Orvosi maszlag (Datura innoxia Mill.) szövettenyészetek univerzális és speciális anyagcseréjének vizsgálata

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA Orvosi maszlag (Datura innoxia Mill.) szövettenyészetek univerzális és speciális anyagcseréjének vizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés LÁSZLÓ IMRE Témavezeto: Szoke Éva D.Sc. Semmelweis Egyetem Farmakognózia Intézet Budapest, 23. 1

2 Szigorlati bizottság: Elnök: Takács Mihály D.Sc. Tagok: Lemberkovics Éva D.Sc. Nyeste László D.Sc. 2

3 Doktori (Ph.D.) értekezés Készült: Semmelweis Egyetem, Farmakognózia Intézet, Budapest, 23. Témavezeto: Prof. Dr. Szoke Éva László Imre Orvosi maszlag (Datura innoxia Mill.) szövettenyészetek univerzális és speciális anyagcseréjének vizsgálata Összefoglaló A Datura innoxia Mill. (orvosi maszlag) számos, gyógyászati szempontból fontos hatóanyagot tartalmaz. A növényben több mint 3 tropán- és pirrolidinvázas alkaloidot azonosítottak, melyek együttesen,5% -,5% mennyiségben fordulhatnak elo. Foalkaloidok a hioszciamin és szkopolamin, melyek paraszimpatolitikus hatásúak. Tanulmányoztuk az in vitro D. innoxia növények, valamint a felhasználásukkal nyert kallusz- és géntranszformált, ún. hairy root kultúrák növekedését, tropán alkaloid összetételét (MALDI-MS) és hioszciamin, szkopolamin, apoatropin tartalmát (HPLC). Az A. rhizogenes A4 törzs alkalmazásával eloállított hairy root kultúrák géntranszformált sajátságát PCR technikával és a termelt opinok kimutatásával igazoltuk. A vizsgált hairy root klónok (# 41, #411 és #415) alkaloid tartalma (,23% hioszciamin és,21% szkopolamin) elérte az in vivo növény gyökerében mért értékeket. Eredményeink ugyanakkor azt jelzik, hogy a véletlenszeru bakteriális tdns beépülés eredményeként kialakuló, eltéro genetikai felépítésu klónok hasonló növekedési jellemzoi mellett nagy mértéku eltéréseket észlelhetok a kultúrák speciális anyagcseréjében, alkaloid termelésében. A kultúrák növekedését és alkaloid tartalmát számos körülmény befolyásolhatja kedvezoen, így részletesebben vizsgáltuk a megvilágítás, továbbá az MS tápközeg szacharóz és Mg 2+ tartalmának hatását a géntranszformált szövetek fejlodésére, és tropán alkaloid tartalmára. A különbözo szövetkultúrákban lezajló apoptotikus folyamatokat TUNEL reakció alkalmazásával mutattuk ki. Abiogén stresszhatások és a növekedés, alkaloid metabolizmus, mérheto endogén HCHO tartalom közötti kapcsolat tanulmányozása során célul tuztük ki a szakirodalmi adatok alapján a transzmetilezési reakciókat befolyásoló, a tenyészetek tápközegébe különbözo koncentrációban adagolt vegyületek (dimedon, szemikarbazid, aminoguanidin, vagy hidralazin, 1ppm, 1ppm, 1ppm és 1ppm) hatásának vizsgálatát [1]. A kallusz- (4,6µg/g - 27,µg/g) és hairy root kultúrák endogén HCHO tartalmát (345,µg/g) MALDI-MS módszerrel mutattuk ki, valamint OPLC és HPLC technikák alkalmazásával határoztuk meg, formaldimedon formájában [2]. A dimedon és szemikarbazid alkalmazását követoen TUNEL reakció segítségével részletesebben tanulmányoztuk a molekulák apoptotikus folyamatokra gyakorolt hatását [3]. A 4 hetes géntranszformált gyökérkultúrákban (kontroll és dimedonnal, vagy szemikarbaziddal kezelt) nem tudtunk kimutatni apoptotikus folyamatokra jellemzo morfológiai változásokat, továbbá DNS fragmentálódást, mely arra utal, hogy a hairy root szövetek fejlodése eltér a korábban vizsgált kultúrákétól. Eredményeinkkel hozzá kívánunk járulni a D. innoxia szövettenyészetek növekedésének, a lezajló apoptotikus folyamatok és a tropánvázas alkaloidok metabolizmusának jobb megismeréséhez, továbbá az abiogén stresszhatások (speciális kémiai stressz) során bekövetkezo változások alaposabb megértéséhez. 1. László, I., Szoke, É., Tyihák, E. (1998) Relationship between abiotic stress and formaldehyde concentration in tissue culture of Datura innoxia Mill. Plant Growth Regulation, 25, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Németh, Zs. and Albert, L. (23): Identification and measurement of endogenous formaldehyde in Datura innoxia Mill. tissues by OPLC, HPLC and MALDI MS techniques. Acta Horticulturae, 597, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (21) Programmed cell death in Datura innoxia Mill. cultures cultivated in light and in dark. Plant Growth Regulation, 33,

4 Ph.D. Thesis Prepared under the guidance of Prof. Éva Szoke, D.Sc., in the Institute of Pharmacognosy, Semmelweis University, Budapest, 23 Imre László Investigation on primary and secondary metabolism of Datura innoxia Mill. tissue cultures Summary Datura innoxia Mill. contains several secondary metabolites with pharmacological and toxicological importance, including more than 3 tropane- and pirrolidin-base alkaloids. Total amount of these alkaloids varies between.5%-.5% in different organs of the plant. Main alkaloids are scopolamine and hyoscyamine which have parasympatholytic effect. The aim of our experiments was to study different genetically modified and non-transformed in vitro cultures of D. innoxia. The growth (fresh and dry weight, dry matter content, growth value and ph of liquid culture media) and tropane alkaloid content (scopolamine, hyoscyamine and apoatropine, using HPLC technique) of in vitro plants, callus tissues and genetically modified, so called hairy root cultures were investigated. The transferred character of hairy root tissues obtained by Agrobacterium rhizogenes A4 microinjection was demonstrated by using polimerase chain reaction (PCR) and opine detection (paper electrophoresis). We have established that the total alkaloid content of hairy root clones (#41, #411 and #415,.23% hyoscyamine and.21% scopolamine) reached that of the root of the in vivo plants. Growth and alkaloid content of in vitro cultures has been effected by several circumstances. We studied the effects of culturing in light, the sucrose and Mg 2+ content of liquid MS basal medium on the growth, biomass production and tropane alkaloid content of the tissues. The presence of apoptotic processes in cells of different tissues (callus and root) accompanied with the shrinkage of the nuclei was investigated by TUNEL reaction. To study the relationship among abiotic stress, growth, alkaloid metabolism and measurable endogenous HCHO concentration different molecules affecting transmethylation reactions have been administered to the culture media (dimedone, semicarbazide, aminoguanidine and hidralazine, 1ppm- 1ppm) of tissues [1]. The endogenous HCHO concentration of callus (4.6µg-27.µg) and hairy root cultures (345.µg) was determined by OPLC and HPLC techniques as formaldemethone [2]. Following administration of dimedone and semicarbazide the apoptotic processes were investigated by TUNEL reaction [3]. The results obtained might help deepening our knowledge about the growth of D. innoxia in vitro cultures, tropane alkaloid metabolism, apoptotic processes in plant cells and the effect of abiotic stress (special chemical stress). 1. László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1998) Relationship between abiotic stress and formaldehyde concentration in tissue culture of Datura innoxia Mill. Plant Growth Regulation, 25, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Németh, Zs. and Albert, L. (23): Identification and measurement of endogenous formaldehyde in Datura innoxia Mill. tissues by OPLC, HPLC and MALDI MS techniques. Acta Horticulturae, 597, László, I., Szoke, É., Tyihák, E. and Szende, B. (21) Programmed cell death in Datura innoxia Mill. cultures cultivated in light and in dark. Plant Growth Regulation, 33,

5 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZÕ SAJÁT KÖZLEM ÉNYEK Folyóiratban megjelent cikk: 1, László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1998) Relationship between abiotic stress and formaldehyde concentration in tissue culture of Datura innoxia Mill. Plant Growth Regulation, 25, , Kiss, A.S., Galbács, Z., László, I., Szoke, É., Galbács, G. (1998) A deutériumtartalom változásának biológiai, biokémiai hatásai. Múzeumi füzetek, az Erdélyi Múzeum-Egyesület Természettudományi és Matematikai Szakosztályának közleményei, 7, , László, I., Szoke, É., Németh, Zs., Albert, L. (1998) Plant tissue culture as a model for study of diversity in formaldehyde bounding. Acta Biologica Hungarica, 49 (2-4), , Szende, B., Tyihák, E., Trézl, L., Szoke, É., László, I., Kátay, Gy., Király-Véghely Zs. (1998) Formaldehyde generators and capturers as influencing factors of mitotic and apoptotic processes. Acta Biologica Hungarica, 49 (2-4), , László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (21) Programmed cell death in Datura innoxia Mill. cultures cultivated in light and in dark. Plant Growth Regulation, 33 (3), , László I., Szoke, É. (22): Biotechnológiai módszerek alkalmazása terápiás szempontból fontos, növényi eredetu hatóanyagok eloállítására. Képzés egy életen át, II/1, , László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Németh, Zs. and Albert, L. (23): Identification and measurement of endogenous formaldehyde in Datura innoxia Mill. tissues by OPLC, HPLC and MALDI MS techniques. Proceedings of the International Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Part II. Acta Horticulturae, 597, , Hank, H., László I., Bálványos, I. and Tóth, E. (23): Effect of magnesium on the growth and alkaloid production of hairy root cultures. Proceedings of the International Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Part II. Acta Horticulturae, 597, Folyóiratban megjelent absztrakt: 1, László I., Szoke É. and Tyihák E. (1998) Effect of Magnesium on the Methylation of Alkaloids in Datura innoxia Mill. Tissue Cultures. Magnesium Research, 11, Könyvfejezetek: 1, Kiss, A.S., László, I., Szoke, É., Galbács, Z. and Galbács, G. (1997) The Effect of Deuterium Depleted Medium on Plant Tumors. In: Magnesium: Current Status and New Developments (Theophanides, T. and Anastassopoulou, J. editors) Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London, , László, I., Szoke, É., Németh, Zs., Kursinszki, L., Albert, L., and Tyihák, E. (1998) Effect of Magnesium on the Methylation of Alkaloids in Datura innoxia Mill. Tissue Cultures. In: Magnesium: Magnesium and Interaction of Magnesium with Trace Elements (Kiss, A.S. editor) Hungarian Chemical Society, Budapest, Hungary,

6 3, Szoke, É., László, I., Liszt, K. (21) A mákalkaloidok képzodése szövettenyészetekben (a mák alkaloidjainak in vitro bioszintézise). In: Magyarország Kultúrflórája, A mák (Papaver somniferum L.). (Sárkány, S., Bernáth, J., Tétényi, P. editors) Akadémiai Kiadó, Budapest, Eloadások jegyzéke nemzetközi és hazai konferenciákon (eloadás/poszter): 1, Szoke, É., Lemberkovics, É. and László, I. (1995) Bioactive Compounds of Chamomile Hairy Root Cultures. 43 rd Ann. Congr. on Med. Plant Res. Abstracts, p. 4. Halle (Germany). 2, Szoke, É., Lemberkovics, É., Troilina, J. and László, I. (1995) Essential Oil Formation in Chamomile Hairy Root Cultures. 26 th International Symposium on Essential Oils, Abstracts, p. 52. Hamburg (Germany). 3, Kiss, A.S., László, I., Szoke, É., Galbács, Z. and Galbács, G. (1997) The Effect of Deuterium Depleted Medium on Plant Tumors. VIII. International Symposium on Magnesium, Book of Abstracts. p. 26. Heraklion, Crete (Greece). 4, László, I. and Szoke, É. (1997) Change of Formaldehyde Level in Tissue Culture of Datura innoxia Mill. For Abiotic Stresses. Stress of Life, International Congress of Stress, Abstracts, p Budapest. 5, László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1997) The Effect of Abiotis Stresses on Formaldehyde Level in Datura innoxia Mill Tissue Culture. Second International Symposium on Natural Drugs, Abstracts p Maratea (Italy). 6, László, I., Szoke, É. and Tyihák, E. (1997) Change of Formaldehyde Level in Tissue Culture of Datura innoxia Mill. For Abiotic Stresses. VI. Semmelweis Science Fair, Abstracts p. 38. Budapest. 7, László I., Szoke É. and Tyihák E. (1998) Tropánvázas alkaloidok vizsgálata genetikailag módosított növényi szövettenyészetekben. Farmakokinetika és Gyógyszermetabolizmus Szimpozium, Abstracts p. 23. Mátraháza. 8, László I., Szoke É. and Tyihák E. (1998) Effect of Magnesium on the Methylation of Alkaloids in Datura innoxia Mill. Tissue Cultures. 6th European Magnesium Congress, Book of Abstracts p. 79. Budapest. 9, László I., Szoke É., Tyihák E. (1998) Abiotikus stresszkörülmények hatása Datura innoxia Mill. szövettenyészetek formaldehid tartalmára. Pécsi Fitoterápiás Napok, Abstracts p. 3. Pécs. 1, Szende B., Tyihák E., Trézl L., Szoke É., László I., Kátay Gy., Király-Véghely Zs. (1998) Foemaldehyde generators and capturers as influencing factors of mitotic and apoptotic processes. 4th International Conference on the Role of Formaldehyde in Biological Systems, Abstracts p. 18. Budapest. 11, László I., Szoke É., Németh Zs., Albert L. (1998) Plant tissue culture as a model for study of diversity in formaldehyde bounding. 4th International Conference on the Role of Formaldehyde in Biological Systems, Abstracts p. 26. Budapest. 6

7 12, László I., Szoke É., Tyihák E., Kursinszki L., Németh Zs., Albert L. (1998) The influence of culturing conditions on Datura innoxia Mill. callus and genetically modified tissue cultures. 46th Annual Congress of the Society for Medicinal Plant Research, Abstracts C3 Vienna (Austria). 13, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Kursinszki, L., Németh, Zs., Albert, L. (1998) The influence of culturing conditions on Datura innoxia Mill. callus and genetically modified tissue cultures. VII. Semmelweis Science Fair, Abstracts p. 31. Budapest. 14, László I., Szoke É., Tyihák E. and Szende B. (1999) Programozott sejt halál vizsgálata növényi szövettenyészetek sejtjeiben. SOTE PhD Tudományos Napok '99 Abstracts p Budapest. 15, László, I., Szoke, É., Tyihák, E. and Szende, B. (1999) Programmed cell death in plant tissue cultures cultivated in light and in dark. 2 Years of Natural Products Research, Joint Meeting of: American Society of Pharmacognosy, Association Francaise pour l Enseignement et la Recherche en Pharmacognosie, Gesellschaft für Arzneipflanzenforschung and Phytochemical Society of Europe, Book of Abstracts P 325 Amsterdam (The Netherlands). 16, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (1999) Investigation of apoptotic processes in Datura innoxia Mill. tissue cultures. X. Symposium of Plant Anatomy in Hungary, Programme and Abstracts of Papers pp Debrecen. 17, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Sze nde, B. (1999) Investigation of apoptotic processes in Datura innoxia Mill. tissue cultures. Gyógyszerészek Országos Kongresszusa IX., Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XI., Programme and Abstracts p. 66. Siófok. 18, László, I., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (2) Biochemical and morphological investigation of Datura innoxia Mill. tissue cultures. 1 st International Colloquium Health, Environment and Natural Substances, Programme and Abstracts of Papers p. 8. Metz (France). 19, László, I., Szoke, É., Kursinszki, L., Szende, B., Tyihák, E. (2) Investigation of genetically modified and non-transformed Datura innoxia tissue cultures. The 6 th European Congress of Pharmaceutical Sciences, Final Program p. 15. Budapest. 2, László, I., Szoke, É., Szende, B. (2) Effect of dimedone and semicarbazide on the growth and metabolism of D. innoxia tissue cultures. 5 th International, Jubilee Conference on Role of Formaldehyde in Biological Systems, Scientific Program and Abstracts p. 7. Sopron. 21, László, I., Kursinszki, L., Szoke, É., Tyihák, E., Szende, B. (21) Datura innoxia Mill. szövettenyészetek biokémiai és morfológiai vizsgálata. Dr. Mozsonyi Sándor Alapítvány emlékülése Díjkiosztása és Tudományos Ülése, Program p.8. Budapest. 22, Bálványos, I., László, I., Vida, K., Hank, H., Kursinszki, L., Tóth, E., Szoke, É. (21) Effect of magnesium on the genetically modified Atropa belladonna cultures. 7 th Hungarian Magnesium Symposium, Program and Abstracts pp Siófok. 23, Kiss, A.S., László, I., Stefanovits-Bányi, É., Galbávs, Z., Szoke, É. (21) Effect of magnesium on the growth of of plant tumors cultivated on culture media with reduced deuterium content. 7 th Hungarian Magnesium Symposium, Program and Abstracts pp Siófok. 7

8 24, László, I., Szoke, É., Kursinszki, L., Tyihák, E., Szende, B. (21) Effect of dimedone and semicarbazide on the growth and metabolism of plant tissue cultures. World Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Abstracts p Budapest. 25, Kursinszki, L., László, I., Albert, L., Németh, Zs., Szoke, É. (21) Determination of tropane alkaloids in plant samples using extrelut column and high-performance liquid chromatography. World Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Abstracts p. 17. Budapest. 26, Hank, H., Vida, K., László, I., Bálványos, I., Kursinszki, L., Tóth, E., Szoke, É. (21) Investigation on the tropane alkalid production of genetically modified Atropa belladonna L. in vitro cultures. World Conference on Medicinal and Aromatic Plants, Abstracts p Budapest. 27, Hank H., László I., Bálványos I., Kursinszki L., Vida K., Kovács Gy., Tóth E., Szoke É. (22) Influence of culturing conditions on the primary and secondary metabolism of genetically modified Atropa belladonna L. tissues. PhD Tudományos Napok, P 34, Budapest. 28, Hank H., Bálványos I., László I., Vida K., Kursinszki L., Kovács Gy., Tóth E., Szoke É. (22) Effect of magnesium on the growth and alkaloid production of hairy roots and reorganised plant cultures, P 29. The IIIrd Romanian Magnesium Symposium With International Participation, Iasi (Romania). 29, Hank H., Bálványos I., László I., Vida K., Kursinszki L., Kovács Gy., Tóth E., Szoke É. (22) Effect of magnesium on the growth and alkaloid production of hairy roots and reorganised plant cultures. Medical plant research and utilization 22, Program and Book of Abstracts p. 92. Kecskemét. 8

9 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITUZÉS IRODALMI HÁTTÉR Rendszertani besorolás Morfológiai jellemzés Elofordulás Tartalmi anyagok A Datura innoxia Mill. tartalmi anyagai A tropánvázas alkaloidok kémiai áttekintése Felhasználás, terápiás hatások, toxikológia A tropánvázas alkaloidok és rokon vegyületek bioszintézise A tropán alkaloid bioszintézisben résztvevo fontosabb enzimek Az ornitin és arginin dekarboxilázok Putreszcin-N-metiltranszferáz N -metilputreszcin oxidáz Tropinon reduktázok Acil transzferázok Hioszciamin 6β-hidroxiláz Tropánvázas alkaloidok kvalitatív és kvantitatív vizsgálata Alkaloidtartalom meghatározása denzitometriás módszerrel Gáz-folyadékkromatográfiás technikák Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerek In vitro tenyészetek alkalmazása az univerzális és speciális anyagcsere vizsgálatára A kallusztenyészetekrol általában Datura innoxia Mill. kalluszszövetek növekedése és tropán alkaloid produkciója A hairy root kultúrákról általában Géntranszformáció Agrobacterium vektor rendszerek alkalmazásával Kointegráns és bináris vektor rendszerek A géntranszformáció igazolása hairy root kultúrákban A polimeráz láncreakció ( polimerase chain reaction, PCR) alkalmazása Southern és Northern lenyomattechnika Opinok kimutatása Tropán alkaloidok termeltetése hairy root kultúrákkal Az inokulum tömegének hatása a növekedésre és alkaloid tartalomra A tenyésztési ido és a táptalaj ph-jának hatása a növekedésre és hatóanyag produkcióra A megvilágítás hatása Datura hairy root tenyészetek növekedésére és tropán alkaloid produkciójára A tápközeg összetételének hatása a kultúrák növekedésére és tropán alkaloid produkciójára Transzgének hatása a tropán alkaloid metabolizmusra A Datura hairy root kultúrák genetikai stabilitása

10 2.9. Formaldehid a biológiai rendszerekben Az endogén formaldehid szerepe a növényi anyagcserében Az endogén HCHO tartalom és a stresszhatások kapcsolata Programozott sejthalál és apoptotikus formája a növényekben, kis- (pl. H 2 O 2 és HCHO) és nagymolekulák szerepe A növényi apoptózis morfológiai jellemzése TUNEL reakció alkalmazása a növényi apoptózis detektálására Az apoptózis folyamatában szerepet játszó gének Programozott sejthalál aktiválásában szerepet játszó hírvivo folyamatok Mitokondrium és enzimfehérjék szerepe a programozott sejthalál során Reaktív oxigéntartalmú molekulák (ROS) szerepe Oxidatív stressz, mitokondriumok és Ca 2+ homeosztázis kapcsolata a PCD folyamatában A szingulet oxigén toxikus és apoptotikus hatásai A HCHO szerepe a sejtek apoptotikus folyamataiban VIZSGÁLATI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK D. innoxia in vitro növények létrehozása és tenyésztése Szövetkultúrák eloállítása és fenntartása Kallusztenyészetek H airy root kultúrák A géntranszformáció igazolása hairy root kultúrákban D. innoxia in vitro növény és hairy root kultúrák vizsgálata PCR technikával A szövetek opin termelésének vizsgálata papír elektroforézissel A kultúrák növekedési aktivitásának jellemzése Friss súly meghatározása Szárazsúly meghatározása Szárazanyag tartalom meghatározása Növekedési érték (NÉ) számítása A folyékony MS tápközeg ph-jának meghatározása Az AMS és M S tápközegek összetételének módosítása Szacharóz tartalom változtatása MgSO 4 tartalom módosítása Dimedon és szemikarbazid alkalmazása Aminoguanidin és hidralazin alkalmazása Tropán alkaloidok kimutatása és meghatározása Növényi szövetek hisztokémiai vizsgálata Dragendorff-reagens alkalmazásával MALDI-MS módszer HPLC módszer Endogén HCHO kimutatása és meghatározása MALDI-MS módszer OPLC eljárás HPLC módszer TUNEL reakció alkalmazása az apoptotikus sejtek kimutatására A kísérleti eredmények statisztikai kiértékelése

11 4. EREDMÉNYEK D. innoxia in vitro növények vizsgálata Az in vitro növények növekedése és alkaloid tartalma D. innoxia in vitro növények gyökereinek szövettani vizsgálata A fiatal gyökerek vizsgálata HE festést követoen Hisztokémiai vizsgálatok Dragendorff reagens alkalmazásával TUNEL reakció alkalmazása Kallusz kultúrák A tenyészetek növekedése és mérheto endogén HCHO koncentrációja Szövettani jellemzés Abiogén stressz hatása a kultúrák növekedésére Abiogén stressz hatása a kultúrák mérheto HCHO tartalmára A kalluszsejtek apoptotikus folyamatainak vizsgálata Hairy root tenyészetek A géntranszformáció igazolása Polimeráz láncreakció Opinok kimutatása A hairy root klónok növekedési jellemzoinek vizsgálata sötétben és fényen A klónok tropán alkaloid tartalma és alkaloid produkciója A hairy root kultúrák szövettani vizsgálata Az MS alaptáptalajon nevelt szövetek vizsgálata Hisztokémiai vizsgálatok Dragendorff reagens alkalmazásával A tápközeg összetételének hatása a növekedésre és hatóanyag produkcióra Szacharóz hatása A MgSO 4 hatása Abiogén stressz hatása a hairy root szövetek növekedésére és hatóanyag produkciójára A dimedon hatása A szemikarbazid hatása A dimedonnal és szemikarbaziddal kezelt hairy root kultúrák szövettani vizsgálata Terápiában alkalmazott vegyületek hatása D. innoxia hairy root szövetek fejlodésére és alkaloid termelésére EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS TÁRGYALÁSA D. innoxia in vitro kultúrák vizsgálata A tápközeg összetevoinek hatása a hairy root tenyészetekre Abiogén stressz hatása a kallusz és hairy root kultúrákra KÖSZÖNETNYILVÁNÍT ÁS IRODALOMJEGYZÉK 8. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK KÜLÖNLENYOMATAI 11

12 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACH α-ciano-4-hidroxi-szinnapinsav ADC arginin dekarboxiláz Ai AOX ATP apoptotikus index alternatív oxidáz adenozin-trifoszfát BI-1 BAX-inhibitor 1 CaMV35S karfiol mozaik vírus 35S promoter 2,4-D 2,4-diklórfenoxi ecetsav #41, #411, #415 Agrobacterium rhizogenes A4 törzzsel fertozött orvosi maszlagból (Datura innoxia Mill.) nyert hairy root klónok Di HMA N G -dihidroximetil- 14 C-arginin DML N ε -N ε -dimetil-l-lizin DPX DNS-fehérje keresztkötéseket GC gázkromatográfia GLC gáz-folyadékromatográfia GUS β-glukuronidáz gén H 2 O 2 hidrdogén-peroxid H6H hioszciamin 6β-hidroxiláz HCHO formaldehid HE haematoxilin-eozin HPLC nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia HR hiperszenzitív válaszreakció i.d. internal diameter, belso átméro MALDI-MS mátrix lézer ionizációs tömegspektrometria MAO monoamin-oxidáz Me-Asc metil-aszkorbigén MML N ε -monometil-l-lizin Mo HMA N G -monohidroximetil- 14 C-arginin MPO N-metilputreszcin oxidáz MS Murashige-Skoog táptalaj NADPH hidrogénezett nikotinsavamid-dinukleotid-foszfát NMR mágneses magrezonancia spektroszkópia NO nitrogén monoxid NPT II neomycin-foszfotranszferáz 1 O 2 szingulett oxigén 12

13 ODC ornitin dekarboxiláz OPLC túlnyomásos folyadékkromatográfia PCD programozott sejthalál PMT putreszcin-n-metiltranszferáz PT pore transit ion ROI reactive oxygen intermediates ROS reactive oxygen species SA szalicilsav SAH S-adenozil-homocisztein SAM S-adenozil-metionin SOD szuperoxid dizmutáz SPE solid phase extraction, szilárd fázisú extrakció SSAO szemikarbazid-szenzitív amin oxidáz T-DNS transzfer-dns THF tetrahidrofolát TML N ε -N ε -N ε -trimetil-l-lizin TMV dohánymozaik vírus TR I és II tropinon reduktáz I és II Tri HMA N G -trihidroximetil- 14 C-arginin TUNEL ( terminal deoxynuclotidyl transferase-mediated dutp nick end labelling ) UV ultraviola VRK vékonyréteg kromatográfia YMB Yeast Mannitol Broth táptalaj 13

14 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITUZÉS A növényi speciális anyagcsere termékei fontos alapanyagforrást jelentenek az élelmiszer-, kozmetikai- és gyógyszeripar számára. Ezek a vegyületek a legtöbbször csupán kis mennyiségben találhatók meg a növényekben, felépítésük pedig a legtöbbször bonyolult, így szintézis útján történo ipari méretu eloállításuk néhány kivételtol eltekintve - nem megoldott. Az analitikai módszerek fejlodésével ugyanakkor egyre nagyobb számú növényi anyagcseretermék feltárására és megismerésére van lehetoség. A biotechnológiai módszerek és molekuláris biológiai ismeretek bovülésével párhuzamosan új lehetoségek nyíltak a növényi sejtek univerzális és speciális anyagcseréjének jobb megismerésére laboratóriumi körülmények között, így egyes sejt- és szövetkultúrák ma már reális lehetoséget nyújtanak bizonyos növényi vegyületek ipari méretu eloállításához is. Az in vitro fenntartott növényi sejtek és szövetek vizsgálata hasonlóan a humán/állati sejt- és szövetkultúrákhoz információt adhat egyes vegyületek univerzális és speciális anyagcserére, apoptotikus folyamatokra gyakorolt hatásának jobb megértéséhez (pl. rákkelto hatás vizsgálata). A növényi sejtekben, szövetekben lezajló programozott sejthalál (PCD) folyamatáról rendelkezésre álló, rohamosan bovülo ismeretanyag alapján feltételezheto, hogy - a humán/állati és növényi sejtek felépítésében lévo alapveto különbségek ellenére egyes alapveto szabályozó folyamatok közösek maradtak az evolúció során. Vizsgálataink során Datura innoxa Mill. (orvosi maszlag) különbözo genetikailag nem módosított és géntranszformált szövetkultúráit használtuk fel. A növény sok más speciális anyagcseretermék mellett gyógyászati szempontból fontos tropánvázas alkaloidokat, többek között szkopolamint és hioszciamint tartalmaz. Mindkét vegyület paraszimpatolitikus hatású (pl. spazmolitikus, nyál és gyomornedv szekréciót csökkento, midriatikus hatás), így szélesköruen alkalmazzák oket a szemészetben, továbbá szívbetegségekben és gyomor-, bélrendszeri panaszok esetén. Bár a tropánvázas alkaloidok bioszintézise, a folyamatban résztvevo enzimek legtöbbje ma már ismert, ennek ellenére még számos lépés nem tisztázott részletesen. Az S-adenozil-metionin (SAM) közremuködésével végbemeno transzmetilezési reakciók alapveto szerepet játszanak a bioszintézis során. A tropán alkaloidok bioszintézise ugyanakkor szoros kapcsolatban áll a poliaminok bioszintézisével, melyeknek többek között a különbözo stresszhatások leküzdésében játszanak szerepet. Munkánk során vizsgálni kívánjuk az in vitro D. innoxia növények felhasználásával nyert kallusz-, valamint géntranszformált gyökérkultúrák (ún. hairy root tenyészetek) növekedését és tropán alkaloid tartalmát. A kultúrák növekedését és alkaloid bioszintetizáló képességét számos körülmény 14

15 befolyásolhatja kedvezoen, így tanulmányozni kívánjuk a megvilágítás, továbbá a tápközeg szacharóz (szénforrás) és Mg 2+ (makroelem) tartalmának hatását a szövetek fejlodésére, biomassza produkciójára, hioszciamin és szkopolamin tartalmára. A különbözo szövetkultúrák sejtjeiben lezajló, jellegzetes morfológiai változásokkal kísért apoptotikus folyamatokat is kiemelt figyelemmel kísérjük. Irodalmi adatok támasztják alá, hogy a különbözo humán, állati és növényi sejtek, szövetek mérheto mennyiségu endogén formaldehidet (HCHO) tartalmaznak, valamint a mérheto HCHO tartalom szoros kapcsolatban áll a különbözo biogén és abiogén stresshatásokkal. A D. innoxia kallusz és hairy root szövetek endogén HCHO tartalmát dimedon alkalmazásával tervezzük kimutatni és mérni, mely irreverzibilisen reagál a HCHO-el, és a keletkezo reakciótermék (formaldimedon) több analitikai módszerrel is kimutatható és mérheto. Abiogén stresszhatások, valamint a növekedés, alkaloid metabolizmus, mérheto endogén HCHO tartalom közötti kapcsolat tanulmányozása során célul tuztük ki a szakirodalmi adatok alapján a transzmetilezési reakciókra alapveto hatást gyakorló a tenyészetek tápközegébe adagolt vegyületek hatásának (pl. dimedon, szemikarbazid, aminoguanidin és hidralazin) vizsgálatát. A dimedon és szemikarbazid adagolását követoen részletesebben kívánjuk tanulmányozni a molekulák apoptotikus folyamatokra gyakorolt esetleges hatását. Eredményeinkkel szeretnénk hozzájárulni a D. innoxia szövettenyészetek növekedésének, a lezajló apoptotikus folyamatok és a tropánvázas alkaloidok metabolizmusának jobb megismeréséhez, továbbá az abiogén stresszhatások (speciális kémiai stressz) során bekövetkezo változások alaposabb megértéséhez. 15

16 2. IRODALMI HÁTTÉR 2.1. Rendszertani besorolás A Datura innoxia Mill. (orvosi maszlag) a Spermatophyta (magvas növények) törzs, Angiospermatophyta (zárvatermok) altörzs, Dicotyledonopsida (kétszikuek) osztály, Lamiidae (Tubiflorae) alosztály, Solananae rendcsoport, Solanales rend, Solanaceae (burgonyafélék) családjába sorolható [1]. A Datura nemzetségbe mintegy 2-25 faj tartozik, melyek négy további szekcióba oszthatók: - Brugmansia (pl. D. arborea L., D. sanguinea Ruiz et Pav.), - Stramonium (pl. D. ferox L., D. quercifolia, D. stramonium L.), - Datura (pl. D. innoxia Mill., D. metel L.), - Ceratocaulis (pl. D. ceratocaula Ort.) [2] Morfológiai jellemzés A Datura nemzetség növényei lágyszárúak, de cserjék és fatermetu növények is elofordulnak közöttük. A lomblevelek osztatlanok, többnyire nyelesek és gyakran hullámos, vagy fogazott széluek. A virágokra a 4 körösség és 5 tagúság jellemzo. A virágtakaró forrt, a csésze csoszeru, teljesen, vagy részle gesen az elvirágzás után is megmarad. A nagy, tölcsér formájú virág alul henger alakú, felül kiszélesedik, leggyakrabban fehér színu (1. és 2. ábra). A porzók szála a pártacsohöz no. A magház kétüregu, a járulékos válaszfalak révén négyüregunek tunik. A te rmés tok, vagy bogyó, melyek nagy számú lapos magvat tartalmaznak. Közép- és Dél-Amerikában fa termetu Datura fajok is megtalálhatók, melyek virágai elérhetik a 26cm hosszúságot, termésük pedig bogyó [2]. A D. innoxiát Miller írta le eloször 1768-ban. A növény hazájaként Mexikót jelölte meg és utalt arra hogy a termése lecsüngo, tüskés, szabálytalanul felnyíló tok [3]. A növény 1-2m magas egyéves növény, elágazó földfeletti hajtással. A gyökér 3-6cm hosszú, 2-4cm vastag, orsó formájú, több mellékgyökérrel. A levelek erosen aszimmetrikusak, szív alakúak, épszéluek, vagy enyhén fogazottak, továbbá - a fiatal szárakhoz hasonlóan - szorösek. A virágok fehérek, a párta 1 cimpájú. A cimpák hosszúak, karomszeruen görbültek (1. ábra). A termés,5-1cm hosszú tüskékkel borított, szabálytalanul felnyíló, lelógó, gömb alakú toktermés. A magok barna színuek, vese alakúak, karunkulával nem rendelkeznek (1. ábra) [2]. Citológiailag a paliszád és szivacsos parenchima sejtrétegei között elhelyezkedo kristályok típusa diagnosztikai értéku, az orvosi maszlag kálcium oxalát rozettákat tartalmaz. Szövettanilag a 16

17 bikollaterális szállítónyalábok és a többsejtu nyelu, egysejtu fejjel rendelkezo mirigyszorök jellemzoek. Elofordulnak ún. Solanaceae mirigyszorök is, melyek 6-8 sejtu fejjel rendelkeznek. Az érszigetek szögletesek, a benyúló érágak V-alakban ágaznak el. A D. innoxiát leggyakrabban a D. metel var. metel-lel tévesztik össze, utóbbinak azonban fülkagyló formájú magja van, lila, vagy fehér színu karunkulával, pártája pedig 5 cimpájú. A D. metel levele továbbá 3 karéjú és majdnem kopasz [3]. 1. ábra A Datura innoxia Mill. virág (a): párta (b), csésze (c), termo- (d) és porzótáj (e), valamint mag (f), és termés (g) habitusképe [2]. 17

18 2. ábra Datura in noxia Mill. virágzó hajtás 2.3. Elofordulás A Solanaceae családba tartozó fajok foként trópusi-, szubtrópusi területeken honos növények, de egyes fajok a mérsékelt égövi területeken is megtalálhatók. A különbözo Datura fajok több kontinensen elofordulnak: Dél Ázsiában (D. metel), Kína mérsékelt övi területein (D. ferox), Amerika trópusi és szubtrópusi tájain, továbbá Ausztráliában (D. leichhardtii) is megtalálhatók. A Közép-Európában igen elterjedt D. stramonium amerikai eredetu, a XVI. században került Európába [4]. A D. innoxia megtalálható Mexikóban, Nyugat-Indiában, Dél-Amerikában, valamint egyéb szubtrópusi területeken. Termesztik Közép- és Dél-Amerikában, Észak-Afrikában, Indiában és Európában (pl. Nagy-Britannia) is [2]. Hazánkban szintén termesztheto, alsó három elágazásában általában beérleli termését [3] Tartalmi anyagok A Datura nemzetség valamennyi növényfajára a tropán alkaloidok elofordulása jellemzo néhány tized százaléktól néhány százalékig terjedo mennyiségben. Az alkaloid tartalom széles határok között, 52µg/g-tól 135 µg/g értékig változhat (friss súlyra vonatkoztatva). A nemzetség legtöbb növényfajában foalkaloidként hioszciamin, vagy szkopolamin, valamint nagyobb mennyiségben meteloidin található. A hioszciamin-szkopolamin arány fajonként eltéro [5,6]. Jelentos D. starmonium magjának aminosav és fehérje, hemagglutinin (lecitin), továbbá cserzoanyag tartalma, de a tropánvázas vegyületek mellett β-karbolin alkaloidok is találhatók bennük. A szteránvázas vegyületek közé sorolható vitanolidok elofordulását írták le D. ferox, D. innoxia, D. metel, D. quercifolia és D. stramonium fajokban (3. ábra) [2,6,7]. CH 3 CH 2 OH O H O O O CH 3 CH 3 H 3. ábra A D. metel-bol izolált daturilinol vitanolid szerkezeti képlete [2]. 18

