A tenyésztõ tápközeg 2, pg/00 ml M¹CSF¹et tartalmazott. Az 1. példában izolált monocitákat felszuszpendáltuk 6 sejt mennyiséggel ml tenyésztõ tápközegben, és átvittük Petri-csészére (0 mm átmérõ). A Petri-csészét elõzõleg feltöltöttük tiszta inaktivált FCS-sel, és az FCS¹t leöntöttük 24 órával késõbb, annak érdekében, hogy ily módon FCS-sel bevont csészét nyerjünk. A Petri-csészét megfelelõ fedõvel befedtük, és 3 napig inkubátorban tartottuk 37 C¹on. A sejtek a Petri-csésze fenekére ülepedtek 24 óra elteltével. A második napon a felülúszót lepipettáztuk, és a Petri-csészét újra megtöltöttük ml friss tenyésztõ tápközeggel. A 4. napon 0 ng ¹interferon adtunk hozzá ml tenyésztõ tápközegben, és a csészét megint lefedtük és további 48 órán keresztül az inkubátorban tartottuk 37 C¹on. 12

13 1 HU 004 T2 2 Azután PBS-sel 1: arányban meghígított ml tripszinoldatot pipettáztunk a Petri-csészébe. A lefedett Petri-csészét percen keresztül az inkubátorban tartottuk 37 C¹on. Azután végrehajtottuk a Petri-csésze aljához tapadt sejtek elválasztását sejtkaparóval oly módon, hogy a sejtek nagyobb része (>90%) a felülúszóban lebegett. A teljes felülúszót ( ml tripszinoldat + ml tápközeg) lepipettáztuk, beleöntöttük egy 0 ml¹es Falconcsõbe, és percen keresztül centrifugáltuk 1800 rpm¹en. A felülúszót azután eldobtuk, és friss tenyésztõ tápközeget (mint fent) adtunk a csapadékhoz (a megmaradt sejtcsapadék), 1 ml tenyésztõ tápközeget adva 6 sejtenként. A sejtszám meghatározása a pontos dózis meghatározásához ismert eljárásokkal történt, vö. Hay R. J., Cell Quantification and Characterisation, Methods of Tissue Engineering, kiad.: Academic Press 02, 4. fejezet, 84. old. Ezt a sejtszuszpenziót lecentrifugáltuk (1800 rpm, perc, lásd fent), és a sejtcsapadékot vagy PBS-ben, vagy emberben történõ alkalmazásra NaCl-ban (fiziológiás) vettük fel. Ezt követõen az intravénás beadás közvetlenül vagy 48 órán belül történhet. Más megoldásképpen a centrifugálás és a tripszint tartalmazó felülúszó eldobása után FCS/DMSO¹t adtunk a sejtekhez fagyasztóközegként, és mélyfagyasztottuk ml térfogatban. A fagyasztóközeg 9% FCS¹t és % DMSO¹t tartalmazott. Mindegyik esetben megközelítõleg 6 sejtet 1 ml közegben vettünk fel, és az alábbi lépésekben hûtöttünk le: perc jégen; 2 óra C¹on elõhûtött Styropor dobozban; 24 óra 80 C Styropor-ban; A tárolás kis csövekben történt folyékony nitrogénben (N 2 ) 180 C¹on. Az 1. ábrán az eredeti monocitikus sejtek tenyésztése és ¹IFN stimulációja után nyert monociták antigénexpressziójának fenotípusos változásait mutatjuk be, áramlási citometriával meghatározva. Az eredeti monocitikus sejtek tenyésztése és ¹IFN stimulációja GM 7 szignifikánsan megnövekedett kötéséhez vezet a módosítás után (jobb oldali grafikon az 1. ábrán), összehasonlítva a módosítás elõtti sejtekkel (bal oldali grafikon az 1. ábrán). Az alábbi 3 7. példák a WO 04/ számú nemzetközi közzétételi iratból vannak átvéve. Ezek az ott feltárt transzplantátumelfogadást indukáló sejteket (TAIC) jellemzik. A PCT/EP03/071 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés szerinti TAIC és a jelen találmány szerinti öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) hasonlósága miatt (lásd fent) az ezen példákban bemutatott eredmények vonatkoznak a STIC-ekre is. Pontosabban, az alábbi 3 7. példák eredményei azt mutatják, hogy optimalizált szuppresszor-funkciójú sejtpopulációt izolálhatunk az eredeti monociták M¹CSF-sel való tenyésztésével és ¹IFN-stimulációjával nyert TAIC populációból a GM 7 monoklonális ellenanyag alkalmazása révén (3. példa); 4 0 hogy a monocitafrakcióban található limfocitáknak nagy hatása van a TAIC-ként hatásos CD14 + /CD3 + -sejtek keletkezésére (4. példa); hogy az 1¹metil-triptofán IDO-inhibitornak nincs hatása a TAIC szuppresszor-funkciójára (. példa); hogy az A¹donor TAIC-ának közvetlen in vitro együtt-tenyésztése a B¹donor limfocitáival indukálja a szabályozó T¹limfociták, azaz CD4 + /CD + - limfociták kialakulását (6. példa); és hogy a donor TAIC és a recipiens limfociták fizikai sejt-sejt kölcsönhatása in vivo indukálja olyan szabályozó T¹limfociták keletkezését, amelyek képesek a szerv-kilökõdés megakadályozására (7. példa). 3. példa A GM 7 ellenanyag kötõdése a TAIC-hoz A GM 7 monoklonális ellenanyagot egerek humán TAIC¹al történõ immunizálásával állították elõ, amelyet a PCT/EP03/071 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben ismertetett módon állítottak elõ. Az ellenanyagot termelõ hibridóma sejteket letétbe helyezték a Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen intézetnél a DSM ACC42 hozzáférési szám alatt. Az alább ismertetett eredmények azt demonstrálják, hogy az ellenanyag specifikusan kötõdik egy olyan antigénhez, amely csak olyan CD14 + sejteken expresszálódik, amelyeket alávetettek 6 napos ex situ módosításnak M¹CSF-sel és 2 napos stimulálásnak ¹IFN¹el a találmány szerint. Az 1. ábrán bemutatjuk a GM 7 kötési kapacitását áramlási citometriával meghatározva monocitikus sejtekhez in vitro módosítás után, azaz TAIC¹cá történõ transzformálás után. Látható, hogy a buffy-coat -ból közvetlenül nyert CD14-pozitív monociták nem kötik a GM 7 ellenanyagot (bal oldali kép; a szürke felhõ felel meg az ellenanyag kontrollnak). Ezzel szemben a monociták egy része olyan antigént expresszál az M¹CSF¹el történõ tenyésztés és ¹IFN¹el történõ stimulálás után, amelyet a GM 7 monoklonális ellenanyag felismer. A 2. példában ismertetett tenyésztés után az átalakult monociták körülbelül 80%¹a képes kötni a GM 7 monoklonális ellenanyagot (jobb oldali kép). Egy további kísérletben a CD14 + /GM 7 + sejtek szuppresszor aktivitását összehasonlítottuk CD14 + /GM 7 sejtekével kevert limfocita tenyészetben (MLC). Az MLC¹t az alábbi irodalmi helyen leírt módon hajtottuk végre: Kurnick, J. T., Cellular Assays, Diagnostic Immunopathology, szerk.: Colvin R. B., Bhan A. K., McCluskey, R. U., kiad.: Raven Press, New York, old. (1994). Ebben a példában a TAIC egy B személybõl származik. Amint a 2. ábrán bemutatjuk, szignifikáns különbség van a GM 7-pozitív és GM 7-negatív TAIC szuppresszor aktivitása között. Az M¹CSF¹el végzett 6 napos kezeléssel és a ¹IFN¹el végzett 2 napos stimulációval nyert TAIC populációnak csak a GM 7-pozitív frakciója mutat szignifikáns inhibíciós hatást az A személy válaszoló sejtjeinek T¹sejt proliferációs aktivitására a B személy sejtjeivel történõ stimuláció után. 13

