PREBIOTIKUS HATÁSÚ FRUKTOOLIGOSZACHARIDOK ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE INTEGRÁLT RENDSZERBEN. CSANÁDI ZSÓFIA okl. környezetmérnök

Átírás

1 PANNON EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI TUDOMÁNYOK ÉS ANYAGTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS PREBIOTIKUS HATÁSÚ FRUKTOOLIGOSZACHARIDOK ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE INTEGRÁLT RENDSZERBEN Készítette: CSANÁDI ZSÓFIA okl. környezetmérnök Témavezetı: DR. SISAK CSABA egyetemi docens PANNON EGYETEM MŐSZAKI KÉMIAI KUTATÓ INTÉZET 2008

2 PREBIOTIKUS HATÁSÚ FRUKTOOLIGOSZACHARIDOK ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE INTEGRÁLT RENDSZERBEN Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta:... Csanádi Zsófia... Készült a Pannon Egyetem... Vegyészmérnöki- és Anyagtudományok Doktori... iskolája/programja/alprogramja keretében Elfogadásra javaslom (igen / nem) Témavezetı: Dr. Sisak Csaba... A jelölt a doktori szigorlaton... % -ot ért el, (aláírás) Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: igen /nem Bíráló neve:......) igen /nem Bíráló neve:......) igen /nem. (aláírás). (aláírás). (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján...% - ot ért el. Veszprém/Keszthely,. A doktori (PhD) oklevél minısítése... a Bíráló Bizottság elnöke Az EDT elnöke 3

3 TARTALOMJEGYZÉK KIVONAT...7 ABSTRACT...8 AUSZUG BEVEZETÉS IRODALMI ÖSSZEFOGLALÁS Funkcionális élelmiszerek Pre- és probiotikumok Prebiotikus hatású egyszerő és összetett szénhidrátok A fruktooligoszacharid típusú prebiotikumok hatása és felhasználásuk Probiotikumok A fruktooligoszacharidok elıállításának enzimatikus lehetıségei A transzferázok szerepe a fruktooligoszacharidok szintézisében A hidrolázok szerepe a fruktooligoszacharidok elıállításában A szimultán termékkinyerés jelentısége összetett biokatalitikus folyamatokban A fruktooligoszacharid szintézis melléktermékének eliminálási lehetıségei A szilárd fázisú biokatalízis A rögzített enzimek jelentısége Az enzimrögzítés fontosabb típusai Rögzített enzimek alkalmazása a fruktooligoszacharidok elıállítására Szilárd fázisú biokatalizátorokkal mőködı reaktorok Szakaszos mőködéső mechanikusan kevert tankreaktor Folyamatos átáramlású kevert tankreaktor Állóágyas oszlopreaktor Fluidizációs reaktor Integrált bioreaktor-rendszerek KÍSÉRLETI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Felhasznált anyagok Enzimkészítmények

4 Fruktooligoszacharidok szintéziséhez használt enzimkészítmények Glükóz, mint melléktermék eliminálására használt enzimkészítmények Hordozó Kötıreagens Egyéb vegyszerek Mérési módszerek Az enzimaktivitások meghatározása Fruktozil-transzferáz aktivitásának mérési módszere Glükóz-oxidáz aktivitásának mérési módszere Kataláz aktivitásának mérési módszere Analitikai módszerek, alkalmazott berendezések és mérımőszerek EREDMÉNYEK Az enzimkészítmények rögzítési módszere Pectinex Ultra SP-L rögzítésének vizsgálata Optimális rögzítési körülmények megállapítása A legkedvezıbb biokatalizátor/hordozó arány megállapítása Pectinex Ultra SP-L glutáraldehides rögzítésének idıfüggése Pectinex Ultra SP-L glutáraldehides rögzítésének koncentrációfüggése Optimális mőködési körülmények megállapítása Oldott állapotú Pectinex Ultra SP-L optimális mőködési körülményeinek megállapítása Rögzített Pectinex Ultra SP-L aktivitásának hımérsékletfüggése Rögzített Pectinex Ultra SP-L aktivitásának ph függése Rögzített Pectinex Ultra SP-L stabilitásának vizsgálata Rögzített Pectinex Ultra SP-L aktivitásának szubsztrátfüggése Fruktooligoszacharidok elıállítása Pectinex Ultra SP-L enzimkészítmény alkalmazásával Oldott állapotú Pectinex Ultra SP-L alkalmazása fruktooligoszacharidok elıállítására rázatott lombikos kísérletek során Rögzített Pectinex Ultra SP-L alkalmazása fruktooligoszacharidok elıállítására rázatott lombikos kísérletek során

5 4.4. A szintézis melléktermékének eltávolítása A glükóz-oxidáz és kataláz koimmobilizálásának vizsgálata A glükóz-oxidáz és kataláz enzimek optimális rögzítési körülményeinek megállapítása A glükóz-oxidáz kataláz biokatalizátor optimális mőködési körülményeinek vizsgálata Reaktorkísérletek Oxigénbeviteli vizsgálatok a folyadékfázisban Glükóz-eltávolítás vizsgálata Integrált fruktooligoszacharid-szintézis és glükóz-eltávolítás megvalósítása Integrált rendszerő reaktorkísérletek ÖSSZEFOGLALÁS IRODALOMJEGYZÉK...95 TÉZISEK THESES PUBLIKÁCIÓK FÜGGELÉK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

6 KIVONAT A disszertációban a számos elınyös élettani tulajdonsággal rendelkezı, prebiotikus hatású rövid láncú fruktooligoszacharidok enzimatikus úton történı elıállításának vizsgálata kerül bemutatásra. A vizsgált reakcióban szacharóz kiindulási anyagból fruktozil-transzferáz enzim segítségével rövid láncú fruktooligoszacharidok elegye és melléktermékként glükóz képzıdik, mely utóbbi komponens a reakció inhibitora. A szerzı munkája során egy, a fruktooligoszacharidok szintézisére alkalmazható enzimkészítmény rögzítésére megfelelı hordozó kiválasztása és egy újszerő kombinált kétlépéses rögzítési módszer kialakítása után meghatározta a biokatalizátor rögzítési körülményeit. Az így kialakított immobilizált enzimkészítmény mőködési körülményeinek meghatározásával egy, a fruktooligoszacharidok elıállítására alkalmas szilárd fázisú biokatalizátort alakított ki, melynek alkalmazásával vizsgálta a fruktooligoszacharidok elıállítási lehetıségeit. A szintézisreakcióban melléktermékként keletkezı glükóz eltávolítására a szerzı egy szilárd fázisú koimmobilizált glükóz-oxidáz kataláz biokatalizátort hozott létre. Munkája során meghatározta annak rögzítési és mőködési körülményeit, valamint vizsgálta mőködését. Az együttes termékelıállítás és melléktermék eltávolítás együttes megvalósítására egy integrált reaktor-rendszert alakított ki, majd tanulmányozta annak mőködését. 7

7 ABSTRACT Enzymatic synthesis of prebiotic fructooligosaccharides in integrated system In this work enzymatic production of the prebiotic fructooligosaccharides was investigated. In the synthesis reaction a mixture of fructooligosaccharides with low molecular weight and glucose as a by-product were formed from sucrose as a raw material, the process is catalysed by fructosyl-transferase enzyme. A solid-phase biocatalyst for the production of fructooligosaccharides was formed from a commercial grade complex enzyme product. An immobilization method was worked out with the combination of adsorption and cross-linking by glutaraldehyde treatment. For the elimination of glucose by-product a co-immobilized glucose oxidase catalase biocatalyst was prepared from soluble glucose oxidase and catalase both of them of fine chemical grade. The immobilization parameters and operational conditions have been optimized for the biocatalysts. An integrated reactor system for the simultaneous fructooligosaccharide production and glucose elimination was constructed and studied. 8

8 AUSZUG Enzymatische Synthese von prebiotischen Fructooligosacchariden in integriertem System In dieser Arbeit wurde die enzymatische Produktion von prebiotischer Fructooligosacchariden untersucht. Während der Reaktion wurde eine Mischung von Fructooligosacchariden und als Nebenprodukt Glukose aus dem Ausgangsstoff Saccharose mit Hilfe von Fructosyltransferase Enzym gebildet. Ein festphasiger biochemischer Katalysator für die Produktion von Fructooligosacchariden wurde aus einem komplizierten Enzymprodukt hergestellt. Eine neue, zweistufige Immobilisierungmethode wurde für die Vernetzung durch Glutaraldehydbehandlung ausgearbeitet. Für die Beseitigung der Glukoseinhibition wurde aus einem feinen Biokatalysator Glukose Oxydase-Katalase eine Co-Immobilisierung durchgeführt und das Produkt untersucht. Die Immobilisierungsparameter und die Betriebsbedingungen sind für die biochemischen Katalysatoren optimiert worden. Ein integriertes Reaktorsystem für die simultane Fructooligosaccharidproduktion und Glukosebeseitigung wurde konstruiert und studiert. 9

9 1. BEVEZETÉS Az utóbbi idıben megnövekedett érdeklıdés tapasztalható az egészséges táplálkozás és étrend, valamint a természetes anyagokból származó táplálék-kiegészítık iránt. A fruktooligoszacharidok számos olyan elınyös tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek lehetıvé teszik széleskörő élelmiszeripari és takarmányozási célú alkalmazásukat. Az emésztıszervrendszer enzimei nem képesek lebontani, így a szervezet energiaforrásként nem képes felhasználni ıket, kalóriatartalmuk kb. 8 kj g -1 (2 Kcal g -1 ) [FARR, 1997]. Ebbıl adódóan diabetikus és alacsony kalóriatartalmú termékek gyártására is felhasználhatók, bár édesítıhatásuk csupán a szacharóz kb. egyharmadának felel meg. Nem hidrolizálódnak a szájüregben sem, ezért nincs fogszuvasodást elıidézı hatásuk [BLOCH és mtsai, 1995]. Ezeken kívül rendelkeznek egy lényeges tulajdonsággal, amely alapvetı fontosságú az ún. funkcionális élelmiszerekben való alkalmazásuk szempontjából. Kedvezı hatással vannak a bélflóra baktériumainak (Bifidobacteria, Lactobacillus sp.) szaporodására és mőködésére, amelyek a szervezet egészségének fenntartásában fontos szerepet játszanak: több vitamin termelıdésében (K, B) is részt vesznek, valamint olyan rövidláncú zsírsavakat hoznak létre (pl.: tejsav, ecetsav, propionsav, vajsav), amelyek a bélsejtek számára szolgálnak táplálékul [HILLIAM, 1998]. Ezen kívül segítenek megakadályozni az emésztırendszerbe bekerült patogén kórokozók elszaporodását is [GOLDBERG, 1994]. A fruktooligoszacharidok szerkezetüket tekintve egy glükóz egységbıl és az ahhoz kapcsolódó két, illetve több fruktóz egységbıl felépülı nyílt láncú molekulák. A homológ sor elsı három és leggyakrabban elıforduló képviselıje a kesztóz (GF 2 ), a nisztóz (GF 3 ) és a fruktozil-nisztóz (GF 4 ). A természetben számos növényben (pl.: hagyma, cikória, cukorrépa, gabona, rizs) megtalálhatók, azonban viszonylag kis koncentrációban. Mesterséges úton történı elıállításuk egyik lehetséges fajtája az enzimkatalitikus szintézis. Ennek során szacharóz (GF) kiindulási anyagból az ún. fruktozil-transzferáz (Ft-áz) enzim segítségével alakítható ki a rövid láncú fruktooligoszacharidok elegye több lépésben. Az elegy a GF 2, GF 3, GF 4 és az át nem alakult szacharóz mellett melléktermékként keletkezı glükózt is tartalmaz. Mivel a glükóz a szintézisreakció kompetitív inhibítora, így annak eltávolítása nélkül maximálisan kb. 60 %-os fruktooligoszacharid-hozam érhetı el. Ezért a glükóz folyamatos eltávolítása a 10

10 rendszerbıl jelentısen megnövelheti az elıállított termékkoncentrációt. A glükóz elimináció egyik lehetséges és viszonylag olcsó fajtája egy másik enzimes rendszer alkalmazása, melynek során immobilizált glükóz-oxidázt (GOD) használhatunk a glükóz eltávolítására. Az enzimkatalitikus szintézis megvalósításának két alapvetı módja lehetséges. Az egyik során szakaszos üzemmódban szabad állapotú enzimmel, illetve az enzimet tartalmazó sejttel történik a szintézis. A másik esetben valamilyen szilárd fázisú hordozóhoz rögzítetten alkalmazzuk a biokatalizátort, melynek révén félfolyamatos, illetve folyamatos üzemmód is megvalósíthatóvá válik. A rögzítésre leggyakrabban Ca-alginát gélbezárást, illetve adszorpciós technikát alkalmaznak. Célkitőzések Doktori munkámat a Pannon Egyetem Mőszaki Kémiai Kutató Intézetében folyó, a rögzített biokatalizátorok elıállításához, alkalmazásához, illetve az azokkal megvalósított biotechnológiai mőveletek tanulmányozásához kapcsolódó korábbi kutatási tevékenység keretein belül valósítottam meg. A kidolgozandó PhD téma egy, az Oktatási Minisztérium támogatásával folyó, a "Biotechnológia 2002" programba tartozó kutatási projekt (Molekuláris biotechnológiai és integrált fruktooligoszacharid termelı eljárás kidolgozása és sertés takarmányozási célú alkalmazása) részeként került kiírásra a Pannon (Veszprémi) Egyetem Vegyészmérnöki Doktori Iskolájában 2002-ben. A projekt célja az volt, hogy egy kereskedelembıl beszerezhetı és/vagy az egyik partner által géntechnikai módosítással elıállított fruktozil-transzferáz enzimekkel prebiotikus hatású fruktooligoszacharidokat szintetizáljunk és azokat megfelelı formázás után a másik partner alkalmazza fiatal sertések etetési kísérleteiben. Munkám kezdetekor célkitőzéseink a következık voltak: 1. Kereskedelembıl beszerzett, (illetve a kooperációs partnerektıl kapott) fruktoziltranszferáz enzim rögzítésére alkalmas módszer(ek) és hordozó(k) kiválasztása. 11

11 2. A rögzítés optimális körülményeinek (hımérséklet, ph, optimális szubsztrátkoncentráció) meghatározása és a rögzítés eredményességének vizsgálata lombikos kísérletekkel. 3. A szilárd fázisú készítmény katalitikus viselkedésének jellemzése, fruktooligoszacharidok elıállításának vizsgálata során. 4. Kísérletek a melléktermékként keletkezı glükóznak a fruktooligoszacharid-szintézissel szimultán, biokatalitikus úton történı eltávolítására. 5. A glükóz eliminációhoz alkalmazható biokatalizátor elıállítása és vizsgálata. 6. Az együttes termékelıállítás és szimultán melléktermék szeparáció megvalósítására alkalmas laboratóriumi mérető reaktor összeállítása és mőködésének vizsgálata. A téma kidolgozásához rendelkezésemre állt az enzimaktivitás mérésekhez szükséges laborháttér, kereskedelmi forgalomból megszereztük az irodalmi adatok alapján a fruktooligoszacharid szintézisre alkalmazható ipari enzimet, biztosítva volt a kellı eszközrendszer az enzim immobilizálásához és a szükséges analitikai vizsgálatokhoz. Munkám során párhuzamosan két, fruktooligoszacharidok elıállítására alkalmas biokatalizátor vizsgálatával foglalkoztam. Az egyik egy kereskedelembıl beszerezhetı enzimkészítmény, a másik pedig egy kooperációs partner által, genetikailag módosított mikroba alkalmazásával elıállított és kinyert sejtlizátum volt. Ez utóbbi minısége azonban nem volt kellıen homogén, az egyes sarzsok aktivitása között lényeges eltérés mutatkozott. Így gyakorlati célú alkalmazásra megfelelınek bizonyult ugyan és kísérleteink során ezzel a biokatalizátorral valósítottuk meg a fruktooligoszacharidok nagylabor léptékő elıállítását, a doktori munkámmal kapcsolatos minıségi elıírások, illetve az abban foglalt vizsgálatok megkövetelt színvonala miatt azonban egy kereskedelmi forgalomból származó enzimkészítmény vizsgálata és az annak során kapott eredmények felhasználása volt szükséges. Emiatt dolgozatomban kizárólag ezzel az enzimmel elvégzett kísérletek és azok eredményei szerepelnek. 12

12 2. IRODALMI ÖSSZEFOGLALÁS 2.1. Funkcionális élelmiszerek Az egyre intenzívebb fogyasztói igényeknek megfelelıen az élelmiszertudomány az utóbbi évtizedekben fokozott figyelmet fordít az egészséges és kedvezı élettani hatású élelmiszerek vizsgálatára, illetve kutatására. A folyamat eredményeképp táplálkozástani szótárunk az ún. funkcionális élelmiszerek fogalmával bıvült. Szervezetünk egészségi állapotát nagymértékben befolyásolja az elfogyasztott táplálék mennyisége és minısége. Élettani kutatások során kimutatták, hogy a rákos megbetegedések közel egyharmadáért a helytelen táplálkozás és étrend tehetı felelıssé [EDDY, 1986], ezen kívül egyértelmő a kapcsolat a magas vérnyomás és annak szövıdményeivel, valamint a szív- és érrendszeri megbetegedésekkel is. A helyes táplálkozás ezzel szemben kifejezetten betegségmegelızı, illetve gyógyulást elısegítı hatású lehet, lassíthatja az öregedési folyamatokat, valamint növelheti mind a fizikai, mind a szellemi teljesítıképességet [SANDERS, 1998]. Az 1. táblázatban bizonyos tápanyagok és azok fiziológiai hatására szerepel néhány példa. 1. táblázat: Néhány megbetegedés és azok megelızésére és kezelésére alkalmazható táplálék-összetevı Betegség Ízületi gyulladás Magas vérnyomás Csontritkulás Szív- és érrendszeri megbetegedések Magas koleszterin-szint Rákos megbetegedések Funkcionális élelmiszer összetevı Ω-3-zsírsavak, gyömbérkivonat, kollagén γ-amino-vajsav, pektin Kalcium, kazein foszfopeptidek β-karotin, fokhagyma, növényi szterinek és polifenolok, antioxidánsok Probiotikumok, pektin, szójarost Zöld tea, fokhagyma, növényi szterinek és polifenolok, pre- és probiotikumok, antioxidánsok 13