19 I. táblázat A Datura quercifolia-ból izolált daturalaktonok szerkezete [2]. CH 3 O CH 3 R 1 H 3 C R 2 CH 3 O 24 CH 2 R 3 25 CH 2 daturalakton R 1 R 2 R OH -H -H -epoxi 2 =O -H -epoxi 3 -H -OH -H --- CH 3 O 4 -H -H -H -epoxi A D. quercifolia -ban több daturalaktont is azonosítottak (I. táblázat). A különbözo fajokra ezeken túl kumarinok (pl. szkopoletin), kaliszteginek, lektinek, flavonoidok, továbbá kávésav és származékainak elofordulása jellemzo [2]. Újabb kutatási eredmények tárták fel az ún. kaliszteginek jelenlétét, melyek pszeudotropinból vezethetok le. A hidroxil csoportok polárissá teszik a molekulákat, ezért a hagyományos apoláris kivonószerek nem távolítják el oket a vizes fázisból az extrakció tisztítási lépése során [8,9]. Eloször a Calystegia sepium (L.) géntranszformált gyökérkultúráiból sikerült izoláln i ezeket a vegyületeket, melyek polihidroxi származékok, nortropán alapvázzal (4. ábra). HN HN HN HO OH OH HO OH OH HO HO OH OH kalisztegin A 3 kalisztegin A 5 kalisztegin B 1 HN HO OH OH OH HN HO OH OH OH HN HO OH OH OH kalisztegin B 2 kaliszteginb kalisztegin B 3 4 HN HN HO HO OH OH OH H 2 N OH OH OH kalisztegin C 1 kalisztegin N 1 4. ábra Néhány jellemzo kalisztegin molekula szerkezete [11]. 19

20 Több típusukat különböztethetjük meg, így pl a trihidroxi származékok a kalisztegin-a csoportba, a tetrahidroxi származékok a kalisztegin-b csoportba, a pentahidroxi származékok pedig a kalisztegin- C csoportba sorolhatók (4. ábra) [1,11] A Datura innoxia Mill. tartalmi anyagai A D. innoxia Mill. és más Datura fajok - a szintén Solanaceae családba tartozó Atropa, Duboisia, Hyoscyamus és Scopolia fajokhoz hasonlóan - számos, gyógyászati és toxikológiai szempontból fontos tropánvázas alkaloidot tartalmaznak [1,12-14]. Az eddigi vizsgálatok során a D. innoxia-ban több mint 3 tropán- és pirrolidinvázas alkaloidot sikerült kimutatni és azonosítani (II. táblázat) [2,15]. A növény különbözo szervei általában,5%-,5% összalkaloidot tartalmaznak [6,16,17]. Legjelentosebbek az L-hioszciamin (racém elegye az atropin), és L-szkopolamin (hioszcin). A hioszciamin elnevezés a Hyoscyamus niger nevébol származik, melybol az elobb említett alkaloidokat II. táblázat A Datura innoxia Mill. tropán- és pirrolidinvázas alkaloidjai [15]. 2

21 eloször izolálták. Mindkét alkaloid megtalálható D- és L- formában, de csupán az L-konfigurációjú vegyületek a terápiásan aktívak. Racemizáció, atropin (D-L-hioszciamin) keletkezése foleg a növénybol történo izoláció során következik be. A hioszciaminnal szemben a szkopolamin jóval kisebb mértékben racemizálódik [1]. A növény különbözo részei eltéro alkaloid spektrummal rendelkeznek. A gyökér - mint az alkaloid bioszintézis helye - igen nagy számú tropán alkaloidot tartalmaz, de a pirrolidinvázas alkaloidok jelenléte is jellemzo (pl. higrin, kuszkohigrin) (II. táblázat). A hajtásra a szkopolamin, mint foalkaloid jelenléte, továbbá a hioszciamin és meteloidin elofordulása jellemzoek. A levelekben a hioszciamin és szkopolamin mellet nagy számú egyéb tropán észter és tiramin (biogén amin) található, mely utóbbi a virágok alkaloid kivonatának is egyik fo összetevoje (II. táblázat) [2,15]. A D. innoxia szöveteiben az alkaloidok kristályos formában raktározódhatnak, különbözo idioblasztokban. Izotópos és hisztokémiai vizsgálatok eredményei támasztják alá tropán alkaloidok 21

22 jelenlétét a mirigyszorökben is. Intercelluláris raktározás elsosorban a gyökér szöveteire jellemzo [3,6] A tropánvázas alkaloidok kémiai áttekintése A tropánvázas alkaloidok kémiai szerkezetük alapján észterek, melyek amino-alkohol részbol (pl. tropinból és szkopinból) (5. ábra) és észterifikáló alifás, vagy aromás savból állnak (6. ábra). Az aminoalkohol molekularész egy pirrolidin és egy piperidin gyurut tartalmaz, melyek N atomja és két C atomja közös [18]. A tropánváz acetát prekurzorból, továbbá a glutamin-prolin-ornitin ciklus egy tagjából alakul ki. Ma már közel 2 olyan alkaloidot ismerünk, melyek az említett biciklusos gyururendszert tartalmazzák [6,19]. Az aminoalkohol molekularész 3-as N CH 3 N CH 3 HN N CH 3 OH HO tropin OH pszeudotropin nortropin OH OH 6-hidrox i-tropin O N CH 3 HN O HO HO N CH 3 OH OH OH szkopin norszkopin teloidin 5. ábra Fontosabb tropanol alapvázak szénatomján rendszerint α-térállású hidroxil csoport található (β-oh pl. a pszeudotropinban). Több hidroxil csoport is lehet az alapvázon - pl. a 6-os és 7-es szénatomokon a teloidin esetén -, így a monoészter származékok mellett lehetoség van di- és triészterek kialakulására is. A szkopin molekulában a 6-7-es helyzetben epoxidáció történik (5. ábra) [2]. A tropánvázas alkaloidok túlnyomó többsége észter, melyek felépítésében a hidroxitropán/tropanol molekularész mellett számos karbonsav vehet részt. A savak egy része kizárólag a tropánvázas alkaloidok kialakításában vesz részt (pl. tropasav), mások viszont igen elterjedtek az élovilágban (pl. fahéjsav, benzoesav). Szerkezetüket tekintve elofordulnak aromás és alifás savak, továbbá dikarbonsavak is (6. ábra) [19]. 22

23 CH 3 HOOC CH CH 3 HOOC CH 2 CH 3 CH CH 3 HOOC H C C CH 3 CH 3 izovajsav izovaleriánsav tiglinsav COOH COOH CH CH COOH benzoesav OCH 3 OH vanillinsav fahéjsav HOOC CH CH CH CH COOH HOOC H C CH 2 OH HOOC C CH 2 truxillsav tropasav atropasav 6. ábra A leggyakrabban eloforduló észterifikáló savak 2.5. Felhasználás, terápiás hatások, toxikológia A tropánvázas alkaloidok a gyógyászatban legrégebben alkalmazott vegyületek közé tatroznak, így a különbözo Datura fajokat is több földrész népi gyógyászatában alkalmazták. Az oshonos területeken foleg a bennszülött törzsek orvos-varázslói alkalmazták oket, mivel hatóanyagaik mérgek, továbbá narkotikus és hallucinogén hatásúak. A központi idegrendszerre hatva transzszeru állapotot idéznek elo [4,6,21,22]. N CH 3 N CH 3 O O O O C CH O C CH CH 2 OH CH 2 OH hioszciamin szkopolamin 7. ábra A hioszciamin és szkopolamin szerkezeti képlete A hioszciamin (atropin) és szkopolamin (7. ábra) befolyásolják a paraszimpatikus idegrendszer muködését. Az acetilkolin és más muszkarin agonisták ko mpetitív antagonistái a posztganglionáris 23

24 kolinerg rostokkal beidegzett szervekben. Paraszimpatolitikus hatásaik miatt - spazmolitikus, nyál és gyomornedv szekréciót csökkento, midriatikus hatás - szélesköruen alkalmazzák oket a szemészetben, továbbá szívbetegségekben és gyomor-, bélrendszeri panaszok esetén [3,23]. Kolinészteráz gátló vegyületekkel történt mérgezés esetén antidótumként használhatók. Perifériás antikolinerg hatásaik mellett a központi idegrendszer muködésére is hatással vannak. Az atropin és szkopolamin lényegében azonos perifériás hatásaival szemben a központi idegrendszer muködését ellentétesen befolyásolják. Az atropin izgató hatású, a szkopolamin viszont bódulatot okoz, mivel az agyban gátolja a kéreg alatti magvak muködését. Ezen alapul utóbbi alkaloid felhasználása anesztetikumként. A Parkinson kór tüneteinek enyhítésére is jól alkalmazhatók, továbbá a szkopolamin tartalmú készítményeket a tengeribetegség kialakulásának megelozésére is felhasználják [3,6,1]. A tropán alkaloid tartalmú növényi mérgezések fo tünetei a vizuális hallucinációk jelentkezése, midriázis, tachicardia, végül az agykérgi muködések gátlása (letargia, kóma). Antidótumként kolinészteráz gátlók (pl. fizosztigmin) adása, továbbá hánytatók (pl. emetin) alkalmazása, a felszívódás gátlása (aktív szén) és a gyomor-bélperisztaltika serkentése (Mg-citrát) jöhet szóba [21]. A kaliszteginek - melyek nortropán alapvázzal rendelkezo polihidroxilezett alkaloidok más polihidroxi alkaloidokhoz hasonlóan számos glikozidáz enzim kompetitív inhibitorai. Hatásuk alapja feltehetoen a szénhidrátokhoz látszólag hasonló kémiai szerkezet. A glikozidázoknak több alapveto élettani folyamatban van szerepük, így pl. az emésztésben, a glikoproteinek bioszintézisében és a glikokonjugátumok lizoszómális lebontásában. Glikozidáz inhibitorok - mint potenciális gyógyszerkészítmények - antidiabetikus, antivirális, antimetasztatikus és immunomoduláns hatásaik révén kerülhetnek felhasználásra [24-26]. Kalisztegin tartalmú növények takarmányként történt felhasználásakor degeneratív idegrendszeri elváltozásokat figyeltek meg szarvasmarhákban. Újabb vizsgálatok kimutatták számos kalisztegin (kalisztegin A 1, B 1, B 2 és C 1 ) jelenlétét több gyümölcsben és zöldségben (pl. burgonya, édesburgonya, paradicsom, stb.), így nagy mennyiségek fogyasztása esetén felmerülhet a humán intoxikáció lehetosége is [27,28 ] A tropánvázas alkaloidok és rokon vegyületek bioszintézise A tropán alkaloid bioszintézis lépéseinek feltárása már az 195-es évek óta folyik, amikor is az izotópok alkalmazása új lehetoségeket adott a kutatók számára [29,3]. A különbözo in vitro sejt és szövetkultúrák felhasználása szintén nagy elorelépést hozott. A részletes vizsgálatok - így pl. a bioszintézis sztereokémiai sajátságainak alapos tanulmányozása - ellenére azonban a folyamat és a benne résztvevo enzimek még napjainkban sem ismertek teljes részletességgel [1,31]. 24

25 Romeike úttöro munkáját követoen [23,32,33] vált elfogadottá, hogy a hioszciamin bioszintézise a növények gyökereiben történik. Az alkaloidok bioszintézisével, egymásba történo átalakulásával kapcsolatban azonban figyelembe kell venni a transzlokáció, akkumuláció szerepét is [5,12]. Korábban elvégzett vizsgálatok eredményei azt mutatták ki, hogy a hioszciamin tartalom a gyökerek felol a föld feletti részek, levelek felé haladva jelentosen csökken ugyanakkor a szkopolamin aránya egyre no. A gyökerek hioszciamin - szkopolamin aránya 5% körüli, míg a levelekben ez alig éri el a 1%-ot a hioszciaminra nézve. Ezek az eredmények megerosítik a hioszciamin transzport közbeni átalakulását szkopolaminná [12]. Az alkaloidok amino-alkohol molekularészének bioszintézise ornitin, arginin és putreszcin prekurzorokból egyaránt levezetheto [18,34,35]. A putreszcinnek központi szerepe van a bioszintézis kezdeti fázisában, mivel ornitinbol, vagy argininbol kiindulva egyaránt ezen a molekulán keresztül megy végbe a metabolizmus (8. ábra). A tropánvázas alkaloidok bioszintézisének kezdeti szakasza ugyanakkor szoros kapcsolatban áll a poliaminok, a pir idin- és pirrolidinvázas alkaloidok bioszintézisével (8. ábra). A putreszcin a spermidin és spermin poliaminok prekurzora, melyek befolyásolhatják a tropán alkaloid bioszintézist is [36]. A poliaminok kialakításában a prekurzor vegyületen túl a SAM molekula is alapveto szerepet játszik. A putreszcin, spermidin és spermin a legtöbb növényi szövetben megtalálható. Alapveto szerepet töltenek be a sejtosztódásban, a morfogenezisben, az öregedésben a növény növekedése, fejlodése során, valamint lényeges szerepük van a különbözo stresszhatások leküzdésében [35,37]. 25

26 ornitin ODC arginin agmatin ADC N-karbamoilputreszcin putreszcin spe rmidin PMT N-metilputreszcin spe rmin MPO N-metilpirrolinium só piridin- és pirrolidinvázas alkaloidok (pl. nikotin, kuszkohigrin) higrin tropin TR I tropinon TR II pszeudotropin hioszciamin H6H más észterek kaliszteginek sz kopola min 8. ábra A tropánvázas alkaloidok és rokon vegyületek bioszintézisének feltételezett mechanizmusa és kapcsolata [39,4]. (ADC: arginin dekarboxiláz, ODC: ornitin dekarboxiláz, PMT: putreszcin-nmetiltranszferáz, MPO: N-metilputreszcin oxidáz, TR I és II: tropinon reduktáz I és II, H6H: hioszciamin 6β-hidroxiláz) A tropán alkaloid bioszintézisben résztvevo fontosabb enzimek Az ornitin és arginin dekarboxilázok Az ornitin ornitin-dekarboxiláz (ODC) hatására putreszcinné alakul. Az ornitin beépülése során az aminosav α-c atomjából alakul ki a tropán váz egyes számú C atomja. Az elso prekurzor valószínuleg az α-keto-δ-amino valeriánsav, mely az ornitinbol oxidatív deaminálás során alakulhat ki, az α-keto-δ valeriánsav pedig spontán módon 1 -prolin-2-karbosavvá alakul. A putreszcin az ornitinhez hasonló arányban épülhet az alapvázba (közel 5%), ami azt jelenti, hogy a tropint szintetizáló enzimrendszer nem specifikus, vagyis nem tesz különbséget az ornitin és 26

27 putreszcin között. Mivel a metil-putreszcin beépülése igen jelentos, a metilezés feltehetoen a ciklizációt megelozoen következik be [38]. Izotópos vizsgálatokkal igazolták, hogy H. albus gyökérkultúrákban a tropanol váz pirrolidin gyuruje ornitinbol, vagy agmatinon keresztül argininbol alakulhat ki [41]. A. belladonna és D. stramonium hairy root kultúrák alkalmazásával megerosítették az L-arginin prekurzor funkcióját, ugyanakkor a korábban intermedier vegyületnek tartott δ-n-metilornitin szerepét sikerült kizárni [19]. NH H 2 N N arginin H NH 2 COOH H 2 N ornitin NH 2 COOH H 2 N ADC NH N agmatin NH 2 ODC O H 2 N putresz cin NH 2 NH 2 H 2 N N N-karbamoilputreszcin 9. ábra A putreszcin bioszintézise az ornitin és arginin aminosavakból [1]. Az ODC az ornitin-putreszcin átalakulás folyamatát katalizálja, az arginin dekarboxiláz (ADC) pedig az agmatin N-karbamoilputreszcinen át történo kialakulását szabályozza argininbol kiindulva (9. ábra). A két enzim aktivitása eltéro lehet, így pl. H. albus gyökérkultúrákban az ADC aktivitás több mint kétszerese volt az ODC aktivitásának [41]. Az ADC csupán baktériumokban és növényekben fordul elo, az ODC viszont minden élolényben megtalálható, fontos szerepe van a sejtproliferációs folyamatokban és elengedhetetlenül szükséges a sejtek normális fejlodéséhez Putreszcin-N-metiltranszferáz Az ornitintol N-metilpirrolinium kation kialakulásához vezeto folyamat (mely a tropánvázas és piridinvázas alkaloidok bioszintézisének közös szakasza) legfontosabb intermedierjei a putreszcin és az N-metilputreszcin (1. ábra). A putreszcin ugyanakkor a poliamin bioszintézis (pl. spermin és spermidin) prekurzor vegyülete is. A putreszcin-n-metiltranszferáz enzim (PMT) a putreszcin N- metilputreszcin átalakulást katalizálja, mely a tropán alkaloidok bioszintézisének elso specifikus lépése [42]. Az enzim - melyet A. belladonna, D. stramonium, H. albus és N. tabacum szöveteibol is 27

28 sikerült izolálni az SAM metil csoportjának a putreszcin egyik amino csoportjára történo transzportját katalizálja [42-45]. A PMT a tropán- és piperidinvázas alkaloidok kialakulásának kulcsfontosságú enzimjének tunik, mivel muködésének következtében válik el egymástól eloször az említett alkaloidok és a poliaminok bioszintézise. H 2 N putreszcin NH 2 PMT poliaminok H 3 C N NH 2 N-metilputreszcin 1. ábra Az N-metilputreszcin képzodése putreszcinbol [1] N-metilputreszcin oxidáz Egybehangzó kísérleti eredmények támasztják alá, hogy az N-metil- 1 -pirrolinium só a tropánváz bioszintézisének prekurzora, mely N-metilputreszcinbol keletkezik 4-metilaminobutanal intermedieren keresztül [19]. A reakciót egy diamin oxidáz enzim, az N-metilputreszcin oxidáz (MPO) katalizálja (11. ábra). A diamin oxidázok széles körben elterjedtek az élovilágban, számos növény- és állatfajból sikerült oket izolálni. Az enzimet D. starmonium hairy root kultúrákban is sikerült kimutatni [4]. A korábbi eredmények arra utaltak, hogy a tropánváz kialakulása során az N-metil- 1 -pirrolinium kation és acetoacetil-co-a kondenzációja, majd dekarboxilezodése történik, higrinen keresztül, mely végül dehidrohigrinen átalakul tropinonná (12. ábra) [19,3]. D. innoxia -val végzett vizsgálatok ezzel CH 3 H 3 C N NH 2 MPO H 3 C N CHO N + N-metilputreszcin 4-metilaminobutanal N-metilpirrolinium kation 11. ábra N-metilpirrolinium kation képzodése N-metilputreszcinbol [1]. szemben azt mutatták, hogy az izotóppal jelzett higrin nem épül be a tropánvázba. Az eredmények alapján sokkal valószínubbnek tunik, hogy a tropinon 2-karboxitropinon intermedieren keresztül alakul ki dekarboxilezodést követoen (12. ábra ) [46,47]. A folyamatot katalizáló enzimet eddig nem 28

29 sikerült azonosítani, de az sem zárható ki, hogy az átalakulás enzim közremuködése nélkül zajlik le [48]. H 3 C CH 3 CH 3 N+ COOH O N H 3 C H 3 C N + higrin O N N-metilpirrolinium kation CH 3 N + O COOH H 3 C N COOH tropinon O 2-karboxitropinon 12. ábra A tropinon kialakulása N-metilpirrolinium kationból [1]. O Tropinon reduktázok A tropin tropán alkaloid bioszintézisben betöltött intermedier szerepét már 1972-ben igazolták [49], ezzel szemben a tropinon pontos funkcióját sokáig nem sikerült tisztázni. Csupán 199-ben, intakt D. innoxia növényekkel végzett vizsgálatok során mutatták ki eloször az izotóppal jelzett [N-metil- 14 C]tropinon beépülését különbözo tropán észterekbe [5]. Koelen és Gross D. stramonium gyökerének sejtmentes kivonatát használva megállapították, hogy a tropinon redukcióját követoen tropin keletkezik [51]. Enzimkivonatokkal végzett további vizsgálatok tárták fel a tropinon tropinná és pszeudotropinná történo enzim katalizálta redukcióját [52]. A redukciót két különálló, sztereospecifikus enzim végzi, melyek közül a tropinon reduktáz I (TR I) a tropinont tropinná, a tropinon reduktáz II (TR II) pedig a tropinont pszeudotropinná alakítja (13. ábra) [6,35,53,54]. Az enzimek szerkezetének feltárása alapján megállapították, hogy a tropinon reduktázok a rövid láncú 29

30 H 3 C N H 3 C N TR-I tropin HO tropan ' alkaloidok tropinon O TR-II H 3 C N N OH HO HO OH pszeudotropin kalisztegin A ábra A tropánvázas alkaloidok és kaliszteginek képzodése tropinonból [1]. dehidrogenázok/reduktázok családjába tartoznak és muködésükhöz redukált nikotinsavamiddinukleotid-foszfát (NADPH) kofaktorra van szükég [55]. Egyes eredmények azt mutatják, hogy a TR I által katalizált folyamat nem sebesség meghatározó lépés a tropán alkaloidok bioszintézise során, így a TR I aktivitás növelése, vagy a TR II aktivitás csökkentése géntranszformációs módszerek alkalmazásával várhatóan nem emeli jelentos mértékben a hioszciamin és szkopolamin produkcióját [53]. A TR II pontos funkciója sokáig nem volt pontosan ismert. Több Solanaceae fajban is jelentos TR II aktivitást mértek, holott a pszeudotropinból levezetheto észterek az akkumulálódott alkaloidok csupán igen kis részét adták. A polihidroxi nortropán vegyületek (kaliszteginek) megismerése kínált megoldást a problémára, mivel a pszeudotropin metabolizmus fo iránya ezen vegyületek felé mutat [1]. A TR I és TR II enzimek funkcióit összegezve elmondható, hogy tropinon redukciója a tropán alkaloid bioszintézis igen fontos lépése, mivel a tropin felhalmozódása tropán alkaloidok, a pszeudotropin képzodése pedig kaliszteginek kialakulását eredményezi Acil transzferázok A tropán alkaloidokat tartalmazó növények számos alifás és aromás savval észterezett tropin, ill. pszeudortopin származékot termelhetnek, melyek kialakítását különbözo acil transzferáz (észteráz) enzimek végzik. Kimutatták, hogy az A. belladonna, D. stramonium, D. tatula, D. innoxia, Hyoscyamus niger, Scopolia japonica gyökereiben mért atropin észteráz aktivitás az egyedfejlodés minden szakaszában jelentos volt [56]. A hioszciamin és szkopolamin aromás savi összetevoje az (S)-(-)-tropasav, melyet hosszú idon át a hioszciamin bioszintézis egyik intermedier vegyületének tartották, biokémiai vizsgálatokkal azonban igazolták, hogy ez a sav nem épül be az alkaloidba (14. ábra) [57]. Izotóppal jelzett fenil[1,3-3

31 13 C 2 ]tejsav adagolását követoen a D. stramonium szöveteibol izolált hioszciamin és szkopolamin 13 C- NMR vizsgálatának eredményei a fenillaktát észterifikációt követo, intramolekuláris átrendezodését jelezték [58]. Chesters és munkatársai (59) D. stramonium gyökérkultúrákat alkalmazva megerosítették a fenil tejsav beépülését, melyet a feleslegben adagolt tropasav csupán kis mértékben befolyásolt. Ezen eredmények alapján feltételezheto, hogy a hioszciamin prekurzora a littorin, mely a tropin (R)-(+)-feniltejsavas észtere (14. ábra). Ennek igazolására izotópokkal többszörösen jelzett littorin molekulákat adagoltak D. stramonium gyökérkultúrákhoz, melyek végül változatlan formában épültek be a tropánvázas alkaloidokba [1,6]. Az alkaloid képzodés ezen szakaszának felülvizsgálata alapján a bioszintézis aktivált feniltejsav (fenillaktoil-coa) és a tropin kapcsolódásával kialakuló littorin molekulán keresztül zajlik, melynek intramolekuláris átrendezodésével kialakulhat a hioszciamin (14. ábra). H 3 C N NH 2 HO tropin HO O fenilalanin H 3 C N HO O O fenilpiroszõlõsav H 3 C N O littorin O H OH HO O H OH feniltejsav H CH 2 OH O H CH 2 OH HO O hios zciamin O tropasav 14. ábra A littorin és hioszciamin képzodése a tropin feniltejsavval történt észterezodése után [1] Hioszciamin 6β-hidroxiláz A szkopolamin - mely a hioszciamin 6,7β-epoxid származéka hioszciaminból képzodik 6βhidroxihioszciaminon keresztül (15. ábra). A hioszciamin 6β-hidroxiláz (H6H) 2-oxoglutarát függo dioxigenáz enzim, melynek muködéséhez az alkaloid szubsztrát mellett 2-oxoglutarátra, Fe 2+ ionokra és aszkorbinsavra is szükség van [1]. Az enzimet tisztított formában H. niger gyökérkultúrákból 31

32 állították elo. A H6H nagy mennyiségben a gyökerek periciklusában található meg, a földfeletti szervekbol azonban nem sikerült kimutatniuk [16]. A hioszciamin hidroxilációját követoen 6β-hidroxihioszciamin képzodik, mely a 7β-H kilépésével epoxidálódik szkopolaminná. A hidroxiláció és epoxidáció folyamatát egyaránt a H6H enzim katalizálja, mely a 6,7-dehidrohioszciamint szintén szkopolaminná alakítja, a vegyület esetleges CH 3 N O H6H HO N CH 3 O H6H O CH 3 N O O C CH O C CH O C CH CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH hioszciamin 6-hidroxi-hioszciamin szkopolamin 15. ábra A szkopolamin bioszintézise [1] intermedier szerepét azonban kísérletesen kizárták [6]. Az epoxidáció már a D. innoxia gyökerében elkezdodhet, azonban a szárban fejezodik be. Kimutatták, hogy a H6H hidroxiláz aktivitása 4-szer nagyobb, mint az epoxidáz aktivitás. Ennek ellenére a szkopolamin termelo növényekben nem halmozódik fel nagyobb mennyiségben 6β-hidroxihioszciamin [61,62] Tropánvázas alkaloidok kvalitatív és kvantitatív vizsgálata A növényekben, sejt- és szövettenyészetekben eloforduló tropánvázas alkaloidok viszonylag kis mennyisége és változatossága számos, egyre érzékenyebb és szelektívebb kvalitatív és kvantitatív analitikai módszer kidolgozását eredményezte. Ezek - többek között - titrimetriás [63], denzitometriás [64], spektrofotometriás [65-67], tömegspektroszkópiával kombinált gázkromatográfiás, gáz-folyadék kromatográfiás (GC, GC-MS, GLC és GLC-MS) [5,68-72], nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás (HPLC) [73-79], és kappillár elektroforézissel végzett módszerek [8-82]. Hiltunen és munkatársai [83] mágneses magrezonancia spektroszkópiás (NMR) módszert dolgoztak ki atropin és hioszciamin kvantitatív meghatározására Atropa belladonna, Hyoscyamus niger, és Datura stramonium leveleibol. Más szerzok szabadföldön termesztett D. metel hioszciamin és szkopolamin tartalmát [84], vagy D. stramonium és A. belladonna hairy root kultúráinak poliamin - és alkaloid metabolizmusát tanulmányozták NMR technika alkalmazásával [85,86]. Több szerzo alkalmazott immunbiológiai módszert ( radioimmunoassay, RIA, enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) kis alkaloidmennyiség szelektív és pontos meghatározására [74-76,87-92]. Monoklonális antitestek segítségével a hioszciamin és szkopolamin kimutatása és tartalmi meghatározása gyorsabbá teheto, továbbá pikogramm mennyiségu alkaloid is kimutatható [74]. 32

33 Alkaloidtartalom meghatározása denzitometriás módszerrel Dorosiev és munkatársai [93] a szkopolamin növényi mintákból történo meghatározására dolgoztak ki denzitometriás módszert, melynek segítségével a nyers kivonat alkalmazásával is jó elválasztás érheto el. Az elohíváshoz p-dimetilamino-benzaldehid tartalmú oldatot használtak, melynek érzékenysége (,1 µg szkopolaminra,,5 µg atropinra) meghaladta a Dragendorff reagensét (KBiI 4,,5 µg szkopolaminra, 1, µg atropinra). A p-dimetilamino-benzaldehid tartalmú elohívó oldat alacsony H 2 SO 4 tartalma következtében (1ml-ben: 1,g p-dimetilaminobenzaldehid és 5,ml 98,% -os H 2 SO 4 ) a réteglapok háttere csaknem fehér marad az elohívást követoen. A D. innoxia és D. stramonium alkaloid tartalmának denzitometriás és HPLC módszerrel végzett meghatározását összehasonlítva azt találták, hogy a kapott értékek nem térnek el jelentosen egymástól. Az eredmények azt mutatták, hogy a denzitometria jól alkalmazható a minták alkaloid tartalmának gyors meghatározására. A réteglapok elohívása szintén p-dimetilamino-benzaldehid tartalmú reagenssel történt (2 mg oldva 4 ml CH 3 OH - 8N H 2 SO 4, 1:1 v/v, λ=495nm) [64]. Nagyszámú D. stramonium hairy root klón szkopolamin és hioszciamin tartalmának meghatározásakor alkalmaztak Dragendorff reagenst. A kifejleszto rendszer CHCl 3 -(CH 3 ) 2 CO- CH 3 OH-NH 4 OH (28,4%) (75:1:15:2 v/v/v/v) volt, a kiértékelés pedig λ=515nm en történt [94] Gáz-folyadékkromatográfiás technikák A tropánvázas alkaloidok növényi mintákból történo kimutatására korábban több szerzo alkalmazott gázkromatográfiás módszert, melyek segítségével nagy számú alkaloid kimutatására és azonosítására nyílt lehetoség növényi mintákból. Robins és munkatársai [95] több mint 3 tropánvázas alkaloidot azonosítottak D. candida x D. aurea hibridbol eloállított hairy root klónokban vékonyrétegkromatográfiás elválasztást követoen GC/MS módszerrel. A mérési eredmények alapjá n megállapították, hogy a szkopolamin és hioszciamin (aposzármazékaikkal együtt) az összalkaloid tartalom mintegy kétharmadát adják. Tömegspektroszkópiás detektálással kombinált gáz-folyadék kromatográfiás módszer (GLC-MS) segítségével részletesen vizsgálták a D. innoxia növény alkaloid spektrumát. A növényi minták kivonása több módszerrel: 2M HCl-al, CH 3 OH -25% NH 4 OH eleggyel (9:1 v/v) vagy CH 3 OH - trietilamin eleggyel (9:1 v/v) történt. A szerzoknek nem sikerült a gyökerek kivonatában littorint kimutatni, más alkaloidokat viszont a rendelkezésre álló tömegspektrumok alapján gyorsan és hatékonyan lehetett azonosítani, az észterek savi kompone nseinek azonosításához pedig a retenciós adatok nyújtottak segítséget (pl. 3α-n-butiriloxitropán és 3α-izobutiriloxitropán azonosítása). A 33

34 kimutatott apoatropin és aposzkopoalmin a szerzok feltételezése szerint csupán a folyamat során keletkezo mutermék [15] Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszerek A HPLC technika fejlodésével lehetoség nyílt nagy számú, kis mennyiségu minta (pl. gyógyszerkészítmények és növényi kivonatok) gyors, rutinszeru ellenorzésére. A növényi mintákból készült kivonatok összetettsége azonban még napjainkban is nehézségeket okoz a megfelelo elválasztás elérésében, amit a különbözo módszerek változatossága is jelez [8]. A minták kivonására leggyakrabban más oldószerekkel kombinált CH 3 OH-NH 4 OH elegyet alkalmaznak. A kiértékelése széles hullámhossz tartományon belül történhet (λ=2nm-28nm), a legtöbbször λ=21nm-en végzik. A III/A-C táblázat néhány, ma már klasszikusnak tekintheto és több, korszerubb mérési eljárás fobb jellemzoit foglalja össze. 34

35 2.8. In vitro tenyészetek alkalmazása az univerzális és speciális anyagcsere vizsgálatára A kallusztenyészetekrol általában A kallusz kultúra homogén, parenchimatikus sejtek halmaza, mely egyaránt kialakítható nem differenciált és differenciált növényi szövetekbol. Ezen tenyészeteknél általában az a cél, hogy ne alakuljon ki szöveti differenciálódás, illetve ne induljon meg organizáció. Kalluszosodás létrejöhet spontán módon, de kiváltható növényi hormon(ok) adagolásával is. Figyelembe kell venni azonban, hogy a kalluszkultúrák fenntartásához legtöbbször elengedhetetlen exogén hormonadagolás következtében a tenyészetek genetikai stabilitása és ennek következtében pl. alkaloid produkciója általában csökken [18]. A Solanaceae családba tartozó fajok, így a Datura nemzetség növényeibol eloállított, de-differenciálódott sejtekbol álló kallusz kultúrák tropán alkaloid tartalma is a legtöbb esetben jóval alacsonyabb, mint a kiindulási növényé [65,19] Datura innoxia Mill. kalluszszövetek növekedése és tropán alkaloid produkciója D. innoxia kallusz szöveteit vizsgálva, Dung és munkatársai [11] megállapították, hogy a tenyészetek növekedése szempontjából az MS [111] tápközeg 1 mg/l kinetin és 1 mg/l 2,4- diklórfenoxi ecetsav (2,4-D) tartalma a legmegfelelobb. A kultúrák biomassza produkciója általában a 6. hétre érte el a legmagasabb értéket, ezt követoen a növekedés lassult, majd teljesen megállt. A gyökér eredetu kallusz fényen lassabban, míg a levél eredetu gyorsabban növekedett. A tenyészetek összalkaloid tartalma az átoltást követo 2. hétig emelkedett (gyökér eredetu kalluszban,125%, szárazsúlyra vonatkoztatva), majd a szövetek intenzív növekedésének beindulásával jelentosen csökkent. Ismételt emelkedés csak a növekedés stacionárius szakaszának elérése után (4-6. hét) volt mérheto. A megvilágítás a tenyészetek növekedéshez hasonlóan hatással volt a tropán alkaloid produkcióra is. Mind a gyökér, mind pedig a levél eredetu kultúrák alkaloid tartalma közel duplájára nott (gyökér eredetu kalluszban,259%, szárazsúlyra vonatkoztatva). Ez az érték tovább emelkedett a táptalaj 2,4-D tartalmának 5 mg/l-re emelésével, és így elérte, ill. meghaladta az intakt szervek alkaloid tartalmát [66]. Palazón és munkatársai [19] D. stramonium hairy root klón és a belole eloállított, géntranszformált kalluszszövet növekedését és alkaloid produkcióját hasonlították össze. A gyökértenyészeteket folyékony MS táptalajon, a kalluszszöveteket pedig 1,µM kinetint és különbözo mennyiségu 2,4-D t (,1µM,,5µM és 1,µM) tartalmazó szilárd MS tápközegen tartották fenn. A transzformált gyökerek növekedése meghaladta a kalluszszövetek növekedését. 1,µM 2,4-D alkalmazása növelte a kallusztenyészetek biomassza produkcióját, de gátolta a gyökérképzodést. A hairy root szövetek 35

36 hioszc iamin produkciója magasabb volt a transzformált kalluszokban mért értékeknél, utóbbiakban a differenciálódás mértékével, a gyökérképzodéssel arányosan nott a hioszciamin mennyisége. Szkopolamint csak a kalluszszövetek tartalmaztak kimutatható mennyiségben, a csökkeno 2,4-D koncentrációval arányosan egyre többet. A 2,4-D és a kalluszszövetek alkaloid tartalma közötti kapcsolat nem az auxin alkaloid bioszintézisre gyakorolt direkt hatásának eredménye, hanem sokkal inkább az intracelluláris hormonegyensúlyra kifejtett hatása. A magasabb 2,4-D koncentráció (1,µM) elosegítette a növekedést, ezzel gátolva a hioszciamin szintézist, az alacsony 2,4-D szint (,1µM) viszont elosegítette a kultúrák differenciálódását, ezáltal gyakorolva jótékony hatást az alkaloid szintézisre. Az alacsony 2,4-D koncentráció mellett, a kallusztenyészetekben mért szkopolamin tartalom nagy valószínuséggel a képzodo gyökerekben szintetizálódó hioszciamin transzportjából és kalluszsejtekben történt átalakításából származik. Összefoglalva elmondható tehát, hogy a kallusz tenyészetek növekedése és alkaloid produkciója csak kivételes esetekben, pl. a tápközeg hormontartalmának optimalizálását követoen éri el a hairy root kultúrákban mért értékeket. A kívülrol adagolt hormonok azonban csökkenthetik a differenciálódás mértékét, a sejtek genetikai stabilitását és így a tropánvázas alkaloidok bioszintézisét is A hairy root kultúrákról általában Az utóbbi néhány évtizedben egyre több kutatócsoport kísérli meg más speciális anyagcseretermékekhez hasonlóan a tropán alkaloidok eloállítását különbözo növényi sejt - és szövetkultúrák segítségével. A különbözo kallusz- és sejtszuszpenziós kultúrákkal nem sikerült jelentos és hosszabb távon is stabil szintu hatóanyag produkciót elérni [112]. Mivel a tropán alkaloidok bioszintézise szempontjából a gyökerek alapveto fontosságúak, ezért értheto, hogy a gyökértenyészetekben magasabb alkaloid szintek érhetok el [62]. Számos vizsgálati eredmény jelzi továbbá, hogy a speciális metabolitok szintézise és a kultúrák organizációs szintje között szoros kapcsolat van [ ]. A tropán alkaloidok eloállításánál további nehézséget okozhat, hogy különösen a lassabban növekvo gyökérkultúrák alkaloid szintje a magasabb. A virulens Agrobacterium rhizogenes törzsekkel végzett fertozést követoen létrehozott hairy root kultúrák nagy mennyiségben tartalmazzák a kiindulási növényre jellemzo speciális anyagcseretermékeket. A transzformált gyökérkultúrák a sejtszuszpenziós tenyészetekhez hasonlóan - gyorsan növekednek in vitro, ugyanakkor genetikailag és biokémiailag stabilak [114,116]. A hairy root-ok hormonmentes táptalajon tenyészthetok, mivel a növényi genomba épült Ri T-DNS szabályozza az endogén hormontermelést. 36

