A PACAP SZEREPE A GONADOTROPH HORMON SZEKRÉCIÓ SZABÁLYOZÁSÁBAN. Doktori értekezés

Átírás

1 A PACAP SZEREPE A GONADOTROPH HORMON SZEKRÉCIÓ SZABÁLYOZÁSÁBAN Doktori értekezés VASZINÉ DR. SZABÓ ENIKŐ Semmelweis Egyetem Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézete SEMMELWEIS EGYETEM SZENTÁGOTHAI JÁNOS IDEGTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA NEUROENDOKRINOLÓGIA PROGRAM Programvezető: Dr. Liposits Zsolt, igazgatóhelyettes, MTA doktora Témavezető: Hivatalos bírálók: Dr. Köves Katalin egyetemi tanár, MTA doktora Med. Habil. Dr. Rékási Zoltán egyetemi docens, PhD Dr. Altdorfer Károly egyetemi adjunktus, PhD Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Rácz Károly egyetemi tanár, MTA doktora Dr. Kovács Krisztina, tud. főmunkatárs, MTA doktora Dr. Madarász Emilia, tud. főmunkatárs, MTA doktora BUDAPEST, 2006

2 TARTALOMJEGYZÉK Oldal RÖVIDÍTÉSEK 3 BEVEZETÉS 4 IRODALMI HÁTTÉR 6 A PACAP izolálása és karakterizálása 6 A PACAP receptorai és hatásmechanizmusa 8 A PACAP sorsa a receptorhoz való kötődés után 11 A PACAP eloszlása 12 A PACAP biológiai hatása 18 KÍSÉRLET CÉLJA 24 ANYAG ÉS MÓDSZER 25 Állatok 25 Cell Immunoblot Assay 26 Sandwhich Enzyme Immunoassay 29 Képanalízis 29 Kísérleti protokoll 30 KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK 31 MEGBESZÉLÉS 43 KÖVETKEZTETÉSEK 49 ÖSSZEFOGLALÁS 50 SUMMARY 51 IRODALOMJEGYZÉK 52 KÖSZÖNETNYILVÁNITÁS 67 MEGJELENT CIKKEK ÉS KONGRESSZUSI ELŐADÁSOK JEGYZÉKE 68 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ÉS ELŐADÁS ABSZTRAKTOK KÜLÖNLENYOMATAI 71 2

3 RÖVIDÍTÉSEK camp: ciklikus adenozin monofoszfát CIBA: cell immunoblot assay CRF: corticotroph hormon releasing hormon DAB: diaminobenzidin tetrahidrochlorid FSH: folliculus stimuláló hormon G s : guanozin kötő fehérje, GTP dependens adenilát ciklázt aktivál G q : guanozin kötő fehérje, phospholipase-c-t aktivál GTP: guanozin trifoszfát GnRH: gonadotroph hormon releasing hormon icv: intracerebroventrikuláris IP 3 : inozitol trifoszfát iv: intravénás LH: luteinizáló hormon M65: Maxadilan 65 mrna: messenger ribonukleinsav PACAP: pituitary adenylate cyclase activating polypeptide PAC1: PACAP 1 receptor P23-P27, P38, P6-30, P6-32, P6-38, P3-32: különböző számú aminosavból álló PACAP polipeptidek RT-PCR: revers transcript-polymerase chain reaction S-EIA: sandwich enzyme immunoassay VIP: vasoactive intestinal polypeptide VIP4-28, VIP10-28: különböző molekulasúlyú VIP polipeptidek VPAC1, VPAC2: VIP-et és PACAP-ot kötő közös receptor 3

4 BEVEZETÉS Számos külső inger, elsősorban fény impulzusok, befolyásolva egy belső biológiai órát, szabályozzák és összehangolják a neuroendokrin rendszer cirkadian oszcillatorikus működését. Scharrer (1964) elképzelése szerint a fényimpulzusok a nervus opticuson keresztül nemcsak a látóközpontot érik el, hanem a hypothalamusban lévő biológiai órát, a nucleus suprachiasmaticust is, ennek a magnak belső, saját ritmusát befolyásolva biológiai ritmusokat szabályoznak (lásd Klein és mtsai, 1991), többek között nőstény patkányban a hypothalamo-hypophysealis gonad rendszer ciklusos működését is. A hypothalamo-hypophysealis-gonad rendszer működésének szabályozásában számos neuropeptid, neurotranszmitter vesz részt. A legfontosabb ezek közül a gonadotroph hormon releasing hormon (GnRH), amelyet Schally és munkatársai izoláltak 1971-ben. Immunhisztokémiai vizsgálatok kiderítették, hogy ez a peptid patkányban elsősorban a septum medialis részében és a preopticus areaban termelődik (Baker és mtsai, 1975; Sétáló és mtsai, 1975). Innen indul el a GnRH pálya, amelynek rostjai az eminentia mediana felületes zonájában végződnek (Sétáló és mtsai, 1976, Merchenthaler és mtsai, 1980). Ez a tíz aminosavból álló peptid fokozott mértékben szintetizálódik az ovulációt megelőző napon délelőtt, amellyel egyidőben nő a perifériás vérben az oestrogen szint. Konstans megvilágítási viszonyok mellett (5-19 óra világos periódus), délután óra között (ún. kritikus periódus) ürül a GnRH a portalis vérbe. Ez a fokozott GnRH kidobás hozza létre a luteinizáló hormon (LH) fokozott kidobását (LH surge) a keringésbe, előidézve az ovulációt (1. ábra, A). Intakt nőstény patkányban az ovuláció négy- vagy ötnaponként következik be, azaz az állatnak négy- vagy ötnapos ciklusa van. A GnRH ciklusos elválasztását az ovariális, majd uterinális ciklus követi. Ugyancsak ciklusosan változik a hüvelykenet citológiai képe. A kenetvétel egy non-invaziv módszer, amely alkalmas a ciklus stádium megállapítására (1. ábra, B). A tizenöt évvel ezelőtt izolált és karakterizált hypophysis adenilát cikláz aktiváló polipeptidről (Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide, PACAP) is kiderült, hogy szerepet játszik a gonadotroph hormon szekréció szabályozásában. 4

5 1. ÁBRA 5

6 IRODALMI HÁTTÉR A PACAP izolálása és karakterizálása A PACAP adenilát cikláz enzim aktiváló tulajdonsága alapján izolálták birka hypothalamusból (Miyata és mtsai, 1989). A PACAP génjét elöször emberi here génkönyvtárból izolálták (Kimura és mtsai, 1990). A gén emberben a 18. kromoszóma rövid karján, a P11-es lókuszon található és 2681 nukleotidból áll (Hosoya és mtsai, 1992). A PACAP két bioaktív amidált formában van jelen, egy 27 aminosavból (P27) és egy 38 aminosavból (P38) álló formában. A P38 a C terminálison 11 aminosavval hosszabb, így magába foglalja a P27 teljes szekvenciáját. A P27 és a P38 egy 176 aminosavból álló prekurzorból származik (2. ábra). A birka és az emberi propeptid 82%-os homológiát mutat a patkány PACAP propeptiddel (Ogi és mtsai, 1990). A PACAP aminosav szekvenciája birka, patkány és emberi szervezetben azonos, és a biológiailag aktív regió szekvenciája az evolúció során nem változott (lásd Vaudry és mtsai, 2000), nem emlős PACAP-ban is ugyanaz. A P38 a szervezetben nagyobb arányban van jelen, mint a P27. Az összes PACAP 90%-a P38, és csak 10%-a P27 (Arimura és mtsai, 1991). A PACAP karakterizálása során kiderült, hogy 68%-ban mutat szerkezeti homológiát a secretin családba tartozó vazoaktív intesztinális polipeptiddel (Vasoactive Intestinal Polypeptide, VIP) (Miyata és mtsai, 1989) (3. ábra). Ebbe a peptid családba tartozik többek között a peptid histidin isoleucin, helodermin, helospectin, secretin és a glucagon is. A secretin-család tagjai jelentős mennyiségben fordulnak elő az idegrendszer mellett az emésztőtraktusban is, így gasztrointesztinális peptideknek is tekinthetők. Gyakran találkozunk az irodalomban a brain-gut" peptid elnevezéssel. Ez természetesen nem azt jelenti, hogy ebbe a csoportba tartozó peptidek nem fordulnak elő más szervrendszerekben. A központi idegrendszer és az emésztőtraktus mellett a brain-gut peptidek közül több megtalálható a légző és a reproduktív rendszerben, de a kiválasztó rendszer és a nyirokrendszer sem kivétel. 6