13 Az egészségmegırzı és egészségjavító táplálkozásnak megfelelıen kialakított összetétellel rendelkezı speciális biológiailag és fiziológiailag aktív komponenseket tartalmazó ún. funkcionális élelmiszerek népszerősége és elterjedése az utóbbi években egyre növekszik. Definíció szerint funkcionális élelmiszernek tekinthetı minden olyan táplálék, illetve táplálék-összetevı, amely a hagyományos tápértéke mellett valamilyen kedvezı élettani hatással rendelkezik [EDDY, 1986]. Ezen termékek fejlesztése és forgalmazása az 1980-as évek elsı felében eredetileg Japánból [FARR, 1997] indult és ott azóta is népszerőek, de ma már az Egyesült Államok [BLOCH és mtsai, 1995], illetve Európa, elsısorban Franciaország és az Egyesült Királyság [HILLIAM, 1998] élelmiszerpiacán is újabb és újabb termékek jelennek meg [GOLDBERG, 1994]. Ezen kívül a funkcionális élelmiszerek iránti megnövekedett érdeklıdés nem csak az élelmiszeriparban, de a gyógyszeriparban is megmutatkozik. A funkcionális élelmiszerek ötlete, illetve vizsgálata alapvetıen a lakosság általános egészségi állapotának javítása érdekében alakult ki ben Japánban [FARR, 1997] állami támogatással egy átfogó nemzeti programot hoztak létre, melynek végeredményeképp kidolgozták a funkcionális élelmiszerekre vonatkozó pontos szabályokat és elıírásokat [FARR, 1997; EDDY, 1986]. Ezek képezik azóta is az alapját a világ többi részén is egyre inkább terjeszkedı funkcionális élelmiszerek piaci szabályozásának, amely azonban még messze nem tekinthetı egységesnek és véglegesnek. Ennek oka abban keresendı, hogy míg a funkcionális élelmiszerek választéka egyre bıvül, azok kedvezı táplálkozási, biológiai, valamint élettani hatásának tudományos megalapozottsága az esetek többségében még nem teljes [BLOCH és mtsai, 1995]. Számos élettani kutatás, epidemiológiai, állat- és humán kísérlet szükséges még a továbbiakban ahhoz, hogy azok ténylegesen helyet kapjanak az élelmiszer-, valamint gyógyszeripar piacán és megfeleljenek a szigorú élelmiszer- és gyógyszeripari elıírásoknak, valamint nem mellékesen, a növekvı fogyasztói igényeknek. Egy, az Egyesült Államok-béli felmérés szerint [GILBERT, 2000] a funkcionális élelmiszerek iránti megnövekedett érdeklıdés és azok egyre nagyobb piaci térnyerése több okra vezethetı vissza [KATAN, 1999]: A fogyasztók a már kialakult betegség gyógyításánál fontosabbnak tartják a betegségek megelızését; 14

14 Az egészségügyi kezelés költségeinek megemelkedése, illetve azok csökkentésére irányuló erıfeszítések, mivel a betegségek megelızése kisebb költségekkel jár, mint a már kialakultak kezelése; Az egyre szélesebb körő fogyasztói ismeretek, tájékozottság és tudatosság is az okok között szerepel. A média egyre nagyobb figyelmet fordít a táplálkozás és az egészségmegırzés közötti kapcsolatokra, így a fogyasztók érdeklıdése fokozottan erre a témára irányul. Ezen kívül elsısorban az Egyesült Államokban, de több nyugat-európai országban is a kormányok és az egészségügyi szervezetek is egyre nagyobb figyelmet fordítanak az egészséges életmód propagálására; A fejlett országok lakosságának elöregedése; A növekvı környezeti szennyezésekbıl eredı veszélyek ellensúlyozása, hiszen számos krónikus megbetegedésben kimutatottan jelentıs szerepet játszanak a káros környezeti tényezık; Az utóbbi idıben elsısorban a humánbiológia területén elszaporodott új tudományos eredmények és jelentıs újdonságok, valamint a funkcionális élelmiszerekre irányuló fogyasztói érdeklıdés ösztönzıleg hat egymásra. A funkcionális élelmiszereknek alapvetıen két csoportja különböztethetı meg [ROBERFROID, 1999]: az egyik a szerkezeti kölcsönhatáson keresztül ható típus, a másik pedig a betegségek kialakulásának kockázatát csökkentı típus. Az elsı csoportba tartozó élelmiszerek és a szervezet adott élettani funkciója között valamilyen kölcsönhatás alakul ki, kedvezıen befolyásolva annak mőködését (pl. antioxidáns vegyületek - oxidatív stressz). A második csoport képviselıi esetében az adott vegyületek nem közvetlenül az adott betegséget szőntetik meg, hanem közvetett úton annak kockázatát csökkentik (pl. rákos megbetegedések). A funkcionális élelmiszerek között fıként a pre- és probiotikumok, élelmi rostok, halolaj, vitaminok, ásványi anyagok, antioxidánsok terjedtek el. Nagy figyelem irányul az utóbbi idıben a probiotikus tejtermékekre, azon belül is a joghurtokra, illetve a vitaminokkal, kalciummal és ásványi anyagokkal dúsított tejtermékekre. Ezek között mára már szélesebb körben elterjedtek és a funkcionális élelmiszerek piacán stabil szerepet kapnak a Lactobacillus sp., illetve Bifidobacterium sp. probiotikus mikrobakultúrák 15

15 alkalmazásával készült tejtermékek. Ezen kívül elterjedtek még: gyümölcslevek, üdítıitalok, a sütıipar és gabonapelyhek piacán a vitaminokkal, ásványi anyagokkal és kalciummal dúsított termékek, csökkentett koleszterin-tartalmú és növényi szterinekkel, valamint vitaminokkal dúsított margarinkészítmények. Ma még fıként csak Japánban népszerőek az élelmi rostokkal dúsított üdítıitalok és élelmiszerek; elsısorban szintén Japánban és az utóbbi idıben Franciaországban alkalmazzák a prebiotikus hatású oligoszacharidokat az édességek és sütıipar területén [HILLIAM, 1998; GILBERT, 2000]. Magyarországon is széleskörő kutatási eredmények bizonyítják a funkcionális élelmiszerek iránti megnövekedett figyelmet. A budapesti Corvinus Egyetem kutatói, Rezessyné Dr. Szabó Judit, Dr. Hoschke Ágoston és Dr. Mayer Ágnes kutatásai között szerepel probiotikus, humán forrásból izolált Bifidobacterium törzsek szeparációja, azonosítása, fiziológiai, biokémiai és funkcionális jellemzésük [MAYER és mtsai, 2003a, 2003b; SZEKER és mtsai, 2005]. 2. táblázat: A Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézetben kifejlesztett probiotikus tejtermékek és táplálék-kiegészítık Márkanév SynBiofir Probioghurt HunCult Prémium Új Party Aktivit Probios LactoDrink Bonolact Termék (Tejtermékek) Ivókefir Ivójoghurt Fermentált ital Habart tejföl Light vajkrém Túró Rudi Sajtkrém Savó- és íróital (Étrend-kiegészítık) Probiotikum (Flórafenntartó felnıtteknek) Regeneral (Flóraregeneráló felnıtteknek) Junior (Csecsemıknek, gyermekeknek) 16

16 A gyakorlatban is megvalósult példaként említhetı a pécsi Magyar Tejgazdasági Kísérleti Intézetben, Szakály Sándor professzor irányításával zajlott kutatási-fejlesztési program, amelynek során több probiotikus tejterméket és táplálék-kiegészítıt dolgoztak ki, mindezeket táblázatos formában is összefoglaltam (2. táblázat). Közülük azóta néhánnyal kereskedelmi forgalomban is találkozhatunk, ezeket a 2. táblázatban kiemelve tőntettem fel. A SynBiofir ivókefir például 2005-ben világújdonságnak számított és a Kiváló Magyar Élelmiszer védjegyet is elnyerte. [SCHAFFER és mtsai, 2005] Pre- és probiotikumok A funkcionális élelmiszerek fajtái közé tartoznak az ún. pre- és probiotikumok, amelyek között alapvetı mőködési és szerkezeti különbség van. Prebiotikumnak tekinthetı minden olyan, a bélrendszer felsı traktusaiban (szájüreggyomor-vékonybél) nem emészthetı táplálék-alkotórész, amely serkenti a vastagbél hasznos mikrobáinak növekedését, illetve aktivitását. Ezzel szemben a probiotikum kifejezés olyan élı mikrobiális táplálék-kiegészítıt takar, amely a vastagbél bélflórájának mikrobiális egyensúlyának javításával a gazdaszervezetet elınyösen érinti. Ebbe a csoportba tartozó mikrobák pl. Bifidobacterium adolescentis, B. bifidum, B. longum, B. infantis, Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. delbruekii, L. plantarum Prebiotikus hatású egyszerő és összetett szénhidrátok A leggyakoribb prebiotikus hatású vegyületek általában az oligoszacharidok [GRITTENDEN és PLAYNE, 1996] közé tartoznak, ilyenek például a fruktooligoszacharidok, galaktooligoszacharidok, inulin, leván, laktulóz, izomaltooligoszacharidok, xilooligoszacharidok. Oligoszacharid megnevezéssel a 3-10 monomer egységbıl felépülı láncokat jelölik, amelyek felépülhetnek azonos, de eltérı monomerekbıl is. Ezek variációja és száma elméletben végtelen, azonban a gyakorlatban csak viszonylag kisszámú képviselıjük 17

17 található meg természetes eredető tápanyagokban. Mesterséges elıállításuk lehetıségei összefoglalóan az 1. és 2. ábrán láthatóak [GRITTENDEN és PLAYNE, 1996]. Galakto-oligoszacharidok α-d-glu-(1,4)-{β-d-gal-1,6} n, n=2-5 β-galaktozidáz Laktóz β-d-gal-(1,4)-α-d-glu alkáli-izomerizáció Laktulóz β-d-gal-(1,4)-β-d-fru + szacharóz β-fruktofuranozidáz Lakto-szacharóz β-d-gal-(1,4)-α-d-glu-(1,2)-β-d-fru (1,2)- 1. ábra: Galaktooligoszacharidok elıállítása laktózból (Glu=glükóz, Gal=galaktóz, Fru=fruktóz) Az oligoszacharidok vízben oldható vegyültek, melyek édesítıhatása kb %-a a szacharózénak [GRITTENDEN és PLAYNE, 1996] és a molekula szerkezetétıl és nagyságától függı. Ez a viszonylag alacsony édesítıhatás olyan szempontból is elınyössé válhat, hogy egyéb ízek intenzitását nem nyomja el. Egyéb mono-, illetve diszacharidokhoz viszonyítva a nagyobb molekulatömeg miatt az oligoszacharidok oldatát nagyobb viszkozitás jellemzi, melyet élelmiszeripari alkalmazásoknál figyelembe kell venni, hiszen nemcsak az adott készítmény állagát, de fagyáspontját is megváltoztathatják, mely tulajdonság szintén elınyösen is kihasználható. Ezen kívül egyes készítményeknél a hıkezelés során fellépı barnulás folyamata is szabályozható általuk, valamint a nagyobb nedvesség-visszatartó képesség miatt a kiszáradás is elkerülhetı. Ezen kedvezı fizikai-kémiai tulajdonságok ellenére alkalmazásuk fı területe mégis csak a prebiotikus hatásuk (2.2 fejezet) miatt az ún. 18

18 funkcionális élelmiszerekben (2.1 fejezet) jellemzı. Kísérletek során kimutatták, hogy napi 4-10 g fruktooligoszacharid bevitele mellett jelentkeznek annak kedvezı élettani hatásai. Glikozil-szacharóz α-d-glu-(1,4)-α-d-glu-(1,2)-β-d-fru + maltóz glukántranszferáz Palatinóz-oligoszacharidok {α-d-glu-(1,6)-d-fru} n, n=2-4 palatináz Szacharóz α-d-glu-(1,2)-β-d-fru β-fruktofuranozidáz Fruktooligoszacharidok α-d-glu-(1,2)-{β-d-fru-(1,2)} n, n=2-9 β-d-fru-(1,2)-{β-d-fru-(1,2)} n, n=1-9 + laktóz β-fruktofuranozidáz Lakto-szacharóz β-d-gal-(1,4)-α-d-glu-(1,2)-β-d-fru (1,2)- inulináz Inulin α-d-glu-(1,2)-{β-d-fru-(1,2)} n, n>10 2. ábra: Oligoszacharidok elıállítása szacharózból és inulinból (Glu=glükóz, Gal=galaktóz, Fru=fruktóz) A fruktooligoszacharid típusú prebiotikumok hatása és felhasználásuk A természetes eredető oligoszacharidok nagy jelentıségő képviselıi a fruktooligoszacharidok. Ezek számos olyan elınyös tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek lehetıvé teszik széles körő élelmiszeripari és takarmányozási célú alkalmazásukat [ASP, 1996; BORNET és mtsai, 2002]: 19

19 Édesítıhatásuk a szacharóz harmadáénak felel meg, emiatt jól alkalmazhatók olyan élelmiszerek esetében, amelyek elıállításához a szacharóz, illetve egyéb édesítıanyagok túl édesnek bizonyulnak; A cukrok fogszuvasodást elıidézı hatása a szájüregben elıforduló Streptococcus mutans mőködésének következménye, amely képes a mono- és diszacharidokat savvá hidrolizálni, melyek a fogzománc felületén kialakuló lyukakért felelısek. A fruktooligoszacharidoknak ezzel szemben, mivel nem hidrolizálódnak a szájüregben, nincs fogszuvasodást elıidézı hatásuk sem [MOYNIHAN, 1998], azaz nem kariogének; A vastagbél nyálkahártya ph-jának csökkentése révén növelik bizonyos ásványi anyagok, így a kalcium, magnézium, cink, vas és foszfor oldódását és így elısegítik azok felszívódását [CORSINI és mtsai, 1995a; CORSINI és mtsai, 1995b]. A kalcium és magnézium felszívódásának javításával lényegesen csökkenthetı a csontritkulás kialakulásának veszélye, míg a vas jobb felhasználásával a vérszegénység kialakulása elızhetı meg [MOLIS és mtsai, 1996]; Ezeken kívül rendelkeznek a korábbiakban már ismertetett (2.2 fejezet) prebiotikus tulajdonsággal is. Kedvezı hatással vannak a bélflóra baktériumainak (Bifidobacteria, Lactobacillus sp.) szaporodására. Mivel azok szén-dioxiddá és olyan rövidláncú zsírsavakká fermentálják ıket (tejsav, ecetsav, propionsav, vajsav), amelyek a szervezet egészségének fenntartásában fontos szerepet játszanak. Ezen ún. probiotikus hatást és annak kedvezı élettani következményeit szintén egy korábbi fejezetben ismertettem (2.2 fejezet). Számos klinikai kísérlet által alátámasztott tanulmány is bizonyítja [TUNGLAND és MEYER, 2002; SCHOLZ-AHRENS, 2001], hogy a fruktooligoszacharidokat az emésztıszervrendszer felsı traktusainak (szájüreg, gyomor, vékonybél) enzimei (pl. α-amiláz, szacharáz, maltáz) nem képesek lebontani, így a szervezet közvetlen energiaforrásként nem képes felhasználni ıket, kalóriatartalmuk mindössze kb. 8 kj g -1. Emiatt diabetikus és alacsony kalóriatartalmú termékek gyártására is felhasználhatók [LUO és mtsai, 1996]. 20

20 A fruktooligoszacharidok csoportjának szakirodalmi megítélése nem teljesen egységes. A szakirodalomban találkozhatunk a fruktánok, glükofruktozánok és inulintípusú oligoszacharidok elnevezéssel is. A fruktán típusú vegyületeknek alapvetıen 3 csoportját különböztethetjük meg: 1. Inulin típusú vegyületek, amelyekhez a lineáris β-(2-1)-fruktánok tartoznak, amelyeket egyébként glükofruktozánoknak is neveznek. 2. Ezek megkülönböztetendıek a második típustól, az ún. leván-típusú oligoszacharidoktól, melyek valójában β-(2-6)-fruktánok. 3. A harmadik csoportba pedig a β-(2-1)-, és a β-(2-6)-kötéseket egyaránt tartalmazó fruktánok tartoznak. A többség azonban azokat a molekulákat tekinti a rövid láncú fruktooligoszacharidok csoport tagjának, melyek szerkezetüket tekintve egy glükóz egységbıl és az ahhoz β-2-1 glikozidos kötéssel kapcsolódó két, három, négy, illetve több fruktóz egységbıl felépülı nyílt láncú molekulák.. kesztóz GF 2 nisztóz GF 3 fruktozil-nisztóz GF 4 3. ábra: A fruktooligoszacharidok szerkezete 21

21 A homológ sor elsı három és leggyakrabban elıforduló képviselıje (3. ábra) az 1- kesztóz (β-d-fruktofuranozil-(2 1) 2 -α-d-glükopiranozid, GF 2 ), a nisztóz (β-dfruktofuranozil-(2 1) 3 -α-d-glükopiranozid, GF 3 ) és a fruktozil-nisztóz (β-dfruktofuranozil-(2 1) 4 -α-d-glükopiranozid, GF 4 ) [YUN, 1996]. Az egyes molekulák moláris tömegei a következık: 1-kesztóz = 504 g mol -1, nisztóz = 667 g mol -1, fruktozilnisztóz = 829 g mol -1. A természetben számos növényben, például banán, hagyma, fokhagyma, cikória, cukorrépa, gabona, rizs megtalálhatók, valamint a méz is tartalmaz fruktooligoszacharidokat, azonban viszonylag kis koncentrációban. A 3. táblázatban néhány példa látható a fruktooligoszacharidok természetes elıfordulására [SANGEETHA és mtsai, 2005]. 3. táblázat: Néhány növény természetes fruktooligoszacharid-koncentrációja (m/m%) Növény Fruktooligoszacharid-koncentráció (%) Árpa 0,15 Paradicsom 0,15 Hagyma 0,23 Banán 0,30 Rozs 0,30 Fokhagyma 0,60 Méz 0, Probiotikumok A 20. század elején Metchnikov orosz Nobel-díjas tudós felfedezte, hogy Dél-Európa egyes részein az emberek sokkal tovább élnek, mint másutt. Kutatásai során megállapította, hogy ezeknek az embereknek az étrendje nagy mennyiségő aludttejet tartalmazott, aminek a készítésében egy bizonyos baktérium (melynek Metchnikov a Lactobacillus bulgaricus nevet adta) is szerepet játszott és a rendszeres fogyasztás miatt ez a baktérium állandóan jelen volt az emésztırendszerükben [WALKER és DUFFY, 1998]. A késıbbiekben 22

22 egyértelmően megállapították, hogy a különbözı tejtermékek számos kedvezı hatással bírnak a szervezet egészségének egészére és az emésztırendszerre nézve. Növelik a fertızésekkel szembeni ellenállóképességet, antibakteriális hatást fejtenek ki és erısítik az immunrendszert, segítenek az emésztıszervi megbetegedések gyógyításában, a rákos megbetegedések megelızésében, illetve csökkentik a vér koleszterinszintjét [CREMONINI és mtsai, 2002; MORELLI, 2002]. A vastagbél baktériumai azért képesek táplálékként hasznosítani az oligoszacharidokat és oligofruktánokat, mert β-fruktozidáz (inulináz) enzimükkel képesek hidrolizálni azok β-2-1 kötéseit [BIEDRZYCKA és BIELECKA, 2004]. A megfelelı probiotikus hatású baktériumokkal szemben támasztott követelmények a következık [WALKER és DUFFY, 1998]: Ellenállóképesség az emésztırendszer enzimeivel szemben; Kolonizáció a vastagbélben; Bizonyítottan kedvezı hatás az egészségre; A Bifidobacterium sp. és Lactobacillus sp. probiotikus baktériumok mőködési jellemzıi a következık [LOSADA és OLLEROS, 2002]: Rövidláncú zsírsavak termelése; Fermentációs termékeik között több tejsavtermelés, kevesebb ecetsav- és hangyasav-termelés; Antibakteriális hatású anyagok termelése, kedvezıtlen környezet kialakítása a különféle kórokozók (pl. Clostridium-, Coli-fajok, gombák) számára; Az immunrendszer mőködésének serkentése; Segítik a tejfehérjék, az aminosavak, a zsírok és a laktóz feldolgozását; Részt vesznek a szervezet számára fontos K, illetve B vitaminok szintézisében; Az orálisan szedett antibiotikumok elpusztítják a hasznos bélflórát, és pl. Candida albicans nevő gomba elszaporodását idézik elı, ami hasmenéshez, székrekedéshez vagy egyéb emésztési zavarokhoz vezet, valamint a szervezet egyéb területeinek is gombásodást idézhet elı: a tüdıben, a szájban, a végtagokon. A probiotikus sejtek a vastagbél nyálkahártyájára tapadva megakadályozzák a patogén mikrobák 23