37 GÉNTRANSZFORMÁCIÓ AGROBACTERIUM VEKTOR RENDSZEREK ALKALMAZÁSÁVAL Az Agrobacterium, mint természetes vektor rendszer ma már széles körben elterjedt és alkalmazott. A Rhizobiaceae családba tartozó Gram-negatív A. tumefaciens és A. rhizogenes talajbaktériumok a fogékony növényeket (általában kétsziku, de egysziku fajokat is) a sebzési helyeken fertozve ún. gyökérnyakgolyva ill. járulékos gyökér (hairy root) képzodést indukálnak [117-12]. A fertozés során, az Agrobacterium felismeri a sérült növényi szövetek által kibocsátott szignál molekulákat és a sérült sejtekhez kapcsolódik (kemotaktikus válasz). A transzformált növényi szövetek baktériummentesítést követoen - in vitro hormonmentes táptalajon korlátlan növekedésre képesek és a talajbaktériumokra jellemzo speciális anyagcseretermékeket (ún. opinokat) termelnek. A gyökérnyakgolyvát és hairy root-okat alkotó növényi sejteket két alapveto sajátság különbözteti meg a növény egyéb sejtjeitol: - in vitro körülmények között kívülrol adagolt növényi hormonok nélkül fenntarthatók, - a talajbaktériumokra jellemzo speciális anyagcseretermékeket állítanak elo és választanak ki, melyeket összefoglaló néven opinoknak nevezünk. Ezekért a sajátságokért a növényi sejtekben jelenlévo bakteriális DNS szakasz, az ún. transzfer-dns (T-DNS) felelos. A génátviteli mechanizmus során a bakteriális plazmid (A. tumefaciens: Ti-plazmid, A. rhizogenes: Ri-plazmid) részét képezo transzfer vagy T-DNS átkerül a növényi sejtbe és stabilan integrálódik a sejtmag DNS-be [121]. A T-DNS a baktérium plazmidjának meghatározott szakasza, mely számos olyan gént tartalmaz, melyek a transzformált növényi sejtekben expresszálódnak. Ezek egy része ún. onc gén, melyek a növényi hormonok szintéziséért felelos enzimeket kódolnak, vagy az opinszintézis irányításában vesznek részt. A Ri plazmid T-DNS ének ún. rol génjei a gyökérképzodésért, valamint az opinok szintéziséért felelosek [122]. A Ti- és Ri-plazmidok T-DNS átvitelével kapcsolatos alapveto tulajdonságai megegyeznek. A fertozés után létrejövo gyökérnyakgolyva és hairy root szövetek sajátságai azonban alapvetoen eltérnek egymástól. A géntranszformált gyökérszövetekbol viszonylag könnyen teljes növény regenerálható, mely intakt T-DNS-sel rendelkezik. A vad típusú A. tumefaciens törzsekkel eloállított gyökérnyakgolyva szöveteibol ezzel szemben igen nehezen hozható létre teljes növény, melynek T- DNS állománya általában át is rendezodik [123]. Meg kell jegyezni, hogy a különbözo A. rhizogenes törzsek virulenciája eltéro, a különbözo baktérium törzsekkel eloállított hairy root-ok pedig eltéro hatóanyag tartalommal és morfológiával rendelkezhetnek [124]. 37

38 - A DNS transzferben résztvevo virulencia gének és fehérjék szerepe IV. TÁBLÁZAT NÉHÁNY, A VIR GÉNEK INDUKCIÓJÁBAN SZEREPET JÁTSZÓ FENOLOS VEGYÜLET SZERKEZETE ÉS INDUKCIÓS HATÁSÁNAK RELATÍV EROSSÉGE [122]. R 1 H 3 CO OCH 3 OH R 1 vegyület vir gén indukciós hatás C O CH 3 ac etosz iringon CH CH C O OH szinapinsav ++++ C O H sziringaldehid +++ C O OH s ziringins av ++ A T-DNS átvitelt a bakteriális kromoszómán lévo chv gének és a Ri-plazmid vir génjei szabályozzák. Utóbbiak a plazmid virulencia régiójában helyezkednek el, a T-DNS szomszédságában. A vir gének csak speciális, fenolos vegyületek megjelenésekor (pl. acetosziringon) lépnek muködésbe, melyek nagy mennyiségben képzodnek a növényi szövetek sérülését követoen (IV. tálázat) [12,125]. A vir gének muködéséhez ezen túlmenoen alacsony ph (ph 5-6) és 29 o C alatti homérséklet is szükséges. A vir gének regulációjában a VirA és VirG fehérjék vesznek részt, melyek közül a VirA kemoreceprtorként muködik a fenolos vegyületek megjelenésekor, a VirG pedig miután a VirA aktiválja - beindítja a transzkripciót. A T-DNS szakasz növényi sejtbe jutásáért a VirB és VirD fehérjék felelosek (pl. a VirD2 fehérje segíti elo a T-DNS sejtmagba jutását), a VirE fehérje pedig megvédi a DNS szakaszt a növényi sejtben található nukleázok hatásától. A megfertozött növényi sejtbe nem csak az elobb említett nukleoprotein komplex jut be, hane pl. a VirF fehérje is, mely az elobbitol függetlenül transzportálódik és a hatékony transzformációt segíti elo [122]. - A T-DNS szakasz beépülése és expressziója A T-DNS véletlenszeruen, rendellenes rekombináció útján épül be a növényi génállományba, melynek során a legtöbbször törlodnek az adott növényi lókusz kisebb szakaszai. Az adott T-DNS egyetlen másolata, de akár egy, vagy több lókuszon több másolata is beépülhet a növényi sejtmagba 38

39 [122]. Az A. rhizogenes Ri-plazmidjában lévo T-DNS felosztható bal T-DNS-szakaszra (T L -DNS) és jobb T- DNS-szakaszra (T R -DNS), melyek bizonyos esetben - pl. oktopin típusú Agrobacterium törzsekkel történt fertozés során egymástól függetlenül is beépülhetnek a növényi genomba [12]. A T-DNS ben bejuttatott idegen gének megfelelo muködéséhez promoter és terminátor szakaszokra van szükség, melyeket a növény saját transzkripciós mechanizmusa képes érzékelni. Ezek régiók általában növényi génekbol, vagy növényi vírusokból (pl. a karfiol mozaik vírus 35S promotere CaMV35S) származnak. Az utóbbi 15 évben egyre többet tudtunk meg az Agrobacterium mediálta géntranszformáció mechanizmusáról. A felmerülo problémák ellenére azonban egyre nagyobb ismeretanyag áll rendelkezésünkre, mely elosegíti, hogy ez a transzformációs rendszer részletesebben ismert és jobb hatásfokú legyen Kointegráns és bináris vektor rendszerek Mivel a Ti és Ri plazmidok in vitro manipulációja méretük miatt (kb. 2 kbp) nehézségekbe ütközik, ezért több módszert is kidolgoztak a probléma megoldására. Az egyik lehetoség a kívánt transzgén(ek) közbenso vektorral (pl. Eserichia coli) történo bejuttatása a T-DNS határszekvenciák közé, ezt az ún. kointegráns rendszert azonban napjainkban már alig alkalmazzák [122]. A másik, sokkal elterjedtebb lehetoség az ún. bináris vektor rendszer alkalmazása. Ebben a rendszerben a T-DNS egy kisebb méretu, különálló plazmidban (klónozó plazmid) helyezkedik el, a vir gének pedig egy másik T-DNS nélküli, legyengített plazmidban (segíto plazmid) találhatók. Erre azért van lehetoség, mert a külön plazmidban található, transz helyzetu virulencia régió is képes elosegíteni a génátvitelt [126]. - Az Agrobacterium rhizogenes A4 plazmidjainak felépítése Az A. rhizogenes A4 (más Agrobacterium törzsekhez hasonlóan, mint pl. az és 8196 törzsek) három plazmidot tartalmaz (para4a, para4b és para4c), melyek közül a legnagyobb - para4c (43kb) - az elso ketto integrált formája. A para4b jelu plazmid (25kb) azonos a Ri plazmiddal (pria4) (16. ábra) [127-13]. A 18kb méretu para4a plazmid nem szükséges a növényi géntranszformációhoz (az A. rhizogenes A4RS törzs pl. nem tartalmaz para4a plazmidot), mivel az eddigi ismeretek alapján a mannopin, mannopinsav és agropinsav katabolizmusát szabályozó gének találhatók benne. A megfigyelések ugyanakkor azt támasztják alá, hogy az A. rhizogenes A4 három plazmidja nem stabil állapotú, mivel mennyiségük egymáshoz viszonyított aránya folyamatosan változik a baktériumon belül [13]. A három plazmid restrikciós (Bam HI) térképének részletes vizsgálata alapján megállapították, hogy a 39

40 pria4 plazmid tartalmazza a virulenciá ért felelos régiót, az agropin lebontás génjeit, valamint a T- DNS t mely a T L és T R szakaszokra bontható (17. ábra). 16. ábra Az Agrobacterium rhizogenes A4 para4a, para4b (pria4) és para4c plazmidjainak cirkuláris Bam HI restrikciós térképe [13]. 17. ábra Az Agrobacterium rhizogenes A4 T-DNS szakaszának Bam HI, Kpp I, Eco RI és Hind III restrikciós térképe [131]. A T L szakaszban található pl. a gyökerek kialakulásáért és speciális anyagcsere fokozásáért felelos rol 4

41 gének (rol A, rol B és rol C), a T R szakaszban pedig az auxin szintézis génjei helyezkednek el [ ]. A T-DNS ben eloidézett mutációkat tanulmányozva megállapították, hogy a T L és T R szakaszokban található gének együttesen felelosek a fertozést követo morfológiai változásokért [132]. A para4a és pria4 plazmidok replikációs szakaszának kezdete eltéro, ami magyarázatot ad a két plazmid egy baktériumon belüli független replikációjára. A két plazmid egy viszonylag homológ régiót (II és II szakaszok, 16. ábra), és egy megegyezo szakaszt (I és I szakaszok, 16. ábra) tartalmaz, mely utóbbiak alapján nyílhat lehetoség a plazmidok integrációjára és a para4c plazmid kialakulására [13] A géntranszformáció igazolása hairy root kultúrákban Bár a növényeken megjeleno járulékos gyökerek jelzik az A. rhizogenes fertozés sikerét, a T-DNS szakasz sejtmagba jutását, mégis szükségessé vált olyan kémiai és biokémiai módszerek kidolgozása, melyek segítségével meghatározható a növényi sejtekbe került idegen gének jelenléte és muködése. Erre a T-DNS be épített riporter gének alkalmazásán túl számos lehetoség van A polimeráz láncreakció ( polimerase chain reaction, PCR) alkalmazása A PCR a biológiai tudományok számos területén sikeresen alkalmazható alapveto fontosságú technika, melynek segítségével specifikus DNS szakaszok kimutatására és tanulmányozására nyílik lehetoség a vizsgált DNS csupán igen kis mennyiségének felhasználásával is. A módszer lehetoséget ad a növényi genomba beépült idegen gé nek kimutatására. Nagy elonye, hogy DNS polimeráz, megfelelo oligonukleotid szakaszok (pl. A rhizogenes T L T-DNS Rol B gén) és nukleotidok jelenlétében a minta DNS megfelelo szakasza nagy mennyiségben eloállítható, és így könnyen detektálható [92, ]. A Nicotiana tabacum és N. rustica kultúrákból eloállított, a T-DNS ben GUS gént is tartalmazó hairy root-okat vizsgálva megállapították, hogy már csupán 5ng nyi minta DNS (mely kb. 3-6 sejt DNS állományának felel meg) elegendo a GUS gén PCR-el történo kimutatásához [137] Southern és Northern lenyomattechnika A módszer bizonyos eukarióta gének szerkezetének megállapítására alkalmasak. A Southern-féle lenyomattechnika szerint a DNS-t restrikciós enzim(ek)kel emésztik, a keletkezo fragmentumokat pedig méretük szerint elválasztják agarózgél-elektroforézis segítségével. A DNS fragmentumokat ezt követoen nitrocellulóz szuröre mossák át puffer segítségével, ahol azok megkötodnek. Ezt követoen a vizsgált génre specifikus, izotóppal jelzett próbával (általában mrns, vagy cdns, esetleg E. coli-ban klónozott DNS-szakasz) hibridáltatják a megkötött komplementer DNS szakaszokat, melyek 41

42 autoradiográfiás módszerrel detektálhatók, így megkapjuk a vizsgált gént tartalmazó DNS-szakaszok pontos mintázatát. Ez a módszer klónozó tecnikák alkalmazásával lehetové teszi egy gén adott genomban lévo kópiái számának meghatározását is. Az RNS analízisére kidogozott analóg technika a Northern lenyomatmódszer [138]. Mindkét módszert elterjedten alkalmazzák hairy root kultúrák genetikai vizsgálatára [12,19,139,14] Opinok kimutatása Különbözo, Agrobacterium törzsekkel történo fertozést követoen a növényi sejtek speciális vegyületeket kezdenek termelni, melyeket összefoglaló néven opinoknak nevezünk. Az opinokat a talajbaktériumok használják fel, így teremtve saját fejlodésükhöz még kedvezobb környezetet [128,141]. Az A. rhizogenes A4 törzs az agropin típusú Agrobacterium törzsek közé tartozik, mely a gyakorlatban azt jelenti, hogy a fertozés után kele tkezo hairy root-ok agropint, mannopint, agropinsavat és mannopinsavat termelnek. Az agropin típusú törzsekre jellemzo, hogy az agropin termelést és lebontást az opinok szintéziséért felelos vir gének szabályozzák. A mannopin, mannopinés agropinsav eseté ben a lebontását azonban a kisebb plazmidban található gének irányítják [128]. Az opinok viszonylag könnyen detektálhatók vizes, híg savas, vagy etanolos extrakciót követo papír elektroforézissel, majd AgNO 3 -tal történt elohívással [128, ]. Petit és munkatársai [128] több A. rhizogenes törzset (agropin, mannopin és nopalin típusúakat) és fertozött növényi szövetet vizsgáltak az opintermelés vonatkozásában. Az agropint, mannopint, agropin- és mannopinsavat (18. ábra) mind a hairy root-okban, mind pedig a belolük regenerált transzformáns növényekben kimutatták. Az izolált, primer hairy root-ok vizsgálata azt mutatta, hogy az agropin jelenléte esetén (pl. A. rhizogenes A4-el történt fertozés után), a többi opinnal összehasonlítva ez a vegyület adta a legnagyobb AgNO 3 pozitív foltot. A szerzok ugyanakkor megállapították, hogy az opinok kivonása során és feltehetoen az élo szöveteken belül is - az agropin és mannopin agropinsavvá alakulnak, így a primer géntranszformált gyökerekbol létrehozott kultúrákat vizsgálva ez utóbbi válik a leginkább detektálható opinná. A. belladonna géntranszformált gyökérkultúrákat tanulmányozva, melyeket A. rhizogenes es törzzsel végzett fertozés után nyertek, megállapították, hogy a fertozést követoen izolált gyökerekben az agropin és a mannopin egyaránt kimutatható. A kultúrák átoltása során azonban megfigyelték, hogy az opinok mennyisége fokozatosan csökkent az egy éves vizsgálati periódus alatt annak ellenére, hogy a T-DNS megorizte integritását (Southern lenyomattechnikával vizsgálva) és a tenyészetek morfológiai jellemzoi sem változtak meg [144]. Savka és munkatársai különbözo genotípusú Glycine maximum egyedeket fertoztek, agropin (A4, 42

43 1855), mannopin (8196) és kukumopin típusú A. rhizogenes törzsekkel. A létrehozott hairy root klónok opin tartalmának vizsgálata azt mutatta, hogy a K599-es törzzsel történt fertozés után H 2 N HN C NH (CH 2 ) 3 CH NH COOH H 2 N (CH 2 ) 3 CH NH COOH HOOC (CH 2 ) 2 CH COOH HOOC (CH 2 ) 2 CH COOH H 2 N HN C NH nopalin (CH 2 ) 3 CH NH COOH H 2 N nopalinsav (CH 2 ) 3 CH NH COOH H 3 C CH COOH H 3 C CH COOH oktopin oktopinsav H 2 N (CH 2 ) 4 CH COOH HOCH 2 (CHOH) 4 CH 2 NH NH H 3 C CH COOH HOOC CH (CH 2 ) 2 CONH 2 lizopin mannopin CH 2 HOH 2 (CHOH) 4 CH NH O CH(CH 2 ) 2 CONH 2 CO agropin HOCH 2 (CHOH) 4 CH 2 NH HOOC CH (CH 2 ) 2 COOH mannopinsav HOCH 2 (CHOH) 4 CH 2 COOH N CH CO CH 2 CH 2 agropinsav H 2 N C CH 2 CH COOH O HOOC (CH 2 ) 2 NH CH COOH szukcinamopin H 3 C CH CH 2 CH H 3 C HOOC (CH 2 ) 2 NH CH leucinopin COOH COOH HO O OH OH O CH 2 OH O OH HO O OH HOCH 2 O O P O OH agrocinopin A 18. ábra Néhány fontosabb opin molekula szerkezeti képlete létrhozott tenyészetek mindegyike tartalmazott opinokat, a többi Agrobacterium törzs esetében 43

44 azonban az arány az 5%-ot sem érte el, ami a transzformáció hatékonyságának csökkenését jelzi [142]. Hasonló eredményeket hozott Solanum tuberosum L. hairy root szövetek opin tartalmának vizsgálata is. Különbözo Agrobacterium törzsekkel (15834, 2659, 2659 GUS és 8196 GUS) végzett fertozés után a vizsgált transzformált gyökerek szöveteinek mintegy 8%-a bizonyult opin pozitívnak. Ez az arány a 2659 GUS és 8196 GUS törzsekkel végzett fertozés esetén közel megegyezett a GUS gén expresszálódásának mértékével, ami ezen esetekben egyértelmuen jelezte a sikeres transzformációt [143]. A Brassica oleracea L. var. Botrytis A. rhizogenes A4-es törzzsel végzett fertozés után képzodo szöveteknek csupán 1% -a tartalmazott opinokat és az egyes hairy root klónok opin tartalma is jelentos eltéréseket mutatott. A mannopin típusú 8196-os törzzsel végzett fertozés után nyert klónokból regenerált növények szövetei a kiindulási hairy root kultúrákhoz hasonlóan kimutatható mennyiségu mannopint és agropint tartalmaztak. A levelek mannopin tartalma, friss súlyra vonatkoztatva mintegy,5% volt, a gyökerekben ez az érték,1% és,6% között változott [123] Tropán alkaloidok termeltetése hairy root kultúrákkal A Solanaceae család több nemzetségének növényfajából állítottak már elo tropán alkaloidokat termelo hairy root tenyészeteket (pl. Atropa, Datura, Duboisia, Hyoscyamus, Scopolia) (V. táblázat). A különbözo hairy root-ok tropán alkaloid tartalma növényfajtól függoen - jelentosen eltérhet egymástól. Sok esetben a magas alkaloid tartalom gyenge biomassza képzéssel jár együtt, így az alkaloidprodukció értéke alacsony marad. A géntranszformált gyökérkultúrák többségében a hioszciamin a fo alkaloid, melynek mennyisége sok esetben eléri, néha pedig meg is haladja a megfelelo növényben mért értéket. Több Datura fajból eloállított hairy root kultúrát tanulmányozva megállapították, hogy a D. innoxia gyökérkultúrái tartalmaznak szkopolamint (11µg/g, friss súlyra vonatkoztatva) a hioszciaminon mellett (486µg/g) - a legnagyobb mennyiségben, ezen kívül 6-hidroxihioszciamin tartalmuk is jelentos (VI. táblázat) [5]. A legmagasabb szkopolamin tartalmat Duboisia myoporoides hairy root-okban sikerült elérni, többszöri szelekciót követoen (V. táblázat). Szisztematikus klón szelekcióval, pl. hairy root-ból származó protoplasztok létrehozásával, akár egyetlen sejtbol is magas alkaloid produkciójú kultúra hozható létre. Erre lehetoséget ad az is, hogy egyes megfigyelések alapján a hairy root-okra nagyfokú szomaklonális variabilitás jellemzo [92,145]. Mivel genetikailag minden egyes klón eltéro, tápanyagigényük is különbözo lehet, ezért a növekedés és az alkaloid produkció optimalizálását minden esetben külön kellene elvégezni [146]. 44

45 V. táblázat Solanaceae fajokból eloállított hairy root kultúrák alkaloid tartalma [1]. A hairy root tenyészet Növényfaj Alkaloid alkaloidtartalma (mg/g szárazsúlyra vonatkoztatva) Atropa belladonna atropin 3,7 atropin+ 9,5 hioszciamin szkopolamin 3, Brugmansia candida hioszciamin 8,2 szkopolamin,25 Datura candida hioszciamin 5,7 szkopolamin 1,1 D. innoxia hioszciamin 14 szkopolamin 1,9 D. metel hioszciamin 3,1 D. stramonium hioszciamin 6,4 szkopolamin 5,6 Duboisia hybrid hioszciamin 2,1 szkopolamin 2,5 D. leichhardtii szkopolamin 18 D. myoporoides hioszciamin 8,6 szkopolamin 32 Hyoscyamus albus hioszciamin 12 szkopolamin 4,6 H. aureus hioszciamin 6,6 szkopolamin,6 H. x györffyi hioszciamin 8,8 szkopolamin,4 H. muticus hioszciamin 12,2 szkopolamin 1, H. niger hioszciamin 12,5 szkopolamin 1,3 Scopolia carniolica hioszciamin,2 szkopolamin,2 S. jabonica hioszciamin 13 szkopolamin 5, S. tangutica hioszciamin,52 szkopolamin,2 A hairy root tenyészetek tropán alka loid produkciója általában a növekedés késo-stacionárius szakaszában éri el a maximumát, ami rázatott lombikban, folyékony tápközegben fenntartott kultúrák esetében 3-4 hét után következik be [146]. Általános tenyésztési feltételek mellett az összalkaloid tartalomnak ilyenkor csupán maximum 5%-a található meg a tápközegben [35,147]. 45

46 Datura candida hibrid hairy root kultúráit vizsgálva megállapították, hogy a tenyészetek alkaloid tartalma a 4 hetes tenyésztési periódus végére elérte a,68%-ot (szárazsúlyra vonatkoztatva), mely az VI. táblázat Datura innoxia hairy root klón (A. rhizogenes LBA942) százalékos alkaloid összetétele (összalkaloid tartalom = 1%) [5]. alkaloid % hioszciamin 55 szkopolamin 1 kuszkohigrin 1 higrin 5 3-hidroxi-6-tigloiloxitropán 4 6-hidroxihioszciamin 3 3-α-acetoxitropán 3 tropin 2 3-tigloiloxi-6-hidroxitropán 2 3-acetoxi-6-hidroxitropán 1 3,6-ditigloiloxitropán 1 3,6-ditigloiloxi-7-hidroxitropán 1 in vitro növény föld feletti részeiben mért érték 1,6-szerese, a gyökerek alkaloid tartalmának pedig 2,6-szerese volt. A géntranszformált gyökerekben a szkopolamin fordult elo legnagyobb mennyiségben, mintegy ötször meghaladva a mért hioszciamin tartalmat. Az alkaloidok túlnyomó része a szövetekben raktározódott, az össz mennyiségnek csupán 3% -a volt mérheto a folyékony tápközegben [148]. Nagy számú (több mint 5) D. stramonium hairy root klón vizsgálata azt mutatta, hogy a tenyészetek növekedése és alkaloid szintetizáló képessége több év elteltével (5 év) is stabil szinten maradt. A fertozéshez hét különbözo Agrobacterium törzset használtak (TR-15, ATCC15834, A4, 1855, A4127, ATCC13333, AR-1), melyek közül az A4-es törzs sorrendben a harmadik legfertozobb A. rhizogenes típusnak bizonyult az adott növényen. A klónok szelekcióját követoen (növekedés és alkaloidprodukció alapján) megvizsgált tenyészetek alkaloid tartalma az átoltást követo napra érte el a maximumát. A hioszciamin esetében ez 4,5 mg/g, a szkopolamin esetében pedig 1,5 mg/g volt szárazsúlyra vonatkoztatva [94] Az inokulum tömegének hatása a növekedésre és alkaloid tartalomra A H. muticus géntranszformált gyökerek esetében részletesen tanulmányozták az inokulum mennyiségének (2,5g/l - 25g/l) hatását a növekedésre és tropán alkaloid produkcióra. Megállapították, 46

47 hogy az inokulum tömege nem befolyásolja a maximális biomassza- és alkaloid produkció értékét. A legmagasabb értékek eléréséhez szükséges ido azonban csökken az inokulum mennyiségének növelésével. A maximális hioszciamin és szkopolamin produkció egy héttel a növekedés stacionárius szakaszának elérése után volt mérheto (89-151mg/l és,6mg/l ), a hioszciaminnak pedig 3-1% -a került a tápközegbe. A szerzok kiemelték ugyanakkor, hogy az inokulum tömegének meghatározásakor nem vették figyelembe a kiindulási klón idosebb és fiatalabb szöveteinek megoszlását [92] A tenyésztési ido és a táptalaj ph-jának hatása a növekedésre és hatóanyag produkcióra A folyékony tápközegben nevelt D. innoxia, D. candia és D. stramonium géntranszformált gyökérkultúrák friss- és szárazsúlya folyamatosan növekedett az 5, valamint 6 hetes tenyésztési idoszak alatt, melyek értékei jellegzetes szigmoid növekedési görbét alkottak [22, ]. A D. innoxia szövetek hioszciamin tartalma a kultiválási ido végéig (4. nap) emelkedett [149]. A D. candida tenyészetek alkaloid tartalma a napra érte el a maximumot, az intenzív növekedési szakasz befejezodésével párhuzamosan. Ezt követoen a hioszciamin és szkopolamin mennyisége egyaránt csökkent a szövetekben [22]. A D. stramonium szövetek hioszciamin tartalma az idovel fokozatosan nott, maximumát az 5-6. hétre érte el (szkopolamin a kultúrákban nem volt kimutatható). A tropin mennyisége az 5. hétre érte al a maximális értéket, mely a 6. hétre jelentosen mintegy felére csökkent [15]. Az A. rhizogenes A4 törzzsel fertozott H. muticus egyedekrol izolált gyökérklónok más törszekkel végzett fertozés után nyert klónoktól eltéroen - világos színuek, vékony keresztmetszetuek és hosszúak voltak. Más Agrobacterium fetozés után kapott klónokkal (pl. LBA942, 15834) össszehasonlítva növekedésük lassabb volt, a növekedés stacionárius szakaszát a 21 nap után érték el. A hioszciamin tartalom maximumát a stacionárius növekedési szakasz kezdetét követo 1 hét után érte el, melynek mintegy 1%-a volt mérheto a tápközegben [91]. Az A. baetica hairy root ok esetében a friss- és szárazsúly értékek emelkedése szintén folyamatos volt az 56 napos tenyésztési idoszak végéig, de a növekedés stacionárius szakasza ekkor még nem volt detektálható. A táptalaj ph értéke kezdeti csökkenést követoen emelkedett, a táptalaj típusától függoen eltéro mértékben. A ph változását egyrészt a tápanyagok táptalajból történt felhasználása, másrészt a szövetekbol történt anyagcseretermék kiválasztás teheto felelossé, így a megemelkedett ph kialakításában szerepe lehet a táptalajba kiválasztott tropán alkaloidoknak is, mint ahogy azt a D. candida szövetek esetében is megfigyelték. Az atropin esetén ez a mennyiség mintegy 2,8%, szkopolamin esetén pedig 15% volt. A táptalaj jóval magasabb szkopolamin tartalmát az eltéro transzport, de az atropin esetleges újbóli felvétele és szkopolamminná alakítása is eloidézheti. A hairy 47

48 root szövetek atropin tartalma a napig emelkedett, míg a szkopolamin tartalom folyamatosan nott az 56. napig [71]. A táptalaj ph értékének hatását vizsgálva A. belladonna hairy root tenyészetekben azt tapasztalták, hogy a biomassza produkció nem változott lényegesen a ph 4-pH 8 tartományban 28 napos inkubálási idot követoen. Hasonló megfigyelést tettek a szövetek és a táptala j hioszciamin tartalmának vonatkozásában, a szkopolamin mennyisége azonban jelentosen (a kontrollhoz, ph 5,8-as táptalajon nevelt kultúrákhoz képest) több mint hatszorosára nott a tápközeg kezdeti ph 7 és ph 8-ra történt beállítását követoen [152] A megvilágítás hatása Datura hairy root tenyészetek növekedésére és tropán alkaloid produkciójára Sötétben és fényen, 3% szacharózt tartalmazó folyékony MS táptalajon tenyésztett D. candida hairy root-ok esetében a kultúrák növekedése hasonló volt a 6. hétig, ezt követoen azonban a fényen nevelt tenyészetek friss súlya gyorsabb ütemben nott, és a 8. hétre mintegy kétszerese volt a sötétben nevelt kultúrákénak. Az alkaloid tartalom (hioszciamin+szkopolamin) az 5-6. hétre el a legmagasabb értéket, a sötétben nevelt kultúrákban,1%-ot, a fényen tenyésztettek esetében viszont csupán mintegy,56%-ot (szárazsúlyra vonatkoztatva). A tápközegben az alkaloid tartalom kb. 3%-a volt mérheto [73]. A fényen nevelt (Gamborg B5 táptalajon, 16 óra/nap megvilágítás 32 napon át) H. niger géntranszformált gyökérkultúrákat tanulmányozva (3% szacharózt tartalmazó Gamborg B5 táptalajon, 16 óra/nap megvilágítás 32 napon át) azt tapasztalták, hogy a fény hatására nem változott minoségileg a tenyészetek alkaloid összetétele, bá r a sötétben és fényen nevelt szövetek morfológiailag eltértek egymástól (pl. színük). Lényegesen magasabb biomassza produkciós értékeket mértek a fényen nevelt tenyészetek esetében, a sötétben tenyésztett kultúrák pedig már 28 nap után megbarnultak és elpusztultak. Sötétben, az átoltást követo 18. napig a szövetek friss súlya lényegesen magasabb, közel duplája volt, mint a fényen nevelt gyökereknek. Minden esetben a hioszciamint lehetett kimutatni foalkaloidként, melynek mennyisége fényen magasabb, 1,2% volt szárazsúlyra vonatkoztatva [97]. Más vizsgálatok azt jelezték, hogy az autotróf körülmények között, fényen nevelt D. stramonium hairy root tenyészetek szkopolamin és hioszciamin produkciója megemelkedik, így elérve a 6,4 mg/g hioszciamin és,24 mg/g szkopolamin tartalmat (szárazsúlyra vonatkoztatva). Meg kell jegyezni ugyanakkor, hogy az elozetesen sötétben nevelt szövetekben nem volt mérheto mennyiségu szkopolamin [153]. Maldano-Mendoza és Loyola -Vargas részletesen tanulmányozták fotoszintetikus (szacharózmentes táptalajon nevelt) és fotomixotróf (csökkentett,,3% szacharóz tartalmú táptalajon tenyésztett) D. 48

49 stramonium hagyományos gyökérkultúrák és hairy root szövetek anyagcseréjét (klorofill szintézis, 14 CO 2 fixálás, stb.) [154]. Folyamatos fényen tenyésztés mellett a hagyományos gyökértenyészetek szöveteiben klorofill A és B tartalma jelentosen megemelkedett, továbbá kalluszosodás jelei is mutatkoztak. A hairy root tenyészetek ezzel szemben megorizték struktúrájukat, viszont a vizsgált 6 klónból csupán 2 zöldült meg a fenntartás során. A fényen nevelt klónok szárazsúlya kétszerese volt a heterotróf, sötétben nevelt hairy root-ok esetében mért értéknek. A megzöldült 2 klón szemben a másik 4 tenyészettel fényen, heterotróf körülmények között nem tartalmaztak mérheto mennyiségu szkopolamint. Elobbi kultúrákban fényen csupán 1% tápközeg szacharóz koncentráció mellett jelent meg mérheto mennyiségu szkopolamin. A hagyományos gyökértenyészetekben heterotróf körülmények között, fény hatására jelentosen megnott a szkopolamin hioszciaminhoz viszonyított mennyisége A tápközeg összetételének hatása a kultúrák növekedésére és tropán alkaloid produkciójára Számos kutató tanulmányozta a tápközeg típusának és összetételének hatását különbözo, tropán alkaloidokat termelo Atropa, Datura Hyoscyamus és Duboisia hairy root klónokra [14,44,97,16,114,146, ]. A legtöbb esetben eltéro táptalajtípus/összetétel volt optimális a tenyészetek növekedésére és hatóanyag produkciójára, melyet az anyanövény típusa mellett az egyes klónok sajátságai is befolyásoltak [97,17]. Az egyes alkaloidok megoszlása a táptalaj összetételének hatására - szintén változatos képet mutat [97]. Az eredmények azt jelzik, hogy minden egyes hairy root klón esetén alapveto fontosságú a megfelelo táptalajtípus és összetétel kiválasztása az optimális alkaloidprodukció eléréséhez. - A szacharóz koncentráció hatása Sauerwein és Shimomura [156] folyékony tápközegben (WP) nevelt H. albus hairy root tenyészetek növekedését és alkaloid produkcióját vizsgálták különbözo szacharóz koncentrációk mellett (3%, 4%, 5%, 6%, 8% és 1%), 19 napos tenyésztési periódust követoen. A legnagyobb biomassza produkció 8% cukorkoncentráció mellett volt mérheto. A táptalaj cukortartalmának emelésével (8%, 1%) csökkent az összalkaloid tartalom, a 7β-hidroxihioszciamin tartalom azonban emelkedett és meghaladta a,12% -ot (szárazsúlyra vonatkoztatva). A legmagasabb szkopolamin (,4%) és hioszciamin (6,65%) tartalmat 3% szacharózkoncentráció mellett mérték. Az A. rhizogenes A4 törzzsel fertozott H. albus növényekrol izolált géntranszformált gyökerek vizsgálata az alkaloidspektrum - 7β-hidroxihioszciamin, 6β-hidroxihioszciamin, szkopolamin, hioszciamin és littorin arányának - változását mutatta a különbözo táptalajokon. A legmagasabb hioszciamin tartalom a Gamborg B5 táptalajon volt mérheto 3% szacharóztartalom mellett, az 49

50 optimális 6β-hidroxihioszciamin és szkopolamin tartalmat azonban, hasonló cukorkoncentráció mellet az ½ MS táptalajon lehetett elérni. Külön vizsgálva a szacharóz hatását Gamborg B5 táptalajon tenyésztett szövetek esetében megállapították, hogy a cukortartalom változása nem befolyásolta lényegesen a friss súly alakulását. Az optimális hioszciamin és littorin tartalmat 3% szacharóz mellett (,58% és,67%, szárazsúlyra vonatkoztatva), míg a 6β-hidroxihioszciamin és szkopolamin szempontjá ból 2% szacharóz bizonyult a legmegfelelobbnek [97]. D. stramonium hairy root szövetek növekedését tanulmányozva %-1% szacharózt tartalmazó táptalajokban a biomassza produkció szempontjából a 4%-6% cukortartalom bizonyult optimálisnak, míg a hioszciamin produkció 5% szacharóz alkalmazása mellett érte el a maximumot [16]. Más megfigyelések azonban azt mutatták, hogy a tápközeg 6%-os szacharóz tartalma növelte legjelentosebben a D. stramonium hairy root-ok alkaloid produkcióját [161]. H. muticus géntranszformált gyökereket vizsgálva (g/l -8g/l szacharóz) azt tapasztalták, hogy a különbözo klónok esetén nagy eltérések mutatkoznak a növekedés (3-8% szacharóz) és hioszciamin produkció (2-6% szacharóz) szempontjából optimális cukortartalmak között. Christen és munkatársainak [97] megfigyelésével szemben azt találták, hogy a cukortartalom jelentos hatással van a hioszciamin produkcióra (egyes esetekben több mint háromszoros emelkedés) [146]. Vizsgálták a D. candida x D. aurea hibridbol A. rhizogenes A4 törzzsel végzett fertozést követoen nyert hairy root-ok növekedését és alkaloid produkcióját különbözo mennyiségu szacharózt (3%-8%) tartalmazó Gamborg B5 folyékony táptalajon. A 28 napos tenyésztést követoen a legnagyobb szárazsúly értékeket 5% szacharóz alkalmazásakor mérték. A hioszciamin mennyisége csupán kis mértékben növekedett, és viszonylag változatlan maradt a 4%-7% szacharóz tartalom mellett (,36% hioszciamin, szárazsúlyra vonatkoztatva). Az eredmények azt mutatták, hogy a szkopolamin mennyiségét (,17%) és a szkopolamin-hioszciamin arányt nem befolyásolta lényegesen a tápközeg szacharóz tartalma. Az alkaloidprodukció értéke a biomasszaprodukció értékeinek megfeleloen 5% szacharóz tartalom mellett érte el a maximumot [15]. - A tápközeg MgSO 4 tartalmának hatása A Mg 2+ alapveto élettani szerepet tölt be a sejtek univerzális és speciális anyagcsere folyamataiban. Szerepe van a riboszómák megfelelo muködésében, elosegíti az aminosavak t-rns-hez való kötodését és a polipeptidlánc riboszómák felületérol való leválását, számos enzim specifikus és nem specifikus aktiválásához szükséges, ezen kívül a foszforilálási reakciók kofaktora, így a különbözo táptalajok összetevojeként alapveto szerepet tölt be a növényi sejtek fejlodésében [162]. A tápközeg magnézium koncentrációjának helyes megválasztásával a különbözo növényi tenyészetek biomassza produkcióját és hatóanyag termelését hatékonyan lehet befolyásolni. 5