14 1 HU 004 T példa Limfociták hatása CD3 + /CD14 + -sejtekre monocitatenyésztés folyamán A CD14 + /CD3 + -sejtek létrehozásakor a monocitafrakcióban jelen lévõ limfociták TAIC-ként való hatásosságát két különbözõ összeállítás összehasonlításával határoztuk meg. Az elsõ összeállításban (amelyet ezt követõen Mo -nak jelölünk) a monocita frakciót kezdetben az 1. példában ismertetett buffy-coat középsõ fázisából vettük. Amint a 2. példában ismertettük, a sejteket azután átvittük az M¹CSF¹el való tenyésztési lépésbe. A tenyésztés kezdetétõl számított egy órán belül a szövettenyésztõ flaska aljához tapadó monocitákat ötször megmostuk ml PBS-sel, és tenyészetben jelen lévõ limfociták mennyisége ily módon <%¹ra (4,8±2,4%) csökkent, míg az így kapott feldúsult monociták (CD14 + ) mennyisége 90% felett (92±,6%) volt. Az összeállításban lévõ további sejtkomponensek B¹limfociták és granulociták voltak. A második összeállításban (amelyet ezt követõen Mo+Ly -nek jelölünk) lévõ sejteket szintén az 1. példában ismertetett buffy-coat -ból származó monocitafrakcióként vettük le. Azonban a Mo összeállítástól eltérõen a szövettenyésztõ flaska aljához tapadó sejteket csak egyszer mostuk meg a tenyésztési fázis kezdetétõl számított 24 óra elteltével, amint a 2. példában ismertettük. Ennek eredményeképpen olyan sejtpopulációt kaptunk, amely 4±,3% CD14 + -monocitából és 23,±8,9% CD2 + -limfocitából állt. Csakúgy mint a Mo összeállításban, limfociták és granulociták szintén voltak ebben az összeállításban is. A megfelelõ sejttípusok mennyiségének meghatározását a teljes sejtpopuláción belül áramlási citometriával hajtottuk végre egyenként három kísérletben (lásd a 3. ábrát). Az eredményeket átlagértékként adjuk meg standard deviációval. Nem lehet meghatározni CD14 + /CD 3 + -sejteket sem a Mo összeállításban, sem a Mo+Ly összeállításban a tenyésztés kezdetekor (d 0=0. nap). Ötnapos tenyésztési periódus után a kísérletet leállítottuk, és a sejteket jellemeztük FACS-elemzéssel a sejteknek a szövettenyésztõ flaskák aljáról a 2. példában ismertetett módon történõ leválasztása után. Azt találtuk, hogy a CD14 + -sejtek relatív mennyisége csökken ezekben az összeállításokban, 92%-ról 42%¹ra a Mo összeállításban, és 4%-ról 28%¹ra a Mo+Ly összeállításban. Látszólag a limfociták gyorsabban proliferálódnak, mint a monociták. A limfociták relatív mennyisége a megnövekedett 4,8%-ról 69,8%¹ra a Mo összeállításban és 23,%-ról 0,6%¹ra a Mo+Ly összeállításban. A tenyésztés folyamán a TAIC-ként hatásos CD14 + /CD3 + - sejtek keletkeznek mindkét tenyészetben. Ebben a vonatkozásban fontos, a CD14 + /CD3 + -sejtek szignifikánsan nagyobb növekedését figyeljük meg a Mo+Ly összeállításban 32,0±,3% mennyiségben, ellentétben a Mo összeállítás csak 7,2±3,2% értékével. Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy a sejtek megtisztítása a monociták több mint 90% relatív mennyiségre történõ dúsításával a tenyésztés kezdetekor negatív hatással van az immunszuppresszív CD14 + /CD3 + -sejtek keletkezésére a TAIC-populációban, míg a az 1. és 2. példában ismertetett eljárás a CD14 + /CD3 + -sejtek szignifikánsan magasabb hozamához vezet.. példa Az 1¹methyl-triptofán IDO-inhibitor hatásának meghatározása a TAIC immunszuppresszor aktivitására Annak tisztázása érdekében, hogy az indolamin- 2,3-dioxigenáz (IDO) 1¹metil-triptofán (1¹MT) inhibitora befolyásolja¹e a Mo és Mo+Ly összeállításokban (lásd a 4. példát) létrehozott TAIC szuppresszor funkcióját, különféle kevert limfocita-tenyészeteket (MLC) hoztunk létre PHA-val (fitohemagglutinin) stimulált T¹sejtekkel 1¹MT jelenlétében és hiányában. Ezekben a kevert limfocita tenyészetekben limfocitát 2 g PHA-val átvittünk 96¹mérõhelyes lemezek mérõhelyeire, amit 144 órás proliferációs periódus követett (amit PhaLy jelöl). A csak tápközegben PHA nélkül tenyésztett limfociták jelentették a további kontrollt (Amit Ly jelöl). A különbözõ tenyészetekben található PHA-stimulált limfociták meghatározása érdekében az alábbi 4 összeállítást futtattuk és vizsgáltuk meg: PhaLy+ Mo+Ly PHA-stimulált limfociták és TAIC ( sejt a 4. példa szerinti Mo+Ly összeállításból). PhaLy+ Mo+Ly +1-MT PHA-stimulált limfociták és TAIC 2 mol 1¹MT jelenlétében ( sejt a 4. példa szerinti Mo+Ly összeállításból). PhaLy+ Mo PHA-stimulált limfociták és TAIC ( sejt a 4. példa szerinti Mo összeállításból). PhaLy+ Mo +1-MT PHA-stimulált limfociták és TAIC 2 mol 1¹MT jelenlétében [ sejt a 4. példa szerinti Mo összeállításból]. 144 órás tenyésztés után az összes kontrollt és tenyészetet tovább tenyésztettük 24 órán keresztül 3 [H]- timidin jelenlétében ( pulzáltuk ), és azután meghatároztuk a beépült radioaktívan jelzett timidin mennyiségét beütésszámként (cpm), lásd a 4. ábrát. Ebben az elrendezésben a meghatározott radioaktivitás mennyisége a DNS¹be beépült jelzett timidin mennyiségének a mértéke, és ezáltal a limfociták proliferációs sebességének a mértéke. A 4. ábrán bemutatott értékek megfelelnek három kísérlet három meghatározása átlagértékeinek, mindenhol a standard deviáció jelzésével. Az eredmények az demonstrálták, hogy a PHA-val nem stimulált limfociták ( Ly ) nem proliferálnak szignifikánsan, az átlagos megfigyelt radioaktivitás 367 cpm (lásd a 4. ábrát). Ezzel szemben a 2 g PHA-val végzett stimuláció szignifikáns növekedéshez vezet a limfociták ( PhaLy ) proliferációjában, a legmagasabb 14