7 PACAP38 PACAP27 VIP H-S-D-G-I-F-T-D-S-Y-S-R-Y-R-K-Q-M-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L-G- K-R-Y-K-Q-R-V-K-N-K-CONH2 H-S-D-G-I-F-T-D-S-Y-S-R-Y-R-K-Q-M-A-V-K-K-Y-L-A-A-V-L- CONH2 H-S-D-A-V-F-T-D-N-Y-T-R-L-R-K-Q-M-A-V-K-K-Y-L-N-S-I-L-N- CONH2 3. ábra. PACAP27, PACAP38 és VIP szekvenciája. A fekete színnel jelölt aminosavak mindhárom peptidben azonosak. A piros színű aminosavak a PACAP-ra jellemzőek, a zöld színnel jelöltek a VIP-ben fordulnak elő. 7

8 A PACAP receptorai és hatásmechanizmusa A PACAP a szervezetben hatását specifikus membrán receptorokon keresztül fejti ki. A receptornak hét transzmembrán valamint egy G proteinkötő doménje van (4. ábra). A receptor szerkezetében hasonló a secretin családba tartozó peptidek más receptorához. A PACAP N-terminális vége játszik szerepet a receptor aktivációban (Gourlet és mtsai, 1991); C-terminális vége a kötőhely felismerést segíti (Gourlet és mtsai, 1996). A PACAP-nak három receptorát irták le (Pisegna és mtsai, 1993, Ogi és mtsai, 1993, Miyamoto és mtsai, 1994, Journot és mtsai, 1995), amelyekhez a PACAP és a VIP különböző mértékben kötődik. A PAC1 két-három nagyságrenddel nagyobb affinitást mutat PACAP-pal szemben, mint VIP-pel szemben. Két fő típusa ismert: a PAC1A a P27-t és P38-t azonos mértékben köti, a PAC1B százszor nagyobb affinitást mutat P38 iránt. A PAC1 receptornak több splice variánsa létezik. A splice variánsokat egy vagy két aminosavból álló kazetta hiánya vagy megléte hozza létre (Journot és mtsai, 1994), amelyek más-más second messenger mechanizmust feltételeznek. A hosszabb forma a harmadik intracelluláris hurkon hip, hop1, vagy hop2 kazettát tartalmaz. A PAC1 receptorok e variánsai G-protein kapcsolt hatásmechanizmussal működnek hasonlóan a calcitonin, a secretin és a parathormon receptorokhoz. G s proteinen keresztül GTP dependens adenilát ciklázt aktiválnak, így növelik az intracelluláris camp szintet. Ez a mechanizmus feltehetőleg a szabályozott fehérje, vagy peptid mrna expresszióját fokozza (Ishizaka és mtsai, 1993) (4. ábra). A ligand rövidebb formához kötődése, amely sem hip, sem hop kazettát nem tartalmaz phospholipase-c-t aktivál. G q proteint aktiválva a phospholipase-c rendszeren keresztül növeli az intracelluláris Ca 2+ szintet. Ez történhet azáltal, hogy az intracelluláris raktárakat üríti ki IP 3 közvetítésével, ez egy gyors Ca 2+ mobilizáció (Pantaloni és mtsai, 1996) (5. ábra). Egy másik splice variáns, amelyben szubsztitució jön létre a II. és IV. transzmembrán szakasz szekvenciájában, L típusú feszültség függő Ca 2+ csatornákat nyit meg a sejtmembránban, amely egy lassúbb mechanizmus (Chatterjee és mtsai, 1996). Ez a mechanizmus hypophysis mellső lebenyből LH kidobást aktivál (6. ábra). A VPAC1 a PACAP-ot és a VIP-et azonos affinitással köti. Valójában ez a VPAC1 azonos a klasszikus VIP receptorral (Usdin és mtsai, 1994). A VPAC1 egy Ca 2+ dependens 8

9 4.5.6.ábra 9

10 intracelluláris Ca 2+ növelő folyamatot aktivál, amely feltehetőleg nem a phospholipase- C kaszkádot veszi igénybe (Rawlings és mtsai, 1993, Sreedharan és mtsai, 1994, Journot és mtsai, 1995). A VPAC2 receptoron a PACAP nem VIP-vel, hanem heloderminnel osztozik (Sreedharan és mtsai, 1993, Couvineau és mtsai, 1994, Usdin és mtsai, 1994, Adamou és mtsai, 1995). A PAC1 receptornak ismert szelektív agonistája a Maxadilan, egy természetes peptid, amelyet a Lutzomyia longipalpis, hétköznapi nevén homoki légy nyálmirigyéből vontak ki (Moro és Lerner, 1997). Agonistaként ismert a C-terminálison rövidebb P23, P24, P25, P26 (Gourlet és mtsai, 1996). Az első öt aminosav elhagyása antagonistát eredményez. Ez a P6-38 (Robberecht és mtsai, 1992). PAC1 receptor antagonista továbbá a Maxadilan 65 (M65) (Fizzane és mtsai, 2004). Mindkét VPAC receptor agonistája az egy aminosavval szubsztituált VIP (Gozes és mtsai, 1995). A PACAP C-terminálison rövidebb formái közül a P23, P24, P25, P26 agonistája a VPAC1 receptornak, míg a VPAC2 receptornak csupán a P25 és P26 (Gourlet és mtsai, 1996). VPAC1 szelektív agonistája az N-terminálison rövidebb VIP4-28 (Summers és mtsai, 2003) és a P6-30, P6-32, P6-38 (Gourlet és mtsai, 1995). VPAC2 receptor szelektív agonistája a P3-32 (Gourlet és mtsai, 1995) és egy ciklikus peptid a Ro (Xia és mtsai, 1997). A VPAC receptorok nem specifikus kompetitív antagonistája a szintetikus 4Cl D - Phe 6, Leu 17 - VIP (Pandol és mtsai, 1986) és a VIP10-28 (Turner és mtsai, 1986). A VPAC receptorok antagonistája Met- Hybrid, Neurotensin6-11-VIP7-28 (Gozes és mtsai, 1995). VPAC1 receptor antagonista a PG (Fizzane és mtsai, 2004). VPAC2 receptor antagonista az N-terminálison rövidebb VIP4-28 (Summers és mtsai, 2003) és az N-terminálison rövidebb P6-38 (Fizzane és mtsai, 2004). A PACAP receptorok széles eloszlást mutatnak a szervezetben. A kölünböző receptorok az egyes szervekben más-más arányban vannak jelen. Magas koncentrációban lehet kimutatni PAC1 receptort az agyban (Masuo és mtsai, 1991), az adenohypophysisben (Vígh és mtsai, 1993), a mellékvesevelőben (Shivers és mtsai, 1991), a testisben, az ovariumban és a pancreasban (Usdin és mtsai, 1994). A receptor mrna legnagyobb mennyiségben a cortex cerebriben (Masuo és mtsai, 1991), a cortex cerebelliben, a hippocampusban, a bulbus olfactoriusban, a gyrus dentatusban, az area postremaban és a nucleus supraopticusban expresszálódik (Shioda és mtsai, 1997). A 10

