Molekuláris sejtbiológia Szeberényi József

Átírás

1 Molekuláris sejtbiológia Szeberényi József

3 Tartalom Molekuláris sejtbiológia... xx Előszó a harmadik kiadáshoz... xxi A prokariota és eukariota sejt felépítése Sejtes szerveződés Genetikai apparátus Sejtalkotók Citoszkeleton, sejtosztódás Az eukariota sejtek kialakulása: az endoszimbiózis-elmélet Vírusok Nukleinsavak A nukleinsavak általános jellemzői A dezoxiribonukleinsav (DNS) DNS, az örökítő anyag A DNS szerkezete A DNS-szerkezet szintjei A ribonukleinsav (RNS) Az RNS szerkezete Az RNS szerepe. RNS-típusok Katalítikus RNS-ek RNS-világ Fehérjék Aminosavak Az aminosavak általános jellemzői Az aminosavak osztályozása A peptidkötés A fehérjeszerkezet szintjei Enzimek Szénhidrátok és lipidek Szénhidrátok A szénhidrátok általános jellemzése A szénhidrátok osztályozása Lipidek A lipidek általános jellemzése A lipidek osztályozása Morfológiai vizsgáló módszerek I.: Fénymikroszkópia A közönséges fénymikroszkóp A mikroszkóp felépítése A képalkotás elve Nagyítás és feloldóképesség Kontrasztfokozás Különleges mikroszkópok Fáziskontraszt- és differenciális interferencia kontraszt mikroszkóp Sötétlátóterű mikroszkóp Polarizációs mikroszkóp Fluoreszcencia-mikroszkóp Konfokális mikroszkóp Fénymikroszkópos vizsgálatok élő sejtekben Morfológiai vizsgálómódszerek II.: Elektronmikroszkópia Transzmissziós elektronmikroszkóp Felépítés, működési elv A minta előkészítése Speciális vizsgálati módszerek Pásztázó elektronmikroszkóp molekulák nyomon követése a sejtben Radioaktív izotópok alkalmazása a sejtbiológiában Autoradiográfia iii

4 Molekuláris sejtbiológia 1.2. A radioaktívan jelölt makromolekulák izolálása és mennyiségi meghatározása Radioaktív jelölés biológiai folyamatok időbeli lefolyásának vizsgálatára Nem radioaktív jelölés Sűrűségjelölés Immunjelölés Szeparációs módszerek Centrifugálás Differenciál centrifugálás Hipopiknikus grádiens centrifugálás Izopiknikus grádiens centrifugálás Kromatográfia Gélszűrés (gélkromatográfia) Ioncserélő kromatográfia Affinitás-kromatográfia Elektroforézis Agaróz gélelektroforézis Poliakrilamid gélelektroforézis A génszerkezet vizsgálómódszerei I.: DNS-szakaszok in vivo és in vitro amplifikációja Restrikciós endonukleázok Restrikció és modifikáció Restrikciós endonukleázok és modifikációs metilázok DNS-fragmentumok klónozása Genomtárak konstrukciója Polimeráz láncreakció A génszerkezet vizsgálómódszerei II.: A DNS szekvencia-analizisének lehetőségei Molekuláris hibridizáció Restrikciós térképezés Southern blot Szekvencia-meghatározás Szekvencia-meghatározás hibridizációval Humán genomprogram A génexpresszió vizsgálómódszerei I.: Idegen gének expressziója A génexpresszió vizsgálatának lehetőségei cdns-klónozás Géntranszfer szövettenyészeti sejtekbe Transzgénikus élőlények A génexpresszió vizsgálómódszerei II.: Az endogén génműködés gátlása Célzott génroncsolás Antisense technika. Ribozimek. RNS interferencia A fehérjefunkció gátlása A génexpresszió vizsgálómódszerei III.: Specifikus géntermékek azonosítása cdns-tár készítése Northern blot Immunológiai módszerek Immuncitokémia Immunprecipitáció Immunoblot (Western blot) módszer Funkcionális genomika A génexpresszió vizsgálata cdns-chipekkel Proteomika A sejtmag felépítése A sejtmag elektronmikroszkópos szerkezete A maghártya A maghártya felépítése Magpóruskomplexum Nukleocitoplazmatikus transzport A kromatinállomány Magmátrix Az eukariota genom organizációja A genomorganizáció vizsgálata DNS-renaturációs kísérletekkel iv

5 Molekuláris sejtbiológia 2. Szatellit-DNS Szétszórtan ismétlődő szekvenciák Tandem ismétlődésű gének Géncsaládok Egyedi szekvenciák Mobilis genetikai elemek Transzpozonok Retrotranszpozonok A kromatin szerveződése A kromatin morfológiai szerveződése A szerveződés szintjei A kromatin speciális funkciójú régiói A kromatin kémiai összetétele A sejtciklus I.: Interfázis és sejtosztódás A sejtciklus fázisai Sejttenyészetek szinkronizálása A fázisok hosszának meghatározása A sejtciklus II.: Szabályozás Vizsgálómódszerek Genetikai vizsgálatok élesztősejtekben Sejtfúzió Béka oociták mikroinjekciója Béka oocita extraktumok in vitro alkalmazása Különböző fázisú sejtek fúziója Ciklin/Cdk komplexek: a sejtciklus endogén regulátorai A G 1 [S átmenet szabályozása Re-replikációs blokk A G 2 [M átmenet és az M-fázis szabályozása A Cdk-aktivitás szabályozása Ellenőrzőpontok a sejtciklus szabályozásában A sejtosztódás Interfázis: felkészülés a sejtosztódásra A mitózis szakaszai Profázis Metafázis Anafázis Telofázis Citokinézis A meiózis DNS-replikáció I.: A DNS-megkettőződés általános jellemzői A replikáció vizsgálómódszerei In vitro módszerek A DNS-szintézis in vivo vizsgálata A DNS-replikáció szemikonzervatív A DNS-replikáció templát- és primerfüggő A DNS replikációja kétirányú A DNS-replikáció szemidiszkontinuus DNS-replikáció II.: A DNS-szintézis mechanizmusa A replikáció mechanizmusa E. coli sejtekben Origo-felismerő komplex Topoizomeráz I Replikatív DNS-helikáz Ssb-fehérjék Primáz DNS-polimeráz III DNS-polimeráz I DNS-ligáz Topoizomeráz II Az eukariota replikáció speciális jellemzői Nagyméretű DNS-molekulák replikációja v