51 A N. tabacum kallusz kultúrák tápközegébe, különbözo koncentrációkban adagolt MgSO 4 jelentosen csökkentette azal 3+ toxikus hatását. Már kis mennyiségu Al 2 (SO 4 ) 3 a friss súly jelentos csökkenését eredményezte, a tápközeg MgSO 4 tartalmának megemelésével viszont a biomassza produkció ismét megemelkedett. A friss súly emelkedésével azonban a tenyészetek nikotin tartalma lecsökkent [163,164]. A MgSO 4 kedvezo hatást gyakorol az organizált kultúrák gyökérképzodésére, továbbá a géntranszformált gyökérkultúrák növekedésére és hatóanyag produkciójára [165]. Matricaria recutita hairy root tenyészetek lineáris növekedését és egyes illóolaj komponensek produkcióját befolyásolta pozitívan a tápközeg megnövelt MgSO 4 tartalma [166]. Ammi visnaga hairy root-ok lineáris növekedése és szárazanyag tartalma szintén nott az alkalmazott, megemelt MgSO 4 koncentráció hatására. Ezzel párhuzamosan azonban a visznagin produkció nem emelkedett jelentosen, feltehetoen az intenzív növekedés, az univerzális anyagcsere túlsúlyának következtében [167]. D. candida x D. aurea hibrid géntranszformált gyökérkultúráinak lineáris növekedése nem tért el jelentosen MS és Gamborg B-5 táptalajon, 6 nap tenyésztési idoszak alatt. Az MS tápközeg MgSO 4 tartalmát duplájára emelve (37 mg/l rol 74 mg/l re) azonban a 2. naptól tovább folytatódott a gyökerek lineáris növekedése és a 6. napra elérte a kontroll tenyészetekben mért érték kétszeresét [165]. A MgSO 4 koncentrációja ugyanakkor hatással van a tápközeg alkaloid tartalmára is, mivel kisebb MgSO 4 szintek mellett kevesebb hioszciamint és szkopolamint lehetett kimutatni D. stramonium hairy root tenyészetek tápközegében [161]. Szilárd- és folyékony B5 táptalajon tenyésztett A. belladonna hairy root kultúrák növekedését és alkaloid termelését vizsgálva megállapították, hogy mind szilárd, mid pedig folyékony Gamborg B-5 táptalajon a biomassza produkció szempontjából az 5 mg/l MgSO 4, a tropán alkaloid tartalom tekintetében pedig a 125 mg/l MgSO 4 alkalmazása bizonyult optimálisnak. Meg kell jegyezni, hogy - hasonlóan a kallusz szövetek esetében korábban megfigyelt tendenciákhoz - az alkaloid tartalom csökkenését mérték a legintenzívebben növekvo szövetekben [168] Transzgének hatása a tropán alkaloid metabolizmusra A legtöbb, tropán alkaloidokat termelo Solanaceae növényfaj és a belolük eloállított in vitro tenyészetek hioszciamint tartalmaznak foalkaloidként, ezzel szemben egyre nagyobb igény van a gyakorlati szempontból értékesebb - szkopolamin tartalom emelésére. Ennek érdekében megvizsgálták, hogy a H6H enzim fokozott expressziójával sikerül-e elérni az alkaloid metbolizmus hioszciamintól szkopolamin felé történo irányítását. A vizsgált két növényfajba (A. belladonna és H. muticus) A. rhizogenes T-DNS segítségével juttattak be H6H gént [169,17]. Mindeddig, az alkaloid 51

52 metabolizmus és a klónozott gének muködésének pontos ismeretének hiányában, azonban nem sikerült jelentosebb gyakorlati eredményeket elérni. Yun és munkatársai [171] A. belladonna növényekbe transzformáltak levélkorong módszerrel, melynek során karfiol mozaik vírus 35S promoterbol (CaMV 35S) és H6H génbol álló kiméra gént juttattak a növényi sejtbe. Csaknem 3 kanamycin rezisztens klónt hoztak létre, melyeket tovább vizsgáltak a H6H gén expressziójának vonatkozásában. Az egyik ígéretes klónt teljes növénnyé regenerálva, majd önmegporzással utódokat létrehozva megállapították, hogy valamennyi utódnövény tartalmazta a 35S-H6H gént (Southern lenyomattecnikával vizsgálva). A növények mindegyikének levelében, hajtásában és gyökerében magas a H6H aktivitást mértek. A vizsgált transzformáns növények melyek morfológiailag eltértek a kontroll A. belladonna egyedektol - szkopolamin tartalma jelentosen megemelkedett, és a kontroll levelek összalkaloid tartalmának 97%-át is elérte. Ezek az eredmények alátámasztották, hogy az alkaloid metabolizmus módosításával egy alapvetoen hioszciamin foalkaloidos növény alkaloid összetételében jelentos, gyakorlati szempontból is elonyös változást lehet elérni. Megemelt szkopolamin szintet nem csupán transzformáns növényben, de hairy root tenyészetekben is sikerült megvalósítani [169,17]. A H. niger-bol származó, CaMV35S promoter irányítása alatt álló H6H gént A. rhizogenes bináris vektor rendszerének segítségével juttatták A. belladonna sejtjeibe. Valamennyi vizsgált hairy root klón H6H aktivitása és 6β-hidroxihioszciamin produkciója megemelkedett. A kontroll hairy root szövetekkel összehasonlítva a H6H transzgént tartalmazó klónok szkopolamin tartalma jelentosen, akár ötszörösére is megemelkedett (,3% szárazsúlyra vonatkoztatva) [169]. Kanegae és munkatársai [172] H6H és GUS géneket juttattak Agrobacterium vektor segítségével H. muticus, A. belladonna és N. tabacum egyedek sejtjeibe. A létrehozott hairy root klónok hisztokémiai vizsgálata azt mutatta, hogy a H6H gén expressziója fajonként eltéro. Nagyobb számú klónt vizsgálva Jouhikainen és munkatársai [17] a H6H gént H. muticus sejtjeibe juttatták, melynek hairy root-jai a hioszciamin mellett általában csupán igen kis mennyiségben tartalmaznak szkopolamint. A H6H gént hordozó A. rhizogenes és LBA942 klónokat alkalmazva 68 különbözo klónt hoztak létre. Csupán 43 klón hordozta a transzgént (PCR módszerrel vizsgálva), melyeknek 4% -ában mértek magasabb szkopolamin tartalmat. A vizsgált klónok egyikének szkopolamin produkciója (17 mg/l) közel két nagyságrenddel meghaladta a kontrollként használt hairy root klónokban mért értékeket. A klónonként mért különbözo szkopolamin-hioszciamin arány és az eltéro szkopolamin produkciós értékek ugyanakkor azt jelzik, hogy a transzgén expressziója klónonként változhat. A tropán alkaloid tartalom emelésének érdekében kísérletek történtek a pmt gén muködésének fokozására is. A. belladonna és N. sylvestris transzgénikus növényekkel végzett vizsgálatok azt 52

53 mutatták, hogy a pmt gén túlmuködése nem befolyásolta lényegesen a nadragulya tropán alkaloid szintjét, ezzel szemben jelentosen megemelte a dohánynövény nikotin tartalmát [173]. Más szerzok A. rhizogenes A4 törzs alkalmazásával eloállított Duboisia myoporoides X D. leichhardtii hairy root klónokat vizsgáltak, melyekbe CaMV 35S promoter irányitása alatt álló, Nicotia na tabacum-ból származó pmt gént juttattak. A transzgént tartalmazó hairy root-ok N- metilputreszcin tartalma 2-4-szer magasabb volt, mint a kontrollként alkalmazott géntranszformált gyökérkultúrákban mért érték. A tropán- és piridinvázas alkaloidok szintjé ben azonban nem történt jelentos változás. A vizsgált növények esetében kapott eltéro eredmények arra utalnak, hogy a pmt transzgén muködésének szabályozása fajonként eltéro [14] A Datura hairy root kultúrák genetikai stabilitása Különbözo növényfajokból (pl. D. stramonium, Nicotiana fajok, stb) eloállított hairy root kultúrák citogenetikai vizsgálata megerosítette, hogy a különbözo tenyészetek sejtjei hosszabb ideje fenntartott szövetekben is - a fajra jellemzo kromoszóma számmal rendelkeznek. A kromoszómák szerkezetében csupán kisebb mértéku eltéréseket sikerült kimutatni. A vizsgált sejtszuszpenziós kultúrák a kallusztenyészetekhez hasonlóan ugyanakkor nagyfokú genetikai instabilitást mutattak, mely a poliploid és aneuploid sejtek nagy számában mutatkozott meg [174]. Baíza és munkatársai [175] részletesen tanulmányozták D. stramonium A. rhizogenes TR-15 ös törzzsel végzett fertozése után nyert hairy root klónok genetikai stabilitását. A vizsgált három klónt a kísérleteket több évvel (8-1 évvel) megelozoen hozták létre és nem-transzformált gyökérkultúrákkal hasonlították össze. Mivel a tenyészetekben más hairy root kultúrákhoz hasonlóan a speciális anyagcseretermékek szintézise hosszú idon keresztül stabil szinten maradt feltételezheto volt, hogy a tenyészetek genetikai stabilitása is igen nagy. Más, dedifferenciált kultúrák estén a szekunder metabolitok termelésének csökkenésével párhuzamosan a kromoszóma állományban is különbözo változásokat figyelték meg (pl. aneuploidia, poliploidia) [176]. Ismert tény továbbá, hogy az in vitro fenntartott növényi sejtek kromoszóma állományában mind számszeru, mind pedig szerkezeti változások gyakran elofordulhatnak [177]. A vizsgált D. starmonium hairy root-ok kariotípusa és kromoszóma száma (2n=24) megegyezett az anyanövényével. Annak ellenére, hogy a hagyományos gyökérkultúrák táptalaja indolvajsavat is tartalmazott, a vizsgált sejtek közel 8%-a diploid volt és csupán a sejtek 2%-a volt aneuploid (2n=2n±x), vagy tetraploid (2n=48). A kromoszómák szerkezete minden vizsgált gyökérkultúrában stabil volt. Az eredmények alapján megállapítható, hogy a vizsgált D. stramonium hairy root szövetek kromoszóma állományára igen nagyfokú stabilitás jellemzo, mely egyértelmuen felülmúlja a hagyományos gyökértenyészetek genetikai stabilitását [175]. 53

54 A különbözo hairy root kultúrák citogenetikai vizsgálatának eredménye azt jelzi, hogy a stabil szekunder metabolit produkció nem csupán a szöveti differenciálódás mértékével, hanem a nagyfokú genetikai stabilitással is szoros kapcsolatban áll Formaldehid a biológiai rendszerekben A formaldehidet (HCHO) a közelmúltig csupán környezetszennyezo anyagnak tartották, mely nagyobb mennyiségben pl. a bútorokból, háztartási vegyi árukból, muanyagipari termékekbol, dohányfüstbol és a kipufogógázokból kerülhet az emberi szervezetbe [178,179]. Toxikus vegyületként elsosorban a légzorendszer, de más szervek daganatos megbetegedéseinek kialakulásában is fontos szerepet tulajdonítanak ezen aldehidnek [18-182]. A szervezetbe került exogén HCHO DNS-DNS, valamint DNS-fehérje keresztkötéseket (DPX) alakíthat ki, melyek genotoxikus hatása pl. a DNS replikáció gátlásában nyilvánulhat meg [183]. Több, DNS-DNS és DNS-fehérje keresztkötéseket kialakító vegyületet (pl. alkilezo ágensek, króm és nikkel tartalmú vegyületek, HCHO) megvizsgálva azt találták, hogy a keresztkötések kialakításához szükséges koncentrációk egyedül a HCHO esetén maradtak a citotoxikus értékek alatt (a vizsgált V79-es sejtek több mint 75%-a életképes maradt) [184,185]. Mivel a sejtek HCHO kezelés mellett megorizték életképességüket, a kialakuló keresztkötések pedig több órán át megmaradtak, így ténylegesen fennáll a DNS károsodásának lehetosége az osztódás során. Ezeket a megfigyeléseket több vizsgálati módszerrel egyértelmuen alátámasztották. A HCHO kezelést követoen 24 órával ugyanakkor már nem sikerült kimutatni a DPX-ek jelenlétét, ami a repair mechanizmusok hatékonyságát jelzi. Mivel azonban a HCHO egyéb makromolekulákkal is (pl. repair fehérjék) reagálhat, így indirekt DNS károsító hatások szintén érvényesülhetnek. Korábbi vizsgálatok a HPRT lókusz mutációs frekvenciájának emelkedésére utaltak HCHO kezelést követoen [186], Merk és Speit eredményei [184] azonban ezt egyértelmuen cáfolták, így nem találták bizonyítottnak az exogén HCHO génmutáción keresztül kialakuló karcinogén hatását. Az exogén és endogén HCHO kromoszóma állományra gyakorolt hatásait azonban még részletesebben fel kell tá rni. Az 5-metil-citozin (m 5 C) eukarióta genomban betöltött szerepét vizsgálva megállapították, hogy a korábban deamináció eredményeként mutációs forró pontnak tartott bázisnak sokkal inkább a DNS elektrokémiai tulajdonságainak módosításában van szerepe, így pl. hatással van a makromolekula speciális regulátor fehérjékkel való kapcsolódására és ezen keresztül többek között a DNS transzkripciójára [187]. Ezek az eredmények is jelzik, hogy DNS-metilezés és demetilezés, a génaktivitás változásának tanulmányozása a kutatások egyik újabb és egyre fontosabb területévé válik [183,185]. 54

55 Bizonyított, hogy az exogén eredetu HCHO-en túl a humán, állati és növényi szövetekben mérheto mennyiségu endogén HCHO is detektálható, mely a különbözo anyagcserefolyamatok során keletkezik [ ,188]. Az endogén HCHO keletkezése túlnyomó részben a sejtekben végbemeno metilezési-demetilezési/oxidációs -redukciós folyamatokhoz kapcsolható (19. ábra) [183,185,189]. demetilezett vegyületek akceptor molekulák oxidáci ó + hidrolízis HCHO al kilezõdés + redukció metilezett vegyületek metilezett vegyületek demetilezés metilezés 19. ábra Az endogén formaldehid (HCHO) képzodésének sematikus vázlata a metilezésidemetilezési/oxidációs -redukciós folyamatok során [189]. A sejteken belül HCHO képzodhet számos exogén és endogén eredetu, N-, O-, vagy S-metilcsoportot tartalmazó vegyületbol oxidatív demetilezés során (demetilázok és speciális peroxidázok közremuködésével), továbbá nem kontrollált enzimatikus reakciók eredményeként (pl. szemikarbazidszenzitív amin oxidáz - SSAO közremuködésével), mely utóbbiak patológiás folyamatok elindításában játszanak szerepet [183]. Thorndike és Beck [19] már a 7-es években kimutatták, hogy a limfocitákban és granulocitákban HCHO keletkezik a metil-tetrahidrofolát tetrahidrofolát (THF) átalakulás során. Az egészséges limfocitákhoz viszonyítva, krónikus leukémiás limfocitasejtekben a HCHO szint jelentosen nagyobbnak bizonyult. A dohányfüst nagy mennyiségben tartalmaz metilamint, mely (az aminoacetonhoz hasonlóan) egyben a SSAO enzim endogén szubsztrátja. A nikotin metabolizmus végterméke szintén a metilamin, melynek SSAO által történo deaminálása során HCHO, ammónia, valamint a vízbol hidrogén-peroxid (H 2 O 2 ) egyaránt keletkezik. A dohányzás és a nikotin hatására felszabaduló adrenalinból a monoaminoxidáz (MAO) hatására szintén metilamin keletkezik. Vizsgálatai során Yu [191] trícium izotóppal 55

56 jelzett, L-(-)-[N-metil- 3 H]-nikotint alkalmazott egerekben a metabolizmus nyomon követése, a keletkezo HCHO indirekt kimutatása céljából. Megállapította, hogy az alkalmazást követo radioaktivitás túlnyomó része makromolekulákban jelentkezik, melyek HCHO hidakkal összekapcsolt fehérje komplexeknek bizonyultak. A komplexek kialakulása sikeresen blokkolható volt SSAO inhibitorokkal (MDL-72974A és szemikarbazid). Mivel a HCHO és H 2 O 2 reakciójának eredményeként különösen reaktív szingulett oxigén ( 1 O2) és gerjesztett HCHO (H*CHO) képzodik [192,193], továbbá a dohányzás során nagyobb mennyiségben keletkezo HCHO keresztkötések kialakításával károsíthatja a makromolekulákat (pl. fehérjék, DNS) így a szerzo alapveto szerepet tulajdonít ezen molekuláknak a dohányzás káros hatásainak kialakulásában [191]. A nikotin Nicotiana plumbaginifolia Viv. szuszpenziós kultúra sejtekben történo nor-nikotinná alakítását izotóppal jelzett nikotin molekulák ((R,S)-[ 2 H-metil]nikotin, (R,S)-[ 13 C-metil]nikotin és (R,S)-[ 14 H-metil]nikotin) alkalmazásával tanulmányozták. Az eredmények azt mutatják, hogy a nikotin metil csoportja demetilezést követoen a növényi sejt univerzális anyagcsere folyamataiban vesz részt, így pl. izotóppal jelzett szerin és metionin jelenlétét lehetett kimutatni a sejtekben. A szerzok feltételezik, hogy a nikotin demetilezése során N-hidroximetil-nor-nikotin képzodik mint intermedier termék, melybol HCHO formájában kerül át a metil csoport a sejtek univerzális anyagcsere folyamataiba, így pl. a C 1 metabolizmus szempontjából fontos folát ciklusba [194]. Napjainkban már egyre nyilvánvalóbb, hogy a különbözo metilezett vegyületek potenciális HCHO forrásnak tekinthetok. Kísérleti eredmények támasztják alá a HCHO molekula jelentoségét a metilezési folyamatokban. Az SAM különbözo transzmetilezési reakciókban szerepel metildonorként (2. ábra), így pl. a DNS-metilezés során is [183,195 ]. A hisztamin - N τ -metil-hisztamin átalakulás közben kimutatható a HCHO keletkezése az S-adenozil-metionin (SAM) S-metilcsoportjából [196]. A folyamatot a hisztamin-n-metiltranszferáz enzim katalizálja, az SAM-ból pedig S-adenozilhomocisztein (SAH) képzodik. A HCHO detektálása formaldimedon formájában történt, dimedon segítségével, mely irreverzibilisen reagál a HCHO -el (21. ábra). Izotóppal jelzett, S-[metil- 3 H]SAM adagolása mellett jelentos mennyiségu jelzett formaldimedon keletkezését mérték. A HCHO dimedonnal történt elvonása ugyanakkor a transzmetilezés jelentos csökkenését eredményezte [197]. Az L-lizin HCHO-el történo in vitro metilezésének vizsgálatakor Tyihák és munkatársai [183] megállapították, hogy a reakció során nagy mennyiségben keletkezik N ε -monometil-l-lizin (MML), valamint kisebb mennyiségben N ε -N ε -dimetil-l-lizin (DML) és N ε -N ε -N ε -trimetil-l-lizin (TML), továbbá egyéb termékek is. A különbözo metilezett L-lizin származékok különös tekintettel a MML-re jelentos fiziológiás hatással rendelkeznek, mivel elosegítik a sejtproliferációt egészséges és daganatos sejttenyészetekben egyaránt [198-21]. 56

57 - OOC - OOC H 2 N C H CH 2 N CH H 2 1 H 2 C* + S CH 2 O H 3 NH 2 N N N CH H 2 O H 2 N C H NH 2 CH N 2 N CH H H CH N δ- + N HO C* δ- S CH 2 O H H H 3 H H OH OH SAM OH OH -- OOC H 2 N C H NH 2 CH N 2 N H 1 CH CH 2 HO C H + N H N S CH H 2 3 O H H OH OH SAH H HO C H H oxidacio ` ` H 2 O 2 HCHO + 2 H 2 O 2. ábra Az s-adenozil-metionin (SAM) demetilezodésének folyamata, az S-adenozil-homocisztein (SAH) és formaldehid (HCHO) képzodése [183] O C H 3 C 2 CH 2 O H 3 C C H 3 C H 3 C CH O Dimedon (5,5-dimetil-ciklohexán-1,3-dion) O C CH C O H C H O C HC C 3' 2' 1' O 4' 6' 5' CH 3 CH 3 Formaldimedon (1,1`,3,3`-tetraketo-5,5,5`,5`-tetrametil- 2,2`-diciklohexilmetán) + H 2 O 21. ábra A dimedon és formaldehid között lejátszódó irreverzibilis reakció, mely formaldimedon kialakulásához vezet [197]. Kísérleti eredmények és a fentebb említett biokémiai folyamatok alapján feltételezheto, hogy a különbözo biológiai rendszerekben gyors, primer HCHO körfolyamat muködik, melyben az L- metionin képzodése az L-homociszteinbol, valamint a HCHO keletkezése az SAM-ból alapveto fontosságú (22. ábra). 57

58 22. ábra A primer HCHO körfolyamat lehetséges fo biotranszformációs lépései[23]. Az SAM-ból keletkezo HCHO számos molekulához kapcsolódhat (akceptor molekulák, pl. nukleinsavak, aminosavak, fehérjék, hisztamin, stb.), az L-homocisztein L-metionin átalakuláshoz szükséges HCHO pedig szintén több forrásból származhat (HCHO generátorok, pl. 5-metiltetrahidrofolát, betainok, stb.) [22]. Az endogén HCHO szélesköru elofordulása a különbözo biológiai rendszerekben, valamint szerepe a transzmetilezési reakciókban egyaránt azt jelzik, hogy a korábbi feltételezésekkel szemben a molekula nem melléktermék, hanem alapveto szereploje a sejtek anyagcsere folyamatainak, nagyrészt még ismeretlen funkciókkal Az endogén formaldehid szerepe a növényi anyagcserében Nagyszámú növényfaj vizsgálata támasztja alá az endogén HCHO jelenlétét a növényi szövetekben, sejtekben [166,24-27]. Adrian-Romero és munkatársai [24], valamint Blunden [28] átfogó vizsgálataik során több alga, zuzmó, moha, haraszt, nyitvatermo és zárvatermo fajt (valamint több gombát és néhány cianobaktérium fajt) vizsgáltak meg az endogén HCHO tartalom szempontjából. A meghatározás dimedon adduktum (formaldimedon) formájában történt, túlnyomásos rétegkromatográfiás (OPLC ) és HPLC módszerekkel. A vizsgált minták valamennyiében sikerült a HCHO-et kimutatni és mérni, változó mennyiségben (friss súlyra vonatkoztatva <1 µg g µg g -1 ). A vizsgált egyedekben mért értékek közötti jelentos eltéréseket egyrészt a fajok közötti különbség, másrészt az adott növények begyujtési ideje is befolyásolhatta. A tavasszal gyujtött mintákban jóval nagyobb HCHO-tartalmat sikerült mérni, mint az osszel és a tél folyamán begyujtött egyedekben. A fiatal szövetekben zajló intenzív osztódással és növekedéssel párhuzamosan jelentosen 58

59 megemelkedik a metilezett vegyületek (pl. metilezett bázikus aminosavak) és a mérheto HCHO mennyisége, mely feltehetoen az intenzív metilezési reakciók eredménye [29]. A szövetek, szervek öregedése során (pl. az oszi levélhullás idején) ismételten nagyarányú endogén HCHO szint emelkedés észlelheto, melyet ekkor a metilezett vegyületek szintjének csökkenése kísér. Ez a demetilezési folyamatok túlsúlyba kerülésének tulajdonítható, melyek során mind HCHO, mind pedig különbözo demetilezett vegyületek képzodhetnek [189]. Az idos szövetekben ugyanakkor fokozottan fennáll a H CHO képzodésének lehetosége, mely igen reaktív, toxikus molekula. Elobbi vegyület pl. a HCHO és H 2 O 2 reakciója során keletkezhet. Mivel a H 2 O 2 fontos szerepet tölt be az oxidatív demetilezés során, az idos szövetekben lezajló intenzív demetilezés lehetoséget biztosít a HCHO és H 2 O 2 közvetlen reakciójára [21]. Albert és munkatársai [25] Quercus cerris L. makkok csírázása során vizsgálták az endogén HCHO mennyiségét formaldimedon formájában HPLC és MALDI-MS módszerekkel. A csírázás kezdetéig a mérheto HCHO koncentráció jelentosen megemelkedett (173% -al a csírázást megelozo 48 órán belül), majd magas értéken stabilizálódott. Érdekes megfigyelés, hogy a kialakuló gyökerek mérheto HCHO tartalma nott a csírázás egész folyamata során. Az Ascophyllum nodosum alga vizsgálatakor, az endogén HCHO koncentráció meghatározása során alkalmazott dimedon hatására irreverzibilisen keletkezo formaldimedont VRK, OPLC, EItömegspektrum, valamint H-NMR spektrum alapján is azonosították, mind a friss, mind pedig a szárított mintákból. A különbözo, N-, S- és O-metil csoportokat tartalmazó vegyületek a sejtekben lezajló, dinamikus metilezési és demetilezési folyamatok során mind HCHO megköto, raktározó, mind pedig HCHO forrásként szerepelhetnek. Ezekbol a funkciós csoportokból eltéro ph viszonyok mellett, dimedon jelenlétében egyaránt képzodhet formaldimedon [189]. Az L-arginin és 14 HCHO in vitro reakciójának vizsgálata során sikerült igazolni különbözo izotóppal jelzett hidroximetil-arginin származék (N G -trihidroximetil- 14 C-arginin Tri HMA, N G -dihidroximetil- 14 C-arginin Di HMA és N G -monohidroximetil- 14 C-arginin Mo HMA) képzodését, melyek reverzibilis módon kötik meg a HCHO-et és viszonylag stabil molekulák [27]. A különbözo HMA molekulák melyek nagyobb mennyiségben találhatók meg a növényekben fiziológiás körülmények között, közvetlen kémiai reakció során képesek átadni a hidroximetil csoport(ok) formájában kötött HCHO-et a THF-nak, melynek eredményeként a folát ciklus egyik tagja, az N 5 -N 1 - metiléntetrahidrofolát koenzim képzodik. Ez felveti annak lehetoségét, hogy az endogén HCHO, illetve a különbözo HMA molekulák a folát ciklustól részben elkülönülo, de szükség esetén gyorsan mobilizálható tartalékot képeznek a C1 metabolizmus számára [211]. Korábbi kísérleti eredmények ugyanakkor azt mutatták, hogy a C 1 metabolizmus szempontjából alapveto fontosságú, a szerin- 59

60 hidroximetiltranszferáz által katalizált szerin - glic in konverzió során az enzim aktív centrumában, a szerinrol származó kötött HCHO-et tartalmaz, mely a THF-al reagálva szintén a N 5 -N 1 - metiléntetrahidrofolát képzodéséhez vezet [212]. Szarvas és munkatársai [213] 14 CO 2 felhasználásával igazolták, hogy a fotoszintézis során H 14 CHO keletkezett, melynek jelenlétét szintén dimedonnal sikerült kimutatni. Zea mays sejtekben már rövid ido elteltével sikerült azonosítani a Tri HMA, Di HMA és Mo HMA molekulákat, ami szintén arra utal, hogy a fotoszintézis során HCHO képzodhet, melyet a levelekben jelenlévo L-arginin képes megkötni. A keletkezo hidroximetil-arginin származékok nem citotoxikusak, antiproliferatív hatással rendelkeznek [27]. A legújabb kísérleti eredmények azt mutatják, hogy a fotoszintézis során keletkezo HCHO nem csupán az L-argininnel, hanem akár Rubisco enzim hiányában a ribulóz- 1,5-difoszfát molekulákkal is képes reagálni a HCHO és L-aszkorbinsav reakciójához hasonlóan [214]. Ez azt jelzi, hogy a HCHO nem csupán keletkezhet a fotoszintézis során, hanem annak egyik kulcsfontosságú molekulájával, közvetlenül is képes reagálni. Phaseolus vulgaris L. egyedfejlodésének tanulmányozása során a fiatal és idosebb levelek viszonylag nagyobb HCHO szintje mellett kimutatták a kolin és trigonellin koncentrációjának folyamatos csökkenését és a peroxidázok aktivitásának emelkedését a növény öregedésével párhuzamosan [215]. A betainok a növényvilágban széles körben elterjedt, változatos funkciókkal rendelkezo N-metilezett amino- és iminosavszármazékok. Ismert a TML sejtosztódást elosegíto, valamint abiogén stresszhatások során érvényesülo védo hatása [216]. A trigonellin fitohormon hatással rendelkezik, a kolin pedig számos foszfolipid (pl. lecitin) alkotórésze [217,218]. D. innoxia L. kallusztenyészetek vizsgála ta is alátámasztotta az endogén HCHO koncentrációban és a metilezett vegyületek mennyiségében, a növényekben az egyedfejlodés során észlelt változásokat. A fiatal D. innoxia kalluszkultúrákban viszonylag nagyobb HCHO koncentráció volt mérheto, mely a tenyészetek öregedése során csökkent, majd a 6. hetet követoen ismét megemelkedett. Ezzel párhuzamosan a TML, kolin és trigonellin koncentrációk folyamatosan csökkentek az ido elorehaladtával, így a 6. hetes kultúrákban észlelt nagyobb HCHO szint már kis betain koncentrációval társult. Ezen eredmények alapján megállapítható, hogy növényi szövettenyészet is sikeresen alkalmazható a HCHO anyagcserében betöltött szerepének vizsgálatára [189] Az endogén HCHO tartalom és a stresszhatások kapcsolata A növényi szervezeteket életük során számtalan stresszhatás érheti, melyek biogén (pl. vírusfertozés, hiperszenzitív reakció - HR) és abiogén stresszhatások (pl. hostressz) egyaránt lehetnek. Mivel az endogén HCHO tartalom, valamint a növények anyagcsere folyamatai, vegetációs periódusa között 6

61 sikerült kapcsolatot kimutatni, így nem meglepo, hogy a különbözo stresszhatások melyek az anyagcserefolyamatokra szintén jelentos hatással vannak során jellemzo módon változott egyes megvizsgált növények HCHO tartalma. N. tabacum cv. Xanthi nc növények dohánymozaik vírussal (TMV) történt fertozését követoen a mérheto HCHO szint emelkedése volt regisztrálható a fertozést követo 24 órán belül. Gázkromatográfiás és radiometriás (dimedon-6-14 C alkalmazásával) mérések igazolták, hogy a megemelkedett HCHO szint a fertozést követo 2-3 nap után ismét a kontroll (nem fertozött növény) szinten stabilizálódott. Ezen eredmények alapján feltételezheto volt, hogy a megemelkedett HCHO szint, illetve a HCHO metabolizmusban történt változás kapcsolatban állhat a vírusfertozéssel [23,219]. Mivel jelen esetben is felmerült a potenciális HCHO forrásként szereplo metilezett vegyületek szerepe, Burgyán és munkatársai [22]. megvizsgálták a növényekbol eloállított, tisztított demetiláz enzim aktivitását több, szubsztrátként szereplo molekula segítségével. Nem jelzett L- metionin, SAM, N-metil-taurin, L-metionin-DL-szulfoxid, 4-metoxitirozin + jelzett dimedon-6-14 C alkalmazásával mérheto volt a reakció során keletkezo HCHO mennyisége. A fertozött növények demetiláz aktivitása minden szubsztrát esetén meghaladta az egészséges növényekben mért értékeket. Az eredmények igazolására L-metionin-(S- 14 CH 3 ) + dimedon alkalmazásával is megismételték a mérést, így bizonyítható volt, hogy a keletkezo HCHO az L-metionin S-metilcsoportjából keletkezett az oxidatív demetilezési folyamat során. Ezek az eredmények az oxidatív metabolizmus korai megváltozását jelzik a TMV fertozés során. Ismert, hogy számos metabolikus változás történik a dohány TMV-al történt fertozését követoen (pl. polifenol-oxidáz, peroxidáz és fenilalanin-ammonia-liáz enzimek aktivitásának emelkedése, stb.), ezek a változások azonban csak a fertozést követo legalább 2 napot követoen voltak mérhetok a de novo enzimszintézis eredményeként [221]. Citrullus vulgaris L. Fusarium oxisporummal történt fertozését követoen szintén a HCHO szint rendkívül gyors emelkedését, valamint a metilezett vegyületek koncentrációjának csökkenését lehetett észlelni [26,222]. Szárazság-stressz hatására a Phaseolus vulgaris L. szöveteiben mérheto HCHO tartalom emelkedett, míg ezzel párhuzamosan a trigonellin koncentrációja csökkent [223]. Abiogén stresszhatások közül a hostressz HCHO metabolizmusra gyakorolt hatását részletesen vizsgálták Phaseolus vulgaris cv. Pinto növényekben [224]. A szerzok kimutatták, hogy a vizsgált homérséklettartományban (1 o C 4 o C) szoros kapcsolat mutatható ki a homérséklet és a mérheto HCHO tartalom között. A környezeti homérséklet emelkedésével párhuzamosan közel megháromszorozódott a detektált endogén HCHO mennyisége. Néhány kvaterner ammóniumvegyületet (TML, kolin, trigonellin), mint potenciális HCHO forrást vizsgálva megállapították, hogy ezek koncentrációja csökkent a levelekben a 2 o C 4 o C ig terjedo 61

62 homérséklet-tartományban. Fontos megjegyezni, hogy a kvaterner ammóniumvegyületek stresszhatások során betöltött szerepét már korábban feltételezték [225]. Az endogén HCHO keletkezéséhez szükséges enzimatikus reakciókat tanulmányozva, a hidrogénperoxid függo N-demetilázok és peroxidázok aktivitása P. vulgaris sejtmentes kivonatában, szobahomérsékleten közel megegyzett a kontroll növényekben mért értékkel. A hosokkot követo megemelkedett HCHO szintre magyarázatot adhat ezen enzimek aktivitásának homérsékletfüggése [226]. Csírázó tölgymakk (Quercus cerris L.) hideg- és hostressz hatására (-2 o C-on és +4 o C-on) bekövetkezo endogén HCHO tartalom változását vizsgálva megállapították, hogy a mérheto HCHO tartalom két alkalommal ér el minimális értéket a vészfázis során (az elso három órán belül, majd a 3. és 5. nap között), valamint a késobbiekben a kontrollhoz képest nagyobb értéken stabilizálódik [227] Programozott sejthalál és apoptotikus formája a növényekben, kis- (pl. H 2 O 2 és HCHO) és nagymolekulák szerepe A soksejtes szervezetek fejlodése szempontjából alapveto fontosságú egy olyan fiziológiai mechanizmus, mely lehetové teszi a sejtosztódás és elimináció egyensúlyának fenntartását [228]. A humán és állati szervezetekhez hasonlóan - bizonyos körülmények között - a növényekben is genetikai program lép muködésbe a nem kívánt sejtek eltávolítására. Ezt a folyamatot, melyben az adott sejt aktívan vesz részt saját elpusztításában programozott sejthalálnak (PCD) nevezzük [229,23]. Ennek során - külso kiváltó ok, vagy belso folyamatok hatására - meghatározott gének aktiválódnak és specifikus enzimek lépnek muködésbe, melyek az adott sejt eliminációjában vesznek részt [231]. Ez a folyamat alapvetoen eltér a nekrózistól, melynek során a sejtnek nincs aktív szerepe saját pusztulásában. Nekrózis során valamilyen stresszhatás (pl. iscemia, ho-, kémiai-, ill. más biogén, vagy abiogén stressz), traumás sérülés a sejtmembrán, sejtorganellumok közvetlen sérülését idézi elo, melynek eredményeként a károsodott sejt szétesik [232,233]. A humán és állati szövetekben megfigyeltek alapján a nekrózissal ellentétben a PCD során nem alakul ki gyulladásos válaszreakció, továbbá nagyon lényeges eltérés, hogy a folyamat energiát is igényel [233]. Megfigyelték, hogy alacsony adenozin-trifoszfát (ATP) szint mellett azok a folyamatok, melyek PCD -t indukálnának, végül nekrózist indítanak el [234]. Egyes szerzok megkülönböztetik a fiziológiás sejthalál folyamatát is azokban az esetekben, ahol nem tisztázott, hogy PCD, vagy apoptózis történik (23. ábra) [235]. Alapveto felismerés, hogy a PCD folyamatának zavara számos kóros elváltozás, betegség kialakulásáért teheto felelossé [236]. 62

63 Környezeti stresszhatások Egyedfejlõdés A sejt véletlenszerû pusztulása Fiziológiás sejthalál Véletlenszerû DNS lebomlás, a sejtorganellumok és plazma membránjának szétesése Genetikai program, kaszpázok, DNS lebontás 18 bp hosszúságú szakaszokra Jellegzetes morfológia, apoptotikus testek keletkezése Nekrózis PCD Apoptózis 23. ábra A sejthalállal kapcsolatos jelenségek sematikus vázlata (folyamatos vonalak: aktív folyamatok, szaggatott vonalak: passzív folyamatok) [235]. A PCD folyamatát funkcionálisan három fo szakaszra lehet bontani [233]: - Stimulus függo indukciós fázis. - Effektor szakasz, mely során a különbözo kiváltó okok eredményeként szabályozó mechanizmusok aktiválódnak. - Degradációs fázis, mely során a PCD re jellemzo morfológiai változások végbemennek. PCD történik pl. a HR során, de alapveto szerepe van a folyamatnak a növényi egyedfejlodés alatt is (pl. szervek öregedése, szállítószövet rendszer differenciálódása, magvak fejlodése és csírázás során) [ ]. A szervek, szövetek öregedését lezáró PCD lassúbb folyamat, melyet az öregedo sejtek anyagcseretermékeinek fiatalabb sejtek számára történo újrahasznosítása is megeloz, ezzel szemben a HR során gyors sejtelhalásra van szükség a kórokozókkal szembeni reakció során [23,231,24]. A növényi sejtek programozott halálát kiváltó folyamatok közül (pl. fertozés apatogén kórokozóval hiperszenzitív válaszreakció során) még viszonylag keveset ismerünk részletesebben, továbbá a folyamatok biokémiai háttere is kevéssé tisztázott [241] A növényi apoptózis morfológiai jellemzé se Az apoptózis elnevezést eloször Kerr és munkatársai [242] használták, magát a folyamatot azonban már sokkal korábban, a XIX. század közepén leírták [243]. Az apoptózis a PCD speciális típusa, 63