11 VPAC1 receptor a központi idegrendszer mellett megtalálható a tüdőben (Lam és mtsai, 1990), a májban (Usdin és mtsai, 1994), a thymusban (Waschek és mtsai, 1995), a mellékvesevelőben (Usdin és mtsai, 1994) és a gasztrointesztinális traktusban (Gottschall és mtsai, 1990). VPAC1 receptor mrna legnagyobb mennyiségben a cortex cerebelliben, a hippocampusban, a bulbus olfactoriusban, a gyrus dentatusban, az area postremaban és a nucleus supraopticusban expresszálódik (Shioda és mtsai, 1997). VPAC2 receptor mrna teljesen más eloszlást mutat, és feltehetőleg kiegészíti a VPAC1 receptor eloszlását. VPAC2 receptor mrna van a thalamusban, a nucleus suprachiasmaticusban, a nucleus amygdalae centralisban és a nuclei pontisban (Usdin és mtsai, 1994, Sheward és mtsai, 1995). A periférián VPAC2 receptor mrna található a szívben (Adamou és mtsai, 1995), a tüdőben (Lam és mtsai, 1990), a pancreasban, az adenohypophysisben, az ovariumban és a gasztrointesztinális traktusban (Usdin és mtsai, 1994). A PACAP sorsa receptorhoz való kötődés után A PACAP más ligandhoz hasonlóan a sejt felszínén lévő receptorhoz kötődik, majd a receptorhoz való kötődés után azzal együtt internalizálódik. Ez a folyamat az endocytosis. A receptor-ligand interakcióban a PACAP receptor C-terminalis végén található es pozicióban lévő négy aminosav, arginin, serin, tyrosin és lysin játszanak alapvető szerepet (Pisegna és mtsai, 2000). Arra vonatkozóan, hogy mi történik a felesleges PACAP-pal az extracelluláris térben, nincsenek kísérleti adatok. A receptort tartalmazó sejt felszínén lévő peptidázok valószínüleg lebontják. A legjobban tanulmányozott lebontó enzim a neutralis endopeptidáz (lásd Böhm és mtsai, 1997). PACAP sejten belüli sorsára vonatkozóan szintén nincsenek kísérleti adatok. Valószínűleg hasonló a sorsa, mint más receptorral együtt internalizálódott ligandnak. A receptor foszforilálódik, majd clathrin és β-arrestin közbejöttével endosomába kerül. Endosomalis acidificatio választja le a ligandot a receptorról. A receptor recirkulál, újra kiül a sejtfelszínre, a ligand pedig lysosomában degradálódik (lásd Trowbridge és mtsai, 1993). A PACAP eloszlása 11

12 A PACAP megtalálható a központi és perifériás idegrendszerben és a szervezet más szöveteiben is. A PACAP eloszlását vizsgálták idegi és nem idegi elemekben. Az eredmények azt mutatják, hogy a PACAP szinte mindenhol megtalálható a szervezetben. PACAP immunreaktivitást írtak le a hypothalamusban, ahonnan a peptidet izolálták, és számos más extrahypothalamikus struktúrában: a septumban, a hippocampusban, habenulában, az amygdalaban, a thalamusban, különböző kérgi területeken és néhány agytörzsi struktúrában is (Köves és mtsai, 1990, 1991, Piggins és mtsai, 1996, Hannibal és mtsai, 1995, Légrádi és mtsai, 1994, Palkovits és mtsai, 1995, Kausz és mtsai, 1999) (7. ábra). A peptid azonban nemcsak a központi, de a perifériás idegrendszerben is jelen van. PACAP immunreaktív idegrostok mutathatók ki a gasztrointesztinális rendszerben is, a lamina propriaban, a tunica submucosaban, a lamina muscularis mucosaeban és a tunica muscularis externában (Sundler és mtsai, 1992, Köves és mtsai, 1993) (8. ábra). PACAP pozitív sejtek mutathatók ki a gyomor és a vékonybél plexus myentericusában (Portbury és mtsai, 1995). A reproduktív szervek simaizomzatában PACAP immunreaktív rostok találhatók (Fahrenkrug és mtsai, 1996). A pancreasban mind az exokrin (Köves és mstai, 1993), mind az endokrin részben található PACAP immunreaktivitás (Filipsson és mtsai, 1998). Az exokrin mirigyek között PACAP immunreaktív idegrostok találhatók (Fridolf és mtsai, 1992), míg a Langerhans szigetekben a β-sejtek PACAP immunpozitívak (Yada és mtsai, 1996). A nyálmirigyekben (Hauser-Kronberger és mtsai, 1992) és a fog pulpában (Ichikawa és mtsai, 2003) is mutattak ki PACAP immunreaktív rostokat. Ezzel összhangban PACAP immunreaktivitás látható a primer érző ganglionokban, így a ganglion trigeminale és a ganglion spinale idegsejtjeiben is (Moller és mtsai, 1993, Kausz és mtsai, 1998) (8. ábra). PACAP immunreaktív rostok figyelhetők meg a perifériás szervek (húgyhólyag falában: Moller és mtsai, 1993, bélfalban: Köves és mtsai, 1993) és a központi idegrendszer ereinek falában (Baeres és Moller, 2004) (8. ábra). 12

13 7. ábra 13

14 8. ábra 14

15 A perifériás idegrendszerben a VIP és a PACAP gyakran koexpresszálódik ugyanabban a sejtben (Sundler és mtsai, 1992); azonban a hypothalamusban nincs koexpresszió a VIP és PACAP között (Vereczki és mtsai, 2003). Ez a morfológiai megfigyelés is arra utal, hogy a két peptidnek egymástól eltérő a szerepe a központi idegrendszerben. A PACAP legnagyobb koncentrációban a hypothalamusban mutatható ki (Arimura és mtsai, 1991). Birkában PACAP pozitivitás figyelhető meg a nucleus supraopticusban és a nucleus paraventricularisban (Köves és mtsai, 1990). A PACAP immunreaktív rostok részben az eminentia mediana zona externájában, részben az eminentia mediana zona internán átfutva a hypophysis hátsó lebenyében végződnek. Ugyanezeket figyelték meg pókmajom és ember idegrendszerében is (Vígh és mtsai, 1991). Intakt patkányban a PACAP alig festhető a hypothalamusban, azonban kolhicin kezelés, hypophysectomia, vagy hypophysis nyélátmetszés után intenzív PACAP festés figyelhető meg a nucleus supraopticusban és nucleus paraventricularisban, a commissura anterior magjában és a nucleus periventricularis anteriorban (Köves és mtsai, 1994) (9. ábra). PACAP neuronok patkányban a nucleus paraventricularis magnocellularis részének ventralis és periventricularis sejtcsoportjában vannak. Egy retrograd tracer, a Fast Blue intraperitonealis beadása után a központi idegrendszer azon részein, ahol hiányzik a vér-agy gát, ilyenek az eminentia mediana zona externájának kapilláris hurkai és a hypophysis hátsó lebenyének erei, idegrostok felveszik és a sejttestjük felé szállítják a tracert. Intakt állatban mind a hátsó lebenybe belépő magno-, mind az eminentia mediana kapillaris hurkai körül végződő parvocelluláris sejtek perikaryonja jelölődnek. Ha pengebeültetéssel a hypophysis nyélen át megakadályozták a tracer bejutását a hátsó lebeny felöl, akkor csak hypophyseotroph neuronok jelölődtek. Ezek között voltak olyanok, amelyek PACAP immunreaktivitást mutattak, azaz hypophyseotrophok. Ezek az eminentia medianaban végződő PACAP tartalmú rostok patkányban csak speciális körülmények között tartalmaznak annyi PACAP-ot, ami immunfestéshez elegendő, például kolhicin kezelés, hypophysectomia (10. ábra), nyélátmetszés vagy szemeltávolítás után. A kolhicin kezelés, hypophysectomia és nyélátmetszés az ürülést gátolja, míg szemeltávolítás után a termelt PACAP mennyisége nő. 15