6 Molekuláris sejtbiológia 2.2. Eukariota DNS-polimerázok Replikáció a kromatinállományban Telomérreplikáció A DNS lánchibáinak kijavítása DNS-károsodás DNS-károsodások direkt kiküszöbölése Excíziós repair Bázisexcíziós repair Nukleotid-excíziós repair Hibás bázispárok korrekciója (mismatch repair) Kettős láncú DNS-törések kijavítása Transzkripció I.: Az RNS-szintézis és -érés általános jellemzői A transzkripció vizsgálómódszerei Az RNS-szintézis in vitro vizsgálata Az RNS-szintézis in vivo vizsgálata Transzkripció és RNS-érés prokariotákban A prokariota RNS-szintézis általános jellemzői A prokariota RNS-szintézis mechanizmusa RNS-érés prokariotákban Az eukariota transzkripció általános jellemzői Transzkripció II.: Riboszóma-biogenezis eukariotákban A nukleolusz Riboszóma-biogenezis a nukleoluszban Az rrns-szintézis vizualizálása A riboszomális gének szerkezete SnoRNS-ek A riboszóma képződésének mechanizmusa Transzkripció III.: Pre-mRNS-szintézis, cap-képződés és poliadeniláció A pre-mrns-szintézis iniciációja Elongáció Az 5 -cap képződése Termináció és poliadeniláció Transzkripció IV.: Pre-mRNS splicing eukariotákban A splicing jelentősége adenovírus mrns-ek képződésében A splicing mechanizmusa A splicing rendellenességei RNS-editing Transzláció I.: mrns-ek, trns-ek, riboszómák szerepe a fehérjeszintézisben A fehérjeszintézis templátja az mrns A trns-ek adapterszerepe A trns-ek szintézise és érése A trns szerkezete Aminoacil-tRNS-ek szintézise A riboszóma szerepe a transzlációban A transzláció vizsgálómódszerei In vitro módszerek In vivo módszerek Transzláció II.: A genetikai kód A kódszótár felállítása Triplet kód Szintetikus polinukleotidok in vitro transzlációja Aminoacil-tRNS-ek kötődésének vizsgálata A genetikai kód jellemzői TRANSZLÁCIÓ III.: A fehérjeszintézis mechanizmusa Transzláció prokariotákban Iniciáció Elongáció Termináció Az eukariota transzláció sajátosságai A transzláció általános jellemzői vi

7 Molekuláris sejtbiológia 4. A fehérjeszintézis gátlószerei A génműködés szabályozása I.: A prokariota operon modell A génreguláció résztvevői DNS-szekvenciaelemek Regulátor-fehérjék Effektor-molekulák Lebontó anyagcsereutak operonjai Bioszintetikus anyagcsereutak operonjai A génműködés szabályozása II.: A génreguláció mechanizmusai eukariotákban A génreguláció szerepe az egyedfejlődésben A Gurdon-kísérlet Magtranszplantáció emlősökben A génexpresszió szabályozásának szintjei eukariotákban A transzkripció szabályozása A pre-mrns-érés szabályozása Az RNS-transzport szabályozása Az mrns-degradáció szabályozása A transzláció szabályozása A fehérje-degradáció szabályozása A fehérjefunkció szabályozása A génműködés szabályozása III.: Transzkripciós faktorok Aktivátorok és represszorok Transzkripciós faktorcsaládok Hélix-turn-hélix fehérjék Cinkujjfehérjék Amfipatikus hélixfehérjék A szteroid-receptor szupercsalád: ligand-aktivált transzkripciós faktorok Transzkripciós faktor betegségek Fejlődési rendellenességek Endokrin kórképek Daganatos betegségek Vezikuláris transzport I.: Fehérjék és lipidek szintézise az endoplazmatikus retikulumban Fehérjeszintézis a durva felszínű endoplazmatikus retikulumon Szabad és kötött riboszómák Fehérjék kotranszlációs transzportja az endoplazmatikus retikulumba Fehérjék poszttranszlációs módosulása az endoplazmatikus retikulumban Membránlipidek szintézise a sima felszínű endoplazmatikus retikulumban Vezikuláris transzport II.: A szekréciós út. Fehérje-glikoziláció és -szortírozás A szekréciós út Fehérje-glikoziláció N-kötésű glikoziláció O-kötésű glikoziláció A glikoziláció orvosi jelentősége Vezikuláris transzport III.: Az endocitotikus út Az endocitotikus út A felvett molekulák sorsa Az endocitózis típusai Az LDL-partikulumok endocitózisa A sejtek koleszterin-felvételének veleszületett és szerzett zavarai A vezikuláris transzport mechanizmusa A transzportgépezet alkotórészei A burkolt vezikulák típusai A sejt védekezési mechanizmusai Xenobiotikumok átalakítása A lizoszómák szerepe A lizoszómák típusai és funkciója A lizoszómák képződése Lizoszomális tárolási betegségek Peroxiszómák Szabad gyökök képződése és semlegesítése vii

8 Molekuláris sejtbiológia 4.1. Fagocitózis A szabad gyökök makromolekula-károsító hatásai Az oxigén szabad gyökök semlegesítése Mitokondrium I.: Felépítés és működés A mitokondriumok általános jellemzői A mitokondriumok szerkezeti elemei Külső membrán Intermembrán tér Belső membrán Mitokondrium mátrix Energia-metabolizmus a mitokondriumban Citrátciklus Oxidatív foszforilálás: a kemiozmózis mechanizmus Mitokondrium II.: A mitokondriális DNS és betegségei Az endoszimbiózis teória A humán mitokondriális genetikai apparátus jellemzői Mitokondriális fehérjeimport Mitokondriális betegségek Öröklődő mitokondriális betegségek Szerzett mitokondriális betegségek A nukleáris DNS mutációi által okozott mitokondriális betegségek Citoszkeleton I.: Mikrofilamentumok A mikrofilamentum-rendszer Az aktinfilamentumok szerkezete és polimerizációja Miozinok szerepe a mikrofilamentumok működésében A mikrofilamentumok szerveződése A mikrofilamentum-rendszer és a sejtmembrán kapcsolata Citoszkeleton II.: Intermedier filamentumok és mikrotubulusok Intermedier filamentumok Az intermedier filamentumok organizációja Intermedier filamentum fehérjék Intermedier filamentum betegségek Mikrotubulusok A mikrotubulusok szerkezete Dinamikus instabilitás Mikrotubulus motorfehérjék sejtmembrán I.: A lipoprotein membrán szerkezete. Sejt sejt kapcsolatok A sejthártya szerkezete A lipoprotein membránok folyékony mozaik modellje A lipid kettős réteg Liposzómák Membránfehérjék Specializált, stabil membrán domének A sejtek kapcsolódásai Lezáró kapcsolódások Lehorgonyzó kapcsolatok Kommunikáló kapcsolatok Sejtmembrán II.: Transzport a sejthártyán keresztül Passzív transzport folyamatok Egyszerű diffúzió Facilitált diffúzió Aktív transzport folyamatok ATP-függő transzporterek Ionfüggő transzporterek Sejtmembrán III.: A sejthártya és az extracelluláris mátrix kapcsolata Kollagének Glikózaminoglikánok és proteoglikánok Multiadhezív fehérjék Integrinek Szignáltranszdukció I.: Jelátviteli molekulák és receptoraik viii