15 1 HU 004 T2 2 mért beépülés átlagos értéke 1849 cpm ezekben a mintákban. A TAIC hozzáadása a limfocitatenyészetekhez egyértelmûen csökkentette a proliferáció sebességét, erõsen, ha a 4. példa Mo+Ly összeállításából való sejteket adtunk (PhaLy+ Mo+Ly, meghatározott érték 1498 cpm), és kevésbé erõsen, amikor a 4. példa Mo összeállításából való sejteket adtunk (PhaLy+ Mo, mért érték 3369 cpm). A2 mol 1¹metil-triptofán (1¹MT) Mo+Ly és Mo stimulált limfocitákat tartalmazó összeállításokhoz való hozzáadása után kapott eredmények azt demonstrálták, hogy az 1¹metil-triptofán (1¹MT) szinergisztikusan növeli a TAIC szuppresszor funkcióját, miáltal a csökkenés erõsebb volt a Mo+Ly összeállításból való TAIC¹al (mért érték 267 cpm), mint a Mo összeállításból való TAIC¹al (mért érték 390 cpm). 6. példa Humán TAIC in vitro együtt tenyésztése allogén limfocitákkal szabályozó T¹limfociták létrehozására Annak vizsgálatára, hogy a TAIC indukálja¹e szabályozó T¹limfociták, azaz CD4/CD + -limfociták kialakulását a recipiensben, TAIC és limfociták számos különbözõ in vitro tenyészetét futtattuk le, és elemeztük az azokból keletkezõ szabályozó T¹limfociták létrejöttét. Ebbõl a célból A jelû donorból származó TAIC¹ot közvetlenül vagy közvetetten in vitro együtt tenyésztettünk B jelû donorból való limfocitákkal. A közvetlen együtt tenyésztésben a TAIC (az A jelû donoré) és a limfociták (a B jelû donoré) közvetlen sejt-sejt érintkezését tettük lehetõvé, míg a közvetett együtt tenyésztésben egy membrán ( sejttenyészet inszert, 0,4 m pórusméret, Falcon, rendelési szám: 90) lehetõvé tette a tápközeg kicserélõdését, de gátolta a két sejtpopuláció fizikai érintkezését. A közvetlen vagy közvetett együtt tenyésztést elõnyösen 3, elõnyösebben 4 napon keresztül hajtottuk végre inkubátor körülmények között, azaz 37 C¹on és % CO 2 atmoszférában. A tenyésztés után meghatároztuk a szabályozó T¹sejtek (CD4 + /CD + ) számát mindkét összeállításban, valamint a kontrollokban, ahol a TAIC vagy a limfociták önmagukban voltak tenyésztve. Ezenfelül abban a kontroll összeállításban, ahol a TAIC volt önmagában tenyésztve, meghatároztuk a CD3 + /CD14 + -sejtek számát, amelyek a legszignifikánsabb szuppresszor funkciójú komponensét képviselik a TAIC sejtpopulációnak a kevert limfocitatenyészetben. Mindegyik összeállításban meghatároztuk a sejtek felszíni antigénjeit FACS elemzéssel, és elemeztük az adott sejtpopulációk mennyiségét az összes sejtmennyiségre vonatkoztatva. Ezenkívül PCR-rel meghatároztuk a szabályozó T¹sejtek által specifikusan expresszált 3 új fõgén (Foxp3, CTLA 4 és Integrin E 7 ) relatív expresszióját az adott sejtpopulációkban (lásd a táblázatot). A foxp3 egy specifikus transzkripciós faktor, amelyet a szabályozó T¹sejtek fejlõdése szabályozó génjének tekintenek, és amelyet specifikusan expresszálnak ezek a sejtek [lásd Hori, S. és mtsai., Control of Regulatory 4 0 T¹cell Development by the Transcription Factor Foxp3, Science 229, old. (03)]. A CTLA 4 egy további faktor, amelyet a CD4 + /CD + -T-sejtek szabályozó funkciója meghatározásának markereként alkalmaznak [lásd Khattri, R. és mtsai., An essential role for Scurfin in CD4 + /CD + T regulatory cells, Nature Immunology, online közlemény, doi:,38/ni909 (03); Shimizu, J. és mtsai., Stimulation of CD + /CD4 + regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance, Nature Immunology, online közlemény, doi:,38/ni79 (03); Cobbold, S. P. és mtsai., Regulatory T cells in the induction and maintenance of peripheral transplantation tolerance, Transpl. Int. 16(2), old. (03)]. Az integrin E 7 egy integrin, amely kötõdik az epitéliális katherinhez, és amely alkalmazható a szabályozó CD + -T-sejtek leghatásosabb szubpopulációjának markereként [lásd Lehmann, J. és mtsai., Expression of the integrin E 7 identifies unique subsets of CD + as well as CD regulatory T cells, PNAS 99(), old. (02)]. A Foxp3¹, CTLA 4 és integrin E 7 -expresszió meghatározását kvantitatív PCR-rel hajtottuk végre GAPDH és ¹actin, két housekeeping gén kontrollként való alkalmazásával; a meghatározott értékeket egyrészrõl egymáshoz viszonyítottuk, a CD14 + /CD3 sejtek esetében kapott értéket 1¹nek tekintve; másrészrõl az abszolút RNS mennyiségeket g per össz- RNS-ként adtuk meg, annak érdekében, hogy a TAIC által in vitro kiváltott szuppresszió mért értékét és a kétszeresen pozitív CD4 + /CD + sejtek kialakulását korreláljuk a megfelelõ gének expressziós arányával. A kvantitatív PCR-hez szokásos eljárásokat alkalmaztunk, amelyek ismertek a szakember számára (lásd Lottspeich, F., Zorbas, H., Bioanalytika, kiad.: Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998). A táblázat azt mutatja, hogy a közvetlen együtt tenyésztésben nyert limfociták populációjában a kétszeresen pozitív CD4 + /CD + sejtek százaléka sokszorosára növekszik 8,7% értékig, összehasonítva a közvetett együtt tenyésztésben nyert CD4 + /CD + limfociták vagy a kontroll mennyiségével, amely közel azonos, sorrendben 2,38% és 2,6%. A CD4 + /CD + sejtek szubpopulációja expresszálja a legmagasabb relatív mennyiségû mrns¹t az összes tesztelt gének közül, összehasonlítva a CD4 + /CD + sejtekben kapott expresszióval (lásd a táblázatot). Míg a Foxp3 expressziója körülbelül egy ¹es faktorral emelkedett (37 versus 3,7), a CTLA 4 expressziója még magasabb maximális expressziót ér el (4699 versus 0,376). A harmadik fõ gén, a integrin E 7 expressziójának a növekedése a CD4 + /CD + sejtekben az együtt tenyésztés folyamán közel ugyanolyan magas, mint a CTLA 4¹é, mivel az integrin E 7 mrns abszolút mennyisége 1,4 9 ¹re emelkedik a CD4 + /CD + sejtekben, összehasonlítva a 3,4 12 g mrns/ g össz-rns értékkel a CD4 + /CD sejtekben.