23 megtapadását és elszaporodását, ami a szervezet és az immunrendszer legyengülése esetén könnyen elıfordulhat; A bél nyálkahártyájának erısítése; A bélflóra összetételére gyakorolt kedvezı hatás; A vastagbél nyálkahártyájára tapadva megakadályozzák a patogén mikrobák megtapadását és elszaporodását; A vér koleszterinszintjének csökkentése a máj lipid-metabolizmusának befolyásolása révén; A vér LDL szintjének (kis sőrőségő lipoprotein, rossz koleszterin ) csökkentése: a vastagbél flórája által termelt rövidláncú zsírsavak akadályozzák a koleszterin képzıdését a májban, a koleszterin bioszintézisében közvetlenül résztvevı HMG- CoA (3-hidroxi-3-metil-glutaril) reduktáz enzim mőködésének akadályozásával [CORSINI és mtsai, 1995a; CORSINI és mtsai, 1995b]; Anti-mutagén és anti-karcinogén hatás; A vér glükózszintjének csökkentése a máj metabolizmusának befolyásolása révén. A probiotikus termékek alkalmazása a csecsemıknél kiemelt jelentıséggel bír. A legalapvetıbb probiotikus hatású anyag a csecsemıkorban természetes táplálék, az anyatej, melynek kedvezı immunológiai és szövettápláló hatásai eddig is bizonyítottak voltak [LEVY, 1998; DEWEY és mtsai, 1995], alapvetıen fontos szerepet játszik az újszülöttek még fejletlen immunrendszerének kialakításában [RAUTAVA, 2002]. Az utóbbi évek vizsgálatai kimutatták azt is, hogy az anyatej probiotikus hatású tejsavbaktériumokat tartalmaz, melyek egyértelmően az anyatejtáplálásnak a vastagbél baktérium flórájára gyakorolt kedvezı hatását bizonyítják [LÖNNERDAL, 2000; ROCÍO és mtsai, 2003]. Míg a tápszerrel táplált csecsemık esetében a vastagbélben egy vegyes bélflóra alakul ki nagyobb számú patogén baktérium megjelenése mellett, az anyatejjel táplált csecsemıkben a Bifidus és Lactobacillus [POLGÁR, 2003; DEWEY és mtsai, 1995] flóra kolonizálódik fıként, amely képes a patogén baktériumok elszaporodásának és toxin termelésének a megakadályozására. Ezen kívül közvetlen kedvezı hatást fejt ki az immunrendszerre és szerepe van a fertızı és atópiás megbetegedések megelızésében is. Csecsemıknél a bélben a tápszeres és késıbb a vegyes táplálásra történı átállás során a bifidus flórát vegyes flóra 24

24 váltja fel. Egyes megfigyelések arra utalnak [LÖNNERDAL, 2000], hogy a Bifidus és Lactobacillus törzsek visszatelepítésével a bélbe és kolonizálódásának elérésével számos betegségben terápiás hatás érhetı el, ezért életkortól függetlenül jelentıséget kapott az élıflórát tartalmazó tápszerek és élelmiszerek fogyasztása. Hangsúlyozandó, hogy a probiotikumként alkalmazható mikrobák csak akkor képesek kifejteni hatásukat, ha számukra felhasználható prebiotikus tápanyagok is jelen vannak a vastagbélben. A jövıben nagy valószínőséggel az ún. szinbiotikumok elterjedése várható. Ezek a pre- és probiotikus hatást ötvözik [BENGMARK, 2003] A fruktooligoszacharidok elıállításának enzimatikus lehetıségei A legtöbb élı szervezet, így a mikroorganizmusok, növények és állatok életmőködései során fellépı különféle biokémiai reakciók lejátszódásáért az élıvilágban meglehetısen nagy számban jelenlévı enzimek a felelısek. A biotechnológia alkalmazása során az ember ezen biokatalizátorokat saját szolgálatába állította. A biokatalitikus fruktooligoszacharid elıállítási eljárás kivitelezésére alapvetıen kétfajta, egymástól lényegesen eltérı megoldás létezik: inulin részleges hidrolízise inulináz enzimmel, illetve szacharóz átalakítása fruktozil-transzferáz enzimmel. Ez utóbbi során szacharóz (GF) kiindulási anyagból az ún. fruktozil-transzferáz (Ft-áz) enzim segítségével alakítható ki a rövid láncú fruktooligoszacharidok elegye több lépésben. A végtermék elegy a GF 2, GF 3, GF 4 és az át nem alakult szacharóz mellett melléktermékként keletkezı glükózt is tartalmaz. Mivel glükóz a szintézisreakció kompetitív inhibitora, így annak eltávolítása nélkül maximálisan kb. 60 %-os fruktooligoszacharid-koncentráció érhetı el. A glükóz folyamatos eltávolítása a rendszerbıl tehát jelentısen megnövelheti az elıállított termékkoncentrációt. A fruktooligoszacharidok biokatalitikus szintézisének kivitelezésére alkalmazható enzimek megnevezése sem egységes. Néhány szerzı a hidrolázok csoportjába tartozó β-dfruktofuranozidázok (EC ) elnevezést használja, melynek oka az enzim transzfruktozilációs aktivitásának felfedezésébıl adódik. Ugyanis invertáz mőködését magas szacharóz-koncentráció mellett vizsgálva mellékreakcióként derült ki ennek az 25

25 aktivitásnak a megléte. Míg mások éppen a transzfruktoziláz aktivitásra utalva a fruktoziltranszferázok (EC ) elnevezést alkalmazzák, ezzel mintegy kiemelve az enzim nem hidrolitikus voltát [YUN, 1996]. A transzferázok különbözı atomcsoportok átvitelét katalizálják a szubsztrátról egy másik molekulára. Az átvitt csoport lehet foszfát-, szulfát-, metilgyök, cukorrész, aminocsoport, nukleotidrész és más egyéb vegyület is. A transzferázok fontos szerepet töltenek be az erjedési folyamatokban, az aromaképzıdésben, a gyümölcsérésben és sok alapvetı biológiai szintézisben. Az élelmiszer-tudomány számára a legfontosabb transzferázok a következık: foszfo-transzferázok, glükozil-transzferázok, aminotranszferázok, valamint a fruktozil-transzferáz. 4. táblázat: Különbözı mikrobák alkalmazása mellett elérhetı fruktooligoszacharidhozamok Forrás Kiindulási szacharózkoncentráció Hozam (%) Hivatkozás (g dm -3 ) Aspergillus niger AS [L'HOCINE és mtsai, ] Penicillium citrinum [HAYASHI és mtsai, 2000] Aspergillus japonicus [CHIEN és mtsai, 2001] Aspergillus oryzae CFR Aureobasidium pullulans CFR [SANGEETHA és mtsai, 2004a] [SANGEETHA és mtsai, 2004b] Bacillus macerans EG [PARK, 2001] Zymomonas mobilis [BEKERS és mtsai, 2002] 26

26 A fruktooligoszacharidok mesterséges úton, nagyobb méretekben történı elıállításának lehetséges módja az enzimkatalitikus szintézis, amelyre kétféle lehetıség kínálkozik [YUN, 1996]: Növényi eredető enzimek alkalmazása: pl. spárga, cukorrépa, hagyma, fokhagyma, articsóka, agavé, cikória enzimei. Ezek szezonális jellege miatt alkalmazásuk kisebb jelentıségő. A másik, nagyobb enzimhozammal rendelkezı csoportban az enzimforrás bakteriális, illetve gomba eredető: pl. Bacillus macerans, Zymomonas mobilis, Lactobacillus reuteri, Aspergillus sp., Aureobasidium sp., Arthrobacter sp., Fusarium sp., Penicillium sp.. Néhány mikroba alkalmazása mellett elérhetı fruktooligoszacharid-hozamra vonatkozó adatokat tartalmaz a 4. táblázat A transzferázok szerepe a fruktooligoszacharidok szintézisében Az enzimmel katalizált fruktooligoszacharid szintézis reakciómechanizmusa nagyban függ a biokatalizátor eredetétıl. A növények és néhány mikroba esetében több enzim együttes mőködésérıl van szó [YUN, 1996]. Például a csicsóka (Helianthus tuberosus) esetében a folyamat a következıképp alakul [EDELMAN és DICKERSON,1996]: Két enzim mőködik együtt: a szacharóz: szacharóz 1-fruktozil-transzferáz (SST) és a β(2 1) fruktán 1-fruktozil-transzferáz (FFT). SST az elsı lépésben szacharózt alakít át glükózzá és kesztózzá (lásd 1.), majd második lépésben az FFT konszekutív reakció során hoz létre nagyobb tagszámú oligoszacharidokat (lásd 2.). GF + GF GF F + G (1) GF F + GF F GF F + GF F (2) n m n 1 m+1 Agavé enzimjének a mőködését vizsgálva a következı eredményre jutottak [BHATIA és NANDRA, 1979]: 27

27 GF + fruktozil transzferáz F fruktozil transzferáz + G (3) F fruktozil transzferáz + GF GF2 + fruktozil transzferáz (4) Hangsúlyozandó, hogy ebben az esetben a glükóz és nem a fruktóz szerepel a szacharózból származó fruktozil-csoport akceptoraként. A képzıdı GF 2, GF 3 és GF 4 molekulák nem mőködhetnek fruktozil donorként, de a magasabb tagszámú oligomerek kialakulása esetén a szacharózból származó glükóz akceptoraként igen. Egy másik vizsgálat [DICKERSON, 1972] során Claviceps purpurea-ból származó enzim mechanizmusát vizsgálták. F 2 1G + F2 1G F 2 6G1 2F + G (5) F 2 1G + F2 6G1 2F F 2 1F 2 6G1 2F + G (6) Ebben az esetben a számok a karbonil-csoportok kapcsolódó szénatomjainak pozícióját, a vékony nyilak pedig a kötés irányultságát jelölik (pl. F2 1G a szacharóz megfelelıje). Aspergillus niger és Aureobasidium pullulans eredető enzimnél a következı (lásd 7.) reakciómechanizmust találták [YUN, 1996], ahol a képzıdı legnagyobb tagszámú oligomer a GF 4. A reakciómechanizmus szerint a szacharóz diszproporcionálódási folyamatban donorként és akceptorként egyaránt szerepel. Itt külön kiemelendı, hogy ezek az enzimek nagymértékő régióspecificitással rendelkeznek, azaz szelektíven szállítják a szacharózról származó fruktozil-csoportot a másik szacharóz molekula elsı szénatomjára, így kizárólag 1-kesztóz keletkezésével kell számolni. GF n=1-3 (7) + + n GFn GFn 1 GFn +1 28

28 Azaz: 8 GF 4 G 4 GF 2 2 GF 2 GF 3 GF 2 GF 4 Számos fruktozil-transzferáz enzimet izoláltak már [YUN, 1996; SANGEETHA és mtsai, 2005; BEKERS és mtsai, 2002; PARK és mtsai, 2003; EUZENAT és mtsai, 1997]: általánosságban elmondható, hogy a mikrobiális eredető enzimek nagyobb molekulamérettel és stabilitással, valamint jobb hımérséklet-tőréssel rendelkeznek, mint a növényi eredető társaik. Az eddig leírt enzimek többsége magas (> 500 g dm -3 ) kiindulási szacharózkoncentráció mellett katalizálja a transzfruktozilációs folyamatot, azaz a fruktooligoszacharidok szintézisét. Ezen szacharóz-koncentráció alatt a hidrolitikus folyamatok lépnek elıtérbe. Fontos megjegyezni, hogy számos, fruktozil-transzferáz enzimet tartalmazó mikroba egyben hidrolitikus, a fruktooligoszacharidok bontását katalizáló enzimet is termel [HAYASHI és mtsai, 1990; PATEL és mtsai, 1994], mindez gyakorlati szempontból meglehetısen elınytelennek bizonyulhat. Az enzimaktivitás definiálására az irodalomban kétféle lehetıséget találhatunk. Egyesek 1 U aktivitással jellemzik azt az enzimennyiséget, amely 1 µmol fruktóz egyik molekuláról a másikra történı átvitelét idézi elı 1 perc alatt, míg mások ugyanezt az egy perc alatt képzıdı 1 µmol glükóz keletkezését elıidézı enzim mennyiségével jellemzik 29

29 [YUN, 1996]. A glükóz mennyiségi meghatározásának egyszerőbb kivitelezhetısége miatt ez utóbbi definíció gyakorlati szempontból elınyösebb A hidrolázok szerepe a fruktooligoszacharidok elıállításában Az elıállítási módok között a biokatalitikus szintézisreakció mellett másik lehetıségként az inulinból történı hidrolitikus bontás lehetısége áll fenn. Az inulin olyan poliszacharid típusú vegyület, DP=10-60, melyben β-2,1 kötésekkel kapcsolódnak össze a fruktózok, a lánc végét egy szacharóz típusú (α-2,1 kötés) glükóz-fruktóz kötéssel lezárva. Az inulin önmagában is rendelkezik prebiotikus tulajdonságokkal [LÓPEZ-MOLINA és mtsai, 2005]. Adagolása során 1-10 g/nap átlagos mennyiség javasolt. A kezelés alatt a vastagbélben a Bifidobacteriumok, melyek β-1,2-glükozidáz aktivitásuk révén képesek bontani az inulint és Lactobacillusok száma bizonyíthatóan növekedett [VANLOO és mtsai, 1995], 40 g/nap dózis felett azonban már nincs jelentıs további növekedés, nem érdemes ennél nagyobb mennyiségekben alkalmazni. Kísérletek során bizonyították, hogy inulin hatására kb. 30 %-kal növekedett a rövidláncú zsírsavak, ezek közül is elsısorban a propionsav és vajsav koncentráció a vastagbélben (ecetsav, tejsav és egyéb elágazó láncú zsírsavak mennyisége nem növekedett számottevıen) [VAN DE WIELE és mtsai, 2004]. F F F F F F F F F F F F (F) m F F F F F F F F F F G F F G F F + F F F F F + F F F + F F F + F F F F F F F F m 4. ábra: Inulin hidrolízise (G-glükóz, F-fruktóz) (endo-)inulinázzal [RONKART és mtsai, 2007] 30

30 Az inulin enzimatikus hidrolízise (endo-)inulináz (E.C ) enzim alkalmazásával hajtható végre, melynek során DP=2-9 tagszámú oligofruktózok, azaz fruktooligoszacharidok és D-fruktóz molekulák keletkeznek (4. ábra) [ROCHA és mtsai, 2006]. A hidrolízist a hidrolázok csoportjába tartozó (exo-)inulináz (EC ) enzimmel végrehajtva D-fruktóz szirup elıállítása lehetséges [CATANA és mtsai, 2007]. A gyakorlatban az inulin-típusú oligoszacharidok elıállításának ma már ipari léptékben megvalósított eljárása a csicsókából (Helianthus tuberosus) és a cikóriából (Cychorium intybus) történı hidrolízis. Az ilyen, inulin-típusú oligoszacharid keverékek összetétele azonban szélesebb spektrumú, nagyobb mennyiségben tartalmaz fruktózláncokat (F m ) és kis mennyiségben terminális glükózt tartalmazó molekulákat (GF n ). Ezzel szemben a szacharózból kiinduló szintézissel történı elıállítás esetében a jóval homogénebb GF n (n=1-10) összetétellel rendelkezı oligoszacharidok elıállítására van lehetıség, illetve akár egyetlen oligomer-frakció, pl. GF 4 elıállítása is lehetséges. Az összetételnek megfelelıen az inulin-típusú oligoszacharid-elegyek fizikai tulajdonságai is eltérnek a rövid láncú fruktooligoszacharidokétól [NINESS, 1999]. Nagyobb molekulatömegük és lánchosszuk miatt oldatukat nagyobb viszkozitás jellemzi. Rosszabb oldhatóságuk miatt vizes közegben hajlamosak a kristályképzésre, amelynek eredményeképpen állagában a közkedvelt termékekre emlékeztetı (tejszín, vaj, stb.) ízhatás és érzet alakul ki, érzékszervi tulajdonságaik leginkább azokhoz teszik hasonlatossá ıket. Ezt táplálék-kiegészítıként való alkalmazásukkor érdemes figyelembe venni. Élettani hatásaikat tekintve az eddigi kutatások során lényeges különbséget nem mutattak ki [RONKART és mtsai, 2007; KOLIDA és GIBSON, 2007]. Mindkét típus rendelkezik a korábban már ismertetett ( fejezet) kedvezı prebiotikus tulajdonsággal. Fiziológiai szempontból mindkét típust az élettanilag kedvezı tulajdonságú élelmi rostok közé sorolhatjuk [GRAHAM és AMAN, 1986]. 31

31 2.4. A szimultán termékkinyerés jelentısége összetett biokatalitikus folyamatokban A biokatalitikus folyamatok során gyakran fellépı probléma, hogy a keletkezı termék, illetve melléktermék inhibitor vagy toxikus hatású az alkalmazott biokatalizátorra (élı sejt vagy enzim) nézve. Erre a problémára jelent megoldást az ún. extraktív biokatalízis [MATTIASON és LARSSON, 1985; LYE és WOODLEY, 1999; SCHÜGERL, 2000] alkalmazása, amely során a keletkezı terméket, illetve mellékterméket a képzıdéssel egyidejőleg és lehetıleg szelektíven nyerik ki a rendszerbıl. A szimultán termékkinyerésnek a termékgátlás hatásának csökkentése mellett további kedvezı hatásai is lehetnek: a kedvezıtlen reakció-egyensúly eltolása; a termék esetleges bomlásából adódó veszteségek csökkentése; a feldolgozási mőveleti lépések számának csökkentése. Mindezek következménye, hogy az extraktív biokatalitikus rendszerekben a hagyományosakhoz képest: csökkenthetı a reaktor térfogata; megtakarítás érhetı el a mind a katalizátor-, mind a szubsztrátköltségeknél. Az extraktív biokonverziók nem egyszerően két- vagy többlépéses folyamatok, megvalósításukra az integrált rendszerek kialakítása ad lehetıséget. A szimultán termékszeparáció és az ahhoz kapcsolódó további lépéseket több körülmény határozza meg: a reakció típusa, a biokatalizátor formája (élı sejt vagy enzim, oldott vagy rögzített biokatalizátor), a bioreaktor kialakítása és mőködési módja. A szubsztrátnak és a termék(ek)nek, illetve melléktermék(ek)nek a biokonverzióval szimultán szeparációjára többfajta módszer alkalmazható [LYE és WOODLEY, 1999] (5. táblázat). 32