9 Molekuláris sejtbiológia 1. A jelátvitel fázisai A kémiai jelátvitel fajtái Endokrin jelátvitel Parakrin jelátvitel Juxtakrin jelátvitel Autokrin jelátvitel Intrakrin jelátvitel A receptorfehérjék lokalizációja Szignáltranszdukció II.: Heterotrimer G-proteinek által közvetített jelátvitel Heterotrimer G-proteinek A camp-út Az inozitol-foszfolipid út Szignáltranszdukció III.: Jelátvitel tirozin-proteinkináz receptorokról Növekedési faktorok és receptoraik A receptoraktiváció mechanizmusa A növekedési faktor receptorokról kiinduló jelpályák A foszfolipáz C út A Ras-fehérjék Az ERK-út A foszfatidilinozitol 3-kináz út A Ral út Szignáltranszdukció IV.: citokinek és egyéb mitogének jelátvitele Citokin-jelátvitel A TGF-β-út Hedgehog-jelátvitel Wnt-jelátvitel Notch-jelátvitel Szignáltranszdukció V.: Stressz- és integrin-jelátvitel Stresszhatások jelátvitele Stresszaktivált fehérjefoszforilációs kaszkádok Az NFκB-út Integrin-jelátvitel Szignáltranszdukció VI.: Általános következtetések és gyakorlati vonatkozások A jelátviteli folyamatok általános jellemzői A jelátvitel specificitása Molekuláris mechanizmusok a jelátvitelben Jelamplifikáció Jelterminálás Jelátviteli hálózatok Klinikai vonatkozások Nem inzulindependens (II. típusú) diabetes mellitus Nephrogen diabetes insipidus Cholera Krónikus gyulladásos betegségek Daganatok Az egyedfejlődés celluláris és molekuláris alapjai Az emlősök korai egyedfejlődése Az egyedfejlődés alapvető celluláris folyamatai Sejtproliferáció Determináció Differenciáció Sejtmozgások Programozott sejthalál (apoptózis) Alakzatformálódás Szignáltranszdukció és embrionális fejlődés Homeotikus szelektor génkomplexek szerepe Az egyedfejlődés veleszületett zavarai Programozott sejthalál Nekrózis és apoptózis Az apoptózis fiziológiás szerepe ix

10 Molekuláris sejtbiológia 3. Az apoptózis legfontosabb regulátorai p53-fehérje Bcl-2 család Kaszpáz-család Apoptózis utak Extrinsic út Intrinsic út Az apoptózis betegségei Daganatbiológia I.: A tumorsejt általános jellemzői A daganatok osztályozása A tumorsejt morfológiája A sejtmag elváltozásai A citoplazma és a sejtfelszín elváltozásai A tumorsejt funkcionális jellemzői Szövettenyészeti sejtek transzformációja A transzformált sejtek viselkedése Daganatbiológia II.: Onkogén DNS-vírusok Onkogén vírusok Onkogén DNS-vírusok SV40- és poliomavírus Adenovírusok Hepatitis B vírus Papillomavírusok Herpeszvírusok Daganatbiológia III.: Onkogén RNS-vírusok A retrovírusok fertőzési ciklusa Erős és gyenge onkogenitású retrovírusok Retrovirális onkogének A retrovirális onkogének eredete Humán retrovírusok Daganatbiológia IV.: Celluláris onkogének Onkogének keresése transzfekciós kísérletekkel Az első emberi onkogén felfedezése Az onkogén-aktiváció mechanizmusai Pontmutáció Inszerciós mutagenezis Transzlokáció Deléció Génamplifikáció Celluláris onkogének, a daganatterápia célpontjai Daganatbiológia V.: Tumor szuppresszor gének A tumor szuppresszor gének létének kimutatása sejtfúziós kísérletekkel Az első humán tumor szuppresszor gén klónozása Tumor szuppresszor gének és szerepük az emberi daganatképződésben Rb p Cdk-inhibitorok APC WT NF BRCA1 és BRCA PTEN VHL Mutátor gének Daganatbiológia VI.: A karcinogenezis többlépéses mechanizmusa Experimentális karcinogenezis: a daganatok klonális evolúciója Tumor-iniciáció Tumor-promóció Tumor-progresszió A karcinogenezis klinikai stádiumai x

11 Molekuláris sejtbiológia 2.1. Primér tumor kialakulása Tumor-invázió Metasztázis-képződés Onkogén-kooperáció Colon carcinoma: a többlépéses karcinogenezis modellje A daganatképződés elméletei Molekuláris medicina I.: Molekuláris diagnosztika Genomszintű diagnosztikai módszerek Citogenetika és strukturális genomika Funkcionális genomika A génszintű diagnózis módszerei Mutáció analízis Pontmutáció kimutatása Nagyobb kiterjedésű léziók kimutatása Génexpresszió analízis Példák a molekuláris diagnosztika alkalmazására Molekuláris diagnosztika öröklődő betegségekben Daganatok molekuláris diagnózisa Fertőző betegségek molekuláris diagnózisa Molekuláris medicina II.: Génterápia Oligonukleotid terápia Antisense inhibitorok Ribozimek sirns-ek Valódi génterápia A génterápia típusai Génterápiás vektorok A génterápia lehetőségei Klinikai génterápiás tapasztalatok xi