16 1 HU 004 T2 2 Táblázat: A specifikus sejtpopulációk mennyiségének meghatározása a sejtek összes mennyiségében közvetlen és közvetett együtt tenyésztés után a sejtfelszíni CD 3, CD4, CD14, CD markerekre vonatkoztatva, és három gén (Foxp3, CTLA 4 és integrin E 7 ) relatív expressziójának és abszolút mennyiségének meghatározása ezekben a sejtpopulációkban. Kontroll Közvetlen együtttenyésztés Közvetett együtttenyésztés TAIC limfociták limfociták limfociták CD14 + / CD14 + / CD4 + / CD4 + / CD4 + / CD4 + / CD4 + / CD4 + / CD3 + CD3 CD + CD CD + CD CD + CD FACS (% pozitív sejtek) Relatív Foxp3-expresszió (PCR) Abszolút RNSmennyiség Foxp3 Relatív CTLA4-expresszió (PCR) Abszolút RNSmennyiség CTLA4 Abszolút RNAmennyiség Integrin E ,6,8 8,7 49 2,38 27, , 37 3,76 1, 1,6 8 3,2 4, ,2 8 1,2 9 3,2 9 4, ,37 0, ,376 6, 6,2 1,9,2 2,4 8 1,9 3,4 9 nem detektálható 1,4 9 3,4 12 A közvetett együtt-tenyésztés után a Foxp3-mRNS relatív mennyisége a CD4 + /CD + szubpopulációban csak, és még alacsonyabb, mint a kontroll limfocitái által expresszált relatív mennyiség, amelyek relatív mennyiségû Foxp3-mRNS¹t expresszálnak. A kontroll limfocitái által expresszált CTLA 4- mrnas relatív mennyisége csak 0,37 a CD4 + /CD + -populációban és 0,1 a CD4 + /CD populációban. A CTLA 4 expressziója a TAIC CD14 + /CD3 + szubpopulációjában hasonló volt a Foxp3 expressziójához, és szintén szignifikánsan magasabb, mint az összes többi sejtpopuláció. Ebben a vonatkozásban megemlítendõ, hogy a CTLA 4 expresszió (12 00 relatív érték) sokszor több volt a CD14 + /CD3 + -szubpopulációban, mint a Foxp3- expresszió, amely 0 relatív értéket mutatott. Az integrin E 7 expressziója nem volt detektálható a TAIC CD14 + /CD3 szubpopulációjában, míg hasonlóan a két másik analizált gén expressziójához, az integrin expressziója a TAIC CD14 + /CD3 + -szubpopulációjában abszolút étekként mérve g RNS per g össz-rns a legmagasabb értéket érte el (3,4 9 g/ g össz RNS). A Foxp3, CTLA 4 és integrin E 7 limfocitamarkerek szignifikánsan megemelkedett expressziója összehasonlítva a normál limfocitákkal a monocitákból származó TAIC¹on teljességgel váratlan, és mindeddig nem figyelték azt meg monocitákon vagy monocitákból származó sejteken. Összefoglalva, ezen példa fent bemutatott eredményei a következõket demonstrálják: Ha valaki abból a 4 0 feltételezésbõl indul ki, hogy a Foxp3¹, CTLA 4¹, és integrin E 7 -expresszió szintje korrelál az adott sejt immunológiai szabályozó tulajdonságaival, itt demonstráltuk, hogy a TAIC CD 3 + /CD14 + szubpopulációjának szuppresszoraktivitása kapcsolatos a három gén magas szintû expressziójával. Ez még meglepõbb, amikor figyelembe vesszük, hogy ezeket a markereket mindmáig csak limfocitákon írták le, de sohasem monocitaeredetû sejteken. Azt is kimutattuk továbbá, hogy a TAIC közvetlen együtt-tenyésztése limfocitákkal szignifikánsan nagyobb mennyiségû CD4 + /CD + limfocitához vezet, összehasonlítva a közvetett együtt-tenyésztéssel és csak limfociták tenyésztésével. Ez alátámasztja azt a feltételezést, hogy in vivo (azaz páciensben) is kialakulnak szabályozó T¹limfociták a TAIC beadása után. Ezek az eredmények összhangban vannak a CD4 + /CD + limfociták ismert immunszabályozó funkciójával és azzal a ténnyel, hogy ezen sejtek Foxp3- CTLA 4- és integrin E 7 -mrms tartalma szignifikánsan magasabb, mint a közvetett együtt-tenyésztett limfocitákban vagy kontroll limfocitákban. 7. példa Transzplantátumtolerancia in vivo indukálása TAIC-al in vitro együtt-tenyésztett limfocitákkal A 6. példában bemutatott eredmények és konklúziókat megerõsítettük in vivo állatkísérletben. Ebben a példában kiválasztott beltenyésztett kombinációból való állatokat oltottunk be a recipiensbõl származó olyan limfocitákkal, amelyeket elõzõleg napon keresztül közvetlenül együtt-tenyésztettünk a donorból 16

17 1 HU 004 T2 2 származó TAIC¹al. Más állatokat a recipiensbõl származó olyan limfocitákkal oltottunk be, amelyek kontrollként egyedül voltak tenyésztve tápközegben. Azokban az állatokban, amelyek az allogén szívátültetés elõtt a recipienstõl származó autológ együtt-tenyésztett limfocitákat kaptak, donorspecifikus tolerancia alakult ki, míg a kontroll állatokban, amelyek naiv nem együtt-tenyésztett kontroll limfocitákat kaptak a recipiensbõl, a transzplantált szív akut módon kilökõdött 14 napon belül. Ezt mutatja a GM 7 expresszió áramlási citometriás meghatározása is a páciensek vérében az operáció után a TAIC¹al együtt-tenyésztett limfociták beadása elõtt (bal oldali ábra) és azután (jobb oldali ábra). A GM 7¹et megkötõ sejtek frakciója az injekció elõtti körülbelül 0,%-ról körülbelül 21%¹ra emelkedett az injekció után, jelezve a GM 7 kötésére képes szabályozó T¹sejtek kialakulását. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a fizikai sejt-sejt kölcsönhatás a donor TAIC és recipiens limfociták között szabályozó T¹sejtek keletkezését indukálja, amelyek önmagukban képesek módosítani a recipiens szingenikus immunrendszerét oly módon, hogy a potenciálisan alloreakív T¹sejtek szuppresszálódnak és ezáltal a szervkilökõdés meggátlódik. 