32 5. táblázat: A fontosabb szimultán termékszeparációs technikák csoportosítása [LYE és WOODLEY, 1999] Az elválasztás alapja (hajtóerı) Lehetséges technikák Megjegyzés Fizikai tulajdonság Illékonyság Desztilláció Gáz-kihajtás Ritkán alkalmazott Molekulatömeg vagy -méret Membránok (MF, UF, RO, stb.) Centrifugálás Méretkizárás Pervaporáció* A szubsztrát és a termék között gyakran túl kicsi a különbség Oldhatóság Extrakció (ATPS, SC is) Kicsapás, kristályosítás Nagy kapacitás, de általában kis szelektivitás Kémiai tulajdonság Töltés Hidrofobicitás Kémiai reakció Elektrodialízis, Ioncsere, Adszorpció, Affinitáson alapuló módszerek Nagy szelektivitás, de általában kis kapacitás * A szeparációs hajtóerık kombinációján alapul. MF: mikroszőrés; UF: ultraszőrés; RO: fordított ozmózis; ATPS: vizes kétfázisú rendszer; SC: szuperkritikus; HIC: hidrofób-kölcsönhatás kromatográfia 33

33 A fruktooligoszacharid szintézis melléktermékének eliminálási lehetıségei A magas fruktooligoszacharid tartalmú elegyek elıállításának fı hátráltatója a szintézisreakció során fellépı melléktermék, azaz a reakcióban keletkezı glükóz inhibíciója. Eltávolítása nélkül maximálisan %-os oligoszacharid-kihozatal érhetı el [YUN és mtsai, 1990]. Ennek következményeképp az ezen a módon iparilag elıállított és kereskedelmi forgalomba kerülı fruktooligoszacharid-elegyek nagy mennyiségben tartalmaznak kiindulási szacharózt és glükózt is. A hatékonyság növelése és kedvezıbb élettani tulajdonságú elegyek elıállítása érdekében érdemes foglalkozni a melléktermék eliminálásának megoldásával. A glükóz eltávolítására több lehetıség is kínálkozik, például membránszeparáció [SJÖMAN és mtsai, 2007; NISHIZAWA és mtsai, 2000], kromatográfiás elválasztás [VONACH és mtsai, 1998], vagy enzimatikus eltávolítás. Ez utóbbira példa a glükóz-izomerázzal és glükóz-oxidázzal történı eliminálás [YUN, 1996]. A glükóz-izomeráz (EC ) enzim az izomerázok csoportjába tartozik, mőködése során glükózt képes átalakítani fruktózzá. A szakirodalomban talált példa [YUN, 1996] szerint ilyen típusú kevert enzimes rendszerben a glükózra vonatkozó kinetikai állandók (Michaelis-Menten, inhibíciós) kedvezıtlen alakulása révén nem sikerült magasabb fruktooligoszacharid-hozamot elérni. A glükóz-oxidáz (β-d-glükóz: oxigén 1-oxidoreduktáz, EC ) enzim az oxidoreduktázok csoportjába tartozik, egy 160 kda molekuláris súlyú dimer szerkezető flavoprotein, kofaktorként FAD-ot tartalmaz. Izoelektromos pontja pi=4,2. Mőködése során β-d-glükóz glükonsavvá (D-glükono-1,5-lakton) és hidrogén-peroxiddá történı oxidációját katalizálja, elektronakceptorként molekuláris oxigént használva fel A szilárd fázisú biokatalízis A biológiai és biokémiai rendszerek alkalmazása során a biotechnológiában is - hasonlóan a vegyiparhoz - az ipari alkalmazhatóság és gazdaságosság követelményei váltak meghatározóvá. Az enzimek immobilizálása a drága biokatalizátorok visszaforgatásának igényével vetıdött fel. Az ötlet már 1915-ben felmerült, azonban akkor még nem tudtak 34

34 megfelelıen stabil készítményeket elıállítani. Az 1950-es években azonban ismét elıtérbe került a probléma és 1955-ben Manecke állított elı elsıként megfelelı stabilitású készítményt polimer hordozó alkalmazásával [CAO, 2005] A rögzített enzimek jelentısége Az enzimkatalitikus átalakítások megvalósításának két alapvetı módja lehetséges. Az egyik során szakaszos üzemmódban szabad állapotú enzimmel, illetve az enzimet tartalmazó sejttel történik az átalakítás. Általában a nem túlságosan drága és a sejtekbıl könnyebben kinyerhetı extracelluláris enzimeket alkalmazzák ilyen módon, mint például a hidrolázok: amilázok, cellulázok, pektinázok [BALLESTEROS és mtsai, 1994]. A másik esetben valamilyen szilárd fázisú hordozóhoz rögzítetten alkalmazzák a biokatalizátort. Az enzimek, mint biokatalizátorok valamilyen szilárd fázisú hordozóhoz történı rögzítése több szempontból is elınyös lehet: A biokatalizátor könnyebben kezelhetıvé és újrafelhasználhatóvá válik, ami csökkenti az eljárás költségeit; Folyamatos üzemmód megvalósítása válik lehetıvé; A folyadékfázis által kimosódó biokatalizátor mennyisége minimális; A rögzítés gyakran csökkenti az adott készítmény fajlagos aktivitását, azonban ezt ellensúlyozza, hogy az aktív térszerkezet stabilizálása révén a készítmény mőködési stabilitása megnövekszik. Az immobilizált enzimkészítményeknek alapvetıen két követelménynek kell megfelelniük [CAO, 2005]: egyrészt a nem-katalitikus tulajdonságaikból adódóan, amelyek a környezetüktıl való könnyő elválaszthatóságot, újrafelhasználhatóságot és stabilitást biztosítják számukra; másrészt a katalitikus sajátságaikon keresztül, amelyek egy adott reakció kivitelezésében szükségesek (aktivitás, produktivitás, hozam). Mindezen tulajdonságok folyamatfüggık, azaz az adott reakció, szubsztrát, termék, reaktortípus határozza meg a rögzítés alapanyagát, módszerét és annak körülményeit, ezért kiválasztásuknál mindezekre figyelemmel kell lenni. 35

35 Az enzimrögzítés fontosabb típusai Az enzimek rögzítésére számos, a gyakorlatban is elterjedt módszer ismert. Ezek összefoglalását tartalmazza az 5. ábra. Immobilizálási módszerek Spontán önadszorpció Irányított (mesterséges) rögzítés Hordozóra rögzítés kovalens kötéssel Gélbezárás Membrán - nal történı elhatárolá s Kereszt - kötés Mikro - kapszulázás 5. ábra: Az enzimrögzítés fontosabb típusai Ezek közül az adszorpcióval történı rögzítés talán a legelterjedtebben használt és legegyszerőbb módszer [RANI és mtsai, 2000; DUMITRIU és mtsai, 2003]. Ebben az esetben az enzimmolekulák elsısorban gyenge van der Waals-erıkkel kötıdnek a hordozó felületén, de a kötésben hidrogénhidak és hidrofób kölcsönhatások is részt vehetnek. Hordozóként szervetlen (alumínium-oxid, titán-hidroxid, bentonit, kalcium-karbonát, agyag, szilikagél, aktív szén, üveg stb.) és szerves (pl. cellulózszármazékok) anyagok is alkalmazhatók. Az adszorpciós rögzítés gyakori hátránya, hogy a gyenge kötıerık következtében a reakció közben bekövetkezı szubsztrát- és ionkoncentráció változások, illetve a hımérséklet-emelkedés hatására deszorpció következhet be. Az ionos rögzítés az enzim és a hordozó ellentétes töltéső csoportjai közötti elektrosztatikus vonzás révén jön létre [GODJEVARGOVA és mtsai, 2006; JANG és mtsai, 2000]. A kötés erısebb, mint az adszorpció esetében, de gyengébb a kovalens rögzítésnél. Természetes alapú (pl. cellulóz, dextrán), valamint szintetikus (pl. polisztirol származékok) ioncserélıket alkalmaznak hordozóként. A módszer jelentıs elınye a hordozó 36

36 regenerálhatósága, hátránya viszont a kovalens rögzítéshez képest a gyengébb erısségő kötés és más ionok lehetséges zavaró hatása. A kovalens kötéseken keresztüli rögzítés esetében a hordozó és a biokatalizátor között megosztott elektronpár képez kapcsolatot [CHELLAPANDIAN és SASTRY, 1996; BAUTISTA és mtsai, 2001]. Ez erıs kötést biztosít a biokatalizátor és a hordozó egyes funkciós csoportjai között, és széles szubsztrátkoncentráció tartományban alkalmazható, a környezet változására kevésbé érzékeny makromolekuláris katalizátor keletkezik. Kovalens kötések többek között az alábbi kémiai reakciókkal alakíthatók ki: diazotálás; amidkötés képzése; alkilezés és arilezés; A ún. keresztkötéses módszer az enzimmolekulák közötti intermolekuláris kovalens kötések létrehozásán alapul. Lényege, hogy az egyes enzimmolekulákat, bi- vagy multifunkciós reagensek segítségével összekapcsolják egymással, és így nagy molekulamérető, oldhatatlan aggregátumok alakulnak ki [ILLANES és mtsai, 2006; JIN CHUAN WU és mtsai, 2006]. Ebben az esetben tehát hordozó alkalmazására nincs szükség. Keresztkötések kialakítására glutáraldehidet, bisz-izocianát származékokat, N,N -etilénbisz-maleinimidet stb. alkalmaznak. Ezek közül a legelterjedtebb a glutáraldehid, amely Schiff-bázis képzés közben reagál a fehérjemolekulák szabad aminocsoportjaival. Egyes esetekben az enzim aktívcentrumának konformációját érintheti a reakció, és ez jelentıs mértékő aktivitáscsökkenéshez vezethet. Az immobilizálás általában hatással van az enzimmőködés kinetikai és mőködési paramétereire. A szabad és rögzített állapotú enzimek között különbségek alakulhatnak ki, úgymint alacsonyabb fajlagos aktivitás, kisebb reakciósebesség, eltérı optimális mőködési ph és hımérséklet, eltérı hıstabilitás. Ezen változások többféle okra vezethetıek vissza [BALLESTEROS és mtsai, 1994]: 1., Konformációs hatások: a rögzítés hatására bekövetkezı fajlagos aktivitás és szelektivitás csökkenés az enzimfehérje negyedleges szerkezetének változásaival magyarázható, mivel a rögzítıanyag és a fehérje között kialakuló kötések megváltoztatják az enzim térszerkezetét. 37

37 2., Sztérikus hatások: az enzim és hordozó közötti kapcsolat az enzim aktív centruma és a szubsztrát között térbeli gátlást alakít ki. 3., Partícionáló hatások: a hordozó kémiai tulajdonságaiból eredı (pl. elektromos töltéssel rendelkezı hordozó esetén elektrosztatikus erık) hatás. A fı jellemzıje ennek egy, a hordozó töltésétıl függı ugrás a rögzített készítmény ph optimumában (6. ábra). Fajlagos aktivitás (Uḡ 1 ) a b c ph 6. ábra: Rögzített enzimek ph-optimumának eltolódása a hordozó töltésének függvényében (a: savas karakterő hordozó; b: semleges karakterő hordozó; c: lúgos karakterő hordozó) [BALLESTEROS és mtsai, 1994] 4., Anyagátadási vagy diffúziós hatások: a diffúziós ellenállásból és a szubsztrát felületi transzportjából erednek. Két fajtájuk különböztethetı meg. Az egyik esetében az enzim valamilyen pórusos hordozó belsejében rögzítetten van jelen, a másik esetben pedig az enzim a hordozó felületére rögzítetten helyezkedik el. Az immobilizált enzim stabilitása több tényezıtıl függ: az enzimfehérje és a hordozó között kialakított kötések számától és fajtájától (kovalens-nem kovalens), az enzim és a hordozó mikrokörnyezetétıl, valamint a rögzítés körülményeitıl [MOO-YOUNG és CHISTI, 1994]. A hordozó pórusmérete és fajlagos felülete közötti kapcsolat hatással van a kialakított biokatalizátor aktivitására [BLANCO és mtsai, 2004]: kb. 200 m 2 g -1 fajlagos felület és 100 nm-nél nagyobb pórusméret mellett 0,1-0,2 az immobilizált enzim és a hordozó mennyiségének aránya. Nagyobb fajlagos felület esetén a pórusméret csökkenése miatt a megkötött enzim mennyisége is kisebb lesz. 38

38 a b c 7. ábra: Pórusos hordozók felületén kialakuló rétegek (a: szubsztrát; b: határfelületi réteg; c: hordozó) [BALLESTEROS és mtsai, 1994] Rögzített enzimek alkalmazása a fruktooligoszacharidok elıállítására A fruktooligoszacharidok rögzített sejtekkel, illetve enzimekkel történı elıállításával kapcsolatos kísérleti eredmények bemutatására a szakirodalomban találhatunk példákat. Ezek közül mutatok be néhányat a 6. táblázatban. A fruktooligoszacharidok ipari mérető elıállításával 1990-ben a japán Meiji Seika Co. foglalkozott elıször [YUN, 1996], ık folyamatos eljárás során Aspergillus niger sejteket alkalmaznak Ca-alginát gélbezárás segítségével. A szöuli Cheil Foods & Chemicals Company szintén folyamatos eljárás során Ca-alginátban rögzített Aureobasidium pullulans sejteket alkalmaz. A 7. táblázatban található néhány további példa. Ezek között oldott állapotú biokatalizátorral, szakaszos üzemmódban mőködı eljárások és immobilizált biokatalizátorral, folyamatosan, illetve félfolyamatosan mőködı eljárások is megjelennek. 39

39 6. táblázat: Fruktozil-transzferázok labormérető immobilizálásának összefoglaló táblázata Enzim forrása Hordozó Kötés típusa Stabilitás Hivatkozás Metakrilami- Aspergillus polimer niger, [CHIANG és gyöngyök, kovalens - Aspergillus LEE, 1997] oxiráncsoportokkal japonicus Aureobasidium sp. Aureobasidium sp. ATCC Aureobasidium sp. ATCC Pectinex Ultra SP-L Pectinex Ultra SP-L Cellulóz Alkil-amin porózus szilika Porózus üveg adszorpció kovalens adszorpció 360 h folyamatos mőködtetés 26 nap folyamatos mőködtetés 30 nap folyamatos mőködtetés Sepabeads EC kovalens - Eupergit C kovalens 20 nap tárolási stabilitás [HAYASHI és mtsai, 1994] [HAYASHI és mtsai, 1992] [HAYASHI és mtsai, 1991a] [GHAZI és mtsai, 2005] [TANRISEVEN és ASLAN, 2005] 7. táblázat: Néhány példa a fruktooligoszacharidok félüzemi és/vagy ipari mérető elıállítására Enzim forrása Szubsztrát Eljárás fajtája Felezési idı Hivatkozás Aureobasidium pullulans 770 g dm -3 szacharóz Félfolyamatos, rögzített sejtek 60 nap [YUN és mtsai, 1990] Aureobasidium pullulans 770 g dm -3 szacharóz Folyamatos, rögzített sejtek 100 nap [YUN és mtsai, 1990] Aureobasidium pullulans 770 g dm -3 szacharóz Félfolyamatos, rögzített enzim 20 nap [YUN és SONG, 1993] Aureobasidium sp. 400 g dm -3 szacharóz Folyamatos, rögzített enzim 30 nap [HAYASHI és mtsai, 1991b] Aspergillus phoenicis 750 g dm -3 szacharóz Szakaszos - [VAN BALKEN és mtsai, 1991] 40

40 2.6. Szilárd fázisú biokatalizátorokkal mőködı reaktorok Biokatalitikus reaktor alatt olyan alkalmasan kiképzett, szabályozott mőködéső berendezést értünk, amelyben enzimekkel, sejtekkel vagy sejtalkotórészekkel katalizált reakciókat, reakciósorozatokat hajtanak végre. A szilárd-fázisú biokatalizátorral mőködı bioreaktorok fı típusai a következık [CHIBATA és mtsai, 1987; KENNEDY és WHITE, 1985]: mechanikusan kevert tankreaktor [GROBOILLOT és mtsai, 1994]; folyamatos átfolyású, mechanikusan kevert tankreaktor; állóágyas reaktor; fluidizált ágyas reaktor [GODIA és SOLA, 1995]; recirkulációs reaktor (hurokreaktor); ultraszőrı membrán reaktor; membránon rögzített biokatalizátorral mőködı reaktor (enzim-membrán bioreaktor); A megfelelıen megválasztott bioreaktor az egyik kulcseleme bármely eljárásnak, amelyhez rögzített biokatalizátort használnak. Nincsenek azonban egyszerő szabályok arra nézve, hogy egy konkrét eljáráshoz milyen reaktortípust válasszunk. A gyakorlatban elemezni kell egy reaktortípus elınyeit és hátrányait az adott folyamat esetében. Néhány figyelembe veendı szempont: a rögzített biokatalizátor kinetikája; a külsı és belsı anyagtranszport hatásai; a tengelyirányú eloszlási (visszakeveredési) hatások; a hıátviteli hatások; a rögzített biokatalizátor mőködési stabilitása. Habár az enzim immobilizálása egyfajta többletköltséget jelent az eljárás kivitelezése során, mindenképpen érdemes mérlegelni a biokatalizátor többszöri felhasználhatóságát és összehasonlítani azt az oldott állapotú alkalmazás során fellépı veszteséggel. Elsısorban a drágább, fıként intracelluláris enzimek esetében jelentıs lehet a különbség. 41

41 Rögzített sejtekkel mőködı oszlopreaktort nagy áramlási sebességek mellett viszonylag nehéz mőködtetni a szubsztrát-termék(ek)-rögzítıanyag között fellépı diffúziós gátlás miatt. Gyakorlati szempontból az immobilizált enzimmel mőködı oszlop elsıséget élvez a rögzített sejtes oszloppal szemben, hiszen a rögzítés módja általában egyszerőbb, valamint az elérhetı térfogati produktivitás nagyobb. Hátrányként megemlítendı azonban, hogy a biokatalizátor mőködési stabilitása az elsı esetben kisebb. A rögzített sejtek alkalmazása során külön nehezítı tényzıként fellép a sejten belüli transzportfolyamatok hatása. A bioreaktorok hatékonyságát az egységnyi idı alatt egységnyi reaktortérfogatban átalakuló szubsztrát mennyiségével jellemezhetjük. Katalizátor Kevert tankreaktor Fluidizált ágyas reaktor Termék Termék Töltetes oszlop Membrán modul Spirál membrán modul 8. ábra: Néhány példa a rögzített biokatalizátorral mőködı bioreaktorok típusaira 42