16 9. ábra Hypothalamus SO, PV 16

17 10. ábra EM 17

18 A PACAP valóban ürül a portalis kapillárisokba, mert Dow és munkatársai (1994) kimutatták, hogy a PACAP koncentrációja magasabb a hypophysis portális vérben, mint az általános keringésben. A fenti adatok arra utalnak, hogy a hypothalamikus PACAP nemcsak a hypophysis hátsó lebenyében szabadulhat fel, hanem elérheti a mellső lebenyt, és résztvesz annak szabályozásában is. RT-PCR és immunhisztokémiai módszer segítségével tett megfigyelések arra utalnak, hogy számos más neuropeptid mellett a PACAP is szintetizálódik az adenohypophysisben. Radleff-Schlimme és munkatársai (1998) RT-PCR technika segítségével PACAP gén expressziót találtak hypophysis mellső lebenyében (11. ábra). Köves és munkatársai (1998) immunhisztokémiai festéssel hím és a ciklus prooestrus stádiumában lévő nőstény patkányban az adenohypophysisben kerek és ovális PACAP immunreaktív sejteket figyeltek meg. A sejtek eloszlása jellegzetes volt. Legnagyobb számban a mellső lebeny úgynevezett gonadotroph zónájában voltak megfigyelhetők. A PACAP pozitív sejtek eloszlása hasonló volt a gonadotroph sejtek eloszlásához, de az utóbbiak nagyobb számban fordultak elő. Kettős festést alkalmazva a PACAP immunreaktivitás sok esetben LH illetve folliculus stimuláló hormon (FSH) immunreaktivitással kolokalizált (12. ábra). A PACAP megtalálható az endokrin rendszer más szerveiben is. Patkány testisben PACAP immunreaktivitás a fejlődő ivarsejtekben figyelhető meg (Shioda és mtsai, 1994), a kifejlett spermiumban nem; nőstényben, az ovariumban a PACAP immunreaktivitás a preovulációs follikulus granulosa sejtjeiben van jelen, ahol in situ hibridizációs módszerrel is kimutatták (Gräs és mtsai, 1996), tehát csak átmenetileg expresszálódik. PACAP található a pancreas Langerhans-sziget β-sejtjeiben (Yada és mtsai, 1996), a mellékpajzsmirigyben (Luts és Sundler, 1994) és a mellékvesevelő chromaffin sejtjeiben (Frödin és mtsai, 1995). A PACAP biológiai hatása A PACAP biológiai hatása nagyon sok féle: neuroendokrin hormon, neurotranszmitter és neuromodulátor, neuroprotektív faktor és fejlődést befolyásoló, trophicus faktor. 11.ábra 18

19 19

20 12. ábra 20

21 Munkám a PACAP hypophysis mellső lebenyben játszott szerepével foglalkozik, ezért csak neuroendokrin szerepére vonatkozó kísérleti adatokat tekintem át részletesen. A PACAP a központi idegrendszerben legnagyobb mennyiségben a hypothalamus magnocelluláris magvaiban található, ahol a PACAP immunreaktivitás részleges kolokalizációt mutat arginin vasopressin (Takahashi és mtsai, 1994) és oxytocin immunreaktivitással (Köves és mtsai, 1994). Miután az oxytocin és a vasopressin egymással nem kolokalizál (Dierickx és mtsai, 1979), az oxytocin vagy vasopressin tartalmú PACAP sejtek külön sejtpopulációt képeznek. A nucleus supraopticusba és a nucleus paraventricularisba adott PACAP fokozza a neuronok kisülésének gyakoriságát, és membrán depolarizációt idéz elő (Uchimura és mtsai, 1996). A magból a PACAP immunreaktív rostok, mint tractus supraopticoparaventriculo-hypophyseos, az eminentia mediana zona internáján keresztül a hypophysis hátsó lebenyébe lépnek ben Murase és munkatársai leírták, hogy az icv adott PACAP serkentette a vasopressin, de nem befolyásolta az oxytocin kidobást. Azonban férfiban, iv infúzióban adva fokozta a vasopressin szekréciót, de az oxytocin elválasztást nem befolyásolta (Chiodera és mtsai, 1995). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a PACAP részt vesz a hátsó lebeny működésének szabályozásában. A PACAP egy lehetséges hypophyseotroph faktor. A hypothalamusban termelt PACAP az eminentia mediana zona externáján át bejuthat a hypophysis portális keringésébe, és így a hypophysis mellső lebenyében endokrin módon befolyásolhatja annak működését. A PACAP megfelel a klasszikus kritériumoknak, amely szerint hypophyseotroph faktornak lehet nevezni. 1. PACAP mutatható ki a portalis erek körül található idegvégződésekben az eminentia mediana zona externájában (Köves és mtsai, 1991) (10. ábra). 2. A PACAP koncentrációja magasabb a hypophysis portalis vérben, mint az általános keringésben (Dow és mtsai, 1994). 3. Magas affinitású PACAP receptorok találhatók az adenohypophysisben (Gotschall és mtsai, 1990, Vígh és mtsai, 1993, Rawlings és mtsai, 1996). 4. PACAP adenohypophysis sejtkultúrából hormon kidobást eredményez (Miyata és mtsai, 1989, Tsujii és mtsai, 1994). 5. A PACAP hiánya befolyásolja a hypophysis mellső lebeny működését. Elsősorban súlyos metabolikus és hőszabályozási zavart eredményez. Olyan egér populációban, 21

22 amelyek megérik az ivarérett kort, az ovuláció előfordulási aránya a kontroll állatokhoz képest csökkent (Sherwood és mtsai, 2005). Miután a PACAP szintetizálódik a hypothalamo-hypophysealis-gonad tengely mindhárom szintjén, ezért nyilvánvaló, hogy szerepet játszik a rendszer működésében. Szabályozó szerepét in vivo és in vitro kísérletek támasztják alá. In vivo hím patkányokban a P38 icv adminisztrációja, vagy iv adott infúziója növelte a plazma LH szintet (Osuga és mtsai, 1992, Leonhardt és mtsai, 1992). Ovariektomizált birkában az icv bejuttatott P38 csökkentette az LH pulzusok amplitúdóját és frekvenciáját (Sawangjaroen és Curlewis, 1994), és patkányban a prooestrus délutánján az un. kritikus periódus" előtt, amikor az idegrendszer felkészül a fokozott GnRH kidobásra, az icv adott P38 gátolta a másnap esedékes ovulációt, míg iv adva nem befolyásolta azt (Köves és mtsai, 1996). Ez utóbbi megfigyelés arra utal, hogy a PACAP LH surge gátló hatását nem a hypophysis szintjén, hanem a hypothalamuson át fejti ki. Ezt a gátló hatást corticotroph hormon releasing hormon (CRF) és endogén opioidok közvetítik, mert CRF antagonista és naloxon a gátló hatást jelentős mértékben visszafordította (Kántor és mtsai, 2001). Férfiban a PACAP iv infúziója nem befolyásolta az LH illetve az FSH szintet (Hammond és mtsai, 1993). A fenti in vivo kísérletek arra utalnak, hogy a PACAP hatása függ a fajtól, a nemtől és a beadás módjától (1. táblázat). Beadott Beadás Faj és nem Válaszreakció Anyag módja P38 icv hím patkány LH pl P38 iv hím patkány LH pl P38 icv ovx birka LH f,a P38 icv (pro) patkány ovuláció P38 iv (pro) patkány ovuláció P38 iv férfi LH pl 1. táblázat. A PACAP in vivo hatása az LH szekrécióra és az ovulációra különböző speciesekben intracerebroventricularis (icv) és intravénás (iv) beadás után. ovx = ovariektomizált; pro = prooestrus stádiumban lévő állat; pl = plazma; f = frekvencia; a = amplitúdó; = nincs válasz; = emelkedés; = csökkenés. 22