64 melynek számos morfológiai jellemzoje van és jellemzo fiziológiai folyamat kísér (24. ábra) [228]. Kiváltó oka lehet többek között citotoxikus vegyület, mely pl. DNS károsodást okoz, ceramidok, mycotoxinok, SA, UV (ultraviola) sugárzás és oxidatív stressz. A klasszikus szemléletnek megfeleloen az apoptózis aktív folyamat, mely során fehérjeszintézis történik. Ezzel szemben számos esetben igazolták, hogy a folyamathoz nem szükséges fehérjeszintézis, továbbá a szintézis gátlása apoptózist indukál [243]. 24. ábra Morfológiai és ultrastrukturális változások az apoptózis során állati sejtben (a) és hiperszenzitív válaszreakció során növényi sejtben (b). A sejtmag lebontásában mindkét esetben endonukleázok vesznek részt. Állati sejtekben a keletkezett apoptotikus sejteket a szomszédos sejtek fagocitálják (a). Növényi sejtekben a szomszédos sejtek által kiválasztott nukleázok is résztvesznek a sejtmag lebontásában (b). Rövidítések: M, mitokondrium; N, nukleusz; ER, endoplazmatikus retikulum; G, Golgi apparátus; V, vakuólum [228]. Az apoptózist kíséro jellegzetes morfológiai változások a kromatin állomány kondenzálódása, a sejtfalfelépítés asszimetriájának elvesztése, a citoplazma és a sejtmag zsugorodása és vakuolizációja, sejt-sejt kapcsolatok megszunése, a sejtmag DNS fragmentálódása, oligonukleoszómális fragmentumok kialakulása, valamint membránnal határolt, ún. apoptotikus testek kialakulása [228, ]. A sejtfalfelépítés asszimetriájának elvesztése, valamint kulcsfontosságú fehérjék (pl. poli(adpribóz)polimeráz) hasítása a kaszpázok aktiválásának eredményeként pedig fontos biokémiai változások [235]. Megfigyelték ugyanakkor, hogy mindezen változások során a mitokondriumok viszonylag hosszú ideig megorzik integritásukat [228,25], funkciójuk azonban károsodik az 64

65 apoptózis folyamata alatt [243]. A növényi sejtek felépítése eltér a humán és állati sejtektol, mivel a sejtmembrán mellett sejtfal is határolja oket, ez pedig hatással van az apoptózis folyamatára is. A sejtfal pl. gátolja membránnal határolt apoptotikus testek kialakulását és szomszédos sejtek általi fagocitózisát. A növényekben ezért nagy je lentosége lehet az autolízisnek, melyet a tracheák kialakulása során is megfigyeltek [251]. Egyéb eltéréseket is észleltek, mivel a növényi sejtmag állománya általában a sejtmag egészében kondenzálódik, eltéroen az állati sejtektol, ahol a kromatin állomány a maghártya mentén lokalizálódik a kondenzálódás során. A növényi sejtmag általában nem 25. ábra A növényi sejt sorsa a PCD-t követoen. Mind a sejttartalom, mind pedig a sejtfal eltunik (1). A sejt maradványait a szomszédos, növekvo sejtek összepréselik (2). A sejtfal marad meg (3). A sejthalál a sejttartalom szervezett remobilizációját követi az öregedés során, majd az elhalt sejteket tartalmazó szerv leválik a növényrol (4) [232]. fragmentálódik és viszonylag intakt marad apoptózis során [228]. Elektronmikroszkópos vizsgálatok tárták fel ún. sarló alakú sejtmagok jelenlétét Nicotiana tabacum sejtekben TMV fertozést követo PCD során, további vizsgálatoknak kell azonban igazolni, hogy ez a morfológiai jellemzo apoptotikus markerként is alkalmazható-e [235]. A sejttartalom eltávolítása többféle módon is történhet, melyet a sejthalált kiváltó körülmény alapvetoen befolyásol. Az apoptózis idobeli lefutása a növényi szervezetekben általában hosszabb 65

66 (esetleg több óra), valamint sok esetben a jellemzo morfológiai bélyegek közül csupán néhányat sikerült egyértelmuen leírni [229]. Glycine maximum L. sejtekben, Pseudomonas syringae fertozés, valamint Alternaria toxin hatására indukálódó PCD során azonban a jellegzetes apoptózisnak megfelelo morfológia legtöbb jellemzojét sikerült detektálni alapos mikroszkópos analízist követoen [228]. Az eddig elért kísérleti eredmények tükrében a növények esetében inkább apoptózis-szeru jelenségekrol beszélhetünk, mivel az állati sejtek apoptózisára jellemzo változások közül egyesek hiányoznak [235] TUNEL reakció alkalmazása a növényi apoptózis detektálására Az apoptózis folyamatát kíséro jellegzetes változások egyike a DNS fragmentálódása, melyet Ca 2+ - dependens endonukleáz enzimek katalizálnak. A DNS lebontásában fontos szerepe lehet továbbá a Zn 2+ -dependens DNáz enzimeknek is [252]. A DNS lebontása 3 és/vagy 5 kb nagyságú fragmentumok endonukleolitikus képzodésével veszi kezdetét, majd ezek a fragmentumok hasadnak tovább a nukleoszómák közötti, összeköto DNS szakaszok mentén [228]. A keletkezo, általában 18 bázispár (, vagy ennek többszörösének megfelelo) hosszúságú fragmentumok in situ detektálhatók olyan reagensekkel, melyek a DNS szakaszok szabadon álló 3`-OH végével képesek reagálni. Fontos megjegyezni azonban, hogy a keletkezo DNS fragmentumok mérete - úgy tunik - ettol eltéro is lehet, mivel pl. Nicotiana tabacum sejtekben lezajló PCD során 5 kb méretu fragmentumok kialakulását észlelték [253]. Nekrózis során a DNS lebomlása véletlenszeruen történik, így a keletkezo fragmentumok mérete is igen heterogén [235]. Az ún. TUNEL reakció ( terminal deoxynuclotidyl transferase-mediated dutp nick end labelling ) során UTP konjugált terminális dezoxinukleotid-transzferáz segítségével marker molekulá t kapcsolnak a nukleoszómális fragmentumok 3`-OH végéhez [235,254]. A vizsgálatot körültekintéssel kell végezni, mivel a DNS nem apoptotikus sejthalál során is degradálódhat, ami szintén pozitív reakciót adhat [255]. Egyes szerzok beszámoltak arról, hogy a növényi szövetek feldolgozása, fixálása, metszése során is bekövetkezhet olyan mértéku DNS fragmentálódás, amely pozitív TUNEL reakciót adhat. A reakció kivitelezése során ezek a hibák azonban ma már kiküszöbölhetok. Szövettenyészetek alkalmazásával pl. a fixálás egyszerubbé válik, ami kiküszöböli a DNS hasadását a folyamat során [235]. A TUNEL reakció alkalmazásakor azonban más, pl. morfológiai jellemzoket is célszeru figyelemmel kísérni az apoptózis pontosabb detektálásához. A sejtmag DNS fragmentálódását kimutatták növényi sejtekben is TUNEL reakció segítségével, melyet pl. patogén által szintetizált toxin, ill. UV-C besugárzás váltott ki [256,257]. Wang és 66

67 munkatársai [255] árpa csírázása során sikeresen alkalmazták a TUNEL reakciót aleuron tartalmú sejtek PCD-ának tanulmányozására, a folyamat idobeli és az embrióhoz viszonyított térbeli lefutásának vizsgálatára Az apoptózis folyamatában szerepet játszó gének Az állati szervezetekben számos gén ismert, melyek indukáló (pl. BAX), vagy gátló (pl. BCL-2, BI-1, DAD1) szerepet töltenek be az apoptózis szabályozásában. Ezen gének növényi homológjainak azonosítása, klónozása még alig adott konkrét eredményeket. Vizsgálták azonban a növényekbe juttatott állati gének muködését. Nicotiana tabacum-ba juttatott patkányból származó BAX gén pl. HR szeru sejthalált indukált [258]. Egy állati gén növényi expressziója azonban önmagában még nem támasztja alá homológ gén jelenlétét. Immunokémiai vizsgálatokkal azonban további részleteket tárhatnak fel. Humán BCL-2 ellen eloállított antitestekkel N. tabacum kivonatában sikerült azonosítani egy lehetséges növényi homológot [259] A programozott sejthalál aktiválásában szerepet játszó hírvivo folyamatok A növényi sejtek PCD-jának aktiválásában szerepet játszó szignál folyamatok úgy tunik az állati sejtekben megfigyeltekhez hasonlóan igen változatosak lehetnek [251]. Számos kísérlet irányul az állati és növényi PCD-t szabályozó molekuláris mechanizmusok közötti esetleges párhuzamok feltárására, így pl. az ún. dad1 fehérje ( defender against death ) mely a PCD gátlására képes - homológját sikerült azonosítani Oryza sativa és Arabidopsis thaliana sejtjeiben is (26. ábra) [228]. Ez az eredmény is egyértelmuen jelzi, hogy a szabályozó mechanizmusok egy része közös lehet a növényi és állati szervezetekben. Igazolták a sebzés és növényi növekedésszabályozó anyagok (auxin és citokinin kezelés) PCD-t kiváltó hatását in vitro fenntartott Zinnia sejteken [26]. A citokinin ugyanakkor gátolja a levelek öregedése során bekövetkezo PCD-t, ezzel szemben indukálja a folyamatot a trachea elemeiben, mely megfigyelések jelzik a szabályozó mechanizmusok sokrétuségét [229]. Kimutatták a Ca 2+, etilén, szalicilsav (SA), reaktív oxigéntartalmú molekulák (ROS), extracelluláris proteázok és nukleázok szerepét is a folyamat megindításában, feltételezik az elektron- és protontranszport folyamatok változásának hatását, valamint egyre több megfigyelés támasztja alá a mitokondrium központi szabályozó szerepét [228,261,262]. 67

68 26. ábra A dad1 fehérje nagymértékben konzerválódott, mintegy 9 aminosavból álló szakasza. Vastag betuk: megegyezo aminosavak; X: nem azonosított aminosav; -- : nem részletezett fehérje szakasz [228] Mitokondrium és enzimfehérjék szerepe a programozott sejthalál során A PCD folyamatának elindításában résztvevo különbözo anyagcsereutak kapcsolata még nem ismert részletesebben, a mitokondrium alapveto szerepe az emlos sejtekben lezajló PCD kialakulásában (pl. a citokróm c felszabadulása mitokondriumból, kaszpázok aktiválása) azonban felveti, hogy pl. a ROI, hypoxia, tápanyagmegvonás, elektrontranszport folyamatának károsodása a mitokondriumon keresztül állnak összefüggésben a növényi szervezetekben is [235,263,264]. A citokróm c kiáramlása a mitokondriumból alapveto fontosságú a kaszpázok aktiválásában, felszabadulásának pontos mechanizmusa a mitokondrium membránján keresztül azonban még további vizsgálatokat igényel. Lehetséges, hogy egy speciális pórus komplex aktiválódik, létrehozva az ún. átmeneti permeabilitási pórust, esetleg a feszültségfüggo anion-csatorna segítségével [264]. Különbözo fehérjék szerepének tanulmányozása során, a Bcl-2 családba tartozó pro- és antiapoptotikus fehérjék - transzgénként növényekbe juttatva is - hatással vannak a PCD folyamatára a mitokondriumok membránjának permeabilitására gyakorolt hatásuk révén [265]. Az anti-apoptotikus hatású Bcl-2, Bcl-x és CED-9 fehérjék N. tabacum-ban gátolták a sejthalál kialakulását több, gomba eredetu fitopatogén anyaggal szemben [266]. Bcl-2 fehérjék a mitokondriumokban, plazmamebránban, az endoplazmatikus retikulumban és a sejtmaghártyában is megtalálhatók (ezek a helyek a reaktív oxigéntartalmú molekulák képzodése szempontjából is alapveto fontosságúak) [243]. 68

69 A szintén Bcl-2 családba tartozó, pro-apoptotikus hatású Bax expresszálódása HR szeru sejthalált idézett elo a dohányszövetben [258]. Ezek az eredmények egyértelmuen jelzik, hogy a mitokondrium a növényekben is alapveto szerepet tölt be a PCD szabályozásában, és ezen muködése emlosgének bejuttatásával is aktiválható. Bár a Bcl-2 családba tartozó fehérjéket eddig nem sikerült növényekben kimutatni, kaszpáz jellegu (ú.n. metakaszpáz) fehérjék szintéziséért felelos géneket már azonosítottak növényekben [267], valamint kaszpáz inhibitorok alkalmazásával sikerült befolyásolni a növényi PCD folyamatát. A kaszpázok blokkolhatók a megfelelo szubsztráthoz kapcsolt aldehid (reverzibilis inhibitor), vagy metilketon (irreverzibilis inhibitor) molekulával [235]. Peptid-klórmetil keton kaszpáz inhibitorral sikeresen blokkolható a NO - H 2 O 2 által indukált sejthalál Arabidopsis thaliana szuszpenziós kultúrákban [268]. Újabb eredmények azonban azt mutatják, hogy a kaszpázok - pl. kaszpáz 3 és kaszpáz 8 - gátlása mellett is bekövetkezhet a sejt halála az ún. onkózis során [264]. Humán és állati sejtekben megfigyeltek alapján az onkózist nem tekintik programozott sejthalálnak, mivel a sejt szétesése és a sejttartalom kiáramlása gyulladásos válaszreakciót indukál. A növényi szövetekben azonban a sejtfalak jelenléte miatt a sejttartalom szabad kiáramlása gátolt, ezért egyes szerzok felvetik, hogy a növényekben számos esetben programozott onkózis lehet a felelos a sejtek eliminációjáért [264]. A kaszpázok mellett egyéb, cisztein és szerin proteázok is szerepet játszhatnak a HR folyamatában. Solomon és munkatársai [269] sikeresen gátolták ROS képzodését és baktérium által aktivált sejthalál kialakulását a cisztein proteáz inhibitor cisztatin segítségével G. maximum sejtkultúrákban. Gietl és Schmid Ricinus communis magvak csírázását tanulmányozva [231] a ricinoszómákból felszabaduló papain típusú cisztein endopeptidázok jelentoségét emelik ki a PCD késoi szakaszában. A növényi sejtek esetében felmerül a mitokondriumokhoz hasonlóan szintén mikrobális eredetu - kloroplasztok PCD ban betöltött esetleges koordináló szerepe [228]. Megfigyelték a fény/sötétség hatását a PCD (pl. HR) folyamatára [27,271], valamint azt, hogy a kloroplaszt membránjainak szétesése a sejthalál végso fázisában volt csupán észlelheto P. vulgaris levelének sejtjeiben HR során [272]. Ezzel szemben, levelek öregedésekor a kloroplasztoknak a folyamat korai szakaszában történt autolízisét és szétesését figyelték meg PCD során [273] Reaktív oxigéntartalmú molekulák (ROS) szerepe Különbözo stresszhatások, különösen azok, melyek hatással vannak a sejt redox homeosztázisára PCD folyamatokat indíthatnak el. A növényi szövetekben számos folyamat vezet ROI k keletkezéséhez és a PCD aktivációjához. Ilyenek pl. az öregedés, melynek során csökken a sejt ROI 69

70 el szembeni detoxikáló képessége [271] a hideg [274] és az ozmotikus stressz [275], UV sugárzás [276], SA [27], és avirulens kórokozóval történo fertozés a HR során [277,278]. Újabb vizsgálati eredmények alapján hasonlóságokat tártak fel a különbözo stresszhatások, mint pl. a toxin és patogén által kiváltott PCD között [239]. A PCD (pl. HR) vizsgálata során számos esetben felmerült a reaktív oxigéntartalmú molekulák (ROI, ROS), mint pl. szuperoxid (. O - 2 ) és a H 2 O 2 szerepe, mint szignálmolekula és/vagy a folyamat kiváltója, bár több ellentmondó eredmény áll rendelkezésre [27,279]. A HR során keletkezo ROI továbbá közvetlenül is károsíthatja a kórokozókat, ezzel is erosítve a növény védekezo mechanizmusait [24,277]. Ezeken túlmenoen, a HR aktivációjának korai szakaszában megfigyelt változások (a szövetek oxidatív károsodása, Ca 2+ és H + beáramlás a sejtekbe, K + és Cl - kiáramlás a sejtekbol) jelzik, illetve hozzájárulnak ROI (pl. Ȯ2- ) termeléshez [28]. A plazmamembránon át lezajló iontranszportban történo változások ugyanakkor a citoszol ph-jának csökkenéséért is felelosek [228]. Lycopersicon esculentum Mill. sejtszuszpenziós kultúrákban megfigyelték, hogy a humán daganatterápiában alkalmazott topo izomeráz-i inhibitor kamptothecin adagolása programozott sejthalált váltott ki a sejtekben, mely során az apoptózisra jellemzo morfológiai változások (kromatin kondenzáció, DNS fragmentáció) is észlelhetok voltak. A kamptothecin alkalmazását követo 2 órán belül a H 2 O 2 produkció jelentos emelkedését mérték a sejteken belül, mely Ca 2+ -csatorna blokkolóval, kaszpáz- és NADPH inhibitorral egyaránt gátolható. A szerzok az etilén mellett több reaktív oxigéntartalmú molekula és az oxidatív stressz alapveto szerepét is feltételezik az apoptotikus folyamat aktiválásában [249]. Hasonló megfigyeléseket tettek Daucus carota L. sejtszuszpenziós kultúrákban a C-források megvonását követoen. A stresszhatás során észlelt megemelkedett szuperoxid produkciót, mind pedig a PCD folyamatát sikeresen blokkolták NADPH oxidáz gátló alkalmazásával [281]. Humán sejteken végzett számos megfigyelés utal továbbá arra, hogy a sejt redox homeosztázisa, oxidatív stressz közvetlenül befolyásolja a citoszol iontartalmát [243]. Kísérleti eredmények jelzik, hogy az oxidatív stressz hatással lehet a citoszol Ca 2+ tartalmára, mivel a Ca 2+ sejtbe történo beáramlását timocitákban blokkolni lehet az antioxidáns hatású N-acetil-L-ciszteinnel [282]. Hasonló hatást figyeltek meg a sejten belüli raktárakból történo Ca 2+ felszabadulásra vonatkozóan hepatocitákban, glutation adagolását követoen [283]. Úgy tunik tehát, hogy minden, a sejtben található Ca 2+ pumpa (plazmamembránban, mitokondriumban és endoplazmatikus retikulumban) közvetlen redox szabályozás alatt állnak [243]. Az elektrontranszport folyamatának károsodása a mitokondriumon belül közvetlenül is hozzájárulhat ROS felhalmozódáshoz [251]. A HR során, az infekció helyén lezajló gyors sejtpusztulás a szisztémás 7

71 rezisztencia erosödését is eredményezheti különbözo, eddig még alaposan fel nem tárt folyamatokon keresztül [229]. A ROI-k kettos szerepet töltenek be a PCD folyamatában. Az indukciós fázis során, mint fakultatív szignálmolekulák szerepelhetnek, valamint a mitookondriális permeabilitás változás eredményeként közvetlenül is hozzájárulhatnak a sejt felbomlásához [233]. Kis dózisú H 2 O 2 [277,284],. O - 2 [27],. OH [285], vagy lipid peroxid kezelés [286] önmagában is elegendo PCD kiváltásához. Delledonne és munkatársai [279] megállapították, hogy a HR viszont blokkolható a szuperoxid dizmutáz (SOD) enzim gátlásával, mely a. - O 2 - H 2 O 2 á történo átalakulását katalizálja. Más eredmények azt mutatják, hogy a növényi sejtek saját. O 2 - termelo rendszere hasonló lehet a makrofágok NADPH oxidáz complexéhez, mivel a ROI termelés hasonlóan az emlos sejtekhez növényi sejtekben is blokkolható NADPH oxidáz gátló vegyüket mikromoláris koncentrációival [229,277,28]. Az emlosök immunrendszerének muködése során a keletkezo ROI reagálhatnak a nitrogén monoxiddal (NO), mely reakcióknak fontos szerepe van a PCD szabályozásában. Újabb eredmények alapján a HR folyamatában hasonló szerepe van a NO nak a növényekben is [251,279,287]. Úgy tunik, hogzy a PCD szabályozásában alapveto szerepe lehet a NO ROI aránynak, melyet a SOD muködése befolyásol, mely átalakítja a jelenlévo. O - 2 -ot és így elosegíti a PCD t kiváltó NO és H 2 O 2 felhalmozódását. A NO és. - O 2 - valamint indirekt módon a H 2 O 2 reakciója során keletkezo peroxinitrit (ONOO - ) szójabab sejtekben megfigyeltek alapján feltehetoen gátolja a PCD folyamatát. Fontos kiemelni tehát, hogy a. O - 2 egyrészt aktiválhatja a HR t a H 2 O 2 képzodésén keresztül, másrészt gátolhatja is a NO al történo reakción keresztül (27. ábra) [239]. Az emlos sejtekben ROI plazmamembránhoz kötött NADPH oxidáz komplex segítségével képzodhetnek kontrolláltan, míg a NO ot nitrogén monoxid szintáz enzim termeli (NOS). A NOS enzim növényi homoló gját eddig nem sikerült megtalálni, a NADPH oxidáz komplex homológjának jelenlétét azonban sikerült alátámasztani Arabidopsis thaliana sejtekben [288]. Egyes eredmények azt jelzik, hogy a SA-nak is szerepe van a ROI és NO által befolyásolt mechanizmusban - mely feltehetoen a sejtciklusra van hatással - a folyamat biokémiai háttere azonban eddig nem tisztázott (27. ábra) [239]. Mivel a növényeket számos környezeti hatás érheti, melyek befolyásolhatják a ROS keletkezését, aktív mechanizmusoknak kell muködni a ROS szint szabályozásában, ezzel is megóva a sejteket a véletlenszeruen aktiválódó PCD folyamatától [251]. Ezt a szerepet töltheti be pl. az úgynevezett alternatív oxidáz (AOX), mely az állati sejtekben nem, csupán a növényekben található meg. 71

72 Az oxidatív elektrontranszportot gátló anyagok - mint az antimicin A és a cianid - aktiválták az AOX expressziót, mely így kivédheti a ROS káros hatásait [289]. Jelentos AOX indukciót figyeltek meg számos egyéb, biogén stresszhatás következményeként is [251]. Proximális (fertõzött) sejt Disztális (nem fertõzött) sejt patogén receptor NO. - O2 SOD NO SOD. O2 - - ONOO H 2O 2 H 2 O 2 antioxidáns enzimek HR mikro HR, HR hiánya mobilis szignálmolekula (pl. ROI/SA?) 27. ábra A reaktív oxigéntartalmú molekulák (ROI) és nitrogén monoxid (NO) hiperszenzitív válaszreakcióra (HR) gyakorolt negatív és pozitív hatásának hipotetikus vázlata. (szuperoxid dizmutáz: SOD, szuperoxid:. O 2 -, hidrogén peroxid: H 2 O 2, peroxinitrit: ONOO -, szalicilsav: SA) [239] Oxidatív stressz, mitokondriumok és Ca 2+ homeosztázis kapcsolata a PCD folyamatában Az eddigi vizsgálatok alapján megállapítható, hogy a Ca 2+ alapveto szerepet tölthet be a PCD folyamatának elindításában a mitokondriumok membránjának permeabilitására gyakorolt hatásán keresztül (pl. a mitokondrium membrán PT pórusainak aktiválása és a citokróm c kiáramlás megindítása) azokban az esetekben, amik or a sejt ATP szintje kicsi [29]. A sejt redox homeosztázisának változása, az oxidatív stressz ugyanakkor a sejt szabad Ca 2+ tartalmára gyakorolt hatásán túl közvetlenül is aktiválhatja a PT pórusokat a ROS termelésén keresztül. Az elektrontranszport gátlása pl. NO-al csökkenti a sejt ATP szintjét, emeli a ROS szintet, mely folyamatok a Ca 2+ tartalom emelkedésével a mitokondriumon keresztül aktiválják a PCD folyamatát. A citoszol Ca 2+ tartalmának emelkedése ugyanakkor nem elegendo önmagában a PCD elindításához (28. ábra) [264]. 72

73 28. ábra A növényi sejtben lezajló programozott sejthalál szabályozásának egyik hipotetikus modellje [233]. A citokróm c felszabadulását amitokondriumból sikerült kimutatni Cucumis sativus szikleveleinek sejtjeiben PCD során, továbbá más növények sejtjeiben is abiogén stresszhatást követoen [291]. Zea mays sejteket vizsgálva megállapították, hogy D-mannóz adagolás hatására a citoszolban citokróm c szabadult fel. A D-mannóz gátolja a hexokinázokat és csökkenti a sejt ATP tartalmát, mely a PT pórusok kialakulásának egyik feltétele. A sejt ATP szintjének csökkentésén túl a D-mannóz emelheti a sejt ROS szintjét, mely folyamatok a citoplazma nagy Ca 2+ szintjével társulva segítik a PT pórusok kialakulását és így a citokróm c felszabadulását [264]. Megfigyelték, hogy egyéb stresszhatások, így pl. a hostressz is citokróm c felszabadulást váltanak ki a növényi sejtben [291] A szingulet oxigén toxikus és apoptotikus hatásai A molekuláris oxigén (O 2 ) nélkülözhetetlen az aerob élolények számára, ugyanakkor potenciálisan toxikus anyag. Alapállapotban, a két páratlan elektronnal rendelkezo O 2 viszonylag inert molekula. Gerjesztés hatására két, energiaszintjében eltéro állapot alakulhat ki, melyek közül a magasabb energiaszintu rendkívül rövid ido alatt (kb s) a kisebb energiaszintu állapotba kerül, melynek 73

74 hosszabb életideje (kb. 4 µs és >1 ms között) már lehetové teszi, hogy különbözo reakciókban vegyen részt. Ez utóbbi molekulát nevezzük szingulett oxigénnek ( 1 O 2 ). Habár a 1 O 2 energiaszintje csupán 94kJ/móllal nagyobb az alapállapotú O 2 -hez, a két molekula reaktivitása mégis alapvetoen eltér, mivel a legkülso elektronhéjukon elhelyezkedo elektronok kvantumkémiai tulajdonságai különböznek egymástól [292]. A 1 O 2 rendkívül reaktív molekula, mely károsítja a biomolekulákat, genotoxikus, citotoxikus hatású, továbbá szerepe van a génexpresszió aktiválásában is. Fotokémiai (bizonyos vegyületek látható, vagy UV fénnyel történt besugárzásával) és kémiai úton egyaránt eloállítható, továbbá a sejtekben endogén körülmények között is létrejöhet (pl. a gyulladásos folyamatok során) [292]. Dahl és munkatársai [293] olyan kísérleti rendszert hoztak létre, melyben más tényezoket kiküszöbölve vizsgálták a 1 O 2 baktériumokra kifejtett toxikus hatását. A 1 O 2 eloállítása azonban a sejteken kívül történt, így nem volt lehetséges annak pontos modellezése, hogy közvetlenül a sejteken belül képzodo 1 O 2 hogyan fejti ki hatását az ott jelenlévo makromolekulákra. A baktériumok sejtfala fizikai és kémiai határt képez a kívülrol behatoló 1 O 2 számára, mely csak ezt követoen léphet reakcióba az életfolyamatok számára alapveto funkciójú molekulákkal. A kísérleti eredmények azt mutatták hogy a 1 O2 a H2O2 nál nagyságrendekkel toxikusabb molekula. Míg 3 percnél rövidebb, kevesebb, mint 1-6 M-os 1 O 2 a Salmonella typhimurium sejtek 99% -át elpusztította, hasonló hatást csupán 6 perces, 1-2 M-os H 2 O 2 kezeléssel sikerült elérni. A 1 O 2 toxikus hatásai azonban a viszgált baktériumfajok némelyikében gátolhatók voltak a fehérje metabolizmus megváltoztatásával, így pl. az L-hisztidin túltermeltetésével, vagy a karnozináz enzim gátlásával [293]. Kochevar és munkatársai egy fotoszenzibilizáló festékanyag, a bengáli vörös látható (514nm) és UV- A fénnyel (355nm) történt besugárzásával állítottak elo elobb 1 O 2 -t, majd más oxidatív gyököket. A vizsgálatok során használt HL-6 sejtszuszpenziós kultúrák sejtjeiben észlelt nukleáris fragmentáció kvantitatív értékelése és a keletkezo oligonukleoszómális fragmentumok kimutatását követoen megállapították, hogy a látható fénnyel történt besugárzás hatására keletkezo 1 O 2 teheto felelossé az apoptotikus folyamatok beindításáért, melynek pontos mechanizmusa még nem ismert. Ezzel szemben, az UV-A fénnyel történt besugárzás eredményeként keletkezo oxidatív gyökök lipid oxidációs hatása volt jelentos, mely azonban nem jelent közvetlen apoptózis indukciót [294]. A 1 O 2 és H 2 O 2 apoptózis indukáló hatásának alaposabb vizsgálata feltárta, hogy HL-6 sejtekben a p38 protein-kináz aktivációját mindkét molekula eloidézheti, ezzel szemben a citokróm c felszabadulása a mitokondriumokból és a kaszpáz 3 aktivációja csak a 1 O 2 hatására következik be [295]. 74

75 Egyes eredmények arra utalnak, hogy az antitestek közvetve mintegy katalizátorként muködve - képesek 1 O 2 termelésre és annak vízmolekulákkal történo reakciójával H 2 O 2 eloállítására. Kimutatták, hogy ezen folyamatok segítségével az antitestek képesek a baktériumok elpusztítására immunsejtek (pl. makrofágok) közremuködése nélkül. Antitestek szerkezetének vizsgálatá val megállapították, hogy bizonyos aktív centrumok jelenléte, a különbözo aminosavak elhelyezkedése lényeges a 1 O 2 keletkezése szempontjából. Mivel az elvégzett kísérletekben UV sugárzást használtak a 1 O 2 képzodésének beindításához, így a szerzoknek nem sikerült megmagyarázni, hogy a szervezet belsejében, a bor felszínétol távol mi szolgáltathatja az energiát ehhez a reakcióhoz [296] A HCHO szerepe a sejtek apoptotikus folyamataiban A korábban leírt megfigyelések alapján az oszi levélhullás (görög nevén apoptózis) során észlelt drasztikusan megemelkedo mérheto HCHO koncentráció, továbbá a potenciális HCHO források (pl. kolin és trigonellin) szintjének csökkenése feltételezheto, hogy az exogén eredetu és a sejtekben kötött formában (pl. hidroximetil csoportok) jelenlévo HCHO fontos szerepet tölthet be az apoptotikus folyamatok elindításában és szabályozásában. Ennek során a koncentráció függvényében serkento és gátló hatás egyaránt érvényesülhet. HT-29 humán vastagbél karcinóma és HUV-EC-C humán endoteliális sejtek kultúráit vizsgálva megállapították, hogy a tápközegekbe adagolt HCHO kis koncentrációban (,1 mm) elosegítette mind a daganatos, mind pedig az endoteliális sejtek osztódását, továbbá csökkentette az apoptotikus aktivitást. Magasabb koncentrációt alkalmazva (1, mm HCHO) a sejtproliferációt gátló és apoptózis indukáló hatás volt észlelheto, tovább emelve a HCHO mennyiségét (1 mm) pedig már toxikus hatások érvényesültek [297]. Az 1 -metil-aszkorbigén (Me-Asc) - mely több zöldségnövény (pl. káposztafélék) szöveteiben is megtalálható kis mennyiségben egy N-metilindol tartalmú aszkorbinsav származék. Szende és munkatársai [298] PC-3 humán prosztata karcinóma sejtekkel végzett kísérleteik során azt találták, hogy Me-Asc adagolását követoen jelentosen no a daganatos sejtek száma és megemelkedik az apoptotikus sejtek aránya. Hasonló mefigyeléseket tettek N G -hidroximetilezett arginin származékok adagolása után is [299]. Az irreverzibilis HCHO megköto dimedon és a Me-Asc együttes alkalmazásakor a fenti hatás elmaradt (a kontrollal összevetve a dimedon önmagában nem volt hatással a kultúrák növekedésére), ami arra utal, hogy a Me-Asc ból a sejtekben in situ keletkezo HCHO fontos szerepet játszik a sejtproliferációt és apoptózist szabályozó folyamatokban [22,298 ]. A sokasodó kísérleti eredmények azt jelzik, hogy a biológiai rendszerekbe kerülo exogén HCHO, valamint a kötött formában (pl. labilis hidroximetil csoportok) található endogén HCHO fontos szerepet tölthet be a fiziológiás és patológiás folyamatok elindításában és szabályozásában. 75

76 III/A. táblázat Néhány, a tropánvázas alkaloidok kimutatására és meghatározására alkalmazott nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszer fobb jellemzoje. Vizsgált objektum (vegyület) Kivonási módszer apoatropin, atropin és szkopolamin Datura candida hibrid hairy root (hioszciamin és szkopolamin) Kivonás liofilizálást és porítást követoen Oszlop 1.: Partisil töltet 2.: Pellosil HC töltet 3cm x 4,6mm HPLC eluens 1.: 1% dietilamin, dietil-éter + metanol elegy (négyféle arányban) 2.: 1% dietilamin, dietil-éter + metanol elegy (95:5 v/v),2 M kénsav (2 óra), centrifugálás, lúgosítás (1M NaOH, ph 12), kirázás kloroformba, bepárlás, oldás a HPLC eluensben µbondapak C18 1µm 3cm x 3,9mm Na-heptán-szulfonát vizes oldata (1 mm) ecetsavval ph4-re beállítva + metanol (6:4 v/v) Datura innoxia hairy root (hioszciamin és szkopolamin) Kivonás,2M H2SO4- val (ultrahang), 1,5-2 óra után szurés, lúgosítás (ph 12-re) 1M NaOH-al, 1ml kloroformmal 3percig állni hagyni, centrifugálni, kloroformos rész bepárlása, HPLC eluensben felvenni Spherisorb C6 5µm 16,5cm x 4,6mm bidesztillált 15% acetonitril víz és Datura stramonium növény (atropin és szkopolamin) Porított, szárított, zsírtalanított minta+ metanol, Soxhlet készülékben 18 órán át, bepárlás néhány ml-re, szurés, kiegészítés metanollal 1ml-re, szilrárd fázisú eztrakció után bepárlás, 1ml metanolban felvenni Ultrasphere C8 25cm x 4,6mm bidesztillált víz - metanol (64:36 v/v) + foszfát puffer +,1M dibutilamin Datura fajok sejt- és szövetkultúrái (szkopolamin) Liofilizált minta+etanol- NH3(28%)(19:1 v/v) óra Soxhlet készülékben, bepárlás, oldás,1m HCl-ban, lúgositás NaOH-al, ph 9,8-ra, átrázás kloroformba, bepárlás, oldás,5% TFA-ban, tisztítás szilárd fázisú extrakcióval, bepárlás, oldás a HPLC eluensban µbondapak C18 3cm x 3,9mm vizes,2%-os foszforsav (ph 7,25 trimetilaminnal) és 15%-os metanol (6:4 v/v) Duboisia és Scopolia fajok (hioszciamin) Szárított, porított drog+ 25ml I.-es mobilfázis, 3 p reflux, centrifugálás, dekantálás, maradékot mosni 2x1ml mobilfázissal, egyesítés, kiegészítés 5ml-re a HPLC mérést megelozoen ODS 12A 5µm 25cm x 4mm I. 1/15M Na-foszfát oldat (ph 3,5-re beállítva H3PO4-val)+ metanol (48:52 v/v) II. I.+1,75mM SDS III. I.+175mM SDS Áramlási 1.: 2,-2,29ml/p 1, ml/p 1,2ml/p,8ml/p 1,ml/p sebesség 2.: 1,33ml/p Detektálás 254 nm és 28 nm 215 nm 21 nm 2 nm 229 nm 21 nm (λ) Forrás [96] [97] [98] [21] [9] [99] 76

77 III/B. táblázat Néhány, a tropánvázas alkaloidok kimutatására és meghatározására alkalmazott nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszer fobb jellemzoje. Vizsgált objektum (vegyület) Kivonási módszer Duboisia és Scopolia fajok (hioszciamin és szkopolamin ) Liofilizált minta+5ml cc. metanolcc. NH4OH (2:1 v/v), további tisztítás Oszlop ODS 12A 25cm x 4,6mm HPLC eluens MeCN és 1mM Na - dodecilszulfonat (ph 3,3) (2:3 v/v) Hyoscyamus muticus és H. niger növény (atropin és szkopolamin) Szárított, porított drog+ 1ml diklórmetánmetanol-nh4oh (7:25:5 v/v/v) 2 órán át, szurés, extrakció 1ml,5M H 2SO4- val, lúgosítás (NH4OH), extrakció diklórme - tánnal, bepárlás, oldás 1ml metanolban, szurés, HPLC mérés RP C18 + RP CN C18 5µm 15cm x 3,9mm bidesztillált víz és acetonitril (65:35 v/v),5% trietilaminnal Hyoscyamus, Brugmansia és Duboisia fajok (szkopolamin) Drogpor+1ml metanol, 3 p reflux, szurés, 1ml-re kiegészítés a HPLC mérés elott Hypersil ODS (C18) 1µm 25cm x 4mm 45%-os metanol és,1% (v/v) foszforsav (ph 7-re beállítva trimetilaminnal) Datura stramonium levél (hioszciamin, szkopolamin, tropasav) Többféle extrakciós módszer összehasonlítása, nincs számottevo eltérés Novapack C18 4µm 15cm x 4mm 12,5% -os vizes acetonitril és,3% (v/v) foszforsav (ph 2,2-re trietilaminnal) Élelmiszerek és biológiai minták (hioszciamin és szkopolamin) 3ml n-hexánnal 2 óra, 25ml cc. NH4OH, 3 p keverés, 15ml diklórmetán hozzáadása után 1 p keverés, fázisok elválasztása és a szerves fázis kirázása 15ml desztillált vízzel, centrifugálás, vizes fázisok egyesítése, kirázás 15ml diklórmetánnal, centrifugálás, bepárlás, oldás 3ml metanolban, belso standard hozzáadása, tisztítás szilárd fázisú eztrakcióval, bepárlás, oldás 1ml MeOH-ban, HPLC mérés Spherisorb ODS-2 (C18) 1µm 25cm x 4,6mm acetonitril+metanol+,5m ammóniumacetát (2,9:27,9:51,2 v/v/v) Áramlási 1,1ml/p,8ml/p 1,ml/p,8ml/p 1,ml/p 2,ml/p sebesség Detektálás 215 nm 254 nm 229 nm 24 nm 21 nm 254 nm (λ) Forrás [75] [1] [74] [11] [12] [13] Datura ferox növény (hioszciamin, szkopolamin és aposzkopolamin) Kivonás EtOH+28% NH4OH (95:5 v/v) 2ml szobahomérsékleten, szurés, bepárlás, 2x1ml 1N HCl -val extrakció, szurés,,7m Nakarbonáttal lugosítás, extrakció 3x5ml metilén-kloriddal, bepárlás, metanolos oldás, tisztítás sziláed fázisú extrakcióval, oldás a mobilfázisban, szurés, HPLC meghatározás µbondapak C18 1µm 25cm x 4,6mm,2%-os foszforsav (ph 7,3-ra beállítva dimetil - propilaminnal) + metanol (6:4 v/v) 77