42 Habár az enzim immobilizálása egyfajta többletköltséget jelent az eljárás kivitelezése során, mindenképpen érdemes mérlegelni a biokatalizátor többszöri felhasználhatóságát és összehasonlítani azt az oldott állapotú alkalmazás során fellépı veszteséggel. Elsısorban a drágább, fıként intracelluláris enzimek esetében jelentıs lehet a különbség. Rögzített sejtekkel mőködı oszlopreaktort nagy áramlási sebességek mellett viszonylag nehéz mőködtetni a szubsztrát-termék(ek)-rögzítıanyag között fellépı diffúziós gátlás miatt. Gyakorlati szempontból az immobilizált enzimmel mőködı oszlop elsıséget élvez a rögzített sejtes oszloppal szemben, hiszen a rögzítés módja általában egyszerőbb, valamint az elérhetı térfogati produktivitás nagyobb. Hátrányként megemlítendı azonban, hogy a biokatalizátor mőködési stabilitása az elsı esetben kisebb. A bioreaktorok hatékonyságát az egységnyi idı alatt egységnyi reaktortérfogatban átalakuló szubsztrát mennyiségével jellemezhetjük. A bioreaktorból kilépı termékáram összetételének nagy hatása van a feldolgozási költségekre, ezért ezt lényeges számításba venni a bioreaktor típusának és a betáplált anyag koncentrációjának megválasztásánál. A szilárd hordozón vagy annak belsejében rögzített biokatalizátorokat tartalmazó reaktoroknál a reakciósebesség meghatározásakor figyelembe kell venni, hogy a szubsztrátkoncentráció a hordozófelületet körülvevı határrétegben kisebb, mint a reaktor fı tömegében [VAN'T RIET és TRAMPER, 1991]. Továbbá az olyan szilárd-fázisú biokatalizátort tartalmazó reaktoroknál, amelyeknél a biokatalizátor zömében a hordozószemcse belsejében helyezkedik el, igen jelentıs lehet az ún. belsı diffúziós ellenállás. A külsı diffúziós gátlást jól kevert reaktorokban gyakran figyelmen kívül hagyják, a belsı viszont az esetek nagy többségében nem hanyagolható el Szakaszos mőködéső mechanikusan kevert tankreaktor A legegyszerőbb és legolcsóbb reaktortípus a kevert tankreaktor, amely reaktortérbıl és mechanikus keverıbıl áll. Általában akkor használják, amikor a szubsztrátoldat erısen viszkózus és a biokatalizátor aktivitása kicsi, viszonylag kis anyagmennyiségek elıállítására alkalmas, az átlagos reakciósebesség kicsi. A konverziót a tartózkodási idı hossza határozza meg. 43

43 Hátránya, hogy a kevertetés következtében a katalizátor mechanikailag károsodhat, kophat, tördelıdhet, ezért csak kemény, mechanikai hatásokkal szemben ellenálló hordozó használata ajánlott [ARMENTIA és WEBB, 1992]. A tökéletes kevertség következtében a kevert tankreaktor bármely pontján gyakorlatilag azonos körülmények (ph, hımérséklet, koncentráció) uralkodnak. A kis szubsztrátkoncentráció és a kis fajlagos aktivitás miatt a reaktortípus alkalmazása elsısorban a szubsztrát által gátolt folyamatoknál elınyös [RAPOSO és mtsai, 2003]. További elınye, hogy viszonylag egyszerően, kis holtidıvel megoldható a mőködési paraméterek szabályozása. Ipari léptékő alkalmazásánál hátrány a viszonylag nagy fajlagos energiabeviteli igény. A kevert tankreaktor leggyakrabban henger alakú. A tartály magassága rendszerint megegyezik az átmérıvel, adott esetben meghaladhatja az átmérı kétszeresét. A keverı a tartály alsó részén helyezkedik el, rendszerint a fenéktıl a keverı átmérıjével azonos távolságra. Ha a keverı magasabban kerül beépítésre, akkor a folyadék cirkulációjában zavart okozhat. Levegıztetés esetén különösen nagy figyelmet kell fordítani a keverı kiválasztására. Ha a katalizátorszemcsék egyáltalán nem érzékenyek a fellépı nyíróerıkre [BLACK és mtsai, 1984], legelterjedtebben a turbinalapátos keverıt használják, de egyéb keverıtípusok is használatosak (pl. propeller-, horgony vagy lapkeverık, amelyek jobban kímélik a szemcséket. A tartályt terelılemezekkel is ellátják, hogy elkerüljék tartalmának forgásba jövetelét. Oxigénigényes folyamatoknál a keverı alá levegıelosztót szerelnek. A legfontosabb jellemzıje a szakaszos reaktornak az a tény, hogy nincs befelé és kifelé irányuló anyagáramlás. Ez azt jelenti, hogy a teljes termékmennyiség felhalmozódik Folyamatos átáramlású kevert tankreaktor Ebben a reaktortípusban a termék elvétele és friss szubsztrát rátáplálása folyamatosan történik. A kevert tankreaktort megfelelı szőrıvel [KRUSE és SCHÜGERL, 1996] felszerelve visszatartható a biokatalizátor, ugyanakkor biztosítható a folyamatos üzemeltetés. Így a szakaszos tankreaktornál hatékonyabb, de némileg bonyolultabb reaktortípushoz jutunk. A hatékony keverés követelménye hasonló, mint az elızı reaktortípusnál, azzal a további megszorítással, hogy el kell kerülni a szubsztrátoldat gyors 44

44 átfolyását a reaktoron. Ez a legjobban úgy oldható meg, hogy a két nyílást a lehetı legtávolabbra kell elhelyezni. Minél hosszabb a tartózkodási idı, annál nagyobb a szubsztrát konverziója termékké. A leggyakoribb üzemeltetési feltételek között a tartályban lévı oldat gazdag a termékben és szegény a szubsztrátban. Ezért a folyamatos átfolyású, kevert tankreaktor nem megfelelı azokban az esetekben, ahol a termék toxikus, vagy gátló hatású, de nagyon jól használható, amikor a szubsztrát hátrányosan hat a kinetikára, vagy a stabilitásra [CARVALHO és mtsai, 2004]. Ezekben a reaktorokban az összenyomható, vagy finom eloszlású hordozószemcsék (pl. poliuretán, cellulóz származékok) is használhatók [CHEN és MCGILL, 1992] eltömıdési veszély nélkül. Rögzített sejteknél jól kevert állapot szükséges annak érdekében, hogy elérhetı legyen az egyenletes szubsztrát ellátás, a nagy keverési sebesség azonban a rögzített biokatalizátor kopási károsodását eredményezi a fellépı nagy nyíróerık miatt [VLAEV és VALEVA, 1992]. Mindemellett a folyamatos átfolyású, kevert tankreaktor a legjobb megoldás az olyan rögzített sejtes rendszereknél, amelyeknél intenzív keverésre és oxigénátvitelre egyaránt szükség van Állóágyas oszlopreaktor A drága szilárd fázisú biokatalizátorokkal mőködı biotechnológiai folyamatok esetében elterjedten használt megoldás a folyamatos üzemő oszlopreaktorok alkalmazása. Az ilyen típusú berendezések üzemeltetési költségei viszonylag alacsonyak és jó kitermeléssel nagy tisztaságú termék elıállítását teszik lehetıvé. Ugyanakkor az oszlopreaktorok beruházási költségei nagyok, fontos elınyük viszont az egyszerő méretnövelési lehetıség [PEREZ és mtsai, 2004]. Az állóágyas oszlopreaktor egy csı alakú berendezés, amelyben a szubsztrát-, illetve a tápoldat a rögzített biokatalizátor részecskék álló halmazán halad keresztül, és a termék folyamatosan távozik a reaktor túlsó végén. A kevert tankreaktoroktól eltérıen, a részecskék a töltött ágyban nem mozognak, hanem a folyadék halad át a tölteten. Így elkerülhetı a gyöngyök kopási károsodása és növelhetı a biokatalizátor-sőrőség a 45

45 reaktorban, ugyanakkor nagyobb jelentısége van a hordozó minıségének és a hidrodinamikai viszonyok megválasztásának [KESHAVARZ és mtsai, 1996]. Az ún. külsı diffúziós gátlás az állóágyas oszlopreaktorban jellemzıen nagyobb, mint a kevert tankreaktorban, ez tehát csökkentheti a reakciósebességet. Nagy szubsztrátkoncentrációnál a konverzióban nem figyelhetı meg különbség, de a kis értékeknél az utóbbi reaktornál kisebb produktivitást kaptak a külsı diffúziós gátlás miatt Fluidizációs reaktor A fluidizációs (fluidizált ágyas vagy fluidágyas) reaktorok egyesítik az állóágyas oszlopreaktor és a kevert tankreaktor elınyös tulajdonságait [GODIA és SOLA, 1995]. A szilárd-fázisú biokatalizátor tölteten felfelé áramoltatott folyadék (szubsztrátoldat), illetve gáz, esetenként mindkettı [SCHÜGERL, 1997] hatására a szemcsék halmaza kiterjed, miközben a növekszik a nyomásesés a szemcseágyon. Amikor ez a nyomásesés egyenlı az egységnyi ágy-keresztmetszetre esı tömeggel, a részecskék lebegı állapotba kerülnek, és az ágy fluidizál, felvéve egy közönséges folyadék dinamikáját. A részecskék között csak kismértékő érintkezés van, ezért a kopás kicsi. A fluidágyas reaktor nagyobb termelékenységet biztosíthat a folyamatos átfolyású, kevert tankreaktornál is, mert az elıbbinél a folyadék mozgása inkább megközelíti a dugószerő áramlást. A fluidizációs reaktor elınye a folyamatos átfolyású, kevert tankreaktorral szemben, hogy egy szeparátor, ill. ülepítı egység csatlakoztatásával technikailag egyszerő még a nagyon finom katalizátor részecskék visszatartása is, és a kihordott szemcsék folyamatosan visszajuttathatók a reaktorba [KIM és mtsai, 2001]. A legfıbb hátránya a reaktortípusnak, hogy a stabil fluidizációra alkalmas folyadéksebesség tartománya általában korlátozott, és ennek következményeként a behatárolt az szubsztrát és a katalizátor érintkezési idıtartama az ágyon való egyszeri áthaladás során. Az érintkezési idı növelhetı a reaktor recirkulációs üzemeltetésével, összhangba hozva azt a folyamatos termékelvétel lehetıségével. Ilyen körülmények között a rendszer hasonlóan mőködik, mint egy kevert tankreaktor. A fluidizációs bioreaktorok további hátránya a viszonylag nagy axiális visszakeveredés, valamint az áramlási 46

46 instabilitás. Emellett az állóágyas reaktortípushoz viszonyítva alacsonyabb katalizátorsőrőség érhetı el és gyakoribbak a mőködtetési és méretnövelési problémák Integrált bioreaktor-rendszerek A biokatalitikus reakcióval párhuzamosan szimultán, folyamatos vagy félfolyamatos termékeltávolítás válhat szükségessé abban az esetben, amikor a keletkezı termék, illetve melléktermék befolyásolja a biokatalitikus folyamat hatékonyságát és termelékenységét [FREEMAN és mtsai, 1993] olyan mechanizmusokon keresztül, mint a termékgátlás, termékveszteségek (pl. evaporáció, lebomlás) és a közegre gyakorolt hatás (pl. viszkozitás, ph, csapadékképzıdés) [LEIB és mtsai, 2001; SISAK és mtsai, 2001]. A szilárd-fázisú biokatalizátorok alkalmazása kedvezı mőveleti lehetıségeket teremt a biokonverziós folyamat és a termékelválasztás integrálására, mivel a biokatalizátor térbeli elhatárolása megkönnyíti és egyszersmind biztonságosabbá teszi az in situ termékszeparációt. Mőveletileg két alapmegoldás létezik [SISAK, 2002]: 1 Az elsı esetben az integrált bioreaktor és a termékszeparátor különálló berendezések, az integrációt a kettı összekapcsolási módja teremti meg. 2 A második csoportot alkotó ún. többfunkciós reaktorok a szilárd fázisú biokatalizátoros rendszereknél gyakoribbak. Ezeknél lényegében egy berendezésben valósítható meg a biokatalitikus folyamat és a szimultán termékkinyerés, ezek tehát ún. extraktív bioreaktoroknak tekinthetık. A szimultán termékelválasztás a legtöbb ismert kinyerési technikával megvalósítható. A leggyakrabban alkalmazott módszerek a következık (lásd még 2.4. fejezet 4. táblázat): a termék extrakciója szerves vagy a reakcióközeggel nem elegyedı vizes fázisba [QURESHI és MADDOX, 1995; ZIJLSTRA és mtsai, 1998]; a termék membránon keresztüli elválasztása [DOIG és mtsai, 1998; GIRONO és DRIOLI, 2000] kicsapás [CHUICHULCHERM, 2004] 47

47 adszorpció [DAVISON és SCOTT, 1992; VÁRDAI és mtsai, 1998] Egyes értékes termékek in situ szeparációjához az ismert módszerek gyakran nem elég szelektívek vagy hatékonyak, ezért folyamatosan bıvül az elválasztási technikák köre. 48

48 3. KÍSÉRLETI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Felhasznált anyagok Enzimkészítmények Fruktooligoszacharidok szintéziséhez használt enzimkészítmények Munkám során egy kereskedelmi forgalomban kapható összetett enzimkészítménnyel dolgoztam: az Aspergillus aculeatus-ból származó Pectinex Ultra SP-L (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) alapvetıen pektináz, celluláz, β-galaktozidáz enzimek keveréke, de számottevı fruktozil-transzferáz aktivitással [HANG és WOODAMS, 1996; DEL-VAL és OTERO, 2003] is rendelkezik, ezért egy gyakorlatban is használható immobilizált fruktoziltranszferáz katalizátor kiindulási anyagaként szerepelhet. Fontos elınye, hogy kereskedelmi forgalomból könnyen hozzáférhetı és viszonylag olcsó enzimkészítményrıl van szó Glükóz, mint melléktermék eliminálására használt enzimkészítmények A fruktooligoszacharidok elıállítása során melléktermékként keletkezı glükóz eltávolítására tisztított glükóz-oxidáz és kataláz enzimek keverékét használtam fel, melyek kereskedelmi forgalomból származnak. A tisztított glükóz-oxidáz (FLUKA) aktivitása 215 U mg -1, míg a tisztított kataláz (SIGMA) aktivitása 830 U mg -1 volt. A glükóz enzimes úton történı eltávolítása glükóz-izomeráz enzim alkalmazásával is történhetett volna, azonban az ide vonatkozó szakirodalmi példa [YUN, 1996] alapján elmondható, hogy ilyen típusú kevert enzimes rendszerben nem sikerült magasabb fruktooligoszacharid-hozamot elérni. Gyakorlati szempontból egy másik hátránya is van a glükóz-izomeráz alkalmazásának, mőködési ph-ja 7,5 [CAMACHO-RUBIO és mtsai, 1996], amely lényegesen eltér a fruktozil-transzferáz ph=5,6 mőködési optimumától, így a két rendszer összehangolása nehezebben valósítható meg, mint glükóz-oxidáz esetében. 49

49 Hordozó A biokatalizátorok (Pectinex Ultra SP-L, glükóz-oxidáz, kataláz) immobilizálásánál hordozóanyagként Amberlite IRA 900 Cl (Rohm and Haas) típusú makropórusos anioncserélı gyantát alkalmaztam. A gyanta anyaga sztirol-divinilbenzol kopolimer mátrix, mely µm átlagos átmérıjő, nm átlagos pórusátmérıjő és 25 m 2 g -1 fajlagos felülető [AMBERLITE IRA 900 CL PRODUCT DATA SHEET]. A gyantát a rögzítési kísérletek elıtt regenerálnom kellett: 4 %-os NaOH-val többször átmostam, majd dekantáltam és desztillált vízzel többször átöblítettem, míg az oldat vezetıképessége a desztillált vízével azonossá vált Kötıreagens A hordozón kialakult enzimkötıdés stabilizálására glutáraldehid (Reanal ZRt.) reagens 25 %-os vizes oldatát hígítottam különbözı arányokban Egyéb vegyszerek Vegyszer Szacharóz 1-kesztóz Nisztóz Fruktozil-nisztóz o-dianizidin o-toluidin Ti(IV)-szulfát reagens Citromsav Ecetsav 99% NaOH, lemezes Na 2 HPO 4 Származási hely Reanal ZRt. Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japan Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japan Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japan SIGMA SIGMA FLUKA Reanal ZRt. Reanal ZRt. Reanal ZRt. Reanal ZRt. 50

50 3.2. Mérési módszerek Az enzimaktivitások meghatározása Munkám során a fruktozil-transzferáz aktivitás és a glükóz-oxidáz aktivitás meghatározásakor mindkét esetben adott körülmények között ( és fejezet) képzıdı glükóz mennyiségének meghatározását végeztem el, azonban a két enzim esetében két különbözı módszerrel. A fruktozil-transzferáz aktivitás meghatározására azért választottam az o-dianizidinmódszert, mert ez szelektív a glükózra. Az aktivitás meghatározása során pedig - az egyéb zavaró tényezık, úgymint a fruktooligoszacharidok és a fruktóz hatásának kiküszöbölésével - csak a keletkezı glükóz mennyiségének meghatározására volt szükségem. Ugyanakkor a glükóz-oxidáz aktivitás meghatározása során nem alkalmazhattam az o-dianizidin-módszert, mivel az szintén glükóz-oxidáz enzim mőködésén alapul, így kivitelezése során H 2 O 2 keletkezésével is számolni kell, amely alkalmatlanná teszi a módszert ebben az esetben. Éppen ezért kellett egy másik, glükóz-koncentráció meghatározására alkalmas mérési eljárást találnom, ez pedig az o-toluidin módszer volt, amely mellesleg technikai szempontból is lényegesen egyszerőbben kivitelezhetınek bizonyult. Kísérleteim eredményességét az enzimkészítmények aktivitásának mérésével követtem nyomon, melyet oldott állapotú biokatalizátornál U cm -3, immobilizált enzimnél U g -1 hordozó mértékegységben adtam meg Fruktozil-transzferáz aktivitásának mérési módszere Az enzimek fruktozil-transzferáz aktivitását a szintézisreakció során melléktermékként keletkezı glükóz (G) mennyiségével jellemeztem [YUN, 1996]: 1 U azt az enzimmennyiséget jelöli, amely 1 µmol glükózt képez percenként. Az oldott állapotú biokatalizátor aktivitásának megállapítása során 0,5 cm 3 Pectinex Ultra SP-L enzimkészítményhez 1,5 cm 3 2 M szacharóz oldatot (ph=5,6, 0,05 M acetát 51