23 A PACAP in vitro primer hypophysis mellső lebeny sejtkultúrában gyengén stimulálta az LH és FSH kidobását (Ortman és mtsai, 1999), GnRH-val együtt adva, potenciálta annak hatását gonadotroph sejtvonalon (Culler és Paschall, 1991). Négy órás oestradiol kezelés tovább fokozta mind a basalis, mind a GnRH vagy PACAP stimulált LH kidobást. Progesteron még tovább növelte az oestradiol hatását. Ha a hypophysis sejteket hosszú idejű oestradiol és progesteron hatásnak tették ki, a sejtek GnRH-ra és PACAP-ra adott LH válasza csökkent (Ortman és mtsai, 1999). Fenti szerzők azt is vizsgálták, hogy milyen second messenger mechanizmus vesz részt ezekben az interakciókban. A rövid idejű oestradiol növelte a camp accumulatiot mind a GnRH stimulált, mind a nem válaszoló LH sejtekben. Ugyanakkor a hosszú idejű oestradiol kezelés a PACAP stimulált camp produkciót gátolta. Míg más szerzők munkájából ismert, hogy a GnRH az LH releaset foszfatidil inozitol rendszeren keresztül serkenti, a PACAP L típusú feszültség függő Ca 2+ csatornát megnyitva fokozza az LH kidobást. Míg in vitro gonadotroph sejttenyészetben a PACAP potenciálta a GnRH hatását az LH kidobásra (Culler és Paschall, 1991), addig perifúziós rendszerben a PACAP egyszeri alkalommal megnövelte a hypophysis mellső lebeny sejtek LH szekréciójának amplitúdóját, ezt követően az LH basalis szintre esett vissza, a sejtek rezisztensé váltak PACAP iránt. Hasonló válaszreakciót kaptak állandó GnRH adás esetén. Mediumban állandóan jelenlévő PACAP növelte a pulzálisan adott GnRH előidézte LH szekréció amplitúdóját (Tsujii és mtsai, 1994). A 2. táblázat összefoglalja a PACAP hatását a hypophysis mellső lebeny gonadotroph sejtjeinek LH szekréciójára in vitro rendszerekben: primér sztatikus sejtkultúrában és dinamikus perifúziós rendszerben. Sztatikus kultúrában a PACAP, az oestrogen és a progesteron potenciálták a GnRH hatását rövid idejű tenyésztés esetén, míg ha hosszabb ideig történt a kezelés, akkor ezek a hormonok gátló hatásúak voltak. Perfúziós rendszerben a PACAP és a GnRH hatása függ attól, hogy a perfúziós folyadékban állandóan vagy impulzusokban vannak jelen ezek a hormonok. Beadott anyag és In vitro modell Válaszreakció a beadás módja 23

24 P38 GnRH E P primer sejtkultúra LH secr. primer sejtkultúra LH secr. 4h primer sejtkultúra LH secr. 4h primer sejtkultúra LH secr. hossz primer sejtkultúra LH secr. pulz perifúziós rendszer LH a áll perifúziós rendszer LH a áll pulz perifúziós rendszer LH a 2. táblázat. A PACAP hatása az LH szekrécióra in vitro modellben (primer sejtkultúrában és perifúziós rendszerben). Pulz = pulzatilis adagolás; áll = PACAP vagy GnRH állandó koncentrációban található az átfolyó mediumban; 4h = 4 órás oestrogen és oestrogen-progesteron kezelés; hossz = oestrogen és progesteron hosszan tartó jelenléte a mediumban; a = amplitúdó; secr. = szekréció; = nincs változás; = LH emelkedése; = LH csökkenése. KÍSÉRLET CÉLJA Az irodalmi adatokból egyértelmű, hogy a PACAP mind hím, mind nőstény patkányban szintetizálódik a hypothalamo-hypophysealis-gonad tengely minden szintjén, azonban expresszióját számos tényező befolyásolja. A központi idegrendszerben mennyisége változik a kísérleti állatok korától és a megvilágítási viszonyoktól függően. Patkányban az ontogenezis során mennyisége növekszik a második hónap végéig, majd szintje a későbbiekben konstanssá válik (Masuo és mtsai, 1994). A fény-sötét periódustól függően is változást mutat a PACAP szint. Patkány nucleus suprachiasmaticusában (Fukuhara és mtsai, 1997), és csirke agytörzsében és közti agyában (Józsa és mtsai, 2001) koncentrációja magasabb a sötét, mint a világos periódusban. Cell immunoblot assay (CIBA) és sandwich enzyme immunoassay (S-EIA) segítségével a következő kérdésekre kerestük a választ: 1. A PACAP ürül-e in vitro a hypophysis mellső lebeny sejtekből? 24

25 2. Ha igen, a PACAP-ot milyen sejtek ürítik. 3. A PACAP S-EIA segítségével mérve milyen értéket mutat a mellső lebenyben fiziológiás körülmények között? 4. A PACAP ürítés in vitro függ-e a nemtől, nőstényben a ciklus stádiumtól és függ-e a napszaktól, amikor az állatokat feláldoztuk? 5. Az LH ürítés in vitro függ-e a nemtől, nőstényben a ciklus stádiumtól és a napszaktól, amikor az állatokat feláldoztuk? 6. A PACAP in vitro befolyásolja-e a gonadotroph sejtek LH ürítését, és a gonadotroph sejtek PACAP iránti érzékenysége függ-e a nemtől, nőstényben a ciklus stádiumtól és a napszaktól, amikor az állatokat feláldoztuk? 7. A PACAP in vitro milyen koncentrációban befolyásolja a gonadotroph sejtek LH ürítését, és ez a koncentráció közel áll-e a fiziológiás mennyiséghez? ANYAG ÉS MÓDSZER Állatok Kísérleteinket 3-4 hónapos Sprague-Dawley (CRL:CD) patkányokon végeztük. Az állatokat 22±2 C-on tartottuk, konstans fényviszonyok között (világos periódus: 5-19 óráig). A ciklus prooestrus és dioestrus stádiumában lévő nőstény és hím patkányokat használtunk a kísérleteinkhez. A nőstény patkányok ciklus stádiumát hüvelykenet alapján határoztuk meg. A kísérleti állatoktól naponta kenetet vettünk. A kenetet metilén kékkel megfestettük, és megvizsgáltuk a citológiai képet. Csak azokat az állatokat használtuk, amelyek két egymást követő szabályos négy napos ciklust mutattak. A hím patkányokat random módon választottuk ki. Az állatokat a 1986-os strasbourgi a kísérleti és más tudományos célokra használt gerinces állatok védelmére megalakult európai egyezmény szabályai szerint kezeltük (Engedély szám: 27-37/99). Cell Immunoblot Assay (CIBA) 25