12 Az ábrák listája ábra: A prokariota sejt szerkezete ábra: Az eukariota sejt szerkezete ábra: Az eukariota sejtek kialakulása ábra: Az élővilág evolúciója: A sejtmag valószínűleg a sejtmembrán betüremkedésével alakult ki, ezt követte aerob baktériumok endoszimbiozisával a mitokondriumok megjelenése, majd fotoszintetizáló cianobaktériumok endoszimbiózisával a kloroplasztiszok létrejötte. Több eukariota-törzs (pl. gombák, állatok) később elveszítette kloroplasztiszait ábra: A nukleinsavak bázisai ábra: A ribóz és a dezoxiribóz szerkezete ábra: Az ATP és a ciklikus-amp szerkezete ábra: A DNS kettős hélix: a láncok komplementer és antiparallel kapcsolódása ábra: Hiperkromicitási görbe ábra: B-DNS és Z-DNS ábra: Az eukariota riboszóma 18S rrns-ének másodlagos szerkezete ábra: Az aminosavak általános szerkezete és a peptidkötés kialakulása ábra: A fehérjék másodlagos szerkezeti elemei: α-helix és β-lemez ábra: A ribonukleáz harmadlagos szerkezete ábra: Az inzulinreceptor doménszerkezete ábra: Az enzim csökkenti a katalizált reakció aktiválási energiáját ábra: A glukóz lineáris és gyűrűs szerkezete: α és β konfiguráció ábra: A maltóz szerkezete ábra: A cellulóz és a keményítő szerkezete ábra: Triglicerid (A.) és foszfolipid (B.) szerkezete ábra: A szfingomielin szerkezete A szteránváz szerkezete ábra: A β-karotin szerkezete ábra: A fénymikroszkóp felépítése. A: A mikroszkóp részei. B: A fény útja ábra: A kép keletkezése a fénymikroszkópban (F 1 és F 2 a lencsék fókuszpontjai) ábra: A polarizációs mikroszkóp működési elve (a: párhuzamos polárszűrők; b: keresztezett polárszűrők; c: anizotróp képlet vizsgálata keresztezett polárszűrők mellett) ábra: A fluoreszcencia mikroszkóp felépítése és működési elve ábra: A konfokális mikroszkóp működési elve (A: a fluoreszcens objektum megvilágítása; B: a fókuszpontból és azon kívüli régióból származó fénysugarak sorsa) ábra: A transzmissziós elektronmikroszkóp felépítési elve ábra: Szögárnyékolással fémgőzölt replika készítése ábra: A fagyasztva törés (A) és a fagyasztva maratás (B) elve ábra: A pásztázó elektronmikroszkóp felépítési elve ábra: Az autoradiográfia elve (A) és alkalmazása a DNS-replikáció kimutatására (B; a sejteket [ 3 H]timidinnel jelölték; a sémás ábra alsó sejtjében replikáció folyt a jelölés idején, a felső két sejt viszont a sejtciklus más fázisában volt) ábra: A szekréciós út vizsgálata pulse-chase jelöléssel. Hasnyálmirigy mirigyvégkamra sejteket 3 percig jelölt aminosavval kezeltek (A), majd 7 (B), illetve 120 percig (C) jelöletlen aminosav jelenlétében folytatták az inkubációt. Az ezt követő elektronmikroszkópos autoradiográfia kimutatta, hogy a fehérjék az endoplazmatikus retikulumban képződnek, innen a Golgi-apparátusba kerülnek, majd szekréciós granulumok útján exocitózissal ürülnek ki a sejtből ábra: A centrifugákban használt szögrotor (A) és kilendülő-poharas rotor (B) ábra: Sejtfrakcionálás differenciál centrifugálással ábra: Bakteriális riboszóma alegységek szétválasztása szacharóz grádiens centrifugálással ábra: DNS és RNS szétválasztása céziumklorid grádiens centrifugálással ábra: Két makromolekula (a és b) szétválasztása oszlopkromatográfiával ábra: A gélszűrés (A), az ioncserélő kromatográfia (B) és az affinitás kromatográfia (C) elve ábra: Emlős sejtből izolált rrns-ek és mrns-ek frakcionálása formaldehid/agaróz gélelektroforézissel ábra: Fehérjék szétválasztása SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel ábra: ph 7 izoelektromos pontú fehérje viselkedése izoelektromos fókuszálás során xii

