IPARI MIKROORGANIZMUSOK ALKALMAZÁSA ÉS TÖRZSJAVÍTÁSUK DR. MARÁZ ANNA E. TANÁR BUDAPESTI CORVINUS EGYETEM, MIKROBIOLÓGIA ÉS BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK

Átírás

1 IPARI MIKROORGANIZMUSOK ALKALMAZÁSA ÉS TÖRZSJAVÍTÁSUK DR. MARÁZ ANNA E. TANÁR BUDAPESTI CORVINUS EGYETEM, MIKROBIOLÓGIA ÉS BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK 2004/2005. TANÉV

2 ÚJ HATÓANYAGOT TERMELŐ MIKRÓBATÖRZS ÉS ELJÁRÁS KIFEJLESZTÉSE Nyers preparátum Mikróba törzs izolálása Tenyészet szelektálása Fermentációs eljárás kidolgozása Termékek kinyerése termék screenelés termék(ek) tisztítása, izolálása, karakterizálása Fermentációs eljárás optimalizálása Kémiai szerkezet meghatározása (módosítása) Toxikológiai vizsgálat Hatósági engedélyeztetés Piackutatás TERMELÉS

3 MIKROORGANIZMUS TÖRZSEK SZŰRÉSE (SCREENING) Ipari jelentõségű mikróba törzsek izolálása: Fő jellemzők: 1. Tiszta tenyészet legyen (vírus- és fágmentesség) 2. Lehetőleg ivaros és ivartalan szaporító képletekkel is rendelkezzen 3. Jó szaporodási képességgel rendelkezzen 4. Lehetőleg csak a kívánt anyagot termelje 5. Ne termeljen toxikus anyagokat 6. Minél jobban védve legyen a fertőzésekkel szemben (savas ph-nál jól szaporodjon, más mikroorganizmusokat gátló metabolitikat termeljen) 7. Törzsjavítási módszerek alkalmazhatók legyenek (minimum mutagén kezelés) 8. Hosszú ideig tartósítható legyen. Izolálási és törzsfenntarási módszerek 1. Izolálás: Közvetlenül a talajból - talajszuszpenzió higításával - grádiens lemez alkalmazásával - differenciál centrifugálással Jellemző élőhelyekről Törzsgyűjteményekből 2. Szelektív dúsítás - talaj kezelése (szárítás, hőkezelés, szűrés, detergensekkel, oldószerekkel való kezelés) - szelektív gátlóanyagokkal való kezelés (antibiotikumok, antimetabolitok alkalmazása) - speciális tápanyagok (szén-, nitrogénforrás) alkalmazása - hőmérséklet, ph, levegőztetés szabályozása 3. Tenyészetek tartósítása - talaj víztelenítése - ferdeeagaros tenyészetek paraffin olajjal való leöntése - szilikagéles tartósítás - liofilezés - fagyasztás (-80 o C-on) - folyékony nitrogénben való tárolás (-196 o C)

4

5 TÖRZSNEMESÍTÉS 1. Szelekció 2. Mutáció 3. Rekombináció A/ Természetes - baktériumoknál: konjugáció transzformáció transzdukció - gombáknál: ivaros keresztezés paraszexuális (ivartalan) keresztezés B/ Meterséges: protoplaszt fúzió rekombináns DNS technika (molekuláris klónozás) TÖRZSNEMESÍTÉS MUTÁCIÓVAL 1. Spontán mutánsok izolálása 2. Mutánsok indukálása A/ Kismutációk indukálása: kis mutagén dózis (> 50% túlélőből) B/ Nagymutációk indukálása nagy mutagén dózis (20% alatti túlélőből)