51 puffer) mértem, fél óra reakcióidı és 150 rpm mellett történı rázatás után az oldatot kiforraltam és meghatároztam az abban keletkezı glükóz mennyiségét. A rögzített enzimkészítmény esetében az aktivitások értékét a 2 M kiindulási szacharóz-koncentrációval rendelkezı oldatban (ph=5,6, 0,05 M acetát puffer) 200 mg rögzített biokatalizátor hatására, 53 C-on, 150 rpm rázatás mellett 2 h alatt keletkezı glükóz mennyiségének meghatározásával állapítottam meg. A glükóz mennyiségének meghatározása fotometriás módszer segítségével történt, o- dianizidin reagens felhasználásával (SIGMA) [SIGMABULLETIN]. Ez az enzimatikus módszer glükóz-oxidáz és peroxidáz enzimek együttes mőködésén alapul. GOD β D glükóz + O + H O D glükonsav + H O (8) POD H O + o dianizidin (redukált forma) o dianizidin (oxidált forma) + H O (9) A kétlépéses folyamat elsı lépéseként (lásd 8.) β-d-glükóz glükóz-oxidáz (GOD) enzim hatására oxidálódik D-glükonsavvá és hidrogén-peroxiddá. A második lépésben (lásd 9.) a keletkezett H 2 O 2 hatására az o-dianizidin színreagens oxidálódik, melynek következtében piros szín alakul ki a reakcióelegyben, így 500 nm-en fotometrálhatóvá válik. A módszer leírása: Felhasznált reagensek: Reagens A: Na-acetát puffer, ph=5,1 A reagens elkészítése során 2,84 cm 3 99%-os ecetsavat kell kb. 900 ml desztillált vízzel hígítani, majd az oldat ph-ját 30 %-os NaOH oldat adagolásával ph=5,1-re állítani. A kapott oldatot 1000 cm 3 -re kell hígítani desztillált vízzel. Reagens B: o-dianizidin reagens (0,21 mm) A reagens elkészítéséhez 13,2 mg o-dianizidint 2 cm 3 desztillált vízben kell feloldani, majd 200 cm 3 -re hígítani Reagens A-val. Reagens C: peroxidáz oldat A reagenshez 60 U cm -3 aktivitású peroxidáz enzimet kell desztillált vízben feloldani. 52

52 Reagens D: glükóz-oxidáz oldat A reagens 0,5 U cm -3 glükóz-oxidáz aktivitású oldat Reagens A-ban elkészítve. A glükóz koncentrációjának meghatározása során a komponenseket a következı mennyiségekben és sorrendben kell összemérni: 2,4 cm 3 Reagens B + 0,5 cm 3 minta + 0,1 cm 3 Reagens C + 0,1 cm 3 Reagens D. Az ebben a reakcióelegyben kialakuló színváltozás fél óra várakozás után fotometrálható. A módszer 0 és 4 mg cm -3 glükózkoncentrációtartományban megbízhatóan alkalmazható. ABS 1,5 1 0,5 y = 3,341x - 0,0445 R 2 = 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 glükózkonc. (mgcm -3 ) 9. ábra: Kalibráló görbe a glükóz-koncentráció o-dianizidin-módszerrel történı spektrofotometriás meghatározásához Glükóz-oxidáz aktivitásának mérési módszere Az alkalmazott glükóz-oxidáz (FLUKA) enzim aktivitása a következıképp jellemezhetı: 1 U aktivitású az a glükóz-oxidáz mennyiség, amely egy perc alatt ph=5,1 és 25 C-on 1 µmol β-d-glükóz oxidációjára képes [BLANDINO és mtsai, 2001]. Az oldott állapotú enzim glükóz-oxidáz aktivitásának meghatározása során 10 cm 3, 10 mg cm -3 kiindulási glükóz-koncentrációval rendelkezı oldathoz (ph=5,1, 0,05 M acetát puffer) 1 mg cm -3 glükóz-oxidáz-koncentrációval rendelkezı törzsoldatból 0,1 cm 3 53

53 mennyiséget mértem, majd 10 percig tartó 150 rpm mellett történı rázatás után az oldatot kiforraltam és mértem annak glükóz-koncentrációját. A rögzített enzimaktivitások értékét 450 mg immobilizált biokatalizátor jelenlétében 5 cm 3, 10 mg cm -3 kiindulási glükóz-koncentrációval rendelkezı oldatban (ph=5,1, 0,05 M acetát puffer) 4 óra alatt mérhetı szubsztrátfogyásból számítottam ki. A méréseket fotometriás módszer segítségével követtem nyomon o-toluidin reagens alkalmazása mellett [COOPER és MCDANIEL, 1970]. A módszer során 4,5 cm 3 o-toluidin reagenst adtam 0,5 cm 3 mintához, majd az elegyet 8 percig forraltam. Hőtés után az oldat abszorbanciája 620 nmen detektálható. A módszer 0,1 és 0,4 mg cm -3 glükóz-koncentráció-tartományban megbízható. 0,8 0,6 y = 1,694x + 0,0455 R 2 = 0,9971 ABS 0,4 0, ,1 0,2 0,3 0,4 0,5 glükózkonc. (mgcm -3 ) 10. ábra: Kalibrálógörbe a glükóz-koncentráció o-toluidin-módszerrel történı spektrofotometriás meghatározásához Kataláz aktivitásának mérési módszere Az alkalmazott kataláz (SIGMA) aktivitását a következıképp jellemeztem: Egy U kataláz aktivitás azt az enzimennyiséget jelöli, amely egy perc alatt ph=4,5 és 25 C-on egy µmol hidrogén-peroxid bontását végzi [PFIFFERI és mtsai, 1993]. Az oldott állapotú enzim aktivitásának meghatározása során 10 cm 3, 1 mg cm -3 kiindulási H 2 O 2 -koncentrációval rendelkezı oldathoz (ph=4,5, 0,1 M citrát-foszfát puffer) 54

54 0,5 mg cm -3 kataláz-koncentrációval rendelkezı törzsoldatból 0,1 cm 3 mennyiséget mértem, majd 10 percig tartó 150 rpm mellett történı rázatás után meghatároztam annak H 2 O 2 -koncentrációját. A rögzített enzimkészítmény kataláz-aktivitásának értékét a 0,08 mg dm -3 kiindulási H 2 O 2 koncentrációval rendelkezı oldatokban (ph=4,5, 0,1 M citrát-foszfát puffer) adott idı alatt mérhetı szubsztrátfogyásból számítottam ki. A mérés során 450 mg immobilizált enzimkészítményt adtam 10 cm 3 H 2 O 2 oldathoz, majd a reakcióelegyet 30 percen keresztül 150 rpm mellett rázattam. 0,8 0,6 y = 0,2698x + 0,0301 R 2 = 0,9956 ABS 0,4 0, ,5 1 1,5 2 2,5 H 2 O 2 (µmolcm -3 ) 11. ábra: Kalibrálógörbe a H 2 O 2 -koncentráció spektrofotometriás meghatározásához A minták elemzését fotometriás módszer segítségével végeztem. A H 2 O 2 mennyiségi meghatározása Ti(IV)-szulfát reagens felhasználásával [PFIFFERI és mtsai, 1993] történt. 1 cm 3 mintához 1 cm 3 Ti(IV)-szulfát reagenst adtam, majd 415 nm-en fotometráltam. A módszer 20 és 120 µg cm -3 H 2 O 2 koncentráció-tartományban megbízhatóan alkalmazható Analitikai módszerek, alkalmazott berendezések és mérımőszerek A fotometriás mérések nyomon követése Biochrom4060 (Pharmacia) típusú spektrofotométer segítségével történt. A módszerek pontos leírása az egyes enzimaktivitások meghatározásánál ( , és fejezetek) található. 55

55 A fruktooligoszacharidok, szacharóz és glükóz együttes meghatározását HPLC módszer segítségével végeztem, amely mérésekhez Aminex HPX-42A típusú (Bio-Rad) kromatográfiás oszlopot használtam. Az állófázis ezüst-szulfonát-divinil-benzol-sztirol kopolimer ioncserélı töltető oszlop volt, melynek hossza 300 mm, belsı átmérıje 7,8 mm, részecskemérete 25 µm. Az eluens desztillált víz volt. A méréseket 0,3 cm 3 min -1 áramlási sebességnél és 30 C hımérsékleten, folyamatos termosztálás mellett végeztem, Merck- Hitachi gyártmányú L-6000A típusú HPLC készülékkel, amely AS-2000A Autosampler típusú automatikus mintavevıvel rendelkezik. A detektálás Merck gyártmányú RI-71 típusú törésmutató detektorral történt. Az eluensen keresztül héliumot buborékoltattam át az oldott oxigén eltávolításának érdekében, mivel az zavarná az RI törésmutató detektor mőködését. A kromatogramok kiértékelése Merck-Hitachi gyártmányú D-2520 GPC típusú integrátorral történt. 12. ábra: A fruktooligoszacharidok, glükóz és szacharóz együttes meghatározása során kialakuló kromatogram 56

56 Retenciós idık (min): GF 4 : 20,95 GF 3 : 23,15 GF 2 : 25,87 GF: 28,74 G: 32,91 Az oldatok oxigéntartalmának meghatározása INGOLD típusú (Mettler Toledo) oxigénelektród segítségével történt. A rázatott lombikos kísérletek, az enzimkészítmények rögzítése, az aktivitás meghatározások és a fruktooligoszacharid-elıállítási kísérletek során Certomat S típusú rázógépet (Braun Biotech International, rázóintenzitása: rpm) és Certomat HK légkeveréses inkubátort (Braun Biotech International, termosztálási tartománya C) használtam. A reaktorkísérletek során a termosztálást JULABO EH-5 típusú termosztáttal (JULABO Labortechnik GmbH, termosztálási tartománya C, tartálytérfogata 5 dm 3 ) végeztem, a szubsztrátoldatok áramoltatását pedig Watson Marlow 323 (Watson Marlow Ltd.) típusú változtatható áramlási iránnyal rendelkezı perisztaltikus pumpával valósítottam meg. 57

57 4. EREDMÉNYEK 4.1. Az enzimkészítmények rögzítési módszere Munkám során elsı célkitőzésem volt a fruktooligoszacharidok szintézisére alkalmazandó Pectinex Ultra SP-L enzimkészítmény rögzítésére alkalmas hordozó és módszer kiválasztása és a rögzítés ideális körülményeinek megállapítása. A rögzítıanyag kiválasztásánál fontos szempontnak adódott, hogy az elıállítandó fruktooligoszacharidok viszonylag nagymérető molekulák, valamint az alkalmazott szubsztrát viszkozitása is nagy, így olyan hordozóra volt szükség, amelynél adott a felületi rögzítés lehetısége, a fellépı diffúziós gátlás kiküszöbölése érdekében. Emellett nem elhanyagolható tulajdonság a kiválasztott ioncserélı gyantánál - egyéb, kifejezetten enzimrögzítésre kifejlesztett hordozókkal szemben - az alacsony ár. A glutáraldehid kötıreagens felhasználásával végrehajtott kovalens kötések kialakításán alapuló enzimrögzítésre többféle lehetıség adódik. Ezek fajtája a lépések sorrendjének megválasztásától függ: A) Alkalmazhatunk glutáraldehiddel elızetesen aktivált hordozót (pl. kitozán, poliakrilamid), majd a hordozón lévı glutáraldehid szabadon maradt funkciós csoportjaihoz köthetjük az enzimet [ZHOU és CHEN, 2001; SEYHAN és ALPTEKIN, 2004]. A glutáraldehiddel elızetesen kezelt hordozó esetében hordozóglutáraldehid, valamint glutáraldehid-fehérje típusú kovalens kötések alakulnak ki, ahol a kötıreagens hidat alkot az enzim és a hordozó anyaga között. A rögzítésre használt anyag, valamint az enzim amino-csoportjai és a kötıreagens aldehid-csoportja között jön létre kovalens kötés ebben az esetben. B) Amennyiben elıbb az enzimet adszorbeáltatjuk, az enzim a pórusszerkezethez van der Waals típusú, hidrogénhíd és ionos kötésekkel kapcsolódik. Ezek a kötések - különösen tömény szubsztrát-oldat alkalmazása esetén - nem elég stabilak, ezért használunk glutáraldehidet, amelynek kötıregens tulajdonságát kihasználva egy stabilabb fehérje-struktúra hozható létre a hordozón lévı fehérjemolekulák 58

58 összekapcsolása révén, mely szerkezet a leoldódási veszély csökkenését eredményezi [D'SOUZA és KUBAL, 2002; LÓPEZ-GALLEGO és mtsai, 2005]. Kísérleteimben hordozóként a korábban már bemutatott ( fejezet) anioncserélı gyantát használtam fel és egy olyan kombinált rögzítési technikát alkalmaztam, amely két lépésbıl tevıdött össze: Elıbb a hordozó felületére történı ionos rögzítéssel kapcsoltam az enzimmolekulákat, majd keresztkötések létrehozásával kívántam fokozni a biokatalizátor stabilitását. Az utóbbi lépésben a glutáraldehid, mint kötıágens segítségével a felületre kötıdött fehérjemolekulák között kovalens kötéseket alakítottam ki Schiff-bázis képzési reakció (lásd 10.) alapján, ezzel egyfajta enzimhálót hozva létre a hordozóanyag szemcséi körül (13. ábra). Fehérje NH 2 + OCH(CH 2 ) 3 CHO + H 2 N Fehérje Fehérje N = CH(CH 2 ) 3 CH = N Fehérje + H 2 O (10) Ennek a hálónak és így a biokatalizátornak a stabilitása annál nagyobb, minél több a kötések száma, amelyek a glutáraldehid koncentrációjának és a kezelés idejének növelésével növelhetık. Ugyanakkor a túlzottan magas glutáraldehid koncentráció kedvezıtlen hatásokkal is járhat, mivel esetlegesen az enzim aktív centrumában, vagy annak közelében kötıdve a biokatalizátor inaktiválódását okozhatja. Ezért fontos a kovalens kötıágens koncentrációjának és a keresztkötések kialakítására szolgáló reakcióidınek a helyes megválasztása, optimálása. Szabad kötıhelyek a hordozó felületén: 13. ábra: Az enzimfehérje és a kovalens kötıreagens (glutáraldehid) között kialakuló kapcsolat 59

59 Az általam alkalmazott új típusú kombinált módszer jelentısen különbözik az irodalomból ismert B) módszertıl (lásd elıbb). Nem csak abban, hogy fruktozil-transzferáz enzimre én alkalmaztam elıször, hanem abban is, hogy a Pectinex Ultra SP-L egyéb fehérjéit védıfehérjékként alkalmaztam a keresztkötés során. A glutáraldehides kezeléskor ugyanis olyan kötések is létrejöttek, amelyek esetében a fruktozil- transzferáztól idegen fehérjék között képzıdött keresztkötés. Ezek a kötések - hasonlóan a 13. ábrán bemutatottakkal - bekapcsolódnak a fehérjehálóba, de a biokatalizátort sokkal kevésbé károsítják, mint a transzferázok közötti kötések. A védıfehérje effektus a szakirodalomból is ismert, egyszerő keresztkötéses rögzítéseknél [MATTIASSON, 1983]. Vizsgálataim során más típusú hordozókkal is próbálkoztam. Az egyik esetben Celite, kovaföld típusú hordozót alkalmaztam, de nem sikerült értékelhetı aktivitást kapnom. A másik esetben Ca-alginát gélbezárással próbálkoztam. Az így kialakított biokatalizátorszemcse azonban mechanikailag nem bírta a nagy töménységő szubsztrát-oldat alkalmazását, még abban az esetben sem, ha a gélszerkezetet glutáraldehides kezeléssel erısítettem Pectinex Ultra SP-L rögzítésének vizsgálata Munkám során célom volt a rögzítés optimális körülményeinek (biokatalizátor/hordozó arány, hımérséklet, ph, kovalens kötıreagenskoncentráció) meghatározása és a rögzítés eredményességének, illetve a kialakított szilárd fázisú biokatalizátor optimális mőködési körülményeinek (szintézis hımérséklete, ph, optimális szubsztrátkoncentráció, stabilitás, aktivitás) vizsgálata lombikos kísérletek során Optimális rögzítési körülmények megállapítása Az optimális paramétereket minden esetben az adott körülmények között mérhetı legjobb aktivitás értékéhez viszonyítva határoztam és adtam meg. A rögzítés minden 60

60 esetben a szabad állapotú enzim mőködési optimumán ( fejezet) történt, hiszen gyakorlati szempontból általában ennek alkalmazása a célszerő A legkedvezıbb biokatalizátor/hordozó arány megállapítása A rögzítés optimális körülményeinek megállapításakor az elsı vizsgált paraméter a legkedvezıbb enzim/hordozó arány volt, melynek meghatározása során 0,2-0,4 g száraz állapotú hordozót 4-8 g enzimkészítménnyel rázattam 24 órán át, szobahımérsékleten 150 rpm fordulatszám mellett, majd leszőrtem és acetát-pufferrel (ph=5,6, 0,05 M) mostam a biokatalizátort, végül mértem a készítmény aktivitását. Az így kapott eredményekbıl (8. táblázat) az 5/0,3 g g -1 enzimkészítmény/hordozó arány mellett tapasztaltam a legjobb fajlagos aktivitást, éppen ezért a továbbiakban ezen értékkel dolgoztam. 8. táblázat: Pectinex Ultra SP-L optimális enzim/hordozó arány megállapítása Pectinex Ultra SP-L mennyisége (g) Hordozó mennyisége (g) Biokatalizátor/ Hordozó arány (g g -1 ) Fajlagos aktivitás (U g -1 hordozó) 8 0,3 26,7 12,8 5 0, ,8 6 0, ,7 5 0,3 16,7 14,8 4 0,3 13,3 11,5 5 0,4 12,5 8,5 61

61 A szakirodalomban egy példát találhatunk [TANRISEVEN és ASLAN, 2005] a Pectinex Ultra SP-L enzimkészítmény rögzítésének részletes vizsgálatára, amelyben Eupergit C (aktív epoxi-csoportokkal rendelkezı akril-gyöngyök) hordozót használtak fel. Az optimális biokatalizátor és hordozó mennyiségének megállapítása során 0,2/0,4 g g -1 enzimkészítmény/hordozó arány mellett kapták a legjobb rögzítési hatékonyságot, amely lényegesen kisebb fajlagos biokatalizátor felhasználást tesz lehetıvé. Meg kell azonban jegyezni, hogy az említett szerzık kifejezetten enzimrögzítésre kifejlesztet hordozóval dolgoztak, amelynek ára sokkal magasabb az általam használt hordozóénál. Ezt figyelembe véve az eredményem elfogadható Pectinex Ultra SP-L glutáraldehides rögzítésének idıfüggése Az enzimmolekulák közötti keresztkötések kialakításának idıtartama fontos tényezı, hiszen helyes megállapítása döntıen befolyásolja a kialakított enzim-hordozó struktúra stabilitását. Túl rövid, vagy hosszú ideig tartó rögzítés esetében a biokatalizátor stabilitása nem lesz megfelelı, vagy az enzim aktivitásának csökkenése következhet be. A meghatározás során a korábbiakban megállapított ( fejezet) optimális enzim/hordozó aránynak megfelelıen több kísérletben 5 g Pectinex Ultra SP-L-hez 0,3 g száraz állapotú hordozót mértem, majd 24 órán át rázattam szobahımérsékleten 150 rpm fordulatszám mellett. Ezután leszőrtem és acetát-pufferrel (ph=5,6, 0,05 M) mostam a biokatalizátort, majd 5 cm 3, 0,5 m/v %-os glutáraldehid oldatot (ph=5,6, 0,05 M acetát puffer) mértem hozzá és adott ideig rázattam szobahımérsékleten, 150 rpm fordulatszám mellett. Ezután leszőrtem és acetát-pufferrel (ph=5,6, 0,05 M) a szabad glutáraldehidtıl mentesre mostam a biokatalizátort, végül mértem a készítmény aktivitását. 62