13 Molekuláris sejtbiológia ábra: Fehérjék frakcionálása két-dimenziós gélelektroforézissel (1D: 1. dimenzió, 2D: 2. dimenzió) ábra: Rekombináns plazmid létrehozása ábra: λ-fág genomtár létrehozása (A.) és a kívánt klón kiválasztása molekuláris hibridizációval (B.) ábra: A polimeráz láncreakció elve ábra: A valós-idejű kvantitatív PCR reakció elve. 1. lépés: polimerizáció; 2. lépés: a fluoreszcens festék lehasítása; 3. lépés: a próba lebontása, a polimerizáció befejezése (részleteket l. a szövegben) ábra: A nukleinsav hibridizáció elve (filter-hibridizáció) ábra: Restrikciós térképezés: a fragmentumok elektroforetikus képe (A.) és a cirkuláris DNS térképe (B.) ábra: A Southern blot elve ábra: Sanger láncterminációs szekvencia-meghatározó módszerének elve ábra: A DNS-szekvenciázó automata működési elve ábra: Szekvencia-meghatározás oligonukleotid-chippel. A. A mikrochip képe; B. A chip egy részlete felnagyítva. Minden mező ugyanazon oligonukleotid számos példányát tartalmazza (a rajz csak 1 példányt ábrázol), a különböző mezők különböző oligonukleotidokat; C. Hibridizáció a fluoroforral jelölt cél-dns; D. A mikrochip képe a fluoreszcencia-mikroszkóban ábra: A hibridizáción alapuló szekvencia-analizáló berendezés működési elve ábra: A molekuláris biológia információ-áramlásának centrális dogmája ábra: A cdns klónozás menete (A.) és a klónozott gén expressziója E. coli sejtekben (B.) ábra: Transzgénikus egerek létrehozása embrionális őssejtek manipulálásával ábra: A célzott génroncsolás elve. A K.O. vektorral kezelt sejtek sorsa háromféle lehet: 1. ha a plazmid nem jut be a sejtbe vagy nem épül be a genomba, a sejt neomicinszármazékkal elpusztítható; 2. a véletlenszerűen integrálódott plazmidot tartalmazó sejteket a ganciklovír öli meg; 3. a kettős szelekciót csak azon a sejtek élik túl, melyekben homológ rekombinációval kerül a neor-gén a célgénbe ábra: mrns molekula hasítása ribozimmel ábra: Az RNS-interferencia elve; specifikus mrns degradációja a sejtmagban természetes módon képződő (A.) és a sejtbe kívülről bejutott sirns felhasználásával (B.) ábra: A Northern blot módszer elve ábra: Az immunprecipitáció menete (az autoradiogrammon az 1. minta a teljes fehérjekeverék a 2. pedig az immunprecipitátum képét mutatja) ábra: Az immunoblot (Western blot) módszer elve ábra: A sejtmag elektronmikroszkópos felépítése ábra: A magpórus komplexum szerkezete (A. felülnézeti kép; B. keresztmetszet) ábra: A magfehérjék importjának (A.) és exportjának (B.) mechanizmusa ábra: mrnp-export a magpóruson keresztül ábra: E. coli és borjú DNS renaturációs görbéje ábra: Szatellit-DNS izolálása céziumklorid grádiens centrifugálással ábra: Southern blot alapú DNS-fingerprint vizsgálat miniszatellit próbával rokonsági kapcsolatok tisztázására ábra: Tandem ismétlődésű gének ábra: A transzpozíció mechanizmusai (A: nonreplikatív transzpozíció; B: replikatív transzpozíció; C: retrotranszpozíció) ábra: Alu-szekvenciák szerepe a génduplikáció folyamatában ábra: A kromatin morfológiai szerveződésének szintjei ábra: A kromatoszóma szerkezete ábra: Egy emberi metafázikus kromoszóma szerkezete ábra: A telomér-hurok szerkezete ábra: A nukleoszomális hisztonok acetilációjának következménye: a nukleoszóma fellazulása ábra: A sejtciklus fázisai ábra: A FACS működési elve ábra: Szinkronizálatlan tenyészet áramlási citometriás képe DNS-festést követően ábra: Ciklin/Cdk komplexek expressziója emlős sejtciklus során (R= restrikciós pont) ábra: A re-replikációs blokk megvalósítása a licensing faktor teória szerint ábra: Az MPF-aktivitás és a ciklinszint változása a sejtciklus során ábra: A Cdk-szabályozás mechanizmusai ábra: Az MPF-aktivitás szabályozása a sejtciklus során xiii

14 Molekuláris sejtbiológia ábra: Ellenőrzési pontok a sejtciklusban ábra: A mitózis szakaszai ábra: Az interfázikus és mitotikus mikrotubulus-rendszer felépítése ábra: Testvérkromatid kohézió és szétválás ábra: Az osztódási orsó megnyúlása az anafázis B. szakaszban ábra: Citokinézis osztódó állati sejtben ábra: A meiózis folyamata. (Az egyszerűség kedvéért az ábra csak egyetlen kromoszómapár sorsát mutatja.) ábra: Homológ rekombináció. A kiindulási, hasonló szekvenciájú DNS-régiókban egyesláncú lánctörések történnek (A.; nyílhegyek). A láncvégek helyet cserélnek és a másik láncvéggel egyesülnek. A lánckeresztezésben ismét törések történnek (B.; nyílhegyek), az újabb láncvégeket is DNS-ligáz egyesíti (C) ábra: A gerinces oociták meiózisa ábra: A DNS-szintézis mechanizmusa a Kornberg-rendszerben ábra: A Meselson-Stahl kísérlet ábra: A templát-primer komplex szerepe a DNS-szintézisben ábra: A replikáció kétirányú jellegének bizonyítása rost-autoradiográfiával (Or = origo) ábra: A replikációs szemidiszkontinuus jellege. A. a szimmetrikus replikáció problémája; B. a vezető és késlekedő láncok szintézise ábra: A prokariota replikáció mechanizmusa. A: A replikációs buborék kialakulása az orirégióban. B: Egy replikációs villa működése és alkotórészei ábra: A DNS-polimeráz III működési modellje ábra: Cirkuláris DNS-ek szétválasztása ábra: A testvérkromatidok szétválasztása az anafázisban ábra: A vég-replikáció problémája ábra: A telomeráz-reakció mechanizmusa ábra: A bázis-excíziós repair mechanizmusa ábra: A nukleotid-excíziós repair mechanizmusa ábra: A mismatch repair mechanizmusa (A. E. coliban; B. eukariota sejtekben) ábra: Kettősláncú DNS-törések kijavítása. A. Nem-homológ láncvégegyesítés. B. Repair homológ rekombináció által ábra: Kapcsolt transzkripció-transzláció prokariotákban: a kromoszóma-poliszóma komplex ábra: A prokariota transzkripció fő lépései ábra: A prokariota promóter és a hozzá kapcsolódó RNS-polimeráz szerkezete ábra: A nukleolusz elektron mikroszkópos szerkezete ábra: Aktívan átíródó rrns transzkripciós egység ábra: Tandem rrns-gének ábra: A riboszóma-biogenezis folyamata ábra: Eukariota fehérjekódoló gének transzkripciójának lépései ábra: Az RNS-polimeráz II promóterek szerkezete ábra: A pre-mrns-szintézis iniciációja ábra: Az 5 -cap képződésének reakciói ábra: A cap szerkezete ábra: Az eukariota pre-mrns-ek 3 -végi érése ábra: A fehérjekódoló gének diszkontinuus szerkezete és a pre-mrns splicing ábra: Intronok azonosítása RNS-DNS hibridek elektronmikroszkópos vizsgálatával. A. A hibridek elektronmikroszkópos vizsgálata alapján készült sémás rajz. B. A vírus-dns térképe az exon- és intron-régiókkal ábra: Az adenovírus késői gén-régióján képződő pre-mrns-ek és az alternatív splicing termékei. (Az ábra csak a legrövidebb pre-mrns-ből képződő érett mrns-eket mutatja.) ábra: A pre-mrns splicing lépései ábra: A spliceoszóma felépülése és a splicing mechanizmusa ábra: RNS-szerkesztés. A. Apo-B100 fehérje szintézise szerkesztetlen mrns-ről. B. Apo- B48 fehérje szintézise szerkesztett mrns-ről ábra: A trns-ek másodlagos (A.) és harmadlagos (B.) szerkezete ábra: Az aminoacil-trns szintetáz reakció lépései. A. aminosav-aktiválás; B. aminoacil-trns szintézis ábra: A riboszómák felépítése xiv