6 KÜLÖNBÖZŐ MUTÁNS TÍPUSOK IPARI MIKROORGANIZMUSOK ESETÉBEN ORGANIZMUS ALKALMAZOTT MUTAGÉN MUTÁCIÓ TÍPUSA TERMÉK Aspergillus niger UV- és röntgensugárzás Regulációs: citromsav termelés citromsav növekedése Hansenula anomala UV-sugárzás Regulációs: antranilsavrezisztencia triptofán Micrococcus glutamicus MNNG (N-metil-N -nitro-nnitrozo-guanidin) Adenin auxotrófia Inozin-monofoszfát Brevibacterium flavum MNNG Regulációs: 5-(aminoetil)-cisztein lizin rezisztencia Corynebacterium UV-sugárzás Homoszerin auxotrófia lizin glutamicum Brevibacterium ammoniagenes Spontáns mutáció Regulációs: 6-merkaptoguaninrezisztencia inozin

7 A Penicillim chrysogenum "Wisconsin" törzsének fejlesztése mutációval S: spontán mutáció; X: röntgensugárzás: UV: UV sugárzás (UV I: 275 nm, UV II: 253 nm); NM: nitrogén-mustár; NG: nitrozo-guanidin; DEB: diepoxi-bután

8 Replika módszer auxotróf mutánsok izolálásához

9 A génsebészet mérföldkövei 1970 Teljes gén in vitro szintézise Restrikciós endonukleázok felfedezése Reverz transzkriptáz felfedezése 1972 Az első rekombináns DNS molekula létrehozása 1973 Plazmid vektorok alkalmazása génklónozásra 1975 Southern blotting (lenyomat) módszer kifejlesztése DNS molekulák specifikus kimutatásához molekuláris hibridizációval 1976 Az első prenatális diagnózis megvalósítása gén-specifikus próba segítségével 1977 Gyors DNS szekvenáló módszer kidolgozása Szomatosztatin hormon előállítása rekombináns DNS (rdns) technikával 1978 Humán genomiális klóntár létrehozása 1979 Inzulin előállítása rdns technikával 1982 Génsebészeti úton (E. coli-val) előállított humán inzulin kereskedelmi forgalomba hozatala Patkány növekedési hormon génjének átvitele egér petesejtbe 1985 Glifozát gyomírtószerrel szemben rezisztens (transzgénikus) dohány előállítása A polimeráz láncreakció (PCR) technika kidolgozása 1988 Az első genetikailag stabil transzgénikus haszonnövény (szója) előállítása A génpuska kifejlesztése DNS bevitelre 1989 Genetikailag módosított vírus (baculovirus) szabadföldi kibocsátása a vírusrezisztencia növelése céljából 1991 Humán proteineket (pl. hemoglobint) termelő transzgénikus malacok és kecskék kifejlesztése

10 A molekuláris klónozás lépései i/ A klónozáshoz használt DNS izolálása, fragmentálása restrikciós endonukleázokkal ii/ A DNS fragmentum beépítése a klónozó vektorba: a rekombináns DNS molekula in vitro előállítása iii/ A rekombináns DNS bejuttatása a gazdasejtbe iv/ A rekombináns DNS-t tartalmazó klón kimutatása, izolálása

11

12

13 A leggyakrabban használt restrikciós endonukleázok és specifikus felismerési és hasítási helyeik A restrikciós endonukleáz Termelő mikroba Hasítási hely jelölése Bam HI Bacillus amyloliquefaciens H 5, -G-G-A-T-C-C-3, 3, -C-C-T-A-G-G-5, Bcl I Bacillus caldolyticus 5, -T-G-A-T-C-A-3, 3, -A-C-T-A-G-T-5, Eco RI Escherichia coli R 5, -G-A-A-T-T-C-3, 3, -C-T-T-A-A-G-5, Eco RII Escherichia coli R 5, -C-C-T-G-G-3, 3, -G-G-A-C-C-5, Hae III Hemophilus aegyptius 5, -G-G-C-C-3, 3, -C-C-G-G-5, Hin diii Hemophilus influenzae d 5, -A-A-G-C-T-T-3, 3, -T-T-C-G-A-A-5, Pst I Providencia stuartii 5, -C-T-G-C-A-G-3, 3, -G-A-C-G-T-C-5, Sau 3A Staphylococcus aureus 5, -G-A-T-C-3, 3, -C-T-A-G-5, Sal I Streptomyces albus 5, -G-T-C-G-A-C-3, 3, -C-A-G-C-T-G-5,