62 Aktivitás (Ug -1 hordozó) 18 17, , , , Idı (min) 14. ábra: A kovalens rögzítés optimális idejének meghatározása Az eredmények összefoglalását tartalmazza a 14. ábra, melyrıl látszik, hogy 15 perces keresztkötési idı esetén értem el a legnagyobb fajlagos aktivitást. A pontos értékeket táblázatos formában a Függelék F1. táblázatában tüntettem fel. A kovalens típusú enzimrögzítésekre általában jellemzı, hogy a keresztkötési idı vs. fajlagos aktivitás görbe egy maximumon megy át. Esetemben látható, hogy ez a maximum pont a minimálisan alkalmazott idınél kisebb. A görbe lefutásából látszik, hogy nem követek el nagy hibát, ha a továbbiakban a 15 min keresztkötési idıt tekintem optimálisnak Pectinex Ultra SP-L glutáraldehides rögzítésének koncentrációfüggése A rögzítés másik fontos tényezıje a keresztkötések kialakítására alkalmazott reagens, munkám esetében a glutáraldehid, megfelelı koncentrációjának megállapítása, hiszen ennek növelésével a kialakított enzim-hordozó struktúra stabilitása növekedhet, azonban túl magas koncentrációk esetében az enzim aktív centruma sérülhet és ezáltal a fajlagos aktivitás értéke csökkenhet. 63

63 Aktivitás (Ug -1 hordozó) 18 17, , ,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Glutáraldehid konc. (%) 15. ábra: Az optimális kovalens rögzítıanyag-koncentráció meghatározása A meghatározás során a korábbiakban megállapított ( és fejezet) optimális enzim/hordozó aránynak és kovalens rögzítési idınek megfelelıen több kísérletben 5 g Pectinex Ultra SP-L-hez 0,3 g száraz állapotú hordozót mértem, majd 24 órán át rázattam szobahımérsékleten 150 rpm fordulatszám mellett. Ezután leszőrtem és acetát-pufferrel (ph=5,6, 0,05 M) mostam a biokatalizátort, majd 5 cm 3, adott koncentrációjú (m/v %) glutáraldehid oldatot (ph=5,6, 0,05 M acetát puffer) mértem hozzá és 15 percig rázattam szobahımérsékleten, 150 rpm fordulatszám mellett. Ezután leszőrtem és acetát-pufferrel (ph=5,6, 0,05 M) a szabad glutáraldehidtıl mentesre mostam a biokatalizátort, végül mértem a készítmény aktivitását. Kísérleteim során tehát megállapítottam az optimális glutáraldehid-koncentráció értékét, mely 0,25 m/v %-os oldat alkalmazásakor adódott (15. ábra). A pontos értékeket táblázatos formában a Függelék F2. táblázatában tüntettem fel. A 15. ábrán látható maximum görbe torzulása azt mutatja, hogy bizonyos glutáraldehid-koncentráció alatt nagyon kis különbség van a között a koncentráció között, ami optimális és a között, ami elégtelen kapcsolatot hoz létre a molekulák között. 64

64 Optimális mőködési körülmények megállapítása Oldott állapotú Pectinex Ultra SP-L optimális mőködési körülményeinek megállapítása Elsıként a szabad állapotú Pectinex Ultra SP-L aktivitását és optimális mőködési körülményeit (9. táblázat) állapítottam meg a fruktooligoszacharidok elıállításához, a legkedvezıbb reakciókörülmények elérésének érdekében. Alkalmazott reakciókörülmények: 0,5 cm 3 Pectinex Ultra SP-L + 1,5 cm 3 2 M szacharóz-oldat adott ph-val rendelkezı 0,05 M acetát pufferben elkészítve, adott hımérsékleten 30 min reakcióidı és 150 rpm rázatás mellett. 9. táblázat: Szabad állapotú Pectinex Ultra SP-L optimális mőködési körülményei Hımérséklet ( C) Fajlagos aktivitás (U cm -3 ) ph Fajlagos aktivitás (U cm -3 ) 40 9,17 4 9, ,10 4,6 9, ,91 5 9, ,34 5,6 10, ,65 6 9, ,40 6,6 9, Rögzített Pectinex Ultra SP-L aktivitásának hımérsékletfüggése A rögzítés körülményeinek (5 g enzimkészítmény/0,3 g hordozó 0,25 m/v %-os glutáraldehiddel 15 perc alatt rögzítve) megállapítása után a kialakított szilárd fázisú biokatalizátor optimális mőködési körülményeit vizsgáltam meg a fruktozil-transzferáz aktivitás alakulásának nyomonkövetésével. Az aktivitásmérés módszere a korábbiakban 65

65 már ismertetett ( fejezet) módon történt, az alkalmazott hımérséklet, illetve a ph megfelelı értékre történı változtatása mellett. Elsıként az optimális mőködési hımérsékletet állapítottam meg, melynek eredményeit tartalmazza a 16. ábra. A pontos értékeket táblázatos formában a Függelék F3. táblázatában tőntettem fel. Az oldott állapotú Pectinex Ultra SP-L 45 C-os optimális mőködési hımérsékletéhez viszonyítva a szilárd biokatalizátorra megállapított 53 C-os optimum magasabb annál, ami a rögzítés következtében várhatóan kialakuló hatás. Ugyanis a rögzítés mintegy kimerevíti az enzimszerkezetet, ezáltal az kevésbé lesz érzékeny a magasabb hımérsékletre. Hasonló jelenséget tapasztaltak más kutatók [TANRISEVEN és ASLAN, 2005] is a Pectinex Ultra SP-L enzimkészítmény kovalens rögzítésekor. Aktivitás (Ug -1 hordozó) 15,8 15,6 15,4 15, ,8 14, Hımérséklet ( C) 16. ábra: Az optimális mőködési hımérséklet meghatározása Rögzített Pectinex Ultra SP-L aktivitásának ph függése A második vizsgált körülmény a mőködési ph volt, szintén párhuzamos mérésekkel. A kísérletek során különbözı vizsgált ph-értékek mellett kapott fajlagos aktivitásokat a 17. ábra tartalmazza. A pontos értékeket táblázatos formában a Függelék F4. táblázatában tőntettem fel. 66

66 Aktivitás (Ug -1 hordozó) ,5 5 5,5 6 6,5 7 ph 17. ábra: Az optimális mőködési ph megállapítása A mérések során megállapított optimális ph=5,6 érték megegyezik a korábbiakban ( fejezet) az oldott állapotú Pectinex Ultra SP-L biokatalizátor esetében tapasztalt optimális ph értékkel, a rögzítés tehát erre a mőködési paraméterre nem gyakorolt hatást. Fıként kovalens rögzítések esetén találtak ettıl eltérı viselkedést is. Egyes esetekben az optimális ph a szabad enziméhez képest jelentısen eltolódik [GOLDSTEIN, 1976], vagy az optimális ph tartománya ki is szélesedhet [TANRISEVEN és ASLAN, 2005] Rögzített Pectinex Ultra SP-L stabilitásának vizsgálata A rögzített katalizátorok stabilitásának megállapítására egymást követı több aktivitásmérési ciklusból álló kísérletsorozatot végeztem, amelyeknek eredményeit a 18. ábra mutatja. Az adatokból számított felezési idı a Pectinex Ultra SP-L esetében kb. 40 nap, amely érték gyakorlati szempontból megfelelınek tekinthetı [v.ö. TANRISEVEN és ASLAN, 2005]. A felezési idı értéke igazolja, hogy a kombinált rögzítéssel jó stabilitású szilárd fázisú biokatalizátorokhoz jutottam. A pontos értékeket táblázatos formában a Függelék F5. táblázatában tőntettem fel. 67

67 Maradék aktivitás (%) Ciklusok száma 18. ábra: A rögzített biokatalizátor stabilitás-vizsgálata során kapott eredmények Rögzített Pectinex Ultra SP-L aktivitásának szubsztrátfüggése Az optimális szubsztrátkoncentráció meghatározása során 5 különbözı kiindulási szacharóz-koncentráció alkalmazása mellett vizsgáltam a biokatalizátor fajlagos aktivitásának alakulását. Az eredmények összefoglalása a 10. táblázatban látható. A további munkához a 2 M kiindulási szacharóz-koncentráció alkalmazását találtam megfelelınek, egyrészt mivel a fruktozil-transzferáz aktivitás szempontjából az 500 g dm -3 ( fejezet) feletti koncentrációk bizonyulnak elınyösnek, másrészt mivel 2 M koncentráció felett a szubsztrát nagy viszkozitású, nehezen kezelhetı oldat, és ez a tény technikai szempontból megnehezítené a reakció kivitelezését. A 4.2. fejezetben részletezett kísérletek során tehát megállapítottam az optimális rögzítési és mőködési körülményeket, amelyek összefoglalását a 11. táblázat tartalmazza. A további kísérletek során az ezen körülmények között kialakított rögzített biokatalizátor alkalmazásával dolgoztam. 68

68 10. táblázat: Az immobilizált enzimkészítmény szubsztrát-függési vizsgálatainak eredményei Kiindulási szacharózkoncentráció (mol dm -3 ) Fajlagos aktivitás (U g 1 hordozó) 0,5 14,74 1,0 15,56 1,5 16,48 2,0 17,26 2,5 17, táblázat: Összefoglaló táblázatok: a kombinált módszerrel rögzített készítmények optimális elıállítási és mőködési paraméterei, stabilitása és aktivitása Biokatalizátor/ Hordozó arány (g g -1 ) Rögzítési idı (min) Glutáraldehid koncentráció (m/v %) 16,7 15 0,25 Hımérséklet ( C) ph 53 5,6 69

69 Felezési idı (nap) Fajlagos aktivitás (U g -1 hordozó) ~ 40 14,8-17, Fruktooligoszacharidok elıállítása Pectinex Ultra SP-L enzimkészítmény alkalmazásával A megállapított optimális rögzítési és mőködési paraméterek alkalmazásával, rázatott lombikos kísérletek során vizsgáltam a fruktooligoszacharidok elıállításának lehetıségét Oldott állapotú Pectinex Ultra SP-L alkalmazása fruktooligoszacharidok elıállítására rázatott lombikos kísérletek során A fruktooligoszacharidok elıállítási lehetıségeinek vizsgálata során, összehasonlítás céljából megvizsgáltam az oldott állapotú Pectinex Ultra SP-L alkalmazásával történı szintézis eredményességét is, rázatott lombikban. Az alkalmazott körülmények a következık voltak: 3 cm 3 Pectinex Ultra SP-L (összaktivitás 32,7 U cm -3 ) + 30 cm 3 szacharóz oldat (2 M, ph=5,6, 0,05 M acetát pufferben), 45 C hımérséklet, 150 rpm rázatási sebesség. A kísérlet során az elemzésekhez 0,05-0,05 cm 3 mennyiségő mintákat vettem. Az eredmények összefoglalását a 19. ábra tartalmazza. 70

70 700 GF4 GF3 GF2 GF G 600 koncentráció (mgcm -3 ) idı (h) 19. ábra: Fruktooligoszacharidok elıállítása oldott állapotú biokatalizátor segítségével, rázatott lombikos kísérletek során 12. táblázat: Rázatott lombikos kísérletek során oldott állapotú biokatalizátor alkalmazásával elért fruktooligoszacharid hozamok Idı (h) Fruktooligoszacharid hozam (%) 0 0, , , , , ,15 71

71 A kísérletek során a fruktooligoszacharid-hozam a 10 órás reakcióidı alatt 54 % fölé nem emelkedett (12. táblázat). A hozamok számításánál a keletkezett összes oligoszacharid mennyiségét viszonyítottam a kiindulási szubsztrát mennyiségéhez. Az elért hozamok alapján 8 h reakcióidı az alkalmazott körülmények között elegendı a reakció egyensúlyának eléréséhez. Ezek az eredmények az összes fruktooligoszacharid hozam tekintetében jobbak, mint az ugyancsak Pectinex Ultra SP-L-t vizsgáló HANG és WOODAMS (1996) eredményei, akik ph=5,5-en és 65 C-on dolgoztak Rögzített Pectinex Ultra SP-L alkalmazása fruktooligoszacharidok elıállítására rázatott lombikos kísérletek során Az oldott állapotú biokatalizátor mőködésével való összevetés érdekében egy 15,6 U g -1 kiindulási aktivitással rendelkezı rögzített készítménnyel elvégzett rázatott lombikos kísérletben is megvizsgáltam az oligoszacharidok elıállításának lehetıségét. Az immobilizált biokatalizátor a fejezetben leírt optimális rögzítési paraméterek felhasználásával készült. A kísérletben alkalmazott körülmények a következık voltak: 6 g immobilizált Pectinex Ultra SP-L + 80 cm 3 szacharóz oldat (2 M, ph=5,6, 0,05 M acetát pufferben), 53 C hımérséklet, 150 rpm rázatási sebesség. A kísérlet során az elemzésekhez 0,05-0,05 cm 3 mennyiségő mintát vettem. Az eredmények összefoglalását a 20. ábra tartalmazza. 72

72 700 GF4 GF3 GF2 GF G 600 koncentráció (mgcm -3 ) idı (h) 20. ábra: Fruktooligoszacharidok elıállítása rögzített biokatalizátor segítségével, rázatott lombikos kísérletek során A kísérletek során az elért fruktooligoszacharid-hozam magasabb volt, mint oldott állapotú biokatalizátor alkalmazása esetében (13. táblázat). 13. táblázat: Rázatott lombikos kísérletek során rögzített biokatalizátor alkalmazásával elért fruktooligoszacharid hozamok Fruktooligoszacharid Idı hozam (h) (%) 0 0,00 1 8, , , , ,41 73

73 4.4. A szintézis melléktermékének eltávolítása A szintézisreakcióban melléktermékként keletkezı glükóz eltávolításának vizsgálatára rögzített glükóz-oxidáz és kataláz koimmobilizált enzimkészítménnyel végeztem kísérleteket. Megállapítottam a biokatalizátorok optimális rögzítési és mőködési paramétereit A glükóz-oxidáz és kataláz koimmobilizálásának vizsgálata A glükóz-oxidáz enzim a glükózt szelektíven képes glükonsavvá és hidrogénperoxiddá oxidálni (lásd 11.). A melléktermékként keletkezı H 2 O 2 az enzimfehérje károsítása révén aktivitáscsökkenést okozhat, ezért célszerő annak eltávolítása a reakcióelegybıl. Ezt a kataláz enzim alkalmazása teszi lehetıvé, amely elbontja a keletkezı hidrogén-peroxidot (lásd 12.). Az iparban használt glükóz-oxidáz készítmények többsége éppen ezért katalázt is tartalmaz. Az elterjedten alkalmazott glükóz-oxidáz készítmények mikrobiális (pl. Aspergillus niger, Penicillium notatum) eredetőek. β D glükóz + O (11) GOD 2 D glükonsav + H 2O2 H O H O + 1 O (12) kataláz / 2 2 A glükóz-oxidáz rögzítésére vonatkozóan a szakirodalomban számos példa található: bezárás kalcium-alginát gélbe [BLANDINO és mtsai, 2000], kovalens rögzítés különbözı szilárd fázisú hordozókon [SZAJÁNI és mtsai, 1987; WETALL és HERSH, 1970; BAUTISTA és mtsai, 2001] vagy polimer-membránon történı immobilizálás [GODJEVARGOVA és mtsai, 2004]. Munkám során a korábban a Pectinex Ultra SP-L esetében már bemutatott (4.1. fejezet) Amberlite IRA 900 Cl típusú hordozót és kétlépéses rögzítési módszert használtam, mivel a nagy töménységő és viszkozitású szacharóz oldat alkalmazása miatt mindenképp célszerő volt valamilyen felületi rögzítési technikát választani és az enzim-hordozó kapcsolatot egy keresztkötéses technikával megerısíteni. Ennek kivitelezésére az anyagok 74

74 rendelkezésemre álltak, a módszert pedig a glükóz-oxidáz kataláz rendszernek a fruktoziltranszferáztól eltérı tulajdonságai miatt részlegesen át kellett alakítanom. Felmerülhet a kérdés, hogy ugyanazon oldott enzimekbıl kiindulva, ugyanolyan phn és hıfokon milyen rögzítési sorrend vezet nagyobb rögzített GOD aktivitáshoz. Az ún. szekvenciális rögzítési módszer, azaz amikor elıbb a glükóz-oxidázt rögzítik, azután a katalázt, vagy a szimultán rögzítés. Elıkísérleteim alapján, amelyeket néhány évvel késıbb az irodalmi adatok [OZYILMAZ és TUKEL, 2007] is megerısítettek, a szimultán immobilizálási módszer bizonyult megfelelınek. A reakcióban melléktermékként keletkezı glükóz eltávolítására elsıként egy kereskedelmi forgalomban kapható, glükóz-oxidáz tartalmú összetett enzimkészítményt, a Novozym 771-et (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark) szerettem volna alkalmazni egyrészt azért, mivel katalázt is tartalmaz, másrészt kedvezı ára miatt. A kísérletek során azonban kiderült, hogy bár megfelelı aktivitású és stabilitású biokatalizátort sikerült elıállítani [SISAK és mtsai, 2006], viszont a Novozym 771, hidrolitikus mellékaktivitása miatt, a termékként keletkezı fruktooligoszacharidok bomlását idézte elı, így az általam elérendı cél megvalósítására nem volt megfelelı. Éppen ezért vált szükségessé, hogy egy másik biokatalizátort dolgozzak ki, amely tisztított glükóz-oxidáz és tisztított kataláz keverékébıl állt össze A glükóz-oxidáz és kataláz enzimek optimális rögzítési körülményeinek megállapítása Az enzimek rögzítésére használt hordozó és a módszer megegyeztek a Pectinex Ultra SP-L esetében alkalmazottéval (4.1. fejezet). Elsı kísérletemben a glükóz-oxidáz (I.) és kataláz (II.) aktivitások alakulását vizsgáltam meg egymástól függetlenül és együttesen (III.), azonos koncentrációjú oldatból rögzítve. Az alkalmazott rögzítıanyag- és enzim-mennyiségek a következık voltak: I.: 500 mg hordozó + 3 cm 3 (10 mg cm -3, ph=5,1, 0,05 M acetát-puffer) glükózoxidáz oldat. II.: 500 mg hordozó + 3 cm 3 (5 mg cm -3, ph=5,1, 0,05 M acetát-puffer) kataláz oldat. 75