26 Sejttenyésztés: A kísérleti állatok hypophysisét CIBA segítségével dolgoztuk fel (Arita, 1993; és Cimini, 1994, Nemeskéri által módosítva). Az állatokat dekapitációval öltük meg, a hypophysiseket steril körülmények között azonnal kivettük és minimal essential mediumban (GIBCO EUROPE-Cat N o ) többször átmosva sztereomikroszkóp alatt szabályos darabokra vágtuk. Spinner flaskába (Bellco-Cat N o ) kimért 10 ml 0.11% trypsines (Sigma-T4799) és 0,1% bovine serum albumint (Sigma-A8551) tartalmazó minimal essential mediumba helyeztük a hypophysis darabokat lekerekített végű Pasteur-pipettával. Ez után 37 o C-on Penicillin-Streptomycin jelenlétében inkubáltuk vigyázva, hogy önálló sejteket kapjunk, de azok épek maradjanak. Egy 2-3 hónapos állat esetében ez körülbelül kétszer 15 perc. Az inkubáció alatt két alkalommal 5% CO 2 95% levegő keverékével dúsítottuk és alkalommal, Pasteur pipettával agitáltuk. A sejt szuszpenziót centrifugáltuk 1000-es fordulatszámon 37 o C-on 10 perc alatt. A felülúszót leöntöttük. Szeparálás után a sejteket haemocytometerben megfestettük. A trypánkéket élő sejtek nem veszik fel. Impermeábilisak a festékkel szemben (Freshney, 1994). Néhány sejt mutatott festést, becslésünk szerint a sejtek 95 %-a szeparálás után élt. A sejt szuszpenziót annyira higítottuk fel Dulbecco's Modified Eagle's Mediummal (GIBCO BRL-Cat N o ), hogy minden 15μl-nyi cseppben 7000 sejt legyen. Kis méretű egyszer használatos steril Petri-csészékbe (Greiner Labortechnik-35/10mm) steril rozsdamentes rácsokat helyeztünk, amelyekre 5X5 mm-es "supported" nitrocellulóz membránokat (BIO-RAD Laboratories) tettünk. A Petri-csészébe 650μl Dulbecco's Modified Eagle's Mediumot, a membránokra 15μl-nyi szuszpenziót helyeztünk. A sejteket 22 óráig tenyésztettük 37 o C-on 5% CO 2-95% levegő jelenlétében. A tenyésztési idő alatt a sejtek által ürített hormont és peptideket a nitrocellulóz membrán megkötötte, amelyeket immunfestéssel tettünk láthatóvá (13. ábra). 26

27 13. ábra. Nitrocellulóz membránok rozsdamentes rácsokon. Immuncitokémia: A tenyésztés után a membránokat 4%-os paraformaldehid oldatban (ph 7,4) fixáltuk, átmostuk 1% Tween-t tartalmazó Tris pufferrel, majd 10%-os bovine serum albuminnal. Ezt követően hozzáadtuk az LHβ (1:10000) illetve PACAP (1:6000) ellenanyagot. Az LHβ ellenanyag tengerimalacban készült (NIDDK-NHPP, University of Maryland, Baltimore). A PACAP ellenanyag nyúlban készült Arimura laboratóriumában, ott történt az ellenanyag jellemzése is (Köves és mtsai, 1990, 1991). Az ellenanyag felismeri mind a PACAP38-t, mind a PACAP27-et. A PACAP illetve az LH ellenanyaggal történt inkubálás után a következő napon ismét átmostuk a membránokat 0,1M foszfát pufferrel, majd rátettük a biotinált tengerimalac illetve nyúl immunglobulin ellen termelt ellenanyagot (Vectastain ABC kit, Vector). Másnap ismét átmostuk a membránokat 0,1M foszfát pufferrel és tovább inkubáltuk avidin-biotinperoxidáz komplex-el. Az ellenanyag kötés helyét diaminobenzidin tetrahidrochlorid (DAB) és H 2 O 2 segítségével vagy fluoreszcens festéssel tettük láthatóvá. A kettős festés esetén a PACAP-ot ABC technikával, az LH-t indirekt immunfluoreszcens festéssel és fluoreszcens izotiocianát konjugátummal tettük láthatóvá. Ebben az esetben az LHβ ellenanyag hígítása 1:500 volt. 27

28 Az ellenanyagok specificitását LH illetve PACAP-al történő kimerítés után hypophysis metszetekben ellenőriztük. A specificitás teszteléséhez paraformaldehid perfúzióval előzetesen fixált patkányok hypophysisét használtuk. A hypophysiseket szukróz oldattal kezeltük (30% cukor foszfát pufferben), majd 20 μm vastag fagyasztott metszeteket készítettünk. Az 1:6000-es munkahígítású PACAP antiszérumot 50 μg PACAP38-cal, az 1:10000-es hígítású LH ellenanyagot 10 μg LH-val előinkubáltuk a festést megelőző napon. Háttérblokkolás után a festéseket hasonló módon végeztük, mint a membránok esetében. Az ellenanyagokat akkor fogadtuk el specifikusnak, ha a kimerített, azaz a megfelelő peptiddel előinkubált ellenanyaggal nem kaptunk festést, ugyanakkor a kimerítetlen szérum specifikusan festett. A 14. ábra A része PACAP immunfestést mutat, míg B része parallel metszeten a kimerített szérummal történő festést mutatja be. Ezen a metszeten festést nem kaptunk. 28

29 Sandwich Enzyme Immunoassay (S-EIA) Tizenöt hím állatot délelőtt 10h-kor dekapitációval megöltünk, a hypophysiseket azonnak eltávolítottuk. A mellső lebenyeket steril körülmények között szeparáltuk, megmértük és szárazjégen megfagyasztottuk, -70 C-on tároltuk, a S-EIA előtt felengedtük, hármasával pooloztuk és homogenizáltuk (Ultrasonic Homogenizer, Chicago) trifluoroecetsavban. A homogenizált hypophysis mellső lebenyeket es fordulatszámon 20 percig 4 C-on centrifugáltuk. A felülúszót speedvac-kel szárítottuk, lemostuk, és ismét szárítottuk, hogy a trifluoroecetsavat eltávolítsuk. A hypophysisek PACAP38 tartalmát négy paralellben mértük. A PACAP-al kezelt gonadotroph sejttenyészetek tenyésztő médiumának PACAP38 koncentrációját az inkubálás után mértük. A mintákat és a standard peptidet (PACAP1-38) PA-6N monoklonális ellenanyaggal (PACAP38 N-terminális vége ellen termelt ellenanyag) bevont microtest ELISA lemezbe tettük és 96 óráig inkubáltuk 4 o C-on. Ezt követően a lemezben lévő lyukakat 1% bovine serum albumint tartalmazó 0.02M-os foszfát pufferrel (ph7) mostuk. Az inkubációs idő végén a lemezt torma peroxidáz jelölt PA-2C monoklonális ellenanyaggal (PACAP38 C-terminális vége ellen termelt ellenanyag) kezeltük 24 órán át 4 o C-on, majd foszfát pufferrel mostuk. A torma peroxidáz aktivitást TMB microwell peroxidáz rendszerrel mértük (Kirkegaad és Perry Laboratórium, USA). Az ellenanyagot Suzuki és munkatársai (1993) állították elő és karakterizálták, és bocsájtották a munkacsoport rendelkezésére. Képanalízis A kapott eredményeket képanalizáló program segítségével elemeztük. Minden egyes membránon látóteret fényképeztünk le, majd az Image Pro Plus-0.4 program segítségével megmértük a blotok átmérőjét és területét, és megszámoltuk a blotokat. Az egyes csoportok adatait a Graphpad Prisma programban található unpaired t-test segítségével hasonlítottuk össze. 29