15 Molekuláris sejtbiológia ábra: Poliszómák szacharóz grádiens szedimentogrammja. Az a nyíllal jelölt csúcs riboszóma monoméreknek, a b és c csúcsok pedig három, illetve öt riboszómát tartalmazó poliszómáknak felelnek meg : ábra: A triplet kódot igazoló genetikai kísérlet elve. T4 bakteriofág DNS-ének egyik génjébe egy (B.), két (C.) vagy három (D.) extra nukleotidot vittek be. Az ábrák a kódolt mrns egy szakaszát, illetve az azoknak megfelelő aminosav sorrendet mutatják. (A. vad-típusú gén). A mutáció eredményeként megjelenő nukleotidokat kövér betűk, a megváltozott aminosavakat satírozás jelölik ábra: A Nirenberg-féle kötődési analízis elve táblázat: A genetikai kódszótár ábra: A kodon-antikodon kapcsolat wobble-pozíciója ábra: Policisztronos prokariota mrns (A.) és monocisztronos eukariota mrns (B.) szerkezete (I = iniciációs kodon, S = stopkodon, ORF = open reading frame) ábra: A prokariota transzláció iniciációja. A: iniciációs faktorok kötődése a kis riboszóma alegységhez; B: a 30S iniciációs komplex létrejötte; C: a 70S iniciációs komplex kialakulása ábra: A prokariota transzláció elongációja. A: aminoacil-trns kötődés; B: peptidkötésszintézis; C: transzlokáció ábra: A prokariota transzláció terminációja ábra: Poliszóma képződése a fehérjeszintézis során ábra: Negatív reguláció a laktózoperonon: a lac represszor működése. (R = regulátor gén; P = promóter; O = operátor; S1, S2, S3 = struktúrális gének) ábra: A laktózoperon transzkripciójának összetett szabályozása. (G = glukóz; L= laktóz) ábra: A triptofánszintézis enzimeit kódoló triptofánoperon szabályozása ábra: A Gurdon-kísérlet lényege ábra: A normális egyedfejlődés és a reproduktív, illetve terápiás klónozás összehasonlítása ábra: Az eukariota génexpresszió szabályozásának szintjei ábra: Kalcitonin és CGRP mrns képződése alternatív splicing útján (E1-E6, exonok) ábra: Eukariota aktivátor transzkripciós faktorok funkcionális osztályozása ábra: Transzkripciós faktor családok ábra: A glukokortikoidok sejtszintű hatásmechanizmusa ábra: Szekréciós fehérje szintézise és transzlokációja az endoplazmatikus retikulumba (ER) ábra: Az endoplazmatikus retikulumon szintetizálódó membránfehérjék topológiája (a. az inzulinreceptor α-alegysége; b. transzferrinreceptor; c. glukóztranszporter; d. β-adrenerg receptor) ábra: A natív polipeptidláncra jellemző diszulfidkötések kialakítása a protein diszulfidizomeráz segítségével ábra: Foszfolipidek transzlokációja az endoplazmatikus retikulum membránban ábra: A szekréciós út: lizoszómák képződése, szabályozott és folyamatos szekréció ábra: Vezikuláris transzport vékonybél polarizált epiteliális sejtjeiben ábra: N-kötésű és O-kötésű fehérjeglikoziláció ábra: Az oligoszacharid-protein transzferáz reakció ábra: Az oligoszacharid prekurzorból képződő érett szénhidráttípusok az N-kötésű glikoproteinekben ábra: Az endocitotikus vezikulumok sorsa a sejtben: 1. degradáció; 2. tárolás; 3. transzcitózis ábra: Az LDL-partikulumok receptor-közvetített endocitózisa ábra: A vezikuláris transzport lépései: 1. burkolt membrán-kitüremkedés képződése a donor membránon; 2. burkolt vezikula képződése; 3. dokkolás a célorganellumon; 4. burokleválás; 5. a vezikula fúziója az akceptor membránnal ábra: A membránfúzióban részt vevő fehérjék ábra: A policiklusos aromás szénhidrogén benzpirén karcinogénné alakítása ábra: Lizoszomális enzimek mannóz-6-foszfát szignáljának képződése ábra: A NADPH-oxidáz aktiválásának eredményeképpen képződött reaktív oxigénszármazékok elpusztítják a fehérvérsejt által bekebelezett kórokozót ábra: A mitokondrium felépítése és metabolikus folyamatai ábra: A mitokondrium belső membránjának két oldala között fellépő elektrokémiai protongrádiens, melynek elektromos eleme a potenciál-grádiens, kémiai komponense pedig a ph-grádiens ábra: Az ATP-szintáz szerkezete xv