75 III.: 1000 mg hordozó + 6 cm 3 (10 mg cm -3 glükóz-oxidáz, 5 mg cm -3 kataláz, ph=5,1, 0,05 M acetát-puffer) összetett enzimoldat. A rögzítés során 24 h szobahımérsékleten, 150 rpm rázatás mellett történt adszorpciót követıen szőrtem a készítményeket, majd 10 cm 3 0,25 %-os glutáraldehiddel (ph=5,1, 0,05 M acetát-puffer) rázattam 150 rpm mellett 1 h ideig. Szőrés, aldehidmentesre mosás és kiszárítás után mértem a biokatalizátorok fajlagos aktivitását. A kapott eredmények összefoglalását tartalmazza 14. táblázat. A rögzítendı glükóz-oxidáz és kataláz mennyiségének megállapítása a glükóz bontása során várhatóan keletkezı H 2 O 2 mennyiségéhez viszonyítva történt, mivel ha a H 2 O 2 feleslegben keletkezik, az enzimek inaktiválódását okozhatja. 14. táblázat: A rögzített enzimkészítmények fajlagos aktivitásának összehasonlítása Glükóz-oxidáz aktivitás (U g -1 ) Kataláz aktivitás (U g -1 ) I. 41,3 - II. - 39,9 III. 40,4 39,5 Az eredményekbıl látható, hogy a külön-külön oldatból történı rögzítéssel összehasonlítva a koimmobilizálás negatív hatása nem érzékelhetı a fajlagos aktivitások tekintetében, így az együttes rögzítéskor megfelelı hatékonyságú biokatalizátor kialakítása lehetséges. Az eredmények arra utalnak, hogy az elsı, adszorpciós lépésnél elég kötıhely áll a fehérjemolekulák rendelkezésére, így az egyik enzim nem szorítja le a hordozó felületérıl a másikat. A továbbiakban a glükóz-oxidáz aktivitást mérve (mivel ez az enzim katalizálja a fı reakciót a glükóz eliminálása során) megállapítottam a készített preparátum optimális immobilizálási paramétereit (glutáraldehid koncentráció, rögzítési idı). Az eredmények összefoglalását a 21. ábra tartalmazza. A legkedvezıbb eredményt a 0,5 %-os glutáraldehid koncentráció és 60 min rögzítési idı esetén értem el. 76

76 GOD aktivitás (Ug -1 ) Glutárald.konc. (%) 0,125 0,25 0, Idı (min) 21. ábra: A glükóz-oxidáz és kataláz tartalmú biokatalizátorok a glükóz-oxidáz szempontjából optimális koimmobilizálási körülményei Ezen körülmények között a biokatalizátor 40,4 U g -1 glükóz-oxidáz és 39,5 U g -1 kataláz aktivitással rendelkezik. Ha a rögzítés optimálás eredményeit a fruktozil-transzferáznál kapott optimumokkal ( fejezet) összhasonlítjuk, megállapítható, hogy a glükóz-oxidáz esetében az optimumok lényegesen drasztikusabb kezelési körülményeket jelentenek. Ennek alapján feltételezhetı, hogy a kombinált rögzítéssel stabilabb glükóz-oxidáz készítmény állítható elı, mint a fruktozil-transzferáz preparátum A glükóz-oxidáz kataláz biokatalizátor optimális mőködési körülményeinek vizsgálata Ezután az optimális mőködési körülmények megállapítása következett. Az elızıekben megállapított rögzítési optimumok alkalmazásával immobilizált biokatalizátor optimális mőködési paramétereit (hımérséklet, ph) vizsgáltam a katalizátor által adott kiindulási glükóz-koncentrációjú oldatban lebontott glükóz mennyiségének nyomon követésével. Az eredmények összefoglalása a 22. ábrán látható. Az optimális mőködési körülményeknek a 30 C-os hımérséklet és a ph 5,1 bizonyult. Ez azt mutatja, hogy a 77

77 rögzített enzim hımérséklet optimuma az oldottéhoz képest kismértékben megnıtt, míg az optimális ph nem változott. GOD aktivitás (Ug -1 ) ,1 ph 4,1 5,1 6, Hımérséklet ( C) 22. ábra: A glükóz-oxidáz kataláz biokatalizátor a glükóz-oxidáz szempontjából optimális mőködési körülményei Munkám során megvizsgáltam a preparátum mőködési stabilitását két különbözı kiindulási glükóz-koncentrációjú oldatban, egy 8-8 aktivitásmérési ciklusból álló kísérletsorozatban (23. és 24. ábra), amelynek során kb. 5-5 %-os aktivitáscsökkenést tapasztaltam, tehát az eredmények alapján a kialakított biokatalizátor megfelelı stabilitással rendelkezik. 78

78 Maradék aktivitás (%) Ciklusok száma 23. ábra: Stabilitás 4 g dm -3 kiindulási glükóz-koncentráció mellett 100 Maradék aktivitás (%) Cikl usok száma 24. ábra: Stabilitás 20 g dm -3 kiindulási glükóz-koncentráció mellett A koimmobilizálás szükségességének alátámasztására is elvégeztem egy kísérletsorozatot, melyben különbözı kiindulási glükóz-koncentrációjú oldatokban alkalmaztam rögzített glükóz-oxidázt, illetve glükóz-oxidáz kataláz együttesen rögzített enzimeket. Az eredmények (15. táblázat) azt mutatják, hogy a glükóz oxidációja során keletkezı H 2 O 2 in situ eltávolítása nagyban megnöveli a glükóz-elimináció hatékonyságát. Hasonló eredményre jutottak más szerzık is [OZYILMAZ és Tukel, 2007]. 79

79 15. táblázat: Glükóz-eltávolítás vizsgálata glükóz-oxidáz alkalmazásával kataláz nélkül, valamint kataláz jelenlétében Kiindulási glükózkonc. (mg cm -3 ) Idı (h) Lebontott glükóz mennyisége (%) Kataláz jelenléte az elegyben 10, , , , , , Reaktorkísérletek Oxigénbeviteli vizsgálatok a folyadékfázisban A melléktermék-eltávolításra alkalmazott enzimatikus módszer nagy oxigénigényét és a szubsztrát (2 M szacharóz) nagy viszkozitását az alkalmazandó reaktor kialakításánál figyelembe kellett venni. Ezért egy olyan felépítéső oszlopreaktort alakítottam ki, melynek belsejébe egy szilikoncsı betétet építettem be [SISAK és mtsai, 2006]. Ebben a csıspirálban az oxigén túlnyomás alatt áramlott, így a csı pórusain keresztül a folyadékba tudott jutni, egyenletes, buborékmentes gázbevitelt biztosítva a rendszerbe. Másik elınye a módszernek, hogy az alkalmazott szubsztrát (2 M szacharóz) nagy töménysége miatt a közvetlen gázbevitel esetén nemkívánatos kristálykiválás és hosszabb távon a rendszer eltömıdése lépne fel és ez elkerülhetı ezzel a technikával. 80

80 A reaktor egy termosztálható duplafalú üvegelembıl áll, belsı átmérıje 3,5 cm, magassága 17 cm, hasznos térfogata 160 cm 3. Az immobilizált biokatalizátor kiáramlását a reaktor alján elhelyezett perforált lemez akadályozza meg. Az oldatban mérhetı O 2 - tartalmat egy átfolyó rendszerben beépített O 2 -elektród segítségével mértem. A folyadék keringetésérıl perisztaltikus pumpa alkalmazásával gondoskodtam. A reaktor összeállítási rajza a 25. ábrán látható. 25. ábra: Glükóz eliminálására alkalmazott reaktor összeállítási rajza 81

81 Megvizsgáltam az oxigénbeviteli sebességet desztillált vízben (a.,) és 2 M szacharózoldatban két, eltérı hosszúságú szilikoncsı betét (b., és c.,) alkalmazása mellett, az oxigéntelítési sebesség meghatározása érdekében. a., Desztillált vízben: 300 cm szilikoncsı (felület=282,6 cm 2 ) szobahımérséklet 130 cm 3 desztillált víz túlnyomás alkalmazása a szilikoncsıben (0,8 bar, 1 bar, 1,2 bar) O2 (%) ,8 bar 1 bar 1,2 bar idı (min) 26. ábra: Oxigénbevitel vizsgálata desztillált vízben különbözı túlnyomás alkalmazása mellett Desztillált víz alkalmazása esetén jól látható, hogy a túlnyomás növelésével jelentıs különbségek alakulnak ki az oxigéntelítés sebessége tekintetében. 82

82 16. táblázat: Oxigénbevitel vizsgálata desztillált vízben Alkalmazott túlnyomás (bar) Relatív oxigéntelítési sebesség (% min -1 ) 0,8 1,2 1,0 1,53 1,2 2,76 b., Szacharózban: 300 cm szilikoncsı (felület=282,6 cm 2 ) szobahımérséklet 130 cm 3 2 M szacharóz oldat túlnyomás alkalmazása a szilikoncsıben (0,8 bar, 1 bar, 1,2 bar) O2 (%) ,8 bar 1 bar 1,2 bar idı (min) 27. ábra: Oxigénbevitel vizsgálata 2 M szacharóz oldatban I. 83

83 17. táblázat: Oxigénbevitel vizsgálata 2 M szacharóz oldatban I. Alkalmazott túlnyomás (bar) Relatív oxigéntelítési sebesség (%min -1 ) 0,8 0,28 1,0 0,34 1,2 0,38 A 2 M szacharóz-oldat vizsgálatánál a kapott eredmények azt mutatják, hogy a túlnyomás növelése nem okoz olyan nagy mértékő oxigéntelítési-sebesség növekedést, mint desztillált víz esetében. Ez azzal magyarázható, hogy az utóbbi oldat viszkozitása és töménysége meglehetısen nagy. Ezért egy másik kísérlet során az alkalmazott szilikoncsı méretét az eddig alkalmazott 300 cm helyett 670 cm-re növeltem, míg a szubsztrát mennyisége változatlan maradt. Így kívántam fokozni az oxigéntelítés sebességét. c., Szacharózban: 670 cm szilikoncsı (felület=631,2 cm 2 ) szobahımérséklet 130 cm 3 2 M szacharóz oldat túlnyomás alkalmazása a szilikoncsıben (0,8 bar, 1 bar, 1,2 bar) 84

84 O2 (%) ,8 bar 1 bar 1,2 bar idı (min) 28. ábra: Oxigénbevitel vizsgálata 2 M szacharóz oldatban II. 18. táblázat: Oxigénbevitel vizsgálata 2 M szacharóz oldatban II. Alkalmazott túlnyomás (bar) Relatív oxigéntelítési sebesség (%min -1 ) 0,8 0,43 1,0 0,66 1,2 0,79 Az eredmények bizonyítják, hogy a szilikoncsı méretének növelése kedvezıen befolyásolta az oxigéntelítés sebességét, így a továbbiakban az itt megállapított paraméterek mellett dolgoztam Glükóz-eltávolítás vizsgálata A nagymérető (670 cm) belsı szilikoncsı alkalmazásával elvégeztem egy kísérletet, melyben oldott állapotú glükóz-oxidázt (215 U) alkalmaztam 130 cm 3 4 g dm -3 kiindulási 85

85 glükóz-koncentrációjú oldatban (ph=5,1, 0,05 M acetát puffer), 1,2 bar túlnyomás és 3 dm 3 h -1 folyadékáramlási sebesség mellett. konverzió O2-tartalom konverzió (%) idı (min) O2-tartalom (%) 29. ábra: Glükóz eltávolításának vizsgálata laboratóriumi mérető reaktorban oldott állapotú glükóz-oxidáz alkalmazásával Az eredmények jól mutatják, hogy míg az oldat kiindulási glükóz-tartalma folyamatosan közel egyenletes sebességgel eliminálódik, az oldott O 2 mennyisége gyorsan csökken az oldatban, majd 0 % körül stabilizálódik. A két folyamat közötti kapcsolatot jól mutatja a 29. ábrán látható görbék lefutása. Ezután rögzített koimmobilizált (glükóz-oxidáz + kataláz) enzimkészítménnyel is végeztem egy kísérletet a rendszer tesztelése érdekében 5 g biokatalizátor, 130 cm 3 4 g dm - 3 kiindulási glükóz-koncentrációjú oldat (ph=5,1, 0,05 M acetát puffer), 1,2 bar túlnyomás és 3 dm 3 h -1 folyadékáramlási sebesség mellett, 5 mérési ciklus végrehajtása során. A vizsgálat során mindvégig nyomon követtem az oldat oxigén-tartalmának alakulását (30. ábra), valamint mértem a végsı glükóz-koncentrációkat, illetve a ph-t (19. táblázat). Az oldott oxigén koncentrációjának idıbeli lefutása a 29. ábrán láthatóhoz hasonló, kivéve azt a tényt, hogy 15 és 30 perc között egy határozott minimuma van az oxigéntelítettségi görbének és a minimumhoz tartozó idıpont a ciklusok sorszámának 86

86 növekedésével kismértékben felfelé tolódik. Ennek oka nagy valószínőséggel az, hogy perc után az idı elırehaladásával csökken a glükóz-oxidáció sebessége, ugyanakkor a bediffundált oxigén mennyisége az oldatban változatlan ciklus 2.ciklus 3.ciklus 4.ciklus 5.ciklus 80 O2 (%) idı (min) 30. ábra: Az oldott oxigén-tartalom változásának nyomon követése glükóz laboratóriumi mérető reaktorban rögzített glükóz-oxidáz kataláz alkalmazásával történı eltávolításának vizsgálata során 19. táblázat: Glükóz eltávolításának vizsgálata laboratóriumi mérető reaktorban rögzített glükóz-oxidáz kataláz alkalmazásával Maradék glükózkoncentráció ph (g dm -3 ) 1. ciklus 0,22 5,35 2. ciklus 0,20 5,65 3. ciklus 0,12 5,77 4. ciklus 0,12 5,94 5. ciklus 0,10 6,10 87

87 Az egyes ciklusok végén mért ph értéke azt mutatja (19. táblázat), hogy jelentıs eltérés nem tapasztalható a kiindulási ph-értéktıl, tehát egy többciklusú folyamat során a ph lényeges mértékő eltolódásával nem kell számolni. Végsı soron, a relatív oxigéntelítési sebesség számszerő értékeibıl levontam azt a következtetést, hogy egy integrált, fruktooligoszacharid szintézisre és egyidejő glükózmentesítésre szolgáló rendszer mőködésének jellemzésére a fenti buborékmentes módszer nem alkalmas. A csövön keresztüli oxigénbevitel kis sebessége nagymértékben visszafogná a kapcsolódó enzimkatalizált folyamat, a glükóz oxidáció sebességét és ebbıl következıen a fruktooligoszacharid szintézis sebessége is jelentısen elmaradna attól az értéktıl, amit a bemért fruktozil-transzferáz aktivitás lehetıvé tenne Integrált fruktooligoszacharid-szintézis és glükóz-eltávolítás megvalósítása A kialakított rögzített biokatalizátorok alkalmazásával egy, a termék-elıállítást és melléktermék-eltávolítást szimultán megvalósítani képes, laboratóriumi mérető, integrált reaktorrendszert állítottam össze és vizsgáltam a fruktooligoszacharidok elıállításának lehetıségét az egyidejőleg megvalósított glükóz oxidáció mellett Integrált rendszerő reaktorkísérletek Amint azt a fejezetben leírtam, a fruktooligoszacharidok biokatalitikus szintézisénél a melléktermék glükóz okozta kompetitív gátlás hatásának csökkentése céljából már néhány évvel ezelıtt is alkalmazták a glükóz-oxidációt, a melléktermék eliminálására [SHEU és mtsai, 2001]. Levegıztetett kevert tankban, oldott enzimek elegyét alkalmazták, és jelentıs javulást értek el a produktivitás tekintetében a glükóz-oxidáció nélküli rendszerhez képest. Az alkalmazott készülék végeredményben egy integrált rendszer volt, hiszen a primer folyamat, a fruktooligoszacharidok szintézise szimultán zajlott a szekunder glükóz-eliminációs folyamattal. Munkámban hasonló rendszert valósítottam meg, de rögzített enzimekkel, így ki tudtam használni az immobilizálás elınyeit. A három fázis jelenléte miatt és az enzimek eltérı hıfok-optimumaihoz való alkalmazkodás érdekében kétreaktoros, ciklikus mőködéső 88

88 megoldást választottam. Az integrált rendszer összeállítása során két laboratóriumi mérető oszlopreaktort kapcsoltam össze, amelyek a fejezetben már ismertetett, a glükózoxidáció vizsgálatánál alkalmazott egységgel azonos paraméterekkel rendelkeztek. Az oxigén bevitelét az ott alkalmazott szilikoncsı betét beépítése nélkül, az oxigén egyszerő bebuborékoltatásával oldottam meg. A szilikoncsı betétet azért nem használtam, mert az oxigénbeviteli kísérletek ( fejezet) eredményei alapján várható volt, hogy a csövön keresztüli oxigénbevitel kis sebessége nagymértékben visszafogná a kapcsolódó enzimkatalizált folyamat, a glükóz-oxidáció sebességét és ebbıl következıen a fruktooligoszacharid szintézis sebessége is jelentısen elmaradna attól az értéktıl, amit a bemért fruktozil-transzferáz aktivitás lehetıvé tenne. Az integrált reaktorrendszer összeállítási és mőködési vázlata a 31. ábrán látható. A fruktooligoszacharidok elıállítására szolgáló reaktoregységet 53 C-ra termosztáltam, míg a glükóz eltávolítására szolgáló egységet 25 C-on mőködtettem, azaz mindkét enzim a hıfok-optimumán mőködött. A kísérlet során a két reaktorban ciklikusan folytattam a reakciókat, a fruktooligoszacharidok szintézisét, illetve a glükóz oxidációját - a reakcióelegyet minden ciklus végén kicserélve a két oszlop között, így biztosítva a félfolyamatos termék-elıállítást, valamint a szimultán melléktermék-eltávolítást a rendszerben. Ciklusidınek 2 órát választottam, mert ennyi idı alatt keletkezett olyan koncentrációjú glükóz, amely még nem okozott jelentıs inhibíciót. Az ábrán látható ciklus (az n-edik ciklus, n 1, 2) szerinti mőködéskor a bal oldali reaktor rögzített Pectinex Ultra SP-L töltetet tartalmazott, és állóágyas üzemben mőködött, a folyadékfázis recirkulációja mellett. A reaktoron keresztül, felülrıl lefelé cirkuláltatta a perisztaltikus pumpa a reakcióelegyet, az 1., 5. és 6. szelepek nyitott állása mellett. A 2.,3., 4., 7.és 8. szelep értelemszerően zárva volt. Ezzel szimultán módon a jobb oldali reaktorban glükóz-oxidáció folyt. A 9. szelepen keresztül beadagolt, és a perforált lemez által eloszlatott oxigén keverte el a reakcióelegy teljes tömegében a katalizátor szemcséket. A 8. szelep zárva volt. A ciklus végén megcseréltem a folyadékfázisokat az oszlopokban. A bal oldali oszlopból, megfordítva a perisztaltikus pumpa irányát, a perforált lemezen keresztül áramoltattam a folyadékot az 1., 7. és 10. (nyomáskiegyenlítı) szelep nyitott állása mellett a tároló edénybe. A 2., 5. és 6. szelepeket lezártam (1. ütem). Ezt követıen a 7., 89

89 szelepet lezárva, majd az , és 8. szelepeket nyitva adagoltam a pumpával a ciklusban glükóz-oxidáción átment folyadékot a bal oldali kolonnába (2. ütem). A csere 3. ütemében a tartályban lévı folyadék került a pumpa segítségével a glükóz-oxidációs oszlopba, úgy, hogy elıbb zártam az 1., 3., 6. és 8. szelepeket, majd nyitottam a 2. és 4. szelepet. 31. ábra: Fruktooligoszacharidok szintézisének vizsgálatára szolgáló integrált reaktorrendszer összeállítása Kiindulási állapotként (1. ciklus) az 1. reaktorba 10 g rögzített Pectinex Ultra SP-L biokatalizátort, valamint 130 cm 3 2 M szacharóz szubsztrátot (ph=5,6, 0,05 M acetát 90