30 Kísérleti protokoll A kísérleti állatokat reggel 10, délután 16 és este 20 órakor öltük meg, az utóbbi két csoportot az LH surge elején és végén. Kísérletünkhöz hím, vagy prooestrus illetve dioestrus stádiumban lévő nőstény patkányokat használtunk. A membránok egy részét PACAP ellenanyaggal, a membránok másik részét LH ellenanyaggal festettük meg, és az esetek egy részében kettős festést alkalmaztunk. Minden időpontban három kísérleti csoportunk volt. Minden csoportban 2 illetve 3 állat szerepelt. A membránok egy része kontrollként szolgált, másik részét 10-7 M koncentrációjú PACAP38-al kezeltük, a PACAP-ot a membránok alá a tápfolyadékba helyeztük. A 3. táblázat mutatja a kísérleti csoportokat, a napszakot, amikor az állatokat feláldoztuk, a kezelés típusát, és az alkalmazott festési eljárást. 10h 16h 20h kontroll 10-7 PAC kontroll 10-7 PAC kontroll 10-7 PAC PRO P, LH LH P, LH LH P, LH LH DI P, LH LH P, LH LH P, LH LH HÍM P, LH LH P, LH LH P, LH LH 3. táblázat. Kísérleti protokoll. Rövidítések: 10-7 PAC=10-7 M PACAP koncentráció a tenyésztő médiumban, DI=dioestrus, LH=LH immunfestés, P=PACAP immunfestés, PRO=prooestrus 30

31 KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK 1. Az LH blotokhoz hasonlóan PACAP blotok mindegyik időpontban megölt állat hypophysis mellső lebeny sejttenyészetében előfordultak. Az ürített PACAP-ot és LH-t a nitrocellulóz membránon az ürítő sejtek körül megfestett köralakú blot jelezte. Az egyes sejtek hormon termelésének különbözőségét a blotok eltérő átmérője jelzi (15. ábra). Az esetek egy részében a PACAP-ot illetve LH-t ürítő sejt látszik a blot közepében, az esetek többségében a sejt a blot közepén nem ismerhető fel. A nem ürítő sejtek kontúr vonala éles. Tenyészetben a sejtek sokszor elvesztik kerek, vagy ovoid alakjukat. A PACAP blotok átmérője azonos idejű tenyésztés esetén kisebb volt, mint az LH blotok átmérője, azaz azonos idejű (22 órás) tenyésztés alatt a sejtek kevesebb PACAP-ot ürítettek, mint LH-t. A prooestrus délelőttjén 10 órakor feláldozott nőstény patkány hypophysis tenyészetéből származó PACAP és LH blotok átmérőjét oszlopdiagramon ábrázoltuk (16. ábra). 2. A PACAP-ot ürítő sejtek részben gonadotroph sejtek. Kettős festéssel a PACAP és LH immunreaktivitás között sok esetben kolokalizációt figyeltünk meg. A 17. ábrán az LH immunreaktivitást indirekt immunfluoreszcens módszerrel festve zöld fluoreszcencia, a PACAP immunreaktivitást barna DAB reakció termék jelzi. Jól megfigyelhető az LH és PACAP blotok méretbeli különbsége. A PACAP sejtek egy része nem ürít 22 órás tenyésztés alatt sem, nem ürítő LH sejtet elvétve találtunk. Az ábra A része olyan sejtet mutat, amelyik PACAP-ot nem ürített, a DAB reakció éles kontúrja utal erre, míg ugyanaz a sejt LH-t ürített. Elmosódott szélű zöld fluorescenciát mutató blot utal az ürített LH-ra. Az ábra B része olyan sejtet mutat, amelyik PACAP-ot is, és LH-t is ürített. A PACAP blot átmérője jól láthatóan kisebb, mint az LH blot átmérője. 31

32 15. ábra PACAP és LH blotok szövettan 16. ábra PACAP és LH blotok Oszlopdiagramm 32

33 17. ábra Kettős festés Barna-zöld 33

34 3. A hypophysis mellső lebenyében jelenlévő PACAP fiziológiás koncentrációja nm nagyságrendű. Tizenöt hím állat hypophysiséből öt 3-3 hypophysisből álló pool-t képeztünk. Erre azért volt szükség, mert az egyedi hypophysisekben nagyon alacsony a PACAP mennyisége, és a mennyiségi meghatározáshoz használt S-EIA érzékenységi szintje alá esik. Három-három hypophysisből elvégzett mérés segítségével megállapítottuk, hogy a hypophysisekben a PACAP koncentrációja rendkívül alacsony, 10-9 és M közé esik (18. ábra). 4. A különböző időpontokban kivett hypophysis mellső lebeny sejttenyészetekben a PACAP blotok száma és nagysága különbözött. Két-két állatból származó 6 nitrocellulóz membránon lévő összes blotot összeadtuk, és a különböző csoportok adatait összehasonlítottuk. Nőstény patkányokban prooestrusban magasabb volt a PACAP blotok száma, mint dioestrusban, ahol csak elvétve találtunk egy-egy blotot. A PACAP blotok száma feltűnően megnőtt azokban a tenyészetekben, amelyek a prooestrus napján este nyolc órakor kivett hypophysisekből származtak. A ciklusnak ebben a fázisában délelőtt 10 órakor és a délután 16 órakor megölt állatok hypophysis tenyészetében is több blot volt, mint dioestrusban, és voltak olyan sejtek, amelyek pozitívan festődtek, de nem ürítettek PACAP-ot, míg este 20 órakor ölve meg az állatokat a blotok száma sokszorosára nőtt, és számos PACAP pozitív sejtet láttunk, amelyek nem ürítettek PACAP-ot, de igen intenzíven festődtek (4. táblázat, 19. ábra). Hím állatokban a PACAP blotok száma nagyon alacsony volt. A délelőtt 10 és 16 órakor kivett hypophysisek tenyészetében hat és öt, a 20 órakor kivett hypophysisek tenyészetében tizenegy blot volt (4. táblázat, 19. ábra). 4. táblázat. PACAP blotok száma a különböző kísérleti csoportokban Kísérleti csoportok Prooestrus Dioestrus Hím 10h 16h 20h 10h 16h 20h 10h 16h 20h Blotok száma

35 18. ábra S-EIA 19. ábra PACAP blot szám 35

36 A 19. ábra oszlopdiagramon mutatja be a PACAP blotok számában a prooestrus vagy dioestrus stádiumában megölt nőstények és hímek hypophysis tenyészetében megfigyelt és a 4. táblázatban bemutatott különbséget. Igaz, hogy ezek az adatok statisztikailag nem értékelhetők (miután minden oszlop egy értéket képvisel és nem átlag eredményt), azonban úgy tűnik, hogy a blotok száma mindegyik kísérleti csoportban este 20 órakor megölt állatok hypophysis tenyészetében magasabb, mint más időpontban kivett hypophysisek esetében. A 20. ábra fénymikroszkópos képen 20 órakor megölt prooestrus (A), dioestrus (B) stádiumában lévő nőstény és hím (C) patkány hypophysis sejttenyészetének PACAP immunfestett képét mutatja. Azért választottuk a szövettani kép bemutatására ezt az időpontot, mert a blotok száma, átmérője és területe ekkor volt a legmagasabb a ciklus mindkét stádiumában lévő nőstény és hím állatok esetében is. Az ürítő sejtek körüli blotok elmosódott kontúrúak, míg a nem ürítő sejtek kontúrvonala éles. Hímben nem ürítő sejtet elvétve láttunk. Dioestrus stádiumban feláldozott nőstény hypophysis tenyészetében ezek száma valamivel magasabb volt, míg prooestrusban történt ölés esetén ezek száma jelentősen megnőtt. Ugyanez a jelenség figyelhető meg a blotok esetében is. A prooestrus stádiumában megölt nőstények hypophysis tenyészetében a 10 órás és a 20 órás csoportban különbség nem volt a PACAP blotok átmérője és területe között (21. ábra), míg 16 órai tenyészetekben mindkét paraméter szignifikánsan kisebb volt. Dioestrus stádiumában kivett tenyészetekben 1, 1 és 3 blotot találtunk. Itt nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget. Ez annak tudható be, hogy a blotok száma rendkívül alacsony volt. Hímekben az este kivett hypophysisek tenyészetében az alacsony számú 11 blot feltűnően nagy volt. Ezek szignifikánsan nagyobbak, mint a 10 és 16 órakor kivett hypophysisek tenyészetében, és ezek a blotok szignifikánsan nagyobbak voltak a prooestrus bármely időszakában megfigyelt blotoknál. 36