8. példa Öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) alkalmazása nátrium-dextrán-szulfát (DSS)-indukált krónikus kolitisz kezelésére Kolitisz kémiailag kiváltható egerekben nátriumdextrán-szulfát orális beadásával az ivóvízen keresztül. Hét napos idõszakon keresztül történõ beadás akut kolitisz kialakulását eredményezi, és az ismételt beadás, amely DSS beadásának legalább négy ciklusát tartalmazza napos normál vízadagolással, krónikus kolitisz kialakulását eredményezi, amely hasonlít a humán colitis ulecerosára. Ez a rendszer jól be van állítva immunológiai és molekuláris vizsgálatokra [lásd például Herfarth, H. és mtsai., Nuclear factor ab activity and intestinal inflammation in dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis in mice is suppressed by gliotoxin, Clin. Exp. Immunol. 1, 9 6. old. (00); Egger, B és mtsai., Mice lacking transforming growth factor a have an increased susceptibility to dextran sulfate-induced colitis, Gastroenterology 113, old. (1997)], és a leírásban a STIC lehetõségének vizsgálatára alkalmazzuk a humán autoimmun colitis ulcerosa¹ra hasonlító DSS-indukált kolitisz krónikus verziójának kezelésére. Normál nõstény BALB/c egereket (egyenként g) tartottunk víz és szokásos táp korlátlan hozzáférésével. Az egerek négy ciklust kaptak % (w/v) nátriumdextrán-szulfátot tartalmazó vízbõl (DSS; ezt az oldatot a leírásban ezt követõen DSS víznek nevezzük), majd kezeletlen vizet a következõ rend szerint: elsõ ciklus: 1 7. nap DSS víz (7 nap); nap normál víz ( nap); második ciklus: nap DSS víz (7 nap); 34. nap normál víz ( nap); 4 0 harmadik ciklus: 41. nap DSS víz (7 nap); nap normál víz ( nap); és negyedik ciklus: 2 8. nap DSS víz (7 nap). Az 8. nap után az összes egér a krónikus kolitisz tüneteit mutatja, amely legalább két hónapig eltart (6A. és 6B. ábra). Az egereket ezután véletlenszerûen négy különbözõ csoportba osztottuk: 1. csoport (n=): a DSS vízzel történõ táplálás negyedik ciklusa vége utáni +1. napon (9. nap) az egerek 62, nemzetközi egységnyi heparint kaptak 0, ml PBS-ben intravénásan (a trombózis megakadályozására), majd másodperccel késõbb genetikailag azonos donor egérbõl származó 6 STIC¹et (lásd a 2. példát) intravénásan 1 ml PBS-ben. 2. csoport (n=7): a DSS vízzel történõ táplálás negyedik ciklusa vége utáni +7. napon (6, nap) az egerek nemzetközi egységnyi heparint kaptak ml PBSben intravénásan (a trombózis megakadályozására), majd másodperccel késõbb genetikailag azonos donor egérbõl származó 6 STIC¹et (lásd a 2. példát) intravénásan 1 ml PBS-ben. 3. csoport (n=12): elsõ kontrollcsoport, amely DSS kezelést kapott, de nem kapott semmilyen sejtinjekciót. 4. csoport (n=6): második, DSS vízzel kezelt kontroll csoport; a DSS vízzel történõ táplálás negyedik ciklusa vége utáni +1. napon (9. nap) az egerek 62, nemzetközi egységnyi heparint kaptak 0, ml PBS-ben intravénásan (a trombózis megakadályozására), majd másodperccel késõbb genetikailag azonos donor egérbõl származó 6 kontrollsejtet (lásd a 1. példát) intravénásan 1 ml PBSben (a kontrollsejtek csontvelõsejtek, perifériás vérsejtek és lépsejtek keveréke, amely a tenyésztés elõtti sejteket reprezentálják a STIC 2. példa szerinti elõállításához, azaz szingenikus egerek lépébõl nyert nem tenyésztett sejtek). Az összes egeret feláldoztuk a 79. napon, három héttel a DSS vízzel történõ táplálás befejezése után. A kísérlet folyamán hetente háromszor megmértük az állatok tömegét a DSS beadás során és az azt követõ három hétben. Az állatok testtömegének változását (tömeggyarapodás vagy ¹vesztés) százalékban fejezzük ki az egerek 9. napon mért tömegéhez viszonyítva, amikor a sejtterápiát kapták. Az % tartományba esõ változásokat tekintjük szignifikánsnak. Az egerek testtömegének változásait a DSS kezelés vége utáni három hétben a 7. ábrán mutatjuk be. 17

18 1 HU 004 T2 2 Amint látható, a STIC beadása a +1. napon (1. csoport= ) megfelelõ korfüggõ tömeggyarapodáshoz vezet, amely nem található meg sem a kezeletlen állatokban (3. csoport= sem a kontrollsejtekkel a +1. napon kezelt állatokban (4. csoport= ), sem a +7. napon STIC¹el kezelt állatokban (2. csoport= ) a betegség lefolyása alatt. Az értékek csoportonként 7 egértõl kapott átlagértékek, a standard deviáció mindig ±% alatt volt. Egy további kísérletben a vastagbélszövetet szövettanilag megfestettük Hematoxilin & Eozin (H & E) festéssel. AH&Efestést a Woods, A. E. és Ellis, R. C. (szerk.) ( Laboratory Histopathology: A Complete Reference, 1. & 2. kötet; kiad.: Churchill & Livingstone, 1994) irodalmi helyen ismertetett módon hajtottuk végre. A megfestett nyálkahártya állapotát két függetlenül dolgozó patológus értékelte, akik nem ismerték a kísérleti beállításokat, az alábbi séma szerint: 0¹ás érték, egészséges, nem feltûnõ lelet; 1¹es érték, minimális kolitisz; 2¹es érték, közepes kolitisz; 3¹as érték, súlyos kolitisz; és 4¹es érték, ulceratív kolitisz, együtt a teljes nyálkahártya elpusztításával. Az értékelés eredményeit a 8. ábrán mutatjuk be. Három héttel a DSS vízzel történõ táplálás negyedik ciklusának befejezése után a 3. csoportkontroll állataiban (nem volt sejt injekció) az átlagos érték körülbelül 4 volt, míg az 1. csoport (STIC beadása a +1. napon) vagy a 2. csoport állataiban (STIC beadása a +7. napon) szignifikánsan