78 III/C. táblázat Néhány, a tropánvázas alkaloidok kimutatására és meghatározására alkalmazott nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszer fobb jellemzoje. Vizsgált objektum (vegyület) Kivonási módszer Datura innoxia és Hyoscyamus x györffy hairy root (hioszciamin és szkopolamin) Háromféle kivonási módszer összehasonlítása Datura candida x D. aurea hibrid hairy root (hioszciamin és szkopolamin) Kivonás diklór-metán - metanol - 25% NH4OH eleggyel, bepárlás, oldás 5ml diklórmetán - 2ml 5% ammónia elegyben, bepárlás 2ml-re, minta felvitele Extrelut oszlopra, lemosás 25ml diklórmetánnal, bepárlás, oldás 1ml CH3CN-ban. Atropa baetica hairy root és tápközeg (atropin és szkopolamin) Táptalaj kivonása: kirázás kloroformba (lúgosítás nélkül), bepárlás, oldás a HPLC eluensben. Datura metel hairy root (hioszciamin és szkopolamin) Kivonás Soxhlet készülékben metanollal, bepárlás, oldás 2 mm-os NH4 Cl oldatban (ph 9,8), tisztítás Extrelut oszlopon (4,5g, lemosás ammóniával telített kloroformmal), bepárlás, oldás a HPLC mobil fázisban Datura innoxia hairy root és tápközeg (hioszciamin) Liofilizálás és porítás után kivonás kloroform - metanol - 28% NH4OH eleggyel (5:5:1,4 v/v/v), bepárlás, oldás,1m sósavban, lúgosítás 3ml 28% NH4OH-ban, kirázás kloroformmal, bepárlás (táptalaj esetén 3ml 28% NH4OH hozzáadásától hasonlóan), oldás a HPLC eluensben Oszlop Spherisorb C6 5µm 12,5cm x 4,6mm Nucleosil 1-5 CN 25cm x 4mm Hypersil ODS 25cm x 4,6mm fordított fázisú C18-as oszlop 25cm x 4,6mm HPLC elue ns bidesztillált víz és 15% acetonitril CH3CN + acetát puffer (,6M ammónium-acetát +,3 M ecetsav, ph 4) (95:5 v/v) 22% acetonitril + 78% puffer (5 mm kálium-foszfát ph 3- ra beállítva ortofoszforsavval) 17% acetonitril (v/v) 5mM - os KH2PO4 oldatban (ph 3,) acetonitril + bidesztillált víz (9:1 v/v) trietilaminnal beállítva ph 3,1-re Áramlási 1,2ml/p 1ml/p 1,-1,5 ml/p sebesség Detektálás 21 nm 21nm 215nm nm (λ) Forrás [14] [15] [71] [16] [17] 78

79 3. VIZSGÁLATI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. D. innoxia in vitro növények létrehozása tenyésztése A vizsgált in vitro kultúrák eloállításához a Magyar Tudományos Akadémia Vácrátóti Botanikai Kutatóintézetébol származó, szabadföldön nevelt D. innoxia Mill. növények magjait használtuk fel. A D. innoxia magok 5-1 másodpercig történo 7%-os etanolos elokezelését követoen a sterilizálást diocid oldattal (3 mg/1ml etil-higany-klorid és 6 mg/1 ml cetil-piridin-klorid) végeztük, háromszor (2 x,5 perc és 1 x 1 perc). A diocid oldatot a magok háromszoros desztillált vizes mosásával távolítottuk el. A magokat sterilizált Petri csészékbe helyeztük, melyekbe elozetesen desztillált vízzel nedvesített szuropapírt helyeztünk és fényen (25Lux, 12 óra/nap, 24±2 C homérsékleten) csíráztattuk. A sziklevelek, valamint a gyökérkezdemény megjelenését követoen a csíranövényeket 3% szacharóz tartalmú szilárd S táptalajra helyeztük (V. táblázat), és napi 12 órás megvilágítást alkalmazva (25Lux) 24±2 C homérsékleten neveltük. A kultúrák fenntartását és szaporítását vegetatív mikroszaporítással végeztük. A leválasztott 2-3cm méretu hajtásdarabokat 8-1 hetente helyeztük kettesével friss S tápközegre, ahol azokból gyökerek és hajtások fejlodtek. Az alkaloidtartalom meghatározása céljából a képzodött in vitro növényeket 8 hét után gyujtöttük be (hajtásokat és gyökereket külön), majd fagyasztva-szárítva tároltuk Szövetkultúrák eloállítása és fenntartása Kallusztenyészetek A D. innoxia in vitro növények hajtásán spontán képzodött kalluszszöveteket izoláltuk és 3% szacharózt, valamint növényi növekedésszabályozó anyagokat is tartalmazó, módosított MS szilárd tápközegen (AMS) tenyésztettük tovább (VII. táblázat) sötétben és fényen (25Lux, 12 óra/nap). A kultúrákat 4-5 hetente helyeztük friss tápközegre Hairy root kultúrák Az S táptalajon tenyésztett 2 hónapos D. innoxia növények szárát Agrobacterium rhizogenes A4 (Rhizobiaceae) törzzsel fertoztük mikroinjektálással. A géntranszformációhoz felhasznált agrobaktériumokat YMB táptalajon [3] tenyésztettük (VIII. táblázat), és a virulencia fokozása 79

80 érdekében 3 nappal a növények fertozése elott a baktériumokat frissen készített YMB táptalajra oltottuk át. VII. táblázat Az S, AMS és MS [11] tápközegek összetétele Összetevok S AMS MS Makroelemek Koncentráció (mg/l) NH 4 NO KNO 3 19 CaCl 2 x 2 H 2 O 44 MgSO 4 x 7 H 2 O 37 KH 2 PO 4 17 Mikroelemek H 3 BO 3 6,2 MnSO 4 x 4 H 2 O 22,3 ZnSO 4 x 4 H 2 O 8,6 KI,83 Na2MoO4 x 2 H2O,25 CuSO 4 x 5 H 2 O,25 CoCl 2 x 6 H 2 O,25 FeSO 4 x 7 H 2 O 27,85 Na 2 -EDTA 37,25 Vitaminok Ca-pantotenát inozit 1 nikotinsav,5 piridoxin,5 tiamin,1 Növényi növekedésszabályozó anyagok kinetin ,4-D Egyéb kazein-hidrolizátum agar ph=5,7 Az elso járulékos gyökerek a fertozést követo 8. napon jelentek meg. 14 nappal a fertozést követoen 26 hairy root klónt izoláltunk, melyeket 25 mg/l cefotaxim és 1 mg/l ampicillin tartalmú szilárd 2% szacharóz tartalmú MS [11] táptalajra (VII. táblázat) helyeztünk baktériummentesítés céljából. A klónok tenyésztését az antibiotikum tartalmú táptalajon (24±2 C homérsékleten, sötétben) addig folytattuk, míg azok baktériummentessé váltak (3-5 átoltás). A baktériummentes hairy root klónokat a továbbiakban antibiotikumot nem tartalmazó 2% szacharóz tartalmú szilárd (7g/l agar) MS táptalajon (VII. táblázat) 24±2 C homérsékleten, sötétben tartottuk 8

81 fenn. Az izolált klónok közül, növekedésük és alkaloid tartalmuk alapján kiválasztva 3 klónt (41, 411 és 415) használtunk fel további vizsgálatok céljából. VIII. táblázat Az YMB táptalaj összetétele [3]. Összetevok YMB Koncentráció (g/l) K 2 HPO 4 x3 H 2 O,655 MgSO4 x 7 H2O,2 NaCl,1 mannit 1, éleszto kivonat (Difco),4 agar 2, ph=7, Kísérleteinket klimatizált rázószekrényben, 2% szacharóz tartalmú MS folyékony tápközegben, (4ml tápközeg/1ml-es Erlenmeyer lombik, rázatás B.Braun Biotech International Certomat BS 4 készülékben: 1rpm, 24±1 o C) sötétben és fényen (25Lux, 12 óra/nap) tenyésztett klónokkal végeztük el. A kultúrák átoltását szilárd tápközegre esetén 4 hetente, folyékony tápközeg esetén 3 hetente végeztük A géntranszformáció igazolása hairy root kultúrákban D. innoxia in vitro növény és hairy root kultúrák vizsgálata PCR technikával A növényi DNS izolálása Dneasy Plant Mini Kit segítségével történt (Qiagen). A sejtek feltárását dörzsmozsárban végeztük,,1g friss növényi mintát (levél és hairy root) folyékony nitrogénben (-196 o C) porítottuk el. Az így elokészített mintákat Eppendorf csövekbe helyeztük, hozzájuk adtunk 4µl AP1 puffert (Qiagen), majd 4µl RNáz A-t (Qiagen) (RNS emésztés). A mintákat homogenizáltuk (Vortex), majd 1 percig 65 o C-on inkubáltuk (közben 2-3-szor összeráztuk) (DNS kivonás). Ezt követoen a mintákhoz 13µl AP 2 puffert adtunk (Qiagen), összeráztuk, majd 5 percre jégre helyeztük (±1 o C) (fehérjék kicsapása). Az oldatot centrifugáltuk (12rpm, 2-3 perc) és a felülúszót használtuk fel a továbbiakban. A mintákat felvittük az elokészített QIAshredder oszlopokra (2ml, Qiagen), majd az oldatot 2 percig centrifugáltuk (12rpm) (fehérjék és sejttörmelék eltávolítása). Az átfolyó oldat 45µl-ét új centrifugacsobe helyezve 675µl AP3/E oldatot adtunk hozzá (Qiagen) a DNS kicsapása céljából. Az oldat 65µl-ét a DNáz mini spin oszlopra (Qiagen) vittük, majd 1 percig centrifugáltuk (1rpm). A cso alján megjeleno folyadékot elöntöttük. Az elokészített oldat maradék részével a lépést megismételtük. A DNáz mini spin oszlopot ezt követoen 81

82 Eppendorf csobe helyeztük és hozzáadtunk 5µl AW puffert (Qiagen) (DNS tisztítás) és 1 percig centrifugáltuk (1rpm). Az alul megjeleno folyadékot elöntöttük. A tisztítási lépést még egyszer megismételtük, de az utóbbi esetben 2 percig centrifugáltuk a mintát. A tisztított DNS leoldása céljából 2 x 1µl 65 o C-os AE puffert (Qiagen) mértünk az oszlopra, 2 x 5 percig szobahomérsékleten (24±1 o C) inkubáltuk, majd centrifugáltuk (2 x 1 perc, 1rpm). Az elkülönült folyadék réteg tartalmazta a tisztított DNS-t. Az oldatot 2x ára (D. innoxia gyökér kivonat) és 15x ére hígítottuk (hairy root kivonat), majd 8µl-t vittünk fel a gélre. Jelzofestékként Blue/Orange-ot (1-2µl) alkalmaztunk. Az A. rhizogenes A4 plazmid DNS izolálását a kolónia PCR-hez szükséges módszer segítségével végeztük. 5µl steril desztillált vízben szuszpendáltunk 1 kolónia A. rhizogenes A4 baktériumot. A szuszpenziót vízfürdon forraltuk (1 o C, 2-5 perc), majd centrifugá ltuk (12rpm, 2-3 perc). A felülúszó tartalmazta a plazmid DNS-t. A minták elokészítését steril boxban, jégen végeztük (±1 o C). Az alkalmazott DNS nélküli összetevok (Master Mix): 3,3µl steril desztillált víz - 1,µl 25mM MgCl 2-1,µl puffer (REDTaq Reaction Buffer) - primerekbol 1,-1,µl (rolb gén 5 primer: 42,2nmól 422µl steril desztillált vízben, majd 1x ére hígítva, bázissorrend: ATGGATCCCAAATTGCTATTCCTTCCACGA és 3 primer: 55,7nmól 557µl steril desztillált vízben, majd 1x ére híg, bázissorrend: TTAGGCTTCTTTCTTCAGGTTTACTGCAGC [31]) -,5µl DNS polimeráz (REDTaq DNA Polymerase) és,2µl 1mM dezoxi-nukleotid-trifoszfát (dntp). A fenti oldathoz (8µl) adtunk 2µl tisztított DNS-t tartalmazó oldatot (összesen 1µl). A markerbol 3,5µl-t alkalmaztunk (Gene Ruler 1bp DNA Ladder Plus). A polimeráz láncreakciót GeneAp PCR System 97-as készülékben (Perkin Elmer Applied Biosystem) végeztük el (denaturáció 94 o C-on 1 percig, kapcsolódás 55 o C-on 1 percig, lánchosszabbítás 72 o C-on 3 percig, mindhárom lépés 3 cikluson át ismételve). A keletkezo 78bp méretu fragmentumokat agarózgél elektroforézis segítségével választottuk el. Az 1,25%-os agaróz gél összetétele:,75g agaróz (Gibco BRL, ultra pure) - 6ml trisz-acetát-etiléndiamin-tetraecetsav (TAE) puffer:,4m trisz acetát -,1M etiléndiamin-tetraecetsav (EDTA) [242,g trisz-hidroximetilaminometán - 57,1ml jégecet - 1,ml,5M EDTA (ph=8,)], továbbá 2,8 µl etídium-bromid festék (UV aktív festék) volt. A kifejlesztés 7V cellafeszültség mellett 3-4 percig történt. A kiértékelést UV fényben (λ=32nm) végeztük. 82

83 A szövetek opin termelésének vizsgálata papír elektroforézissel Az Agrobacterium Ri-plazmidjának meghatározott szakasza, az ún. transzfer DNS (tdns) a fertozés során stabilan integrálódik a növény genomjába. Ennek egyik következményeként a növényi sejtek a baktériumok számára fontos speciális aminosavakat, ún. opinokat kezdenek termelni, melyek sikeres Agrobacterium fertozést követoen kimutathatóak a sejtekben. Az A. rhizogenes fertozéssel nyert 41, 411, és 415-ös hairy root klónok opin szintézisét Petit módszere alapján mutattuk ki [128].,2 g liofilizált mintát 3 x 2 ml 7 % etanollal forraltunk (3 x 5 perc). A kivonatot rotációs vákuumbepárlón szárazra pároltuk, majd 1 ml desztillált vízben oldottuk. A három mintából ötszörös hígítást követoen 6 µl-t vittünk fel Filtrat 14 kromatográfiás papírra elektroforézis céljából. Tesztként 5 µl mannopint használtunk (4 mg/ml). Jelzofestékbol (,1 % metilénzöld) 4 µl-t vittünk fel az elozetesen pufferral (cc. hangyasav - cc. ecetsav - víz (3 : 6 : 91, v/v/v) impregnált papírra. Az elektroforézis készülékben (LaborMIM) történt futtatást követoen (kb. 2 óra) a papírt megszárítottuk és,4 % acetonos AgNO 3 oldattal hívtuk elo. Szárítást követoen a papírt 2 % etanolos (9 %) NaOH oldatba helyeztük. Végül szárítás után fixátor oldatba (Kodak X-Al-4, 3 %-os tioszulfát oldat + 3 %-os tioszulfit oldat + 2,3 %-os ecetsav oldat) mártottuk és megszárítottuk A kultúrák növekedési aktivitásának jellemzése Friss súly meghatározása A szövetek leoltási és begyujtési friss súlyának (g), meghatározása (g) analitikai mérlegen (Mettler AE 24) történt 4 tizedes jegynyi pontossággal. A leoltási friss súly meghatározásához a tápközeget tartalmazó lombikokat közvetlenül az átoltást megelozoen és azt követoen lemértük. Az értékek különbségébol számítással határoztuk meg a leoltási friss súly értékét. Folyékony tápközegben nevelt hairy root klónok esetén az értékek számításánál figyelembe vettük a szövetek felszínén átvitt tápközeg tartalmat. Ennek meghatározásához a tápközeget papírvattán itattuk fel a szövetdarabok felszínérol, majd meghatároztuk az átlagos tömegveszteséget (2 párhuzamos, átlagos tömegveszteség mindhárom vizsgált klón esetében: 43,54±3%), melyet a számításoknál figyelembe vettünk. 83

84 A begyujtési friss súly meghatározása szilárd tápközegen nevelt kallusz szövetek esetében a tápközeg darabjainak eltávolítása, folyékony tápközegben nevelt hairy root klónoknál a tápközeg papírvattán történt felitatása után történt Szárazsúly meghatározása A szövetek szárazsúlyának meghatározása (g) a fentiekhez hasonlóan analitikai mérlegen történt 4 tizedes jegynyi pontossággal fagyasztva-szárítást (liofilizálást) követoen, melyet B.Braun Christ Loc-1M Alpha 1-4 készülékben végeztünk. A leoltási szárazsúly számításánál kallusz szövetek esetében a kísérletek elvégzéséhez használt (kiindulási) 4 hetes szövetek szárazanyag tartalmát vettük figyelembe a leoltási friss súly meghatározását követoen. A hairy root kultúráknál a 3 hetes tenyésztek szárazanyag tartalma szolgált alapul Szárazanyag tartalom meghatározása A szárazanyag tartalom számításához a begyujtési friss- és szárazsúly értékeket vettük figyelembe. Az értékeket az aktuális friss súly százalékában adtuk meg (%) Növekedési érték (NÉ) számítása A szárazsúlyra vonatkoztatott növekedési érték meghatározása a kallusz és hairy root szövetek esetében egyaránt a leoltási és begyujtési szárazsúlyok figyelembevételével történt, az alábbi képlet alapján: B-L NÉ = L melyben B: a begyujtéskor mért szárazsúly, L: a leoltáskor mért friss súlyból és a megfelelo szárazanyag tartalomból számított szárazsúly A folyékony MS tápközeg ph-jának meghatározása A növényi szövetek begyujtését követoen a tápközeget redos szuropapíron szurtük. A ph meghatározását Radelkis Laboratory Digital ph Meter OP-211/1-es készülékkel végeztük 23±1 o C-on 2ml táptalajban, minden egyes tenyészet esetében, három tizedesjegynyi pontossággal Az AMS és MS tápközegek összetételének módosítása 84

85 Szacharóz tartalom változtatása A folyékony MS tápközegben [11] nevelt D. innoxia hairy root klón (41) esetében vizsgáltuk a tápközeg szacharóz koncentrációjának hatását a tenyészetek növekedésére és tropán alkaloid tartalmára. A szacharózt %, 1,%, 2,% (az általunk használt MS tápközeg szacharóz koncentrációjának felel meg), 3,% és 6,%-ban (m/v) adagoltuk. A sötétben nevelt kultúrákat (1rpm, 24±1 o C) 4 hetet követoen gyujtöttük be (párhuzamos minták száma: n=7) MgSO 4 tartalom módosítása A folyékony, 2% szacharózt tartalmazó MS tápközegben [11] nevelt 41-es D. innoxia hairy root klón esetében vizsgáltuk a tápközeg MgSO 4 tartalmának hatását a tenyészetek növekedésére és tropán alkaloid tartalmára. A magnéziumsót mg/l, 185 mg/l, 37 mg/l (az MS tápközeg MgSO 4 koncentrációjának felel meg), 74 mg/l és 148 mg/l koncentrációban adagoltuk. A sötétben és fényen (25Lux, 12 óra/nap, 1rpm, 24±1 o C) nevelt kultúrákat 4 hetet követoen gyujtöttük be (párhuzamos minták száma: n=7) Dimedon és szamikarbazid alkalmazása A szilárd AMS tápközegen nevelt D. innoxia kallusz kultúrák és folyékony, 2% szacharózt tartalmazó MS tápközegen [11] nevelt 41-es hairy root klón esetében vizsgáltuk a tápközeg dimedon (21. ábra) tartalmának hatását a tenyészetek növekedésére, mérheto endogén HCHO koncentrációjára és tropán alkaloid tartalmára. A kontroll (dimedon mentes táptalaj) mellett a dimedont 7,133 x 1-3 mm/l (1ppm), 7,133 x 1-2 mm/l (1ppm),,7133mM/l (1ppm) és 7,133mM/l (1ppm) koncentrációban adagoltuk. A 41-es hairy root klón esetében vizsgáltuk a tápközeg szemikarbazid (29. ábra) tartalmának hatását is a tenyészetek növekedésére, mérheto endogén HCHO és tropán alkaloid tartalmára. A kontroll (szemikarbazid mentes táptalaj) mellett a szemikarbazidot 1,3321 x 1-2 mm/l (1ppm),,13321 mm/l (1ppm), 1,3321 mm/l (1ppm) és 13,221 mm/l (1ppm) koncentrációban adagoltuk. A tápközegek ph -ját minden esetben ph=5,7 -re állítottuk. A sötétben és fényen nevelt (25Lux, 12 óra/nap, 24±1 o C) nevelt kallusz és hairy root kultúrákat (25Lux, 12 óra/nap, 1rpm, 24±1 o C) 2, 4 és 6 hetet követoen gyujtöttük be (párhuzamos minták száma: n=7). 85

86 Aminoguanidin és hidralazin alkalmazása A folyékony MS tápközegben [11] nevelt 41-es D. innoxia hairy root klón esetében vizsgáltuk a tápközeg aminoguanidin és hidralazin (1-hidrazino-ftalazin) (29. ábra) koncentrációjának hatását a tenyészetek növekedésére és tropán alkaloid tartalmára. A kontroll (aminoguanidin mentes táptalaj) mellett az aminoguanidint 1,35 x 1-2 mm/l (1ppm),,135 mm/l (1ppm), 1,35 mm/l (1ppm) és 13,5 mm/l (1ppm) koncentrációban adagoltuk. A kontroll (hidralazin mentes táptalaj) mellett a hidralazint 6,245 x 1-3 mm/l (1ppm), 6,245 x 1-2 mm/l (1ppm),,6245 mm/l (1ppm) és 6,245 mm/l (1ppm) koncentrációban adagoltuk. A tápközegek ph -ját minden esetben ph=5,7 -re állítottuk. A sötétben nevelt kultúrákat (1rpm, 24±1 o C) 4 hetet követoen gyujtöttük be (párhuzamos minták száma: n=2). N H 2 N NH CO NH 2 H 2 N H 2 N HN NH N NH NH 2 szemikarbazid aminoguanidin hi dralazin 29. ábra A szemikarbazid, aminoguanidin és hidralazin szerkezeti képlete 3.6. Tropán alkaloidok kimutatása és meghatározása Növényi szövetek hisztokémiai vizsgálata Dragendorff-reagens alkalmazásával Az alkaloidok gyökereken belüli lokalizációjának vizsgálata céljából in vitro D. innoxia növény gyökerét, valamint a 41-es hairy root klónt használtuk fel, melyeket cc. vizes pikrinsav oldat pufferolt formalin cc. ecetsav (55,6:37:7,4 v/v/v) elegyben fixáltuk 3 percen át, szobahomérsékleten. A mintákat ezt követoen 7%-os etanolban mostuk a fixáló oldat teljes eltávolítása céljából. Abszolút etanolban végzett dehidrálás után a szövetdarabokat folyékony paraffinba ágyaztuk. A 8µ-os metszeteket hagyományos rotációs mikrotómmal készítettük. A metszeteket tárgylemezre helyeztük, majd a paraffin eltávolítása céljából xylolban áztattuk (2 x 1 perc). A Dragendorff festést (KBiI 4 reagens alkalmazásával) megfelelo elokészítés után - 5 perc 96%-os etanolban, 5 perc 7%-os etanolban, mosás desztillált vízben - végeztük, a metszeteket 2 órán át tartottuk a reagensben [32], majd,1n H 2 SO 4 al mostuk és vizes glicerinben fedtük le. Az elkészült metszeteket 86

87 fénymikroszkóppal vizsgáltuk (Zeiss Axioskop, Germany), a látottakat MC 8 fotó feltét (Zeiss, Germany) segítségével dokumentáltuk MALDI-MS módszer A tropán alkaloidok kimutatását/azonosítását Finnigan LASERMAT 2 készülékben is elvégeztük. Mátrixként α ciano-4-hidroxi szinnapinsavat (ACH) alkalmaztunk. A HPLC meghatározáshoz eloállított, tisztított kivonatokat CH 3 OH-al hígítottuk 1:1 arányban, majd a minták 5µl-ét elegyítettük 5µl ACH tartalmú oldattal (2mg/ml ACH 6%-os CH 3 OHban) a mintatartó lemezeken. Az autentikus hioszciamin és szkopolamin standard oldatokat (2 x 1-5 M, 5-5 µl) elozetesen CH 3 OH-al hígítottuk 1:1 arányban, majd 5µl ACH tartalmú oldattal elegyítettük, szintén a mintatartó lemezen. A készülékbe helyezés elott az oldatokat szobahomérsékleten beszárítottuk HPLC módszer - A minták elokészítése és tisztítása A begyujtött szöveteket a friss súly meghatározását követoen mélyhutoben fagyasztottuk le (-14±1 o C). A minták fagyasztva szárítását B.Braun Christ Loc-1M Alpha 1-4 liofilizáló készülékben végeztük el. A szárazsúly meghatározását követoen a kivonást 3 x 1ml CHCl 3 CH 3 OH 25% NH 4 OH 15:5:1 (v/v/v) eleggyel végeztük B.Braun Labsonic U (power level: 2, duty cycle:,5s) ultrahangos sejtfeltáró készülékben. Az egyesített, szurt és szárított (Na 2 SO 4 siccum) kivonatokat BÜCHI Rotavapor R-3-es vákuumbepárló készülékben, 8 o C-on szárítottuk be, majd 1,5ml CHCl 3 -ban oldottuk és a minták tisztításáig Eppendorf csövekben, mélyhutoben tároltuk -14±1 o C-on, majd szobahomérsékleten beszárítottuk. A minták tisztítása szilárdfázisú extrakcióval történt SUPELCO Supelclean LC-18 SPE (3 ml) oszlopokon, melyeket elozetesen 2 x 2,5 ml metanollal és 2 x 2,5 ml KH 2 PO 4 pufferrel (3mM, ph=6,8) aktiváltunk. A beszárított kivonatokat 2 x 1,5ml és 1 x 1,ml 3% -os metanolban (3mM KH 2 PO 4 puffer metanol, 97:3, v/v) oldottuk (ultrahangfürdoben, 3 x 4 perc) és a visszaoldásnak megfelelo részletekben vittünk fel az LC-18 SPE oszlopokra. A mintafelvitelt követoen az oszlopokat 2 x 2,5ml 3%-os metanollal mostuk (3mM KH 2 PO 4 puffer metanol, 97:3, v/v). A tropán alkaloidokat tartalmazó frakciót 2 x 2,5ml 8%-os metanollal (metanol - 3mM KH 2 PO 4 puffer, 8:2, v/v) eluáltuk és a szükséges hígítás után (5x-ös) vizsgáltuk. 87

88 A HPLC mérés alapján a hioszciamin visszanyerése az SPE oszlopról 98,2±1,3%, a szkopolamin esetében 96,3 ±1,3%, az apoatropinnál pedig 12,5 ±1,8% volt (n = 3). - HPLC meghatározás A meghatározáshoz Surveyor moduláris HPLC rendszert használtunk (Thermo Finnigan, USA), mely kvaterner gradiens pumpábó l, diódasoros detektorból és a mintaadagolóból állt. Az adatok kiértékelését ChromQuest 4. kromatográfiás szoftver (Thermo Finnigan, USA) alkalmazásával, személyi számítógépen végeztük. Az elválasztást LUNA C18 (5 µm) fordított fázisú oszlopon (25 x 4,6 mm i.d.) végeztük (Phenomenex, USA), melyhez azonos töltetu elotétoszlopot (8 x 3 mm i.d.) csatlakoztattunk. Eluensként acetonitril : 3mM foszfát puffer (ph=6.) : metanol (12 : 8,1 : 7,9, v/v/v) elegyet alkalmaztunk, az áramlási sebesség 1, ml/perc volt. A csúcsok azonosítását autentikus standardok retenciós idejének és a megfelelo UV spektrumok adatainak felhasználásával végeztük (3. ábra). A kvantitatív meghatározás λ=21nm-en történt, az injektált mintamennyiség 5µl volt. A kalibrációs egyenest 1-2 µg/ml tartományban vettük fel. A kalibrációs egyenesek egyenlete: hiszciamin y=1,1615 * 1-5 x 3,45; szkopolamin y=1,59418 * 1-5 x 7,1789; apoatropin y=1, * 1-5 x 7,1789. Az alkaloid tartalom értékeit µg/g, illetve mg/g-ban (száraz súlyra vonatkoztatva) adtuk meg. A kultúrák száraz súlyának és száraz súlyra vonatkoztatott hatóanyag tartalmának szorzataként kiszámítottuk a hatóanyag produkció értékeket hioszciamin, szkopolamin, apoatropin alkaloidokra (mg alkaloid/kultúra). A C 88

89 B 3. ábra A tartalmi meghatározáshoz használt tesztkeverék kromatogramja (A), továbbá a hioszciamin (B), szkopolamin (C) és apoatropin (D) UV spektruma. D 3.7. Endogén HCHO kimutatása és meghatározása MALDI-MS módszer A kimutatás formaldimedon formájában történt. A frissen begyujtött szövetmintákat folyékony nitrogénben fagyasztottuk, porítottuk (,25g), majd,7 ml,2 % metanolos dimedon oldatot adtunk hozzájuk (dimedon addukt, formaldimedon kialakulása céljából). Az oldatokat centrifugáltuk (5g, 5 perc, 4 o C-on). Az elkészült oldatok felülúszójának 5-5 µl-ét elozetesen CH 3 OH-al hígítottuk 1:1 arányban, majd 5µl ACH tartalmú oldattal (2mg/ml ACH 6%-os CH 3 OH-ban) elegyítettük a mintatartó lemezen. Ezt követoen az oldatot szobahomérsékleten beszárítottuk. A formaldimedont autentikus standard (5µl, CH 3 OH-al 1:1 arányban higított 2%-os dimedonos CH 3 OH oldat) alkalmazásával azonosítottuk OPLC ELJÁRÁS A D. innoxia kallusz és hairy root kultúráiban határoztuk meg az endogén HCHO tartalmat OPLC technikával, denzitometriás értékeléssel. A frissen begyujtött szövetmintákat szerint készítettük elo, majd centrifugálást követoen a felülúszók 3µl-ét impregnált szélu vékonyrétegre (Kieselgel 6 F 254 ) vittük. A formaldimedon elválasztása OPLC készülékkel (OPLC-NIT CO., Ltd., Budapest, Hungary) történt. Kifejleszto: kloroform metilén-klorid (35:65, v/v). A kvalitatív és kvantitatív analízis denzitometriás (Shimadzu CS 93, Kyoto, Japan) értékelés alapján történt (λ = 26nm). A formaldimedont autentikus standard (olvadáspont: 191 o C) oldatával és UV spektrum alapján azonosítottuk [33]. A formaldimedon standard elkészítéséhez 2ml 38% -os desztillált vizes HCHO oldatot és dimedon oldatot (5g dimedon 63

90 3ml C 2 H 5 OH és 5ml desztillált víz elegyében oldva) elegyítettünk. A keletkezo csapadékot szurtük, majd C 2 H 5 OH-ban oldottuk. Az oldatot centrifugáltuk (1g 1percig 2 o C-on), majd a felülúszó megfelelo részleteit (1µl, 12µl, 14µl 16µl, 18µl és 2µl) vittük fel a vékonyrétegre HPLC módszer A meghatározáshoz használt HPLC készülék Gynkotec M 48 pumpából, TOSOH 64 UV detektorból és Rheodyne 8125 injektorból (2µl loop) állt. Az alkalmazott oszlop Chrompack ChromSpher C-18 (15 x 4,6 mm i.d., 5µm), a mobil fázis pedig CH3OH :,1M HCl 76:24 (v/v) arányú elegye (ph=2.63) volt. A detektálás λ = 26nm-en történt. Az adatok kiértékelését EF 212 ADDA konverteren keresztül (Elektroflex GM, Szeged), személyi számítógépben végeztük el TUNEL reakció alkalmazása az apoptotikus sejtek kimutatására A kallusz és hairy root szöveteket a es alfejezetben leírtaknak megfeleloen fixáltuk és metszettük. A párhuzamos metszeteket Superfrost tárgylemezekre helyeztük a haematoxilineozin (HE) festés és a TUNEL reakció elvégzése céljából. A TUNEL reakciót in situ sejthalál kimutatására szolgáló készlettel (Apop-Tag, Oncor, Gaithersburg, MD, USA) végeztük [298]. A negatív kontroll esetében - amikor a terminális transzferáz helyett desztillált vizet használtunk - a sejtmagok nem festodtek. Az elkészült metszeteket hagyományos fénymikroszkóppal vizsgáltuk (Zeiss Axioskop, Germany), a látottakat MC 8 fotó feltét (Zeiss, Germany) segítségével dokumentáltuk. A vizsgát szövetekben meghatároztuk az apoptotikus sejtmagok arányát (apoptotikus index, A i ), melyet véletlenszeruen kiválasztott 1, legnagyobb nagyítással (4x) vizsgált látómezoben található TUNEL pozitív sejtmagok alapján számítottuk ki. A számítást minden esetben háromszor végeztük el A kísérleti eredmények statisztikai kiértékelése A vizsgálatok során végzett párhuzamos mérések (n=7 és 2) eredményeit átlagoltuk. Az adatok statisztikai kiértékeléséhez kiszámítottuk a szórást és a megbízhatóságot (± SD, p<,5), valamint T-próbát végeztünk [34]. 74

91 4. EREDMÉNYEK 4.1. D. innoxia in vitro növények vizsgálata Az in vitro növények növekedése és alkaloid tartalma A sterilizált D. innoxia magokból kifejlodött csíranövényeket szilárd S táptalajon, fényen tenyésztettük tovább vegetatív mikroszaporítással. Az izolált, 2-3cm es, levél nélküli hajtásdarabokat helyeztük a tápközegre. A friss tápközegen a hajtások növekedésnek indultak és gyökereket fejlesztettek. Az áttetszo tápközegben kifejlodött gyökerek esetében gyakran klorofill tartalomra utaló zöldes elszínezodés volt megfigyelheto (31. ábra). A B 31. ábra D. innoxia in vitro növény hajtása (A) és gyökere (B) S táptalajon, 8 hetet követoen. Külön vizsgáltuk a 8 hetes in vitro növények gyökerének és hajtásának (szár és levél) alkaloid tartalmát. A gyökerek az intakt növény gyökeréhez hasonlóan - legnagyobb mennyiségben hioszciamint tartalmaztak (3,µg/g liofilizált szövet), kisebb mennyiségben szkopolamint (1,4µg/g) és apoatropint (7,µg/g) sikerült kimutatni (32. ábra). A hajtás tropán alkaloid tartalmának vizsgálata során csupán apoatropint sikerült mérheto mennyiségben azonosítani (5,µg/g) (32. ábra). Alkaloid tartalom (ug/g) hioszciamin szkopolamin apoatropin gyökér hajtás 32. ábra D. innoxia in vitro növény gyökerének és hajtásának alkaloid tartalma (S táptalajon nevelve, 6 hetet követoen, µg/g liofilizált szövet). 75

92 D. innoxia in vitro növények gyökereinek szövettani vizsgálata A fiatal gyökerek vizsgálata HE festést követoen A növények fiatal gyökereinek szövettani vizsgálata céljából metszeteket készítettünk a hajtástól elválasztott és megfeleloen fixált, 8. hetes gyökerekbol, melyeket HE festést követoen vizsgáltunk (33. ábra). A B 33. ábra 8 hetes, szilárd S tápközegen nevelt D. innoxia in vitro növények gyökereibol készült metszetek, HE festést követoen (A: 2x os nagyítás; a: rhizodermisz, b: kéregparenchima, e: fanyalá bok, f: háncsnyalábok; B: 4x os nagyítás; nyilak: apoptotikus folyamatokra utaló sejtmagok). A rhizodermisz alatt a kéregparenchima sejtjeit figyeltük meg. A kéreghatár nehezen felismerheto, a központi hengerben háncs- és fanyalábok különíthetok el. Az edények hálózatos, vermes gödörkés sejtfal vastagodásúak. A legtöbb metszetben jellegzetesen zsugorodott, kompakt, sötétebben festodo sejtmagokat figyeltünk meg, melyek jelenléte apoptotikus folyamatokra utalt (33. ábra) HISZTOKÉMIAI VIZSGÁLATOK DRAGENDORFF REAGENS ALKALMAZÁSÁVAL A B 34. ábra 8 hetes, szilárd S tápközegen nevelt in vitro D. innoxia növények gyökereibol készült metszetek, Dragendorff reagenssel történt hisztokémiai reakciót követoen kereszt- (A) és hosszmetszeti (B) képen (1x os nagyítás) 76

93 Az alkaloidok szöveteken, sejteken belüli lokalizációjának tanulmányozása céljából hisztokémiai reakciót végeztünk Dragendorff reagens alkalmazásával. A D. innoxia in vitro növények gyökereiben (34. ábra) - a Dragendorff reagens alkalmazását követoen - sikerült kimutatni alkaloidok jelenlétére utaló sárgásbarna, kristályos csapadékot. A csapadékkristályok minden esetben a sejtfal közelében fordultak elo, leggyakrabban a kéregparenchima rhizodermisz és hipodermisz közelében elhelyezkedo sejtjeiben (34/A. ábra), valamint a háncs- és fanyalábok közelében található parenchima sejtekben (34/B. ábra) TUNEL REAKCIÓ ALKALMAZÁSA A HE festést követoen, egyes sejtmagokban észlelt jellegzetes morfológiai változások pontosabb vizsgálata céljából TUNEL reakciót alkalmaztunk az apoptotikus folyamatok kimutatására. A TUNEL reakciót követoen az apoptotikus sejtmagok szelektíven, barna színnel festodtek (35. ábra). Apoptotikus sejtmagokat jellemzoen a rhizodermiszben, a hipodermiszben és a kéregparenchima külso sejtjeiben, valamint a háncs- és fanyalábok sejtjeiben találtunk (35. ábra). A B C 35. ábra 8 hetes, szilárd S tápközegen nevelt D. innoxia in vitro növények gyökereibol készült metszetek, TUNEL reakciót követoen (A: 2x os nagyítás; B: 4x os nagyítás, C: 2x os nagyítás ; a: apoptotikus folyamatokra utaló TUNEL pozitív sejtmagok) Kallusz kultúrák A D. innoxia in vitro növény hajtásán képzodött kalluszszöveteket növényi növekedésszabályozó anyagokat (kinetin és 2,4-D) tartalmazó, szilárd tápközegen (AMS) tenyésztettük sötétben és fényen. A sötétben nevelt kultúrák az átoltást követo 2-3. hétig sárgásfehér színuek, majd ezt követoen világos barnák (36/A. ábra), a 7-8. hetet követoen pedig sötétebb barnák voltak a szövetek öregedésével párhuzamosan. A fényen nevelt kultúrák klorofill tartalmuk miatt megzöldültek, színük csak kis mértékben mélyült a tenyésztési ido során, életképességüket pedig a sötétben nevelt kalluszszövetekkel összehasonlítva hosszabb ideig megorizték (9-12 hétig) (36/B. ábra). 77