16 Molekuláris sejtbiológia ábra: A humán mtdns géntérképe. (Az rrns-géneket fekete, a fekérjekódoló szakaszokat szürke régiók, a trns-géneket a megfelelő aminosav neve jelzi.) ábra: Mátrixfehérje importja a mitokondriumba ábra: Az aktin-polimerizáció mechanizmusa ábra: A mikrofilamentum-képződés taposómalom mechanizmusa (treadmilling) ábra: A II. típusú miozin szerkezete ábra: A miozinműködés modellje ábra: Vezikuláris transzport mikrofilamentum mentén ábra: Aktinkötegek (A.) és aktinhálózat (B.) szerkezete ábra: A disztrofin fehérje funkciója ábra: A mikrovillusok szerkezete ábra: Az intermedier filamentumok szerkezete ábra: A mikrotubulus szerkezete ábra: A centroszóma szerkezete ábra: Mikrotubulus motorfehérjék ábra: A lipoprotein membránok szerkezete ábra: Unilamelláris (A.) és multilamelláris (B.) liposzómák szerkezete ábra: Liposzóma által szállított gyógyszerek bejutása a célsejtbe: diffúzió (A.), lipidkicserélődés (B.), endocitózis (C.), membránfúzió (D.) ábra: A kaveola szerkezete ábra: Vékonybél-hámsejtek stabil kapcsolódásai ábra: A zonula occludens szerkezete ábra: Az övdezmoszóma (A.) és a foltdezmoszóma (B.) szerkezete ábra: A réskapcsolat szerkezete ábra: A membrántranszport folyamatok típusai ábra: Az akciós potenciál ábra: A Na + -K + pumpa működése ábra: A multidrog transzporter szerkezete ábra: A glukóz transzepiteliális transzportja a vékonybél hámsejtjén keresztül ábra: Az extracelluláris mátrix és a sejtmembrán kapcsolata ábra: A kollagén tripla-helikális szerkezete ábra: A kollagénképzôdés mechanizmusa ábra: Aggrekán komplexek felépítése ábra: Sejtfelszíni proteoglikánok ábra: A fokális adhézió (A.) és a hemidezmoszóma (B.) szerkezete ábra: A sejtet érő környezeti hatások ábra: A kémiai jelátvitel szakaszai ábra: A kémiai jelátvitel típusai. A: endokrin; B: parakrin; C: juxtakrin; D: autokrin; E: intrakrin szignalizáció (, ligand; Υ, receptor) ábra: Intracelluláris (A.) és sejtfelszíni (B.) receptorok ábra: A sejtfelszíni receptorokról induló intracelluláris jelátviteli pályák felépítésének elve ábra: Heterotrimer G-fehérje által közvetített jeltovábbítás. (A: alapállapot; B: receptoraktiválás; C: alegység-disszociáció; D: effektor-aktiválás; E: GTP-hidrolízis) ábra: A camp-út ábra: A ciklikus-amp képződése és elbontása ábra: A foszfolipáz C reakció (a rövidítéseket l. a szövegben) ábra: Az inozitol-foszfolipid út ábra: Néhány növekedési faktor receptor szerkezete ábra: A növekedési faktor receptorok aktiválásának mechanizmusa (1. ligandkötés; 2. receptordimerizáció; 3. autofoszforiláció; 4. jelátviteli fehérjék kötődése és foszforilációja [a rövidítések jelentését lásd később a szövegben]) ábra: SH2- és SH3-doméneket tartalmazó jelátviteli fehérjék (a rövidítések jelentését lásd a szövegben) ábra: A növekedési faktorok jelátviteli útjai ábra: A Ras/MAPK jelátviteli út (a rövidítések jelentését l. a szövegben) ábra: A Ras-ciklus ábra: A foszfatidilinozitol 3-kináz reakció (a rövidítéseket lásd a szövegben) ábra: A citokin jelátvitel (a rövidítések jelentését l. a szövegben) xvi

17 Molekuláris sejtbiológia ábra: Az interferon fehérjék képződésének szabályozása és szerepe a vírusfertőzés gátlásában ábra: A transzformáló növekedési faktor (TGF-β) jelátvitele ábra: A Hedgehog jelátviteli út ábra: A Wnt jelátviteli út ábra: Notch jelátviteli út ábra: MAPK jelátviteli utak emlős sejtekben. (A rövidítések magyarázatát l. a szövegben. Az üresen hagyott téglalapok olyan, már azonosított jelátviteli fehérjéket reprezentálnak, melyek nevének ismertetése meghaladja a könyv kereteit.) ábra: A stresszválasz NFκB-útja ábra: A fokális adhézió által közvetített integrin-jelátviteli utak (a rövidítések jelentését l. a szövegben) ábra: Jelamplifikáció a camp-úton ábra: A növekedési faktor receptorokról divergáló (A.) és a fos-promóteren konvergáló(b.) jelpályák ábra: Az inzulin jelátviteli pályái. (A rövidítések jelentését l. a szövegben.) ábra: A megtermékenyítés és a zigóta első mitotikus osztódása ábra: Az emlős egyedfejlődés korai szakasza ábra: A homeotikus génkomplexek Drosophilában (A.) és egérben (B.). A komplexek azonos számmal jelölt génjei egymással homológok. A C. ábra a Hox-gének expressziójának eloszlását mutatja az egér embrió központi idegrendszerében és szelvényeiben ábra: A nekrózis és az apoptózis morfológiai jellemzői ábra: A Bcl-2 család: A. anti-apoptotikus Bcl-2 fehérjék; B. pro-apoptotikus multidomén Bcl-2 fehérjék; C. pro-apoptotikus BH3-domén fehérjék ábra: A Bcl-2 család tagjainak egymásra hatásai a sejttúlélés és a sejthalál szabályozásában ábra: Az apoptózis extrinsic (receptor által közvetített) és intrinsic (mitokondriális) útja (részletek a szövegben) ábra: Szövettenyészeti sejtek malignus transzformációja ábra: Az SV40-polioma víruscsalád genomjának szerkezete (a nyilak a transzkripció irányát jelölik) ábra: Az SV40-vírus fertőzési ciklusa. A: lítikus fertőzés permisszív sejtekben; B: permanens transzformáció nonpermisszív sejtekben ábra: A cervix carcinomát okozó HPV-16 vírus genomjának szerkezete. (E1-E7, a korai régió termékei; L1-L2, a késői régió termékei; a nyíl a transzkripció kezdőpontját és írányát jelzi.) ábra: A retrovirusok vírionjának szerkezete ábra: A retrovírusok fertőzési ciklusa ábra: Bishop és Varmus kísérlete: a v-src onkogén azonosítása ábra: Az avián leukaemia vírus és a Rous sarcoma vírus provírusának géntérképe ábra: Transzdukáló retrovírus képződése (a gag a részlegesen deletált gag gént jelöli) ábra: Transzdukáló retrovírus genomjának kialakulása ábra: Az első humán onkogén klónozása ábra: A c-myc protoonkogén inszerciós aktiválódása ALV-fertőzést követően,(e1, E2, E3: a c- myc gén exonjai) ábra: A Philadelphia-kromoszóma (A.) és a bcr/abl fúziós gén, (B.) létrejötte reciprok transzlokációval ábra: A génamplifikáció mechanizmusa (A.) és kromoszomális megjelenési formái (B.) ábra: Az Rb-gén tumor szuppresszor hatásának bizonyítása kopasz egerekben ábra: A p53/rb-út. A: A p53-fehérje hatása a sejtciklusra; B: Az Rb-fehérje hatásmechanizmusa ábra: A p53-fehérje szabályozása és effektor mechanizmusai ábra: A VHL tumor szuppresszor fehérje hatásmechanizmusa A: hipoxiás állapot; B: normoxiás állapot ábra: A daganat klonális evolúciója (Az eltérő árnyalatú, illetve alakú szimbólumok genetikailag/epigenetikailag eltérő sejteket jelölnek.) ábra: A bőrrák stádiumai ábra: A colon carcinoma genetikai változásai ábra: Az emberi kromoszóma-szerelvény ábra: Az emberi kromoszómaszerelvény Giemsa-sávozással nyert mintázata ábra: A komparatív genom-hibridizáció elve xvii