14 Gyógyászati célra előállított heterológ humán fehérjék Fehérje Funkció Rekombináns gazda epidermis növekedési faktor sebek gyógyulása Saccharomyces cerevisae folliculus stimuláló hormon meddőség gyógyítása inzulin diabetes gyógyítása E. coli és Saccharomyces cerevisae relaxin szüléskönnyítő E. coli somatotropin törpeség gyógyítása E. coli somatostatin acromegalia gyógyítása Saccharomyces cerevisae calcitonin csontgyengeség gyógyítása Saccharomyces cerevisae erythropoetin vérszegénység gyógyítása VIII véralvadási faktor hemophilia (vérzékenység) gyógyítása E. coli plazminogén aktivátor véralvadás gátló E. coli interleukin-2 rákellenes hatás E. coli tumor nekrózis faktor rák gyógyítása α-interferon vírus- és rák- (leukémia-) ellenes hatás E. coli β-interferon sclerosis multiplex gyógyítása, AIDS E. coli ellenes hatás γ- interferon rákellenes hatás, reuma gyógyítása E. coli lizozim gyulladásgátló Saccharomyces cerevisae α-amiláz keményítő lebontása Saccharomyces cerevisae Fehérje mérnökség útján módosított proteinek A módosított tulajdonság Eljárás Glükóz izomeráz hőstabilitásának növelése Biopeszticid hatás kifejtése a..vedlését szabályozó hormon módosításával α-antitripszin oxidációval szembeni rezisztenciájának növelése a hirudin hatékonyságának növelése a 253-as argininnek lizinre való kicserélése a hormon módosítása a LacZ gén inszerciójával metioninnak valinra való kicserélése a 47-es aszparaginnak lizinre vagy argininre való kicserélése

15 A génsebészet gyakorlati alkalmazása 1. Mikróbás fermentációk erjedésipari géntechnológiailag módosított élesztőtörzsek enzimtermelés (pl. rekombináns kimozin, β-glükanáz, celluláz, xilanáz) 2. Vírusellenes vakcinák termelése Vírus köpenyfehérjét kódoló gén klónozása, antigen termeltetés baktériummal vagy élesztőgombával (pl. kanyaró, veszettség, hepatitis B vírusok). 3. Emlős proteinek termelése vérfehérjék termeltetése (pl. véralvadást elősegítő faktorok, véralvadékot oldó proteinek) emberi hormonok termelése (sárgatest stimuláló hormon, insulin, méh relaxin) immunitást növelő fehérjék termelése (interferonok, lizozim, tumor nekrózis factor) 4. Transzgénikus növények előállítása Bt. (Bacillus thuringiensis) rovarölő toxint termelő növények előállítása (pl. gyapot) vírusellenálló növények előállítása virus köpenyfehérje gén klónozásával lassan érő (nem puhuló) Favr savr paradicsom előállítása 5. Transzgénikus állatok előállítása Gyógyászati jelentőségű fehérjék termeltetése állatokkal (pl. antitripszin kiválasztása juh tejbn, véralvadékot oldó fehérje termeltetése kecskében) 6. Géntechnológiailag módosított mikroorganizmusok felhasználása a környezeti biotechnológiában klórozott növényvédőszereket (pl. 2,4,5-T) bontó enzimek génjeinek klónozása halogénezett aromás vegyületek (pl. klórbenzén), egyéb aromas vegyületek (anilinek, toluene), szénhidrátok bontása génklónozással 7. Génterápia Öröklődő betegségek kezelése génsebészeti eszközökkel

16 ENZIMTERMELÉS MIKROORGANIZMUSOKKAL DR. MARÁZ ANNA E. TANÁR BUDAPESTI CORVINUS EGYETEM, MIKROBIOLÓGIA ÉS BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK 2004/2005. TANÉV