csökkent átlagos értékek voltak, sorrendben körülbelül 1 (1. csoport) és körülbelül 1, (2. csoport). A kontrollsejtekkel kezelt állatokban (4. csoport) az átlagos érték körülbelül 3 volt, ami majdnem olyan magas, mint a kezeletlen egereké (3. csoport). Ezek az eredmények összhangban vannak a megfestett vastagbélmetszetek szövettani értékelésével (H & E festés, lásd fentebb), amint a 6. ábrán látható. Ez az értékelés a legkritikusabb a STIC¹el végzett kezelés hatásosságának meghatározásában. A 6A. (2, nagyítás) 6B. ( nagyítás) ábrák a 3. csoport kezeletlen állatai vastagbelének az állapotát illusztrálják nagyrészt tönkretett nyálkahártyával és a körülvevõ szöveteket erõsen elárasztották a gyulladásos sejtek. Ezek az ábrák a kolitiszt elõrehaladott stádiumait mutatják. A kezeletlen állatok kolitiszének az elõrehaladásával (6A/B. ábra) ellentétben a nyálkahártya morfológiája nagymértékben megmaradt az 1. csoport állataiban, amelyek STIC¹et kaptak a +1. napon [6C. (2, nagyítás) és 6D. ( nagyítás) ábra]. A gyulladás és a nyálkahártya pusztulásának csak csekély jelei láthatók ezekben az állatokban, a környezõ szövetek elárasztása nélkül. A kontrollsejtekkel a +1. napon kezelt 4. csoport állatai (6E. ábra; 2, nagyítás) és egy STIC¹el a +7. napon kezelt 2. csoportbeli állat (6F. ábra; 2, nagyítás) vastagbélmetszetei egyaránt az elõrehaladott kolitisz tüneteit mutatják nagymértékben elpusztult nyálkahártyával és a környezõ szövetek gyulladásos sejtek általi erõs elárasztásával, hasonlóan a kezeletlen állatokhoz (6A/B. ábra). 4 0 A fenti kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a kolitisz indukálására beadott DSS kezelés vége utáni +1. napon beadott STIC képes szuppresszálni vagy egyértelmûen csökkenteni a kolitisz tüneteit. A STIC¹el kezelt állatokban nincs szignifikáns tömegvesztés (7. ábra), és a szövettani értékelésük szignifikánsan kisebb, mint a kezeletlen állatoké (8. ábra), és a vastagbél nyálkahártyájának általános állapota majdnem normális, amint vastagbélmetszetek szövettani festésébõl látható (6C/D. ábra). A +7. napon beadott STIC (2. csoport) nem képes a STIC beadása elõtti 7 napos idõszak alatt kialakult kolitisz kezelésére. Habár nem történik meg a kolitisz kialakulásának visszafordítása, a betegség elõrehaladása megáll, amint egy 2. csoportbeli állat alacsonyabb szövettani értékébõl látszik, összehasonlítva egy kezeletlen 3. csoportbeli állattal (8. ábra). Ez a jelenség specifikus a DSS-indukált kolitisz ezen példában alkalmazott modelljére, és nem lehet egyszerûen átvinni más körülményekre. A szingenikus egerek lépébõl nyert nem tenyésztett sejteket képviselõ csontvelõsejtek, perifériás vérsejtek és lépsejtek keveréke nem alkalmas kolitisz kezelésére, mivel az ezekkel a sejtekkel kezelt állatok (4. csoport) a kezeletlen állatokéhoz hasonlóan súlyos kolitisz tüneteit mutatják (6E/F.; 7. és 8. ábra). Ez egyértelmûen bizonyítja, hogy a STIC képes a kolitisz kezelésére, és nem az olyan sejtek, amelyek jelen vannak azon sejtek keverékében, amelyekbõl a STIC kialakul a tenyésztés folyamán. 9. példa Öntoleranciát indukáló sejtek (STIC) alkalmazása SCID egerekben CD4 + /CD62L + limfociták átvitelével indukált kolitisz kezelésére Kolitisz mesterséges indukálása SCID (súlyos kombinált immundeficiencia) egerekben egy másik megközelítési mód a STIC és azok autoimmun betegségek kezelésére való lehetõségének elemzésére. A SCID egerek nem tartalmaznak sem T¹, sem B¹sejteket. Az immunrendszerüket helyre lehet állítani pajzsmirigysejtek specifikus szubpopulációjának bevitelével. Ezek a sejtek, amelyeket CD4 + CD62L + vagy CD62L high sejteknek nevezünk, újra benépesítik az immunrendszert, de a szabályozás hiánya miatt krónikus gyulladással járó spontán kolitisz kialakulását is indukálják. Ezt a modell rendszer az úgynevezett krónikus kísérletes kolitisz CD62L + /CD4 + SCID transzfer modellje egérben [lásd például Mudter, J. és mtsai., A new model of chronic colitis in SCID mice induced by adoptive transfer of CD62L + CD4 + T cells: Insights into the regulatory role of interleukin¹6 on apoptosis, Pathobiology 70, old. (02)], amely lehetõvé teszi a kolitisz mint autoimmun betegség kialakulásában szerepet játszó sejtpopulációk specifikusabb elemzését. A leírásban ezt a modellt alkalmazzuk STIC lehetõségének vizsgálatára deregulált immunrendszer által indukált kolitisz kezelésére. Ez a modell mechanisztikusabb vizsgálatokat tesz lehetõvé, de gyengébb rendszernek tartják, mint a DSS modell rendszert (lásd a 18