37 20. ábra PACAP blotok fénymikroszkópos képe: 20h pro-di-him 37

38 21. ábra PACAP blotok átmérője és területe minden időpontban pro-di-him 38

39 5. Minden csoportban sok LH blotot láttunk, azonban ezek nagysága és száma különbözött az egyes csoportokban. LH ürítés minden tenyészetben volt, de annak mértéke különbözött az egyes csoportokban. Az LH blotok száma minden kísérleti állatban, kivéve a prooestrus estéjét, sokkal magasabb volt, mint a PACAP blotok száma. Az egyes kísérleti csoportokban az LH blotok számát az 5. táblázat, az LH blotok átmérőjét és területét a 22. ábra oszlopdiagramon mutatja be. 5. táblázat. LH blotok száma a különböző kísérleti csoportokban Kísérleti csoportok Prooestrus Dioestrus Hím 10h 16h 20h 10h 16h 20h 10h 16h 20h Blotok száma Prooestrus stádiumában 10 és 16 órakor megölt nőstény állatok hypophysisének tenyészetében az ürítő és blotot képező LH sejtek száma magas volt, ez a szám jelentősen csökkent estére, a lezajlott LH surget követően. Dioestrus reggelén a prooestrus reggeléhez hasonlóan magas blot számot találtunk, azonban a blotok szignifikánsan kissebbek voltak, míg a 16 órakor kivett hypophysis tenyészetekben alacsony blotszám mellett a blotok nagysága kicsit magasabb volt, de a prooestrusos szintet nem érte el. Feltűnően megnőtt a blotok átmérője és területe dioestrusos állatok esti tenyészetében. A különbség elérte, sőt szignifikánsan meg is haladta a prooestrusra jellemző nagyságot. Hímekben a hormont ürítő sejtek száma reggel 10 és este 20 órakor magasabb volt, mint délután 16 órakor, amikor az ürítő sejtek száma 57-re csökkent. A ürítő sejtek által képezett LH blotok átmérője és területe reggel 10 és este 20 órakor közel azonos volt, míg az LH blotok szinte tűszúrásnyian picik voltak délután 16 órakor. A 10 és 20 órakor mért blotok átmérője és területe közötti különbség nem volt szignifikáns, azonban a 16 órakor mért blotok átmérője és területe a reggel és este mért blotokéhoz képest szignifikáns különbséget mutatott (22. ábra). 39

40 22. ábra kezeletlen LH blotok him-nőstény 40

41 6. A PACAP kezelés a kivétel időpontjától függően befolyásolta az LH szekréciót. Ha a mellső lebenyek tenyésztését a M koncentrációjú PACAP jelenlétében végeztük, az nem befolyásolta az LH szekréciót, ezért ezt a kezelést a későbbiekben nem alkalmaztuk. Nőstényekben 10-7 M koncentrációjú PACAP hozzáadása a médiumhoz különböző időpontokban más-más módon befolyásolta az LH szekrécióját (23. ábra, A, B, C, D) mind a prooestrus, mind a dioestrus stádiumában lévő állatokból származó tenyészetekben. Az ürítő sejtek száma a PACAP-al kezelt tenyészetekben délelőtt 10 órakor jóval alacsonyabb volt, mint a kezeletlen tenyészetekben, 16 és 20 órakor az ürítő sejtek száma ezzel szemben megnőtt a kontroll csoporthoz képest. Az LH blotok átmérője és területe prooestrusban délelőtt 10 órakor ellentétes irányú változást mutatott, a sejtek által képzett blotok szignifikánsan nagyobbak voltak a kezelt tenyészetekben a kezeletlenekhez képest, 16 és 20 órakor az egyedi sejtek által ürített hormon mennyisége nem különbözött. Dioestrusban délelőtt a blotok átmérője és területe szignifikánsan nőtt, ugyanakkor 16 és 20 órakor szignifikáns csökkenés volt megfigyelhető az LH ürítésben. Hímekben a PACAP kezelés a blotok számát nem befolyásolta, míg az egyedi sejtek hormon ürítése 10 és 20 órakor kivett tenyészetekben szignifikánsan csökkent (23. ábra, E, F). 7. A tenyésztő médiumhoz adott PACAP koncentrációtól függően befolyásolta a mellső lebeny sejtek LH ürítését. A tenyésztés végén a médiumban még jelenlévő PACAP mennyiségét S-EIA segítségével visszamértük. Azokban a tápfolyadékokban, ahol a PACAP-ot 10-7 M koncentrációban tettük a Petri-csészébe, M koncentrációt tudtunk mérni (18. ábra). Ez a mennyiség a hypophysisekben mért mennyiséghez hasonló, tehát fiziológiásnak tekinthető. Azokban a tenyészetekben, ahol M PACAP-ot adtunk a médiumhoz, a PACAP nem volt mérhető, és nem befolyásolta a sejtek LH ürítését. 41

42 23. ábra PACAP kezelés hatása LH secretiora 42

43 MEGBESZÉLÉS Az irodalmi adatok és kísérleti eredményeink is arra utalnak, hogy a PACAPnak szerepe van a hypothalamo-hypophysealis-gonad tengely működésének szabályozásában (Köves és mtsai, 2003, Fahrenkrug és mtsai, 1996). Arra vonatkozóan vannak korábbi irodalmi adatok, hogy patkány ováriumban a PACAP átmenetileg expresszálódik, csak a preovulációs tüsző granulosa hámjában mutatható ki PACAP mrna, a ciklus más stádiumában nem (Lee és mtsai, 1999, Ko és mtsai, 1999). Munkacsoportunk eredményei arra utalnak, hogy a PACAP nemcsak az ováriumban mutat ciklussal összefüggő változást, hanem a hypophysisben is. PACAP csak a prooestrus napján kivett nőstény patkány hypophysis mellső lebenyében festhető, a ciklus más stádiumában nem (Köves és mtsai, 1998). Eredményeink összhangban vannak Wuttke és munkatársai (1994) és Radleff-Schlimme és munkatársai (1998) RT- PCR technikával nyert azon megfigyelésével, hogy a hypophysisben lévő PACAP mrna mennyiségét az oestrogen emeli, és prooestrusban ezért van immunfestéshez elegendő PACAP, míg a ciklus más stádiumában nincs. Kísérleti munkánkban alkalmazott CIBA alkalmas néhány sejt hormonürítésének detektálására. Az egy sejt által ürített hormon mennyisége nagyon kicsi, azonban ezzel a technikával ilyen kis hormon mennyiség is felismerhető. Hypophysis mellső lebeny sejttenyészeteinkben a PACAP blotok száma és mérete szignifikánsan kisebb volt, mint az LH blotoké. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a PACAP kisebb mennyiségben ürül, mint a hypophysisből a véráramba ürített, és távoli célszerven ható LH. Ennek alapján feltételezhető, hogy a hypophysisben termelt PACAP lokálisan, auto- és parakrin módon befolyásolja az LH sejtek GnRH-ra adott válaszreakcióját. A PACAP autokrin hatását már korábban is feltételezték Radleff- Schlimme és munkatársai (1998). A kísérleti állatokat ismételt intravénás PACAP bolus injekciókkal kezelték, és azt tapasztalták, hogy ez a beavatkozás körülbelül hatszorosára növelte a PACAP génexpressziót a hypophysis mellső lebenyében. Feltételezték, hogy a PACAP-ot szintetizáló sejt membránján lévő PACAP-ra specifikus PAC1 receptoron keresztül befolyásolta saját expresszióját, mert a VIP nem befolyásolta a PACAP génexpressziót. 43