17 Enzimek ipari előállítása mikroorganizmusokkal AMILÁZOK Enzim neve α amilázok glükoamilázok pullulanázok β-amilázok Termelő mikroorganizmus Bacillus subtilis Bac. amyloliquefaciens Bac. licheniformis Aspergillus oryzae Aspergillus niger Asp. awamori Rhizopus niveus Aerobacter aerogenes Pseudomonas amylodermatosa Bacillus polymixa Bac. cereus Rhizopus japonicus GLUKÓZIZOMERÁZOK PROTEÁZOK PEKTINÁZOK LIPÁZOK Alkalikus proteázok Neutrális proteázok Savanyú proteázok Oltóenzim (rennin) Bacillus coagulans Streptomyces sp. Arthrobacter sp Bac. licheniformis B. amyloliquefaciens Streptococcus fradiae Bac. subtilis Pseudomonas aeruginosa Aspergillus oryzae Aspergillus niger Asp. awamori Mucor miehei Mucor pusillus Endothia parasitica Aspergillus niger Asp. wentii Rhizopus sp. Aspergillus spp. Mucor spp. Rhizopus sp. Candida sp

18 MIKRÓBÁKKAL TÖRTÉNŐ ENZIMELŐÁLLÍTÁS ELŐNYEI 1. Gyors növekedés, ipari körülmények között jó tenyészthetőség 2. Olcsó növekedési szubsztrátumok alkalmazhatósága (természetes táptalajok, mezőgazdasági melléktermékek) 3. Nagyszámú mikróbafaj és törzy sokféle enzimet termel, amei törzsjavítással tovább fokozható, illetve növelhető 4. Nem mikrobiális enzimek génjei mikróbákban klónozhatók, génsebészeti úton expressziójuk javítható ENZIMELŐÁLLÍTÁS LÉPÉSEI 1. Megfelelő enzimet termelő törzs szelektálása Szelektív táptalaj alkalmazása pl. amiláz - keményítő proteáz - kazein. 2. Izolált mikróba jellemzése, rendszertani besorolása (legalább nemzetség szintig), lehetőleg GRAS - biztonságosnak elfogadott - legyen) 3. Mikróbák elszaporítása környezeti feltételek optimalizálása, léptéknövelés 4. Enzimek kinyerése, tisztítása, minősítése ENZIMTERMELŐ MIKROORGANIZMUSOK TÖRZSNEMESÍTÉSE 1. Törzsnemesítés szempontjai: ne termeljen káros anyagcsere termékeket (pl. antibiotikum, mikotoxin) ipari szinten gazdaságos legyen enzim minősége.megfelelő legyen (szennyező enzim minimális legyen) 2. Módszerek: mutáció rekombináció in vitro rekombináns DNS technika 3. Termelő törzs tartósítása:

19 élő tenyészetként (átoltások során termelés csökkenhet) liofilezés mélyhűtve (-70, -80 o C-on, glicerinnel keverve) folyékony nitrogénben (krioprotektív anyag alkalmazása)

20 Proteázkészítmények jellemzői Mikróba Enzim Optimális Hőmérséklet ( o C) Optimális ph Elhasított kötések száma Asp. saitoi Savas proteáz 45 2,4-4,0 9 Asp. oryzae Neutrális proteáz 45 4,5-7,0 9 Asp. oryzae Alkalikus proteáz 45 8,0-9,0 5 Mucor miehei Tejalvasztó 55-2 proteáz (rennin) Bac. Subtilis Neutrális proteáz 50 5,0-7,5 6 Bac. licheniformis Alkalikus proteáz 55 8,0-9,0 7 Lipázkészítmények jellemzői Mikróba Enzim Optimális Hőmérséklet ( o C) Optimális ph Maximális hidrolízis fok Asp. niger Lipáz ,0-5,5 90 Asp. niger Lipáz ,5 70 Rhizopus sp. lipáz 40 6,5-7,0 80 Mucor miehei lipáz 40 7,8-8,2 94 Candida sp. lipáz 37 5,5-6,5 90

21