19 1 HU 004 T2 2 fenti 8. példát), mert az immunrendszer nem népesedik be teljesen. SCID BALB/c egerek (egyenként g) intraperitoneális injekciót kaptak 1 6 CD4 + /CD62L-selectin - high T¹sejtekkel PBS-ben, amelyeket normál BALB/c egerek lépébõl izoláltunk a Macs mágneses gyöngy szortírozó rendszer (Milteny Biotechy Germany) alkalmazásával. Az egereket vízhez és szokásos táphoz való korlátlan hozzáférés mellett tartottuk. A CD4 + /CD62L-selectin high T¹sejtek átvitele utáni 4 6 héten belül az egerekben kolitisz alakul ki. A kolitisz kialakulását a tömegváltozás értékelésével határozzuk meg. Az egereket ezután véletlenszerûen három különbözõ csoportba osztottuk: 1. csoport (n=): a kolitisz CD4 + /CD62L-selectin high T¹sejtek beadásával történõ indukálása után 6 héttel az egerek 62, nemzetközi egységnyi heparint kaptak 0, ml PBS-ben intravénásan (a trombózis megakadályozására), majd másodperccel késõbb genetikailag azonos donor egérbõl származó 6 STIC¹et (lásd a 2. példát) intravénásan 1 ml PBS-ben. 2. csoport (n=): elsõ kontroll csoport, amely csak a CD4 + /CD62L-selectin high T¹sejteket kapta, de nem kapott semmilyen további sejtinjekciót a 6 hét után. 3. csoport (n=): második kontrollcsoport, amely CD4 + /CD62L-selectin high T¹sejteket kapott. Hat hét elteltével az egerek 62, nemzetközi egységnyi heparint kaptak 0, ml PBS-ben intravénásan (a trombózis megakadályozására), majd másodperccel késõbb genetikailag azonos donor egérbõl származó 6 kontrollsejtet (lásd a 2. példát) intravénásan 1 ml PBS-ben. A kontrollsejtek ugyanazok, mint a 8. példában definiáltak (csontvelõsejtek, perifériás vérsejtek és lépsejtek nem tenyésztett keveréke). Az összes patkányt feláldoztuk 1 12 héttel a betegséget indukáló T¹sejtek átvitele után, vagy amikor a kontroll állatokban kolitisz jelei alakultak ki, a 2. kontroll csoport állatainak tömegváltozása alapján értékelve. Hasonlóan a 8. példában ismertetett DSS modellhez, az állatok testtömegét hetente háromszor mértük a kísérleti idõszak folyamán. Az állatok testtömegének változását százalékosan adjuk meg (tömeggyarapodás vagy ¹vesztés) az egereknek a kísérlet megkezdése utáni 6 héttel mért tömegéhez viszonyítva, amikor a sejtterápiát kapták. Ismét az % tartományba esõ változásokat tekintjük szignifikánsnak. Az egerek testtömegének változásait a teljes kísérleti idõszak alatt a 9. ábrán mutatjuk be. 6 hét elteltével az összes csoport egereinek majdnem azonos a testtömege. Míg a STIC beadása 6 hét után (1. csoport= ) 4 0 megfelelõ korfüggõ tömeggyarapodáshoz vezet, a kezeletlen csoportba tartozó egerek (2. csoport= ), valamint a 6 hét elteltével a kontroll sejtekkel kezelt egerek (3. csoport= ) csökkent testtömeg-gyarapodást (2. csoport) vagy semmilyen gyarapodást sem (3. csoport) mutatnak a betegség lefolyása alatt. Az értékek csoportonként 6 egértõl kapott átlagértékek, a standard deviáció mindig ±% alatt volt. Az állatok feláldozása után azonnal meghatároztuk a vastagbél hosszát és a lép tömegét. Mindkét érték lehetõvé teszi a gyulladás mértékének a megbecslését, de nem nagyon érzékenyek. A. ábrán bemutatjuk a vastagbél hosszának (A. ábra) és a lép tömegének (B. ábra) mérésének eredményeit. Amint ebbõl az ábrából láthatjuk, a STIC¹el kezelt állatok (1. csoport) vastagbele szignifikánsan hosszabb (körülbelül 11 cm) és a lépük szignifikánsan kisebb (körülbelül mg), mint a kontroll állatoké. A 2. csoportbeli kontrollállatoknak rövidebb a vastagbele (körülbelül,3 cm) és megnagyobbodott a lépük (körülbelül 0 mg), súlyos gyulladást jelezve, míg a kontrollsejteket kapó állatokban (3. csoport) a kolitisz kevésbé súlyos tünetei alakulnak ki (vastagbél hossza körülbelül,6 cm és a lép tömege körülbelül mg), összehasonlítva a kontroll állatokkal (2. csoport), de elõrehaladott kolitisz, összehasonlítva a STIC¹el kezelt állatokkal (1. csoport). Ezután egy további kísérletben a vastagbélszövetet szövettanilag megfestettük Hematoxilin & Eozin (H & E) festéssel [Woods, A. E. és Ellis, R. C. (szerk.), Laboratory Histopathology: A Complete Reference, 1. & 2. kötet; kiad.: Churchill & Livingstone, 1994] irodalmi helyen ismertetett módon hajtottuk végre. Amint már ismertettük a 8. példában, a nyálkahártya állapotát két függetlenül mûködõ patológus értékelte, akik nem ismerték a kísérleti beállításokat. A nyálkahártya értékelési rendszer ugyanaz volt, mint a 8. példában: 0¹ás érték, egészséges, nem feltûnõ lelet; 1¹es érték, minimális kolitisz; 2¹es érték, közepes kolitisz; 3¹as érték, súlyos kolitisz; 4¹es érték, ulceratív kolitisz, együtt a teljes nyálkahártya elpusztításával. Az átlagos értékeket a 11. ábrán mutatjuk be. Hat héttel a kezelés átvitele után a 2. csoportbeli kontrollállatokban, amelyek nem kaptak sejtinjekciót, az átlagos érték körülbelül 3 volt, súlyos kolitiszt jelezve. Az 1. csoportbeli, STIC¹et kapó egerekben és a 2. csoportbeli, 6 hét után kontrollsejteket kapó egerekben szignifikánsan csökkent értékeket kaptunk, sorrendben körülbelül 1, (minimális kolitiszt jelezve; 1. csoport) és körülbelül 2, (közepes kolitiszt jelezve; 2. csoport). Ezek az eredmények ismételten összhangban állnak a H & E festett vastagbélmetszetek szövettani értékelésének eredményeivel, amint a 12. ábráról látható (0 nagyítás). A 12A/B. ábrák mutatják be a 3. csoportbeli állatok vastagbelének állapotát, amelyek kezeletlenek maradtak a kolitisz CD62L high T¹sejtekkel történõ indukálása után. Mindkét példa mononukleáris sejtekkel való kifejezett beszûrõdést és jelentõs nyálkahártya-integritás csökkentést, tüszõréteg-károso- 19