94 A B 36. ábra D. innoxia kallusz kultúrák (AMS tápközgen, 5 hetet követoen, A: sötétben és B: fényen tenyésztve) A tenyészetek növekedése és mérheto endogén HCHO koncentrációja Mind a sötétben, mind pedig a fényen nevelt kalluszszövetek friss súlya növekedett a 6 hetes tenyésztési idoszak alatt. Méréseink azt mutatták, hogy a fényen nevelt szövetek friss súlya minden esetben meghaladta a sötétben nevelt szövetek megfelelo értékeit, a 6. héten azonban már nem észleltünk szignifikáns eltérést (4/A. ábra). A kalluszszövetek mérheto endogén HCHO tartalmát dimedon adduktum (formaldimedon) formájában határoztuk meg, denzitometriás és HPLC módszerekkel (37. és 38. ábrák), a formaldimedon jelenlétét ugyanakkor MALDI-MS technika segítségével is kimutattuk (39. ábra). A korábbi megfigyelésekkel összhangban azt tapasztaltuk, hogy az endogén HCHO koncentráció a fiatal szövetekben magas volt, mely a szövetek öregedésével fokozatosan csökkent a 6. hét végéig (4/B. ábra). A tenyészeteket ezt követoen kísérleteink során nem vizsgáltuk, az irodalmi 37. ábra D. innoxia kalluszszövetek endogén HCHO tartalmának meghatározásához használt réteglap (6 hetes, sötétben nevelt kultúrákból készült kivonatok, 1 és 7: formaldimedon teszt, 2: ppm dimedon kontroll, 3: 1ppm dimedon, 4: 1ppm dimedon, 5: 1ppm dimedon és 6: 1ppm dimedon a tápközegben). 78

95 38. ábra Endogén HCHO tartalom meghatározása HPLC módszerrel D. innoxia kaluszszövetben (standard: formaldimedon tesztoldat, minta: 6 hetes, sötétben nevelt, a tápközegben 1ppm dimedont tartalmazó D. innoxia kalluszszövetbol készült kivonat). A 39. ábra Endogén HCHO tartalom kimutatása MALDI-MS módszerrel D. innoxia kaluszszövetben (A: formaldimedon tesztoldat, B: 6 hetes, sötétben nevelt, a tápközegben 1ppm dimedont tartalmazó D. innoxia kalluszszövetbol készült kivonat). B adatok azonban azt jelzik, hogy az idosebb szövetek endogén HCHO tartalma ismét megemelkedik [189,35]. Eredményeink ugyanakkor azt mutatták, hogy a fényen nevelt szövetek HCHO koncentrációja minden vizsgált idopontban (2, 4 és 6 hetet követoen egyaránt) szignifikáns mértékben meghaladta a sötétben tenyésztett kalluszokban mért értékeket (4/B. ábra). 79

96 Friss súly (g) sötétben fényen A szövetek HCHO koncentrációja (ug/g) sötétben fényen Tenyésztési ido (hét) Tenyésztési ido (hét) A 4. ábra D. innoxia kalluszszövetek friss súlyának (A) és mérheto endogén HCHO koncentrációjának változása (B) sötétben és fényen, a 6 hetes tenyésztési ido alatt Szövettani jellemzés A sötétben és fényen nevelt, 6 hetes kalluszszövetek mikroszkópos vizsgálatát a megfeleloen elokészített (fixált, dehidrált és beágyazott) szövetekbol készült metszetek HE festését követoen végeztük el. A sötétben és fényen tenyésztett szövetek sejtjei nem mutattak morfológiai eltérést, a sejtek parenchimatikusak voltak, szöveti differenciálódás jeleit nem mutatták. Kisebb sejtekbol álló, jól festodo sejtmagokat tartalmazó sejtcsoportokat minden metszetben megfigyeltünk (41/A. ábra). A HE festést követoen néhány esetben különösen a kultúrák felszínhez közeli sejtjeiben - a sejtmagok jellegzetes zsugorodását figyeltük meg, mely apoptotikus folyamatokra engedett következtetni (41/B. ábra). B A B 41. ábra D. innoxia kallusz szövetminták HE festést követoen, A: 6 hetes, fényen nevelt szövet (k: kis méretu sejtekbol álló csoport, 1x os nagyítás), B: 6 hetes, sötétben nevelt szövet (a: apoptotikus folyamatokra utaló, zsugorodott sejtmagok, 2x os nagyítás). 8

97 Abiogén stressz hatása a kultúrák növekedésére A dimedont sikeresen alkalmazták többek között D. innoxia kalluszszövetekben az endogén HCHO kimutatására és meghatározására a molekula és a HCHO között lezajló irreverzibilis reakciót felhasználva [189]. A dimedon in vivo sejtekre, szövetekre gyakorolt, endogén HCHO elvonáson alapuló hatásának tanulmányozása céljából a vegyüle tet növekvo koncentrációban alkalmaztuk D. innoxia kalluszszövetek tápközegében. A szilárd AMS tápközegbe adagolt dimedon (ppm kontroll, 1ppm, 1ppm, 1ppm és 1ppm) jellegzetes hatással volt a szövetek növekedésére sötétben (42. és 44/A. ábrák) és fényen (43. és 44/B: ábrák) egyaránt. Alacsonyabb dimedon koncentrációk elosegítették a szövetek növekedését, így 1ppm és 1ppm dimedon tartalom mellett a friss súly értékei (4 hét elteltével sötétben: 17,19g és 17,75g, fényen: 15,62g és 16,34g) elérték, ill. kis mértékben meghaladták a kontroll szöveteknél mért értékeket (sötétben: 15,36g, fényen: 17,7g) (4/A. és 44. ábrák), míg 1ppm dimedon adagolása mellett 4 hét után jelentosen megnott a szövetek friss súlya (sötétben: 19,55g, fényen: 18,76g) (44. ábra). A legmagasabb alkalmazott dimedon koncentráció (1ppm) jelentos növekedésgátlást okozott sötétben és fényen egyaránt, csupán a 6 hetes, sötétben nevelt A B C 42. ábra D.innoxia kallusz kultúrák 2 (A), 4 (B) és 6 (C) hét nevelés után sötétben, szilárd AMS tápközegen (balról jobbra: ppm, 1ppm, 1ppm, 1ppm és 1ppm dimedon a tápközegben). 81

98 A B C 43. ábra D.innoxia kallusz kultúrák 2 (A), 4 (B) és 6 (C) hét nevelés után fényen, szilárd AMS tápközegen (balról jobbra: ppm, 1ppm, 1ppm, 1ppm és 1ppm dimedon a tápközegben). Friss súly sötétben (g) hetes 4 hetes 6 hetes Friss súly fényenen (g) hetes 4 hetes 6 hetes Tápközeg dimedon tartalma (ppm) Tápközeg dimedon tartalma (ppm) A 44. ábra D. innoxia kalluszszövetek friss súlyának változása sötétben (A) és fényen (B) 2, 4 és 6 hetet követoen. kalluszkultúrák friss súlya (14,7g) közelítette meg a kontroll értéket (16,12g) (4/A. és 44/A. ábrák). Az 1pm dimedont tartalmazó táptalajon nevelt szövetek ugyanakkor hamar megbarnultak és az idos szövetekre jellemzo megjelenést mutattak (42. és 43. ábrák). A sötétben és fényen nevelt szövetek szárazanyag tartalma hasonlóan a mért friss súlyokhoz nem tért el jelentosen egymástól. Általában elmondható, hogy a sötétben nevelt szövetek szárazanyag tartalma, minden alkalmazott dimedon koncentráció mellett kissé magasabb volt (45. ábra). A 4. B 82

99 hétre a szövetek fejlodésével párhuzamosan jelentosebben visszaesett a szárazanyag tartalom. 1ppm dimedon alkalmazását követoen mindhárom vizsgálati idopontban magas (más kezelésekkel összehasonlítva sötétben közel 25%-al, fényen közel 7%-al magasabb) szárazanyag tartalom értékeket kaptunk (45. ábra). Ezzel szemben 6 hete t követoen, sötétben alacsony értéket mértünk (45/A. ábra). Szárazanyag tartalom sötétben (%) hetes 4 hetes 6 hetes Szárazanyag tartalom fényen (%) hetes 4 hetes 6 hetes Tápközeg dimedon tartalma (ppm) Tápközeg dimedon tartalma (ppm) A 45. ábra D. innoxia kalluszszövetek szárazanyag tartalmának változása sötétben (A) és fényen (B) 2, 4 és 6 hetet köve toen. B Növekedési érték sötétben hetes 4 hetes 6 hetes Növekedési érték fényen hetes 4 hetes 6 hetes Tápközeg dimedon tartalma (ppm) Tápközeg dimedon tartalma (ppm) A 46. ábra D. innoxia kalluszszövetek növekedési értékének változása sötétben (A) és fényen (B) 2, 4 és 6 hetet követoen. B A legmagasabb növekedési értékeket 1ppm dimedon alkalmazása mellet kaptuk (pl. 6 hetet követoen sötétben: 9,5; fényen: 14,67), a fényen nevelt szövetek értékei pedig jelentosen meghaladták a sötétben tenyésztett szövetek esetében számolt értékeket (46. ábra). A legmagasabb dimedon tartalom hatására (1ppm) a szövetek növekedése jelentosen lelassult, a legtöbb esetben a kontroll szövetek növekedése alatt maradt. A 6. hétre a növekedési értékek közötti különbségek ugyanakkor csökkentek (46. ábra). Az 1ppm dimedont tartalmazó táptalajon, 83

100 sötétben nevelt kalluszok esetében pl. a növekedési érték (7,6), a friss súly változásánál észlelteknek megfeleloen megközelítette a kontroll értékét (8,84) (46/A. ábra) Abiogén stressz hatása a kultúrák mérheto HCHO tartalmára A szövetek endogén HCHO tartalmát hasonlóan a kontroll tenyészetekhez denzitometriás és HPLC módszerekkel határoztuk meg. A tápközegbe adott dimedon a szövetek növekedése mellett jellegzetes módon befolyásolta a kalluszszövetek mérheto endogén HCHO tartalmát sötétben és fényen egyaránt. A kontroll (dimedon mentes táptalajon nevelt) tenyészetekhez hasonlóan a szövetek endogén HCHO koncentrációja jelentosen csökkent a 6. hét végéig (47. ábra). A különbözo dimedon tartalmú táptalajokon nevelt kalluszszövetek esetében is azt tapasztaltuk, hogy a fényen nevelt szövetek mérheto HCHO tartalma meghaladta a sötétben nevelt mért értékeket (47. ábra). A tápközegbe adott 1ppm dimedon hatására a kontroll tenyészetekhez képest - kis mértékben csökkent az endogén HCHO koncentráció (4/B. és 47. ábrák). 1ppm és 1ppm dimedon hatására kissé tovább csökkentek, vagy nem változtak szignifikánsan az értékek. 1ppm dimedon hatására azonban a 4. és 6. hétre megemelkedett a HCHO koncentráció, mely nem csupán elérte, hanem pl. a 4. héten sötétben és fényen is (17,µg/g; illetve 27,µg/g liofilizált szövet) meghaladta a kontroll szövetekben mért értékeket (15,µg/g; illetve 18,µg/g liofilizált szövet) (4/B. és 47. ábrák ). A szövetek HCHO koncentrációja sötétben (ug/g) hetes 4 hetes 6 hetes A szövetek HCHO koncentrációja fényen (ug/g) hetes 4 hetes 6 hetes Tápközeg dimedon tartalma (ppm) Tápközeg dimedon tartalma (ppm) A 47. ábra D. innoxia kalluszszövetek mérheto endogén HCHO koncentrációjának változása a tápközeg dimedon tartalmának függvényében sötétben (A) és fényen (B), 2,4 és 6 hetet követoen. B A kalluszsejtek apoptotikus folyamatainak vizsgálata A korábban, HE festést követoen észlelt, jellegzetesen zsugorodott sejtmagok (41/B. ábra) a TUNEL reakció elvégzését követoen szelektíven festodtek (48/B. és D. ábrák), mely alátámasztotta az apoptotikus folyamatok jelenlétét ezekben a sejtekben. (Meg kell jegyezni azonban, hogy néhány esetben olyan sejtek is TUNEL pozitív reakciót adtak, melyekben a HE festést követoen nem lehetett 84

101 kimutatni az apoptózisra jellemzo morfológiai változásokat, pl. a sejtmag és citoplazma zsugorodását.) Az apoptotikus sejtek megoszlása nem volt egyenletes a szöveteken belül. A TUNEL pozitív sejtmagok esetében azt észleltük, hogy számuk a tenyészet felszínéhez közeli 1-2 sejtrétegben magasabb volt (a sejteknek akár 3%-a), míg arányuk a mélyebben található sejtrétegek felé haladva gyorsan csökkent. A tápközegbe adagolt dimedon - hasonlóan a kultúrák növekedéséhez jellegzetes hatást gyakorolt az apoptotikus sejtek számára. Az A i értéke nott az alkalmazott dimedon mennyiségével párhuzamosan, de 1ppm dimedon tartalom mellett csaknem teljesen megszunt a DNS fragmentálódás, az A i értéke pedig jelentosen csökkent, különösen a fényen nevelt szövetek esetében (48/F. és 49. ábra). Megfigyeltük továbbá, hogy a fényen nevelt szövetekben 1ppm dimedon tartalom kivételével minden alkalmazott dimedon koncentráció mellett jelentosen kevesebb apoptotikus sejtmag volt kimutatható (49. ábra). Apoptotikus index (Ai Tápközeg dimedon tartalma (ppm) sötétben fényen 49. ábra D. innoxia kalluszszövetek apoptotikus indexének (Ai) változása (sötétben és fényen, 6 hét tenyésztési ido után) a tápközeg dimedon tartalmának függvényében Hairy root tenyészetek A D. innoxia in vitro növények szárának A. rhizogenes A4 törzzsel történt mikroinjektálása után megjeleno járulékos gyökereket (5. és 51. ábrák) izolálás és baktériummentesítés után szilárd (52. ábra), majd folyékony (53. ábra), 2% szacharózt tartalmazó MS táptalajon tenyésztettük. 85

102 5. ábra D. innoxia hajtás hairy root-okkal 12 nappal az A. rhizogenes A4 törzzsel történt fertozés után. A B 51. ábra D. innoxia # 41 hairy root klón 4 hét nevelés után, szilárd MS tápközegen (A: 1x és B: 2x nagyítás). A B C 52. ábra D. innoxia #41 (A), #411 (B) és #415 (C) hairy root klónok 4 hét nevelés után, szilárd MS tápközegen. 86

103 A B C 53. ábra D. innoxia # 41 (A), #411 (B) és #415 (C) hairy root klónok 4 hét nevelés után sötétben, folyékony MS tápközegben. Az eloállított, genetikailag eltéro hairy root klónok szelekcióját követoen részletesebb vizsgálatainkhoz növekedésük és tropán alkaloid tartalmuk alapján két hioszciamin foalkaloidos (# 41 és # 415), valamint egy szkopolamin foalkaloidos klónt (# 411) használtunk fel (52. és 53. ábrák) A géntranszformáció igazolá sa A kísérleteink során felhasznált géntranszformált gyökérkultúrák (hairy root klónok) genetikai vizsgálatára több módszert alkalmaztunk. A bakteriális, A. rhizogenes A4 törzsbol származó DNS állomány (rolb gén meghatározott szakasza) kimutatására PCR te chnikát alkalmaztunk, míg a transzgén expressziójának, muködésének bizonyítása céljából az opinok jelenlétét mutattuk ki a transzformált növényi szövetekben. Az A. rhizogenes fertozést követoen kialakuló járulékos gyökerek, valamint a belolük létrehozott hairy root kultúrák az Agrobacterium-okra jellemzo speciális anyagcsretermékeket (opinokat) termelnek. A nem transzformált növényi sejtek nem tartalmaznak opinok szintéziséért felelos géneket, így nem képesek eloállítani ezeket, az Agrobacteriumok anyagcseréje szempontjából fontos vegyületeket. Mivel a fertozés során az A. rhizogenes Ri plazmidjának meghatározott szakasza (t-dns) mely pl a rolb gént és az opinok szintéziséért felelos géneket is tartalmazza bejut a növényi sejtbe és stabilan integrálódik a sejtmag DNS-ébe, a különbözo opinok növényi sejtekbol, szövetekbol történo kimutatása igazolja a sikeres géntranszformációt Polimeráz láncreakció Az A. rhizogenes t-dns ben található rolb transzgén meghatározott szakaszának hairy root genomban való jelenlétét PCR technika segítségével igazoltuk a kísérleteink során legtöbbször felhasznált # 41 hairy root klón esetében. A DNS izolálás ellenorzése céljából külön vizsgáltuk a PCR kivitelezésekor negatív kontrollként alkalmazott (nem transzformált) D. innoxia in vitro növény 87

104 gyökerét, továbbá a # 41 hairy root klón sejtjeit. Az izolált DNS mindkét kivonat esetében jól meghatározott foltokat adott az agarózgélen (54/A. ábra, világos sávok). A PCR elvégzését követoen a D. innoxia in vitro növény gyökerének sejtjeibol izolált DNS (negatív kontroll) nem tartalmazott a rolb gén jelenlétére utaló szekvenciát (54/B. ábra 1 és 2). Az A. rhizogenes A4 törzsbol izolált plazmid DNS (pozitív kontroll) ugyanakkor a marker által jelzett helyen (7bp-8bp) (54/B. ábra 5) a rolb génnek megfelelo, 78bp méretu szekvenciát tartalmazott (54/B. ábra 6 és 7). A kontroll eredmények alapján igazoltuk, hogy a # 41 hairy root klón szöveteinek sejtjeiben szintén jelen volt a rolb génre jellemzo DNS szakasz (54/B. ábra 3 és 4). A 54. ábra A: D. innoxia in vitro növény levelének (1 és 2) és az A. rhizogenes A4-es törzs alkalmazásával eloállított hairy root klón (# 41) (3 és 4) DNS kivonata agarózgél elektroforézist követoen, B: polimeráz láncreakció (PCR) eredménye (1 és 2: D. innoxia in virto növény levele - negatív kontroll, 3 és 4: D. innoxia #41 hairy root klón, 5: marker, 6 és 7: A. rhizogenes A4 törzs plazmid DNS - pozitív kontroll). B Opinok kimutatása A kísérleteink során vizsgált D. innoxia hairy root klónok (# 41, # 411 és #415) opin termelését papír elektroforézis segítségével igazoltuk (55. ábra). A tesztvegyületként használt mannopint - vagy a vele azonos Rf értéken megjeleno mannopinsavat - a vizsgált hairy root klónok közül kettoben (# 41 és # 411) sikerült kisebb mennyiségben kimutatni (Rf =,46). Viszonylag nagyobb mennyiségben tartalmaztak a kultúrák két másik opin komponenst, melyeket az irodalomban közölt Rf értékek alapján agropinként (Rf =,56) és agropinsavként (Rf =,25) azonosítottunk [128, 36 ]. Agropint és agropinsavat a # 41 és # 411 klónok egyaránt tartalmaztak, a # 415 klón szöveteiben azonban kiemelten csak agropinsavat sikerült kimutatnunk (55. ábra). Az irodalmi adatoknak megfeleloen az említett opin molekulák (agropin, agropinsav, mannopin és mannopinsav) mindegyikének jelenléte jellemzo az A. rhizogenes A4 törzs alkalmazásával eloállított hairy root szövetekre, a viszonylag 88

105 nagyobb agropinsav tartalomért pedig a tenyésztési ido és az opinok izolálása egyaránt felelossé teheto [128]. front agropin mannopin (mannopinsav) agropinsav start 89

106 55. ábra Opinok kimutatása D. innoxia hairy root klónokban papír elektroforézist követoen (1 és 5: mannopin teszt, 2: # 41, 3: # 411 és 4: # 415 klónokból készült kivonatok) A hairy root klónok növekedési jellemzoinek vizsgálata sötétben és fényen Részletesen vizsgáltuk három, folyékony MS tápközegen nevelt D. innoxia hairy root klón (# 41, # 411 és # 415) növekedési jellemzoit (frissés szárazsúly, szárazanyag tartalom, növekedési érték) és a tápközegek ph-jának változását a 6 hetes tenyésztési idoszak alatt. A vizsgált klónok friss súlya az átoltást követo kisebb csökkenéstol eltekintve folyamatosan emelkedett az 5. hétig sötétben és fényen egyaránt. A 6. hétre a friss súly értéke változatlan maradt, illetve kis mértékben csökkent (56. ábra). A fényen tenyésztett klónok friss súlya jelentosen, 1,7-2,3-szorosan meghaladta a sötétben tenyésztett szövetekét mindhárom klón esetében (56. ábra). Az egyes klónok friss súlyának gyarapodása nem tért el jelentosen egymástól. Míg sötétben a # 41 és #415 klónok friss súlya közel megegyezett, fényen egyértelmuen a # 41 klón friss súlya volt magasabb (56. ábra). A szövetek szárazanyag tartalma jellemzo módon változott (nott, majd csökkent) a tenyésztési ido alatt, ugyanakkor a 4. hétig nem mutatott jelentos eltérést a sötétben és fényen nevelt kultúrák között (57. ábra). Az átoltást követoen minden klón esetében gyorsan nott a szárazanyag tartalom, majd feltehetoen a sejtek térfogatának növekedésével párhuzamosan fokozatosan csökkent. A 4. hetet követoen a sötétben nevelt szövetek szárazanyag tartalma kis mértékben ismét megemelkedett, de csupán a # 41 klón esetében haladta meg az 1. héten kapott értéket (57/A. ábra). B Friss súly (g) sötétben Friss súly (g) fényen A Tenyésztési ido (hét) Tenyésztési ido (hét) 56. ábra D. innoxia hairy root klónok (# 41, # 411 és #415) friss súlyának változása sötétben (A) és fényen (B) a 6 hetes tenyésztési idoszak alatt. A fényen nevelt kultúrákat tanulmányozva megállapítottuk, hogy a szárazanyag tartalom ellentétben a sötétben nevelt szöveteknél tapasztaltakkal tovább csökkent az 5. hétig, majd változatlan szinten maradt a 6. hét végéig (57/B. ábra). A szövetek számított növekedési értéke folyamatosan nott a vizsgált idoszakban (58. ábra). Az egyes klónok növekedési értékei ugyanakkor nem tértek el jelentosen egymástól sem sötétben, sem pedig fényen. A három vizsgált klón növekedési értékét összehasonlítva a # 411 klón növekedése volt viszonylag kisebb, sötétben és fényen közel megegyezo (58. ábra). A #41 és

107 #415 klónok növekedési értéke nem tért el szignifikánsan a 6. hétre, és az érté kek hasonlóan a #411 klónhoz csaknem megegyeztek a sötétben és fényen nevelt kultúrák között (58. ábra). A kapott eredmények alapján elmondható tehát, hogy a három vizsgált hairy root klón növekedési jellemzoi nem térnek el szignifikánsan sötétben és fényen. Növekedési érték sötétben Tenyésztési ido (hét) Szárazanyag tartalom (%) sötétben Tenyésztési ido (hét) Növekedési érték fényen Tennyésztési ido (hét) B Szárazanyag tartalom (%) fényen A Tenyésztési ido (hét) ábra D. innoxia hairy root klónok (# 41, # 411 és #415) szárazanyag tartalmának változása sötétben (A) és fényen (B) a 6 hetes tenyésztési idoszak alatt. B A 58. ábra D. innoxia hairy root klónok (# 41, # 411 és # 415) növekedési értékeinek változása sötétben (A) és fényen (B) a 6 hetes tenyésztési idoszak alatt. A folyékony MS tápközegek ph-ját hasonlóan a növekedési jellemzokhöz hetente határoztuk meg. Az átoltást követoen, a 2. hétig gyorsan csökkent a tápközegek ph értéke ph 5,7-rol ph 4,5 körüli értékre (59. ábra). A 2. hetet követoen, a kultúrák öregedésével és feltehetoen a tápközegbe kiválasztott tropán alkaloidok mennyiségének emelkedésével párhuzamosan, egészen az 5-6. hét végéig nott a tápközegek ph értéke (59. ábra). A sötétben nevelt kultúrákat tanulmányozva megállapítottuk, hogy a 6. hét végére a tápközegek ph értéke csaknem elérte, vagy kis mértékben meghaladta a kezdeti ph 5,7- es értéket (ph 5,47-5,8) (59/A. ábra). A fényen tenyésztett szövetek esetében nagyobb mértékben 91

108 nottek a tápközeg ph értékei a tenyésztési ido végére (ph 5,7-rol ph 6,35-6,53-ra) (59/B. ábra). A három klón esetében mért értékek kevés kivételtol eltekintve nem mutattak szignifikáns eltérést (59. ábra). B Tápközeg ph sötétben Tápközeg ph fényen A Tenyésztési ido (hét) Tenyésztési ido (hét) 59. ábra D. innoxia hairy root klónok (# 41, # 411 és # 415) tápközeg ph értékeinek változása sötétben (A) és fényen (B) a 6 hetes tenyésztési idoszak alatt. Összefoglalva a D. innoxia hairy root klónok növekedésének vizsgálata során kapott eredményeinket elmondhatjuk, hogy az átoltást követoen észlelt kisebb csökkenéstol eltekintve mindhárom klón friss súlya egyenletesen gyarapodott az átoltást követo 4-5. hétig, amikor is a #41 és # 415 (sötétben), illetve a # 41 (fényen) klónok esetében mértük a legnagyobb értékeket (56. ábra). A friss súly alakulásával összhangban változott a szövetek szárazanyag tartalma, mely az átoltást követoen nott, majd fokozatosan csökkent. A sötétben és fényen nevelt klónok szárazanyag tartalmának változása ugyanakkor eltérést mutatott az átoltást követo 5-6. hétre. Míg fényen a tenyésztési ido végén kis szárazanyag tartalom értékeket kaptunk, sötétben egyértelmuen az értékek növekedését mértük mindhárom klón esetében (57. ábra), mely alátámasztja azon megfigyelésünket, hogy a sötétben nevelt kultúrák rövidebb ideig orzik meg életképességüket. A klónok növekedési értékei egyenletes növekedést mutattak, egészen a 6. hét végéig, jelentos eltérést nem észleltünk a sötétben és fényen nevelt szövetek között (58. ábra). A tápközeg ph értékek alakulása megfelet az irodalmi adatoknak [71], kezdeti csökkenés után növekvo értékeket mértünk. A fényen nevelt klónok tápközegének ph-ja a sötétben nevelt szövetekkel ellentétben a 2. hét után gyorsan elérte, majd meghaladta a kiindulási ph 5,7 értéket. A 4-6. héten, fényen szignifikánsan magasabb ph-kat mértünk (59. ábra) A klónok tropán alkaloid tartalma és alkaloid produkciója A szövetek növekedéséhez hasonlóan részletesen tanulmányoztuk a kiválasztott hairy root klónok alkaloid tartalmát és alkaloid produkciós értékeit mind a sötétben, mind pedig a fényben nevelt kultúrák esetében. - Tropán alkaloidok kimutatása MALDI-MS technikával Az alkaloid tartalom meghatározásához készített, tisztított kivonatokban MALDI-MS technika segítségével sikerült kimutatnunk és azonosítanunk a hioszciamint és szkopolamint (6. és 61. ábrák). 92

109 A B 6. ábra Hioszciamin (A) és szkopolamin (B) tesztoldatok MALDI-MS spektruma. A D. innoxia # 41 klón vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a szövetek hioszciamin tartalma az átoltást követo 4. hétre érte el a legmagasabb értéket sötétben és fényen egyaránt (1,99mg/g és 2,8mg/g liofilizált szövet) (63. ábra). A sötétben nevelt szövetek hioszciamin tartalma gyorsan emelkedett, és már a 2. hét végére megközelítette a legmagasabb értéket, mely a 4. hét után is csak kisebb mértékben csökkent (63/A. ábra). A szövetekben mért hioszciamin tartalom fényen lassabban érte el a maximális értéket, a 4. hét után pedig jelentosen csökkent (63/B. ábra). Eredményeink azt mutatják, hogy a # 41 klón szöveteinek hioszciamin tartalma a fényen nevelt 3 és 5 hetes kultúrák kivételével meghaladja a szkopolamin tartalmat. A szkopolamin tartalom sötétben szintén gyorsan emelkedett és a tenyésztés 2-4. hetére ért el maximális értéket 61. ábra D. innoxia # 41 hairy root klón felhasználásával készült kivonat MALDI-MS spektruma. - Alkaloid tartalom meghatározása HPLC módszerrel A szövetek hioszciamin, szkopolamin és apoatropin tartalmát kvantitatívan HPLC technika segítségével határoztuk meg (62. ábra). 62. ábra D. innoxia # 41 hairy root klón (2 héten át fényen tenyésztve) alkaloid kivonatának HPLC kromatogramja. (1,62mg/g 1,67mg/g liofilizált szövet) (63/A. ábra). A fényen nevelt szövetek szkopolamin tartalma valamivel késobb, a 3-5. hétre érte el a legmagasabb értékeket (1,58mg/g 1,68mg/g 93

110 liofilizált szövet), és csak ezt követoen csökkent jelentosen (63/B. ábra). Az apoatropin tartalom sötétben a 2-4. hétig volt magasabb (,17mg/g,21mg/g liofilizált szövet), az 5. és 6. héten a hioszciamin és szkopolamin tartalom csökkenésével párhuzamosan kisebb értékeket mértünk (,1mg/g és,8mg/g liofilizált szövet) (63/A. ábra). Fényen egészen a 2-5. hétig viszonylag nagyobb apoatropin tartalmat mértünk (,19mg/g,22mg/g liofilizált szövet), csupán a 4. héten csökkent kisebb mértékben ezen alkaloid mennyisége (,11mg/g liofilizált szövet) (63/B. ábra). (,47mg/liofilizált kultúra), szkopolamin produkciója pedig már a 3. héten elérte a legmagasabb értékeket (,33mg/liofilizált kultúra) (64/A. ábra). A fényen nevelt kultúrák esetében a Alkaloid produkció (mg/kultúra) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin Alkaloid tartalom (mg/g) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin Alkaloid produkció (mg/kultúra) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin Alkaloid tartalom (mg/g) A Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin B 63. ábra D. innoxia # 41 hairy root klón sötétben (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid tartalma (szárazsúlyra vonatkoztatva). Az alkaloid tartalom és az átlagos szárazsúly értékeibol számított alkaloid produkció értékei alapján megállapítható, hogy a sötétben tenyésztett szövetek hioszciamin produkció ja az 5. héten A B 64. ábra D. innoxia # 41 hairy root klón sötétben (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid produkciós értékei (szárazsúlyra vonatkoztatva). szkopolamin produkció szintén a 3. héten érte el a maximumot (,6mg/liofilizált kultúra), a hioszciamin produkció viszont a 4. héten volt a legnagyobb (,77mg/liofilizált kultúra) (64/B. ábra). Fontos kiemelni azonban, hogy míg az alkaloid tartalom szempontjából nem volt jelentos eltérés, az alkaloid produkció esetében azonban jelentosen magasabb - közel kétszeres - értékeket kaptunk a fényen tenyésztett kultúrák esetében (64. ábra). 94

111 A # 415 klón alkaloid tartalmát tanulmányozva azt találtuk, hogy hasonlóan a # 41 klónhoz ezekben a szövetekben is a hioszciamin a foalkaloid (65. és 66. ábrák). Sötétben tenyésztett szövetekben az átoltást követoen gyorsan csökkent mind a hioszciamin, mind pedig a szkopolamin tartalom. Csak az 5-6. héten tapasztaltunk növekedést, de a 6. héten mért értékek (2,26mg/g hioszciamin és 1,34mg/g Alkaloid tartalom (mg/g) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin szkopolaminliofilizált szövet) sem haladták meg 2.5 jelentosen Alkaloid tartalom (mg/g) hioszciamin szkopolamin apoatropin Tenyésztési ido (hét) B A 66. ábra D. innoxia # 415 hairy root klón sötétben (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid tartalma (szárazsúlyra vonatkoztatva). 65. ábra D. innoxia # 415 hairy root klón (4 héten át fényen tenyésztve) alkaloid kivonatának HPLC kromatogramja. az 1 hetes kultúrákban mért értékeket (1,86mg/g hioszciamin és 1,27mg/g szkopolamin liofilizált szövet) (66/A. ábra). Fényen a 3. és 5. héten mértünk nagyobb hioszciamin (1,85mg/g és 1,89mg/g liofilizált szövet) és szkopolamin tartalom értékeket (1,9mg/g és 1,7mg/g liofilizált szövet), melyek az 5. hét után csökkentek (66/B. ábra). A sötétben nevelt kultúrákban - hasonlóan az alkaloid tartalom étékeihez - egészen a 6. hétig (,63mg hioszciamin,,37mg szkopolamin és,2mg apoatropin/liofilizált kultúra) növekedtek az alkaloid produkciós adatok (67/A. ábra).fényen szintén az alkaloid tartalom értékeinek megfeleloen a 3. és az 5. héten 95

112 kaptunk kiugró értékeket (,68mg és,73g hioszciamin, illetve,38mg és,42mg szkopolamin/liofilizált kultúra), (67/B. ábra), de csupán az 5. héten mért értékek közelítették meg a #41 klónnál, fényen kapott értékeket (64/B. és 67/B. ábrák). Alkaloid produkció (mg/kultúra) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin héten maximális szkopolamin tartalmat mértünk (1,21mg/g liofilizált szövet), mely ebben az esetben is fokozatosan csökkent, majd az 5. héten mért kis mértéku emelkedés után jelentosen csökkent (69/B. ábra). A sötétben nevelt kultúrák hioszciamin tartalma a 3. héten volt a legnagyobb (1,9mg/g liofilizált szövet), majd csökkenést követoen az 5. héten kissé újra megnott (,99mg/g liofilizált szövet) (69/A. ábra). Fényen hasonlóan a szkopolamin tartalomhoz kisebb értékeket mértünk, a maximumot az 5. héten detektáltuk (,77mg/g liofilizált szövet) (69/B. ábra)..9 Alkaloid produkció (mg/kultúra) hioszciamin szkopolamin apoatropin Tenyésztési ido (hét) A B 67. ábra D. innoxia # 415 hairy root klón sötétben (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid produkciós értékei (szárazsúlyra vonatkoztatva). 68. ábra D. innoxia # 411 hairy root klón (5 héten át fényen tenyésztve) alkaloid kivonatának HPLC kromatogramja. A különbözo hairy root tenyészetek növekedésének és alkaloid tartalmának elozetes vizsgálatát követoen sikerült kiszelektálnunk egy klónt (# 411), mely szkopolamin foalkaloidot tartalmazott (68. és 69. ábrák). A # 411 klón szkopolamin tartalma sötétben volt nagyobb, a 3. hétre érte el a maximumot (1,72mg/g liofilizált szövet), majd az 5. hét után jelentosen csökkent (69/A. ábra). Fényen nevelt szövetekben már a 2. 96

113 B Alkaloid tartalom (mg/g) Alkaloid tartalom (mg/g) A Tenyésztési ido (hét) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin hioszciamin szkopolamin apoatropin 69. ábra D. innoxia # 411 hairy root klón sötétben (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid tartalma (szárazsúlyra vonatkoztatva). Az apoatropin tartalom viszonylag egyenletesen alakult a tenyésztési ido alatt, csökkenés csak a 3. hét után következett be (69. ábra). Az alkaloid tartalom meghatározásánál tapasztaltakkal ellentétben az alkaloid produkciós értékek a # 411 klón esetében is nagyobbak voltak a fényen nevelt szövetek esetében, bár ebben az esetben nem tapasztaltunk akkora eltérést, mint a #41 klónnál (64. és 7. ábrák). A sötétben tenyésztett kultúrák hioszciamin produkciója egészen a tenyésztési ido végéig, a 6. hétig emelkedett (,23mg/liofilizált kultúráig). A szkopolamin produkció már az 5. héten maximumot mutatott (,29mg/liofilizált kultúra), az apoatropin esetében még az 5. és 6. héten is viszonylag magasabb értékeket kaptunk (,2mg/liofilizált kultúra). (7/A. ábra). Fényen a hioszciamin produkció csupán az 5. héten haladta meg jelentosen a sötétben kapott értékeket (,3mg/liofilizált kultúra), szkopolamin esetében azonban már a 2. héttol (,3mg/liofilizált kultúra) jelentosen magasabb értékeket kaptunk. A legnagyobb, 5. heti értékeket követoen (szkopolamin esetében,34mg/liofilizált kultúra) mindkét alkaloid produkciójának esetében jelentos csökkenést detektáltunk (7/B. ábra). Az apoatropin produkció csupán fényen volt jelentosebb, a 2-5. héten viszonylag egyenletesen magasabb értékekkel (,4mg,6g/liofilizált kultúra) (7. ábra). Alkaloid produkció (mg/kultúra) Alkaloid produkció (mg/kultúra) A Tenyésztési ido (hét) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin hioszciamin szkopolamin apoatropin B 7. ábra D. innoxia # 411 hairy root klón sötétben (A) és fényen (B) tenyésztett szöveteinek alkaloid produkciós értékei (szárazsúlyra vonatkoztatva). 97