18 Molekuláris sejtbiológia ábra: Tumorsejt génexpressziós profiljának vizsgálata (piros fluoreszcencia: csökkent génexpresszió a tumorban; zöld fluoreszcencia: fokozott génexpresszió a tumorban; sárga fluoreszcencia: nincs különbség; nincs fluoreszcencia: a gén nem expresszálódik) ábra: RFLP-analízis a sarlósejtes anaemiát okozó mutáció kimutatására ábra: Az allélspecifikus hibridizáció elve (A.) és alkalmazása sarlósejtes vérszegénység molekuláris diagnózisára (B.) ábra: A vadtípusú és mutáns PCR-primerek alkalmazásának elve (A.) és a módszer felhasználása a sarlósejtes vérszegénység diagnosztikájában (B.) ábra: A multiplex PCR elve. A: Exonok (E1-E4) és primerpárok (nyilak) egy génszakaszon; B: A génszakasz multiplex PCR-reakciókban amplifikált és gélelektroforézissel szétválasztott termékei vadtípusú (1. minta) és deléciót szenvedett (2-4. minta) DNS-preparátumok esetében ábra: A HIV-fertőzés gátlása antisense oligonukleotiddal ábra: Génterápia retrovirális vektorral ábra: Génterápia adenovírus vektorral xviii

19 A táblázatok listája táblázat: A molekuláris sejtbiológiában általánosan használt radioaktív izotópok táblázat: Az eukariota RNS-polimerázok jellemzői táblázat: Az mtdns-mutációk következményei az egyes szervekben táblázat: Néhány aktinkötő fehérje táblázat: Polipeptid növekedési faktorok táblázat: Jelátviteli ágensek aktiválásának és inaktiválásának néhány példája táblázat: Az apoptózis rendellenességei táblázat: A daganatsejtek főbb jellemzői táblázat: Néhány retrovirális onkogén jellemzői táblázat: Néhány humán celluláris onkogén jellemzői táblázat: A legfontosabb tumor szuppresszor gének jellemzői táblázat: Protoonkogének, tumor szuppresszor gének és mutátor gének jellemzői táblázat: Génterápiás vektorok jellemzői xix

20 Molekuláris sejtbiológia Szeberényi József Kiadás éve: 2011 Nordex Kft. Dialóg Campus Kiadó, 2011 Szeberényi József, 2011 ISBN: Kiadó: NORDEX KFT. Dialóg Campus Kiadó Műszaki szerkesztő: NORDEX KFT. Dialóg Campus Kiadó xx

21 Előszó a harmadik kiadáshoz 2009-ben a Johns Hopkins Egyetem Orvostudományi Karán - mely az Egyesült Államok legjobb orvoskarai közé tartozik radikális reformmal új orvosképzési stratégiát vezettek be. Ennek hátterében az a frusztráló tapasztalat állt, hogy miközben a molekuláris biológia tudománya az elmúlt évtizedekben lankadatlan sebességgel tört előre, az új eredmények következményei a vártnál és a kívánatosnál lassabban jelennek meg a klinikai orvoslásban. A szakértők véleménye szerint ennek fő oka, hogy a molekuláris genetika, genomika oktatása a graduális és posztgraduális orvosképzésben nem elég hatékony, így a gyógyítás frontvonalában dolgozó gyakorló orvosok többségének nincs esélye arra, hogy lépést tarthasson a tudomány fejlődésével, az általa kínált diagnosztikai és terápiás lehetőségekkel. A Johns Hopkins reform lényege a genomiális medicína (azaz a beteg DNS-e bázissorrendjéből nyerhető információk klinikai felhasználásának tudománya)oktatásának előtérbehelyezése volt a klinikai oktatásban és a továbbképzésben. Hogy az orvosképzési reform milyen eredményt hoz, azt csak évek múlva tudjuk meg. Az azonban biztos, hogy a sejtek és gének tudománya, a molekuláris sejtbiológia megérkezett a klinikai orvoslásba. A molekuláris patológia nélkülözhetetlen a betegségek kialakulási mechanizmusának tisztázásában, a molekuláris diagnosztika módszerei rutineljárásokká válnak és a génterápiával is számolni kell már, mint kezelési alternatívával. A Pécsi Tudományegyetem általános orvos, fogorvos és gyógyszerész képzésének Molekuláris sejtbiológia tárgya tankönyvének 3. kiadása megkísérel lépést tartani az elmúlt évek fejleményeivel. Az átdolgozott kiadás elkészítésében nagy segítséget kaptam lektoromtól, Molnár János professzortól. Éles szemmel vett észre minden szakmai tévedést, hiányosságot, stiláris gyarlóságot a készülő kéziratban. Lektori tevékenysége eredményeképpen javult a szöveg minősége, tartalmi és érthetőségi szempontból egyaránt. Javaslatai közül csak azokat nem tudtam figyelembe venni, melyek a könyv terjedelmét a kívánatosnál jobban megnövelték volna. Hálával tartozom alapos és lelkiismeretes munkájáért, tanácsaiért. A borítón látható, fibroblaszt sejtkultúrát ábrázoló összetett kép lézer pásztázó konfokális fluoreszcencia mikroszkóppal készült. A sejtmagok kék színe DNS-festés eredménye, a vörös szín az immuncitokémia segítségével jelölt foszfo-erk 1 és 2 fehérjék elhelyezkedését mutatja. A szürkés hátteret a mikroszkóp fáziskontraszt üzemmódjával, ugyanerről a látótérről készített szürkeskálás kép adja (Berta Gergely felvétele) július Szeberényi József Ajánlott irodalom Marshall, E. (2011): Waiting for the revolution. Science 331, xxi

Több megjelenítése