20 1 HU 004 T2 2 dást, és a nyálkahártya alatti réteg és izom propria beszûrõdését mutatja. Kontrollsejtek (vér¹, csontvelõ és lépszövetbõl származó, nem M¹CSF- és ¹interferonstimulált monociták) leírt módon történõ beadása nem akadályozza meg a mononukleáris sejtek beszûrõdését és a nyálkahártya-veszteséget, amint a 12C/D. ábrákon bemutatjuk. Mindkét minta jelentõs nyálkahártya alatti limfocitabeszûrõdést is mutat, de az izom propria még intakt marad. A STIC kolitisz CD62L high T¹sejtekkel történõ indukálása utáni beadása alapvetõen javítja a nyálkahártya-integritást (12E/F. ábra). Mindkét minta vastagbélmetszeteiben csak kisebb limfocitabeszûrõdést, tüszõréteg-veszteség hiányát és a nyálkahártya alatti réteg és izom propria rétegek károsodásának hiányát láthatjuk az elemzett bélszakaszokon. Hasonlóan a nátrium-dextrán-szulfát (DSS) indukált krónikus kolitisz kezelésére beadott STIC¹el kapott eredményekhez (lásd a 8. példát), kimutatjuk a krónikus kísérletes kolitisz CD62L + /CD4 + SCID transzfer egérmodellje alkalmazásával, hogy a STIC képes szuppreszálni vagy egyértelmûen javítani az indukált kolitisz tüneteit. A STIC¹el kezelt egerek megfelelõ korfüggõ tömeggyarapodást mutatnak (9. ábra), a vastagbelük szignifikánsan hosszabb (A. ábra), és a lépük tömege szignifikánsan kisebb (B. ábra), mint a kontrollcsoport egereié, amelyek a vastagbél súlyos gyulladásában szenvednek. Végezetül a STIC¹el kezelt egerek szövettani értékelése szignifikánsan alacsonyabb a kezeletlen állatokkal összehasonlítva (11. ábra), és az STIC¹el kezelt egerek vastagbélmetszeteinek a szövettani elemzése a kolitisz kisebb vagy semmilyen tüneteit sem mutatják (12. ábra). Összehasonlítva a kolitisz STIC¹el történõ kezelésének hatásaival, a szingenikus egerek lépébõl nyert nem tenyésztett sejteket reprezentáló csontvelõsejtek, perifériás vérsejtek és lépsejtek keveréke szignifikánsan kisebb hatást mutat, mivel az ezen sejtekkel kezelt állatok (3. csoport) súlyosabb tüneteket mutatnak, mint amit a STIC¹el kezelt állatokban találtunk (9. A/B., 11. és 12. ábra). Ellentétben a 8. példában a DSS modell rendszerrel kapott eredményekkel, a CD62L high sejtekkel indukált kolitisz modellben a kontrollsejtek képesek javítani a tüneteket bizonyos mértékben, mivel az kontrollsejteket kapó állatok kevésbé súlyos tüneteket mutatnak a semmilyen sejtett nem kapott kontrollállatokhoz hasonlítva. A 8. példa eredményeivel összhangban ez megint egyértelmû bizonyíték arra, hogy a tsz STIC¹ek képesek autoimmun betegségek kezelésre. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás páciens megzavart öntoleranciájával kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére szolgáló sejtek elõállítására, azzal jellemezve, hogy a) azon páciens vérébõl izolált monocitákat, akinek a sejteket be fogjuk adni, in vitro többszörözünk alkalmas tenyésztõ tápközegben, amely tartalmazza az M¹CSF celluláris növekedési faktort; 4 0 b) a monocitákat egyidejûleg vagy az a) lépést követõen ¹IFN¹t tartalmazó tenyésztõ tápközegben tenyésztjük; és c) a b) lépésben kialakult sejteket kinyerjük, a sejteknek a tenyésztõ tápközegtõl való elválasztásával. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a monociták humán eredetûek. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a monocitákat a vérbõl úgy izoláljuk, hogy a monociták mellett limfociták is jelen vannak legalább % mennyiségben az izolátum teljes sejtszámára vonatkoztatva. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben kialakult sejteket vagy a c) lépésben kinyert sejteket a DSM ACC42 hibridóma sejtvonal által termelt ellenanyagokhoz való kötõdés alkalmazásával szelektáljuk.. Az 1 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben kialakult vagy c) lépésben kinyert sejtek vagy a 4. igénypont szerinti szelekciós lépésben nyert sejtek közül kiszelektáljuk azokat a sejteket, amelyek együtt expresszálják a felszínükön a CD3 és CD 14 antigéneket. 6. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az M¹CSF koncentráció a tenyésztõ tápközegben 1 g/l. 7. Az 1 6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az a) lépést követõen a monocitákat órán keresztül tenyésztjük ¹IFN¹t tartalmazó tenyésztõ tápközegben, a ¹IFN jelenlétében való tenyésztést 3 6 nappal az a) lépésbeli tenyésztést követõen kezdve. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ¹IFN koncentráció a tenyésztõ tápközegben 0,1 ng/l. 9. Az 1 8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a teljes tenyésztési idõszak az a) és b) lépésekben 4 8 nap.. Az 1 9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont c) lépése után vagy a 4. és. igénypont szelekciós lépése után a sejteket felszuszpendáljuk alkalmas sejttenyésztõ tápközegben vagy PBS-ben vagy NaCl oldatban. 11. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejteket fagyasztó közegben szuszpendáljuk fel, és azt követõen mélyfagyasztjuk. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fagyasztóközeg magzati borjúszérumot (FCS) vagy humán AB0-kompatibilis szérumot és DMSO¹t tartalmaz. 13. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1 3. vagy 6. igénypontok c) lépésében nyert sejteket vagy a 4. vagy. igénypont szelekciós lépésében nyert sejteket gyógyászati készítménnyé szereljük ki. 14. Felszínükön a CD3 és CD14 antigéneket együtt expresszáló sejtek, páciens megzavart öntoleranciájával kapcsolatos betegségek megelõzésére és/vagy kezelésére, amelyek az igénypontok szerinti eljárások bármelyikével nyerhetõk.