114 Összefoglalva a szelekciót követoen részletesebben vizsgált 3 klón esetében kapott alkaloid tartalom eredményeket elmondható, hogy a #41 és # 415 klónokban a hioszciamin található foalkaloidként, a # 411 klón pedig egyértelmuen szkopolamin foalkaloidos. A sötétben nevelt # 41 klón hioszciamin tartalma 4 héten volt a legnagyobb, a # 415 klón esetében ugyanekkor minimumot mértünk, a # 411 klón esetében pedig a hioszciamin tartalom viszonylag hamar, a 3. hétre elérte a legnagyobb értéket. A sötétben nevelt klónok szkopolamin tartalma hasonlóan alakult (63/A., 66/A. és 69/A. ábrák). A #411 klón esetében a 3. héten mértük a legnagyobb szkopolamin tartalmat is, mely ekkor közel 1,7- szeresen múlta felül a hioszciamin tartalmat (69/A. ábra). A 6. héten csökkent a # 41 és # 411 klónok hioszciamin és szkopolamin és apoatropin tartalma, a #415 klón esetében azonban a 4. héttol jelentos alkaloid tartalom növekedést mértünk (63/A., 66/A. és 69/A. ábrák). Fényen a # 41 és #415 klónok alkaloid tartalma volt magasabb (3-5. héten). A # 41 klón hioszciamin tartalma hasonlóan a sötétben nevelt szövetekhez a 4. héten volt a legnagyobb. A # 415 klón alkaloid tartalmának alakulása jelentosen eltért a sötétben nevelt szövetekétol, mivel fényen a 3. és 5. héten is maximális hioszciamin és szkopolamin értékeket kaptunk. A # 411 klón szkopolamin tartalma már az átoltást követo 2. héten elérte a legnagyobb értéket, a 6. hétre azonban mindhárom klón esetében alkaloid tartalom csökkenést mértünk (63/B., 66/B. és 69/B. ábrák). Az alkaloid produkció mindhárom klón esetén fényen volt nagyobb. A # 41 klón esetében, sötétben az 5. és 6. héten kaptunk maximális hioszciamin produkciós értékeket, míg a szkopolamin produkció már a 3. héten elérte a maximumot. A sötétben tenyésztett kultúrák hioszciamin és szkopolamin produkciós értékei közül a # 415 klón esetében, 6 hetet követoen kapott értékek a legnagyobbak (64/A., 67/A. és 7/A. ábrák). A fényen nevelt szövetek hioszciamin produkciója szemponjából a # 41 klón bizonyult a legelonyösebbnek 4 hét tenyésztést követoen, a klón szkopolamin produkciója pedig egészen a 3-5. hétig egyenletesen nagy volt. Ki kell emelni ugyanakkor, hogy a #411 klón esetébe a sötétben és a fényen nevelt szövetek szkopolamin produkciója a 2-5. hétig szignifikánsan meghaladta a hioszciamin produkciós értékeket (64/B., 67/B. és 7/B. ábrák) A hairy root kultúrák szövettani vizsgálata Az MS alaptáptalajon nevelt szövetek vizsgálata A D. innoxia #41 hairy root klón szöveteibol készült metszetek HE festést követo mikroszkópos vizsgálata során a fiatal gyökerekre jellemzo szöveti felépítést figyeltük meg. Kívül a rhizodermisz található, melynek sejtjei között sok esetben a gyökérszorök is láthatók (71. ábra). 98

115 apoptotikus folyamatokra utaló, jellegzetes morfológiájú sejtmagokat észlelnünk (71. ábra). A B 71. ábra D. innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek hossz- (A, 1x os nagyítás) és keresztmetszeti (B, 2x os nagyítás) képe (4 héten át, sötétben tenyésztve, HE festést követoen. a: rhizodermisz, c: hipodermisz, d: kéregparenchima, e: fanyalábok, f: háncsnyalábok, g: edények hálózatos és vermes-gödörkés sejtfalvastagodással) HISZTOKÉMIAI VIZSGÁLATOK DRAGENDORFF REAGENS ALKALMAZÁSÁVAL Az alkaloidok szöveteken, sejteken belüli lokalizációjának tanulmányozása céljából a D. innoxia in vitro növény gyökereihez hasonlóan hisztokémiai reakciót végeztünk Dragendorff reagens alkalmazásával. A vizsgált hairy root klón (# 41) szöveteiben Dragendorff reagens alkalmazásával sikerült kimutatni az alkaloidok jelenlétére utaló sárgásbarna, kristályos csapadékot (72. ábra). A csapadékkristályok - D. innoxia in vitro növény gyökereihez hasonlóan - minden esetben a sejtfal közelében helyezkedtek el, leggyakrabban a kéregparenchima rhizodermisz és hipodermisz közelében elhelyezkedo sejtjeiben (72. ábra), valamint a háncs- és fanyalábok közelében található parenchima sejtekben. A rhizodermisz alatt tág lúmenu sejtekbol álló hipodermisz található, melyet a kéregparenchima sejtjei követnek (71. ábra). A kéreghatár nem, vagy csak alig kiveheto. A háncs és faelemek jól láthatóak, a hosszmetszeti képen megfigyelheto az edények hálózatos és vermes-gödörkés sejtfalvastagodása is (71. ábra). A sötétben és a fényen nevelt szövetek között a HE festést követoen - nem tudtunk morfológiai különbségeket kimutatni. Érdekes módon az MS alaptáptalajon nevelt szövetekbol készült metszetek sejtjeiben egyáltalán nem, vagy csupán nagyon kis számban tudtuk a sejtmagokat megfigyelni (71. ábra). A HE festést követoen a metszetekben nem sikerült A B 99

116 72. ábra 4 hetes, folyékony MS tápközegen, fényen nevelt D. innoxia hairy root kultúrából (# 41 klón) készült metszet, Dragendorff reagenssel történt hisztokémiai reakciót követoen (A: 1x -os és B: 4x -os nagyítás) A tápközeg összetételének hatása a növekedésre és hatóanyag produkcióra A tápközeg összetétele alapveto hatással van az in vitro kultúrák univerzális és speciális anyagcseréjére. A megfelelo táptalaj kiválasztása mellett további lehetoségeket kínál az összetevok mennyiségének megváltoztatása, melynek segítségével a szövetek növekedése és/vagy hatóanyag termelése optimalizálható. A táptalaj összetételének helyes megválasztása a különbözo hairy root klónok esetében is alapveto fontosságú, mivel az egyes klónok eltéro genetikai felépítése, valamint ennek eredményeként fejlodése és hatóanyag (pl. tropán alkaloid) termelése jelentosen eltérhet egymástól. súlyok fokozatosan csökkentek a 6% szacharóz alkalmazásáig (73/A. ábra). A tenyészetek szárazsúlya fokozatosan nott az általunk alkalmazott MS alaptáptalajnak megfelelo 2%-os szacharóz tartalomig (,2g), ezt követoen azonban, a magasabb szacharóz koncentrációk alkalmazása mellett nem változott jelentosen (73/B. ábra). Szárazsúly (g) Friss súly (g) Tápközeg szacharóz tartalma (%) Szacharóz hatása Részletesebben vizsgáltuk a tápközeg szacharóz koncentrációjának hatását sötétben tenyésztett D. innoxia #41 hairy root klón növekedésére és tropán alkaloid tartalmára. A szacharóz hatásának kiküszöbölése céljából - a kontrollként alkalmazott MS alaptáptalaj mellett negatív kontrollként B A Tápközeg szacharóz tartalma (%) 73. ábra A tápközeg szacharóz koncentrációjának hatása D. innoxia #41 hairy root klón friss súlyára (A) és szárazsúlyára (B) (4 hetet követoen, sötétben nevelve). szacharóz mentes táptalajt is felhasználtunk. A tenyészeteket 4 hetet követoen gyujtöttük be. A várakozásoknak megfeleloen a szacharóz mentes tápközegben nevelt szövetek friss súlya volt a legkisebb (1,26g). 1% szacharóz tartalom (m/v) mellett a szövetek jól fejlodtek (3,g), majd a friss 1

117 Szárazanyag tartalom (%) Tápközeg szacharóz tartalma (%) szkopolamin, valamint 1,76mg/g hioszciamin, 1,61mg/g szkopolamin) 2% és 3% tápközeg szacharóz tartalomnál mértük, a legnagyobb (6%) szacharóz mennyiség azonban már a tropán alkaloid tartalom jelentos csökkenését idézte elo (1,8mg/g hioszciamin, 1,2mg/g szkopolamin), mely alatta maradt a szacharóz mentes tápközegen nevelt szövetekben mért értékeknek is (1,42mg/g hioszciamin, 1,1mg/g szkopolamin) (75/A. ábra). B Növekedési érték A Tápközeg szacharóz tartalma (%) 74. ábra A tápközeg szacharóz koncentrációjának hatása D. innoxia #41 hairy root klón szárazanyag tartalmára (A) és növekedési értékére (B) (4 hetet követoen, sötétben nevelve). A szárazanyag tartalom egyenletes növekedést mutatott a szacharóz koncentráció emelésével párhuzamosan, a szacharóz mentes táptalajon nevelt tenyészetek szárazanyag tartalma (6,98%) viszont csaknem elérte a 2% szacharózt tartalmazó tápközegen tenyésztett szövetek esetében kapott értéket (7,2%) (74/A. ábra). A szacharóz mentes táptalajon fejlodo tenyészetek a várakozásoknak megfeleloen alig növekedtek (74/B. ábra). A legnagyobb növekedési értéket az MS alaptáptalajnak megfelelo szacharóz koncentráció mellett kaptuk (1,67), majd a növekedési értékek ismét csökkentek (74/B. ábra). A legnagyobb hioszciamin és szkopolamin Az alkaloid tartalomhoz hasonlóan a hioszciamin és szkopolamin produkció is 2% és 3% szacharóz alkalmazása mellett érte el a maximális értékeket (,37mg hioszciamin,,31mg szkopolamin/liofilizált kultúra, illetve,34mg hioszciamin,,32mg szkopolamin/liofilizált kultúra), melyek közel kétszeresen múlták felül a 1% és a 6% szacharóz tartalmak esetében számított értékeket (75/B. ábra). B Alkaloid tartalom (mg/g) Alkaloid produkció (mg/kultúra) A Tápközeg szacharóz tartalma (%) Tápközeg szacharóz tartalma (%) szkopolamin hioszciamin apoatropin szkopolamin hioszciamin apoatropin tartalmat (1,83mg/g hioszciamin, 1,52mg/g 11

118 75. ábra A tápközeg szacharóz koncentrációjának hatása D. innoxia #41 hairy root klón alkaloid tartalmára (A) és alkaloid produkciójára (szárazsúlyra vonatkoztatva, 4 hetet követoen, sötétben nevelve) A MgSO 4 hatása A különbözo MgSO 4 koncentrációk hatását sötétben és fényen nevelt D. innoxia #41 hairy root szöveteket esetében egyaránt vizsgáltuk (76. ábra). A Mg 2+ hatásainak kiküszöbölése céljából - a kontrollként alkalmazott MS alaptáptalaj mellett negatív kontrollként MgSO 4 mentes táptalajt is felhasználtunk. Sötétben a 74 mg/l MgSO 4 -ot tartalmazó táptalajon nevelt szövetek friss súlya (3,41g), míg fényen az MS alaptápközegnek megfelelo 37 mg/l MgSO 4 tartalmú tápközegben fejlodo szövetek friss súlya bizonyult a legnagyobbnak (3,7g) (77/A. ábra). A MgSO 4 mentes tápközegen nem, a 185 mg/l MgSO 4 tartalmú táptalajon azonban a friss súly csökkenését lehetett észlelni. Magasabb MgSO 4 koncentrációk alkalmazása nem befolyásolta jelentosen a friss súly gyarapodását (77/A. ábra). A B 76. ábra D. innoxia #41 hairy root klón 4 hét nevelés után, módosított MgSO 4 tartalmú folyékony MS tápközegben sötétben (A) és fényen (B) (balról jobbra: mg/l, 185 mg/l, 37 mg/l, 74 mg/l és 148 mg/l MgSO 4 ). B Friss súly (g) A Szárazanyag tartalom (%) Tápközeg MgSO4 koncentrációja (mg/l) Tápközeg MgSO4 koncentrációja (mg/l) sötét fény sötét fény 77. ábra A tápközeg MgSO 4 koncentrációjának hatása a D. innoxia #41 hairy root klón friss súlyára (A) és szárazanyag tartalmára (B) (4 hetet követoen, sötétben és fényen nevelve). A szövetek szárazanyag tartalma a kevésbé jól növekvo kultúrák esetében, 185 mg/l MgSO 4 koncentrációnál volt a legnagyobb sötétben és fényen egyaránt (18,12%). A mg/l és 185 mg/l MgSO 4 koncentrációk mellett a sötétben és fényen nevelt kultúrák szárazanyag tartalma gyakorlatilag meggyezett (77/B. ábra). Az alaptáptalajon (37 mg/l), illetve magasabb ( mg/l) MgSO 4 koncentrációk alkalmazása mellett a szövetek szárazanyag tartalma kis mértékben csökkent, a fényen nevelt kultúrák esetében pedig - a sötétben nevelt tenyészetekkel összehasonlítva - magasabb szárazanyag tartalom értékeket kaptunk (77/B. ábra). 12

119 A növekedési értékek szempontjából egyértelmuen a 37mg/l MgSO 4 -ot tartalmazó MS alaptáptalaj bizonyult a legkedvezobbnek sötétben és fényen egyaránt (1,77; illetve 1,91). Ennél alacsonyabb és magasabb MgSO 4 koncentrációknál valamivel kisebb értékeket kaptunk (78. ábra). Növekedési érték Tápközeg MgSO4 koncentrációja (mg/l) sötét fény 78. ábra A tápközeg MgSO 4 koncentrációjának hatása a D. innoxia #41 hairy root klón növekedési értékére (C) (4 hetet követoen, sötétben és fényen nevelve). Bár a tápközeg MgSO 4 koncentrációjának változása jelentosen befolyásolta a tropán alkaloid tartalmat a sötétben és fényen nevelt kultúrák esetében is, a szövetek tropán alkaloid tartalma, azonban sötétben és fényen nem tért el jelentosen egymástól (79. ábra). A sötétben nevelt szövetekben, a tápközeg MgSO 4 koncentrációjának emelésével egyenletesen nott a kultúrák alkaloid tartalma az MS alaptápközegnek megfelelo 37mg/l-es MgSO 4 koncentrációig (1,69mg/g hioszciamin és 1,52mg/g szkopolamin), mely optimálisnak bizonyult. Ennél nagyobb MgSO 4 tartalom a hioszciamin és szkopolamin mennyiségének jelentos csökkenését idézte elo (79/A. ábra). A fényen tenyésztett kultúrák esetében nem észleltünk szignifikáns eltérést a MgSO 4 -mentes és a 185mg/l MgSO 4 esetében mért alkaloid tartalmak között (79/B. ábra). 37mg/l MgSO 4 koncentráció már jelentos hioszciamin és szkopolamin tartalom növekedést eredményezett, 74mg/l MgSO 4 alkalmazása azonban tovább növelte az alkaloid tartalmat (1,74mg/g hioszciamin és 1,67mg/g szkopolamin), mely ekkor kissé meghaladta a sötétben, 37mg/l MgSO 4 mellett mért értékeket (79. ábra). Az 148mg/l MgSO 4 koncentráció azonban már a fényen nevelt szövetekben is jelentos alkaloid tartalom csökkenést eredményezett, mely viszont nem volt olyan kifejezett, mint sötétben (79. ábra). Az alkaloid produkció szempontjából sötétben a hioszciamin és szkopolamin tartalommal megegyezoen a 37mg/l MgSO 4 koncentráció volt a legkedvezobb (,54mg hioszciamin,,49mg szkopolamin/liofilizált kultúra), mely csaknem megegyezett a fényen kapott értékekkel (,53mg hioszciamin,,48mg szkopolamin/liofilizált kultúra) (8. ábra). Fényen, 74mg/l MgSO 4 alkalmazását követoen tovább nott az alkaloid produkció értéke (,62mg hioszciamin,,6mg szkopolamin/liofilizált kultúra), mely még 148mg/l MgSO 4 koncentráció mellett is jelentosen felülmúlta a sötétben fejlodött szövetekben kapott értékeket. A fényen nevelt kultúrák apoatropin produkciója a tartalmi adatoknak megfeleloen, a MgSO 4 mentes táptalaj kivételével jelentosen meghaladta a sötétben tenyésztett szövetek esetében kapott értékeket (8. ábra). 13

120 2.5.7 Alkaloid tartalom (mg/g) hioszciamin szkopolamin apoatropin Alkaloid produkció (mg/kultúra) hioszciamin szkopolamin apoatropin Tápközeg MgSO 4 tartalma (mg/l) Tápközeg MgSO4 tartalma (mg/l) Alkaloid tartalom (mg/g) hioszciamin szkopolamin apoatropin Alkaloid produkció (mg/kultúra) hioszciamin szkopolamin apoatropin Tápközeg MgSO4 tartalma (mg/l) B A Tápközeg MgSO4 tartalma (mg/l) 79. ábra Különbözo MgSO 4 koncentrációjú tápközegeken, sötétben (A) és fényen (B) nevelt D. innoxia hairy root szövetek (# 41 klón) alkaloid tartalma (szárazsúlyra vonatkoztatva). B A 8. ábra Különbözo MgSO 4 koncentrációjú tápközegeken, sötétben (A) és fényen (B) nevelt D. innoxia hairy root szövetek (# 41 klón) alkaloid produkciója (szárazsúlyra vonatkoztatva) Abiogén stressz hatása a hairy root szövetek növekedésére és hatóanyag produkciójára A dimedon hatása A kallusz kultúrákhoz hasonlóan vizsgáltuk a tápközegbe adagolt dimedon hatását a D. innoxia # 41 hairy root klón növekedésére és tropán alkaloid termelésére sötétben és fényen történt tenyésztést követoen (81. és 82. ábrák). A szöveteket 4 hetet követoen gyujtöttük be, a kontroll (dimedon mentes) és a tápközegben 14

121 1ppm dimedont tartalmazó kultúrákat pedig a 2. és 6. héten is vizsgáltuk. A 4. hét után begyujtött kultúrák friss súlya a kontroll tenyészetekhez (sötétben: 2,2g; fényen: 2,61g) képest - kis mértékben csökkent az 1ppm 1ppm dimedon kezelés hatására. A tápközegbe adott 1ppm dimedon azonban már nagy mértékben csökkentette a friss súly értékeket (sötétben: 31g; fényen:,48g) (83/A. ábra). A fényen nevelt szövetek esetén nagyobb friss súlyokat mértünk, az eltérés azonban csak 1ppm dimedon alkalmazása mellett bizonyult szignifikánsnak (83/A. ábra). A szövetek szárazanyag tartalma csupán kis mértékben csökkent a tápközeg dimedon tartalmának emelésével. A friss súly alakulásával ellentétben a szárazanyag tartalom 1ppm dimedon alkalmazását kivéve a sötétben tenyésztett szövetekben volt kis mértékben nagyobb, 1ppm dimedon hatására azonban jelentosen, 9,77%-ra nott a sötétben fenntartott kultúrák szárazanyag tartalma (83/B. ábra). B C 81. ábra Sötétben tenyésztett D.innoxia # 41 hairy root klón 2 szövetei (A) és 4 hét (B) nevelés után, (balról jobbra: ppm, 1ppm, 1ppm, 1ppm és 1ppm dimedon a tápközegben), valamint 6 hetet követoen (C) folyékony MS tápközegben (balról jobbra: ppm és 1ppm dimedon a tápközegben). A A B C 82. ábra Fényen tenyésztett D.innoxia #41 hairy root klón szövetei 2 (A) és 4 hét (B) nevelés után, (balról jobbra: ppm, 1ppm, 1ppm, 1ppm és 1ppm dimedon a tápközegben), valamint 6 hetet követoen (C) folyékony MS tápközegben 15

122 (balról jobbra: ppm és 1ppm dimedon a tápközegben). B Friss súly (g) A Szárazanyag tartalom (%) Tápközeg dimedon tartalma (ppm) Tápközeg dimedon tartalma (ppm) sötétben fényen sötétben fényen 83. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek friss súlya (A) és szárazanyag tartalma (B) különbözo dimedon tartalmú folyékony MS tápközegen, 4 hetet követoen. Dimedon hatására jelentosen csökkent a kultúrák növekedési értéke sötétben és fényen egyaránt, 1ppm dimedon pedig teljesen gátolta a szövetek növekedését (84/A. ábra). A folyékony MS tápközegek ph értékét 4 hetet követoen minden vizsgált dimedon koncentráció esetében meghatároztuk. Eredményeink azt mutatják, hogy a fényen nevelt szövetek táptalajainak ph-ja minden esetben meghaladja a sötétben tenyésztett szövetek megfelelo értékeit (84/B. ábra). Sötétben és fényen is alacsonyabb ph-kat mértünk a tápközeg dimedon tartalmának növekedésével párhuzamosan. Sötétben csupán 1ppm (ph 4,32), fényen pedig 1ppm dimedon koncentráció mellett mértünk kissé magasabb ph értékeket (ph 4,58), melyek azonban alatta maradtak a kontroll szövetek esetében kapott értékeknek (sötétben: ph 4,4; fényen: ph 4,77) (84/B. ábra). A B Növekedési érték Tápközeg ph Tápközeg dimedon tartalma (ppm) Tápközeg dimedon tartalma (ppm) sötétben fényen sötét fény 84. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek növekedési értéke (A) és tápközeg ph értékei (B) különbözo dimedon tartalmú folyékony MS tápközegen, 4 hetet követoen A 4 hetes szövetek tropán alkaloid tartalma sötétben meghaladta a fényen mért értékeket (85. ábra). A sötétben fejlodött kultúrák szkopolamin tartalma minden alkalmazott dimedon koncentrációnál meghaladta a szövetek hioszciamin tartalmát. 1ppm és 1ppm dimedon hatására jelentos szkopolamin tartalom növekedés következett be (1,51mg/g és 1,65mg/g liofilizált szövet) (85/A. és 86/A. ábrák), míg a hioszciamin esetében csupán 1ppm tápközeg dimedon tartalom hatására mértünk a kontroll szövetekhez (,93mg/g) viszonyítva kissé nagyobb 16

123 alkaloidtartalmat (1,1mg/g) (85/A. ábra). Mind a hioszciamin, mind pedig az apoatropin tartalom sötétben (A) és fényen nevelve (B), 4 hetet követoen. csökkent a tápközeg dimedon tartalmának növekedésével. 1ppm dimedon hatására azonban már jelentosen csökkent a szövetekben mindhárom vizsgált tropán alkaloid mennyisége (85/A. és 86/B ábrák). A fényen nevelt szövetekben 1ppm dimedon alkalmazása mellett nott meg valamelyest a szövetek szkopolamin tartalma (,46mg/g), 1ppm hatására pedig a hioszciamin tartalom (,75mg/g). Ezek az értékek azonban egyik esetben sem haladták meg a kontroll tenyészetekben mért értékeket (,78mg/g hioszciamin és,46mg/g szkopolamin), 1ppm dimedon alkalmazása pedig fényen is jelentos tropán alkaloid tartalom csökkenést eredményezett (85/B. ábra). Alkaloid tartalom (mg/g) Tápközeg dimedon tartalma (ppm) hioszciamin szkopolamin apoatropin B A 86. ábra A tropán alkaloid tartalom meghatározásához, D. innoxia #41 hairy root klón felhasználásával készült kivonatok HPLC kromatogramja (4 héten át sötétbe n tenyésztve, A: 1ppm dimedon és B: 1ppm dimedon a tápközegben). A szövetek alkaloid produkciója sötétben és fényen egyaránt csökkent a tápközegbe adagolt dimedon hatására, 1ppm alkalmazását követoen pedig a tenyészetek már nem állítottak elo tropán alkaloidokat számottevo mennyiségben. B A Alkaloid tartalom (mg/g) Tápközeg dimedon tartalma (ppm) hioszciamin szkopolamin apoatropin 85. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek tropán alkaloid tartalma különbözo dimedon tartalmú folyékony MS tápközegen Megfigyeltük, hogy a dimdon kezelés hatására az alkaloid tartalom alakulásának megfeleloen a sötétben nevelt szövetek szkopolamin produkciója meghaladta a megfelelo hioszciamin produkciós értékeket. A fényen nevelt szövetek alkaloid produkciója ugyanakkor 1ppm és 1ppm dimedon alkalmazása mellett felülmúlta a sötétben kapott értékeket (87. ábra). 17

124 Alkaloid produkció (mg/kultúra) Tápközeg dimedon tartalma (ppm) hioszciamin szkopolamin apoatropin HCHO tartalom (ug/g liofilizált szövet) Tápközeg dimedon tartalma (ppm).25 B Alkaloid produkció (mg/kultúra) A Tápközeg dimedon tartalma (ppm) hioszciamin szkopolamin apoatropin 87. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek alkaloid produkciója különbözo dimedon tartalmú folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B), 4 hetet követoen. A szövetek tropán alkaloid tartalmának meghatározását követoen, a fényen nevelt kultúrákból az 1ppm dimedon kezelés kivételével - rendelkezésre álló minták feldolgozásával, OPLC technika segítségével meghatároztuk a szövetek endogén HCHO tartalmát (88. ábra). A formaldimedon adduktum formájában meghatározott HCHO tartalom a kontrollhoz (345,µg/g liofilizált szövet) viszonyítva kissé megnott 1ppm dimedon hatására (38,8µg/g), majd szignifikáns mértékben csökkent a 1ppm dimedon tartalmú táptalajon (274,2µg/g). 88. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek endogén HCHO tartalma különbözo dimedon tartalmú folyékony MS tápközegen, fényen nevelve, 4 hetet követoen. 1ppm dimedon hatására kis mértékben ismét nott a mérheto endogén HCHO tartalom (38,8µg/g), azonban ez nem érte el a kontroll szövetekben mért értéket (88. ábra). A 4 hetes kultúrák mellett amikor is minden alkalmazott dimedon koncentráció mellett fejlodo szövetet részletesen vizsgáltunk tanulmányoztuk a 2 és 6 hetes szövetek fejlodését és tropán alkaloid tartalmát is, melyek dimedon mentes és 1ppm dimedont tartalmazó táptalajon fejlodtek. A friss súlyok, melyek értékei növekedtek a 6 hét alatt, az elso 2 hetet követoen csaknem megegyeztek a dimedon mentes és a 1ppm dimedont tartalmazó táptalajok esetében. Ezzel szemben a 1ppm dimedonnal kezelt szövetek friss súlya 4. és 6. hétre már a kontroll értékek alatt maradt (89. ábra). Fényen minden esetben kissé magasabb friss súlyt mértünk, azonban az értékek csupán a 2 hetes kontroll és a 6 hetes 1ppm dimedont tartalmazó táptalajon nevelt szövetek esetében tértek el szignifikánsan egymástól (89. ábra). 18

125 B Friss súly (g) Friss súly (g) A Tenyésztési ido (hét) Tenyésztési ido (hét) sötét fény sötétben fényen 89. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek friss súlya 2, 4 és 6 hetet követoen dimedon mentes (A) és 1ppm dimedont tartalmazó (B) folyékony MS tápközegen. Szárazsúly (g) sötét fény B A 9. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek szárazsúlya 2, 4 és 6 hetet követoen dimedon mentes (A) és 1ppm dimedont tartalmazó (B) folyékony MS tápközegen. A sötétben és fényen fejlodo szövetek szárazsúlya a 4. hétig nott dimedon mentes táptalajon, míg dimedon hatására sötétben fokozatosan csökkentek az értékek a 2. és 6. hét között. A fényen nevelt szövetek szárazsúlya 1ppm dimedon hatására a 6. héten jelentosen megnott (,17g) (9/B. ábra). A fényen fejlodo szövetek szárazanyag tartalma az esetek többségében szignifikáns mértékben meghaladta a sötétben tenyésztett szövetek megfelelo értékeit (91. ábra). A kontroll szövetek esetében legnagyobb szárazanyag tartalmat 4 hetet követoen kaptuk (8,21% sötétben és 7,86% fényen) (91/A. ábra), míg 1ppm dimedon alkalmazása mellett a 6. hétre nottek meg az értékek (8,91% sötétben és 7,13% fényen) (91/B. ábra). A friss és szárazsúlyokkal szemben a szövetek szárazanyag tartalma sötétben volt kis mértékben nagyobb (91. ábra). Tenyésztési ido (hét) Szárazsúly (g) sötét fény Tenyésztési ido (hét) 19

126 Szárazanyag tartalom (%) Tenyésztési ido (hét) sötét fény Növekedési érték sötét fény Tenyésztési ido (hét) B A Szárazanyag tartalom (%) Tenyésztési ido (hét) sötét fény 91. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek szárazanyag tartalma 2, 4 és 6 hetet követoen dimedon mentes (A) és 1ppm dimedont tartalmazó (B) folyékony MS tápközegen. A sötétben nevelt kontroll tenyészetek növekedési értéke (2,86) a 4. hétre, míg a fényen nevelt kultúrák esetében a 6. hétre érte el a legnagyobb értéket (5,27). A 1ppm dimedon kezelés hatására jelentosen csökkent a szövetek növekedése a vizsgált 6 hetes idoszakban. A legnagyobb növekedési értékek sötétben (2 hét után,47) és fényen (6 hetet követoen 1,65) csupán megközelítették a kontroll tenyészeteknél 2 hét elteltével meghatározott értékeket (sötétben,85; fényen 2,8) (92. ábra). B Növekedési érték A Tenyésztési ido (hét) sötét 92. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek növekedési értékei 2, 4 és 6 hetet követoen dimedon mentes (A) és 1ppm dimedont tartalmazó (B) folyékony MS tápközegen. fény 11

127 ,74mg/g hioszciamin,,86mg/g szkopolamin) Tápközeg ph sötét fény (94. ábra). A szövetek hioszciamin és szkopolamin tartalma fényen nem érte el a sötétben nevelt szövetekben mért értékeket, csupán az apoatropin tartalom haladta meg kis mértékben a és 6. héten, sötétben kapott adatokat (94. ábra). Tenyésztési ido (hét) Tápközeg ph sötét fény Alkaloid tartalom (mg/g) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin Tenyésztési ido (hét) B A 93. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek tápközeg ph értékei 2, 4 és 6 hetet követoen dimedon mentes (A) és 1ppm dimedont tartalmazó (B) folyékony MS tápközegen. A tápközegek ph értékei csupán a kontroll szövetek esetében emelkedtek meg a 6. hétre (ph 5,14 sötétben, illetve ph 5,42 fényen), a 1ppm dimedont tartalmazó tápközegek ph értéke ugyanakkor nem változott jelento mértékben (ph 4,27 4,39 sötétben, illetve ph 4,21 4,66 fényen) (93. ábra). A sötétben és fényen tenyésztett, kontroll szövetek tropán alkaloid tartalma nem növekedett számottevoen az átoltást követo 6. hétig. A tenyésztési ido végén mért értékek (sötétben: 1,mg/g hioszciamin, 1,12mg/g szkopolamin; fényen:,99mg/g hioszciamin,,89mg/g szkopolamin) nem, vagy csupán alig haladták meg a 2. héten mért értékeket (sötétben: 1,23mg/g hioszciamin,,97mg/g szkopolamin; fényen: B Alkaloid tartalom (mg/g) A Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin 94. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek tropán alkaloid tartalma 2, 4 és 6 hetet követoen folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B). 111

128 B Alkaloid produkció (mg/kultúra) Alkaloid produkció (mg/kultúra) A Tenyésztési ido (hét) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin hioszciamin szkopolamin apoatropin 95. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek alkaloid produkciója 2, 4 és 6 hetet követoen folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B). Az alkaloid produkció értékei mind sötétben, mind pedig fényen nottek a 6 hetes tenyésztési periódusban (95. ábra) Sötétben és fényen közel azonos eredményeket kaptunk, csupán a 6 hetes, fényen nevelt kultúrák alkaloid produkciós értékei (,24mg hioszciamin,,22mg szkopolamin és,6mg apoatropin/liofilizált kultúra) haladták meg a sötétben nevelt szövetek megfelelo adatait (95. ábra). A 1ppm dimedont tartalmazó táptalajon nevelt szövetek hioszciamin és szkopolamin tartalma a 6. hétre meghaladta a kontroll szövetekben mért értékeket sötétben és fényen egyaránt, csupán a sötétben nevelt szövetek esetében mértünk a kontroll értéknél kisebb hioszciamin tartalmat. Meg kell jegyezni ugyanakkor, hogy a 4. héten a kontroll szövetekhez hasonlóan alkaloid tartalom csökkenést észleltünk (96. ábra). B Alkaloid tartalom (mg/g) Alkaloid tartalom (mg/g) A Tenyésztési ido (hét) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin hioszciamin szkopolamin apoatropin 96. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek tropán alkaloid tartalma 2, 4 és 6 hetet követoen 1ppm dimedon tartalmú folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B). 112

129 B Alkaloid produkció (mg/kultúra) Alkaloid produkció (mg/kultúra) A Tenyésztési ido (hét) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin hioszciamin szkopolamin apoatropin 97. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek alkaloid produkciója 2, 4 és 6 hetet követoen 1ppm dimedon tartalmú folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B). A táptalajban lévo 1ppm dimedon már 2 hét elteltével kisebb alkaloid produkció csökkenést eredményezett a kontroll szövetekhez viszonyítva (97. ábra). Az értékek a 4. hétre érték el a minimumot, ezt követoen ismét nottek, és a 6 hetes, fényen nevelt szövetek esetében meg is közelítették a kontroll szövetekben kapott értékeket (,2mg hioszciamin,,21mg szkopolamin és,6mg apoatropin/liofilizált kultúra) (97. ábra). Összefoglalva a D. innoxia #41 hairy root klón növekedésének és tropán alkaloid termelésének vizsgálata során kapott eredményeinket elmondhatjuk, hogy a tápközegbe adagolt dimedon gátolta a szövetek fejlodését, mivel hatására egyaránt csökkentek a mért friss- és szárazsúlyok, valamint a számított szárazanyag tartalom értékek, különösen 1ppm alkalmazását követoen (83. és ábrák). A növekedési értékek csökkenése szignifikáns mértéku volt valamennyi alkalmazott dimedon koncentráció mellett sötétben és fényen egyaránt (84/A. ábra). A sötétben nevelt szövetek hioszciamin és szkopolamin tartalma felülmúlta a fényen nevelt kultúrákban mért értékeket (85. és 93. ábrák). A 4 hetes, sötétben nevelt szövetekben 1ppm és 1ppm dimedon hatására a szkopolamin tartalom szignifikáns növekedését észleltük. Az 1ppm dimedon adagolását követoen pedig, a szövetek fejlodéséhez hasonlóan szignifikáns mértékben csökkent a kultúrák alkaloid tartalma és a számított alkaloid produkció értéke mindhárom vizsgált tropán alkaloid esetében (85. ábra) A szemikarbazid hatása A dimedon mellet tanulmányoztuk a tápközegbe adagolt szemikarbazid hatását, sötétben és fényen tenyésztett D. innoxia # 41 hairy root klón növekedésére és tropán alkaloid termelésére (98. és 99. ábrák). A HCHO-el reverzibilis reakcióba lépo szemikarbazid in vivo sejtekre, szövetekre gyakorolt hatásának tanulmányozása céljából a vegyületet növekvo koncentrációban alkalmaztuk D. innoxia kalluszszövetek tápközegében. Hasonlóan a dimedon kezeléshez a szöveteket ebben az esetben is 4 hetet követoen gyujtöttük be. A kontroll (szemikarbazid mentes) és a tápközegben 1ppm szemikarbazidot tartalmazó kultúrákat a 2. és 6. héten is vizsgáltuk. A tápközeg növekvo szemikarbazid tartalma jellegzetes hatással volt a 4 hét után begyujtött 113

130 szövetek fejlodésére. A friss súly a kontroll szövetekkel összehasonlítva - 1ppm szemikarbazid hatására szignifikáns mértékben megnott (3,91g sötétben és 4,4g fényen), majd fokozatosan csökkent egészen 1ppm tápközeg szemikarbazid tartalomig. A sötétben és fényen nevelt szövetek friss súlya között nem észleltünk jelentos eltérést (1/A. ábra). A B C 99. ábra Fényen tenyésztett D.innoxia #41 hairy root klón 2 szövetei (A) és 4 hét (B) nevelés után, (balról jobbra: ppm, 1ppm, 1ppm, 1ppm és 1ppm szemikarbazid a tápközegben), valamint 6 hetet követoen (C) folyékony MS tápközegben (balról jobbra: ppm és 1ppm szemikarbazid a tápközegben). 6 Friss súly (g) sötétben fényen B C Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm) 98. ábra Sötétben tenyésztett D.innoxia # 41 hairy root klón 2 szövetei (A) és 4 hét (B) nevelés után, (balról jobbra: ppm, 1ppm, 1ppm, 1ppm és 1ppm szemikarbazid a tápközegben), valamint 6 hetet követoen (C) folyékony MS tápközegben (balról jobbra: ppm és 1ppm szemikarbazid a tápközegben). Szárazanyag tartalom (%) sötétben fényen Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm) A B A 1. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek friss súlya (A) és szárazanyag tartalma 114

131 (B) különbözo szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen, 4 hetet követoen. A szövetek szárazanyag tartalma 1ppm szemikarbazid alkalmazásának hatására csökkent, majd 1ppm és 1ppm mellett (sötétben 1,7-12,8%, fényen 9,48-1,15%) - a kontroll értékeket (7,92-8,26%) is meghaladva megnott. 1ppm szemikarbazid hatására ismét a kontroll értékek alá, az 1ppm-es kezeléshez hasonló értékekre csökkent a szövetek szárazanyag tartalma (1/B. ábra). A szövetek növekedési értéke 1ppm szemikarbazid hatására jelentosen megnott (sötétben 5,18; fényen 6,56), majd a tápközeg szemikarbazid tartalmának növekedésével párhuzamosan nagy mértékben csökkent, a 1ppm és 1ppm szemikarbazidot tartalmazó táptalajon fejlodött kultúrák növekedése gyakorlatilag meg is állt (11/A. ábra). Növekedési érték Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm) sötétben fényen 11. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek növekedési értéke (A) és tápközeg ph értékei (B) különbözo szemikarbazid mentes folyékony MS tápközegen, 4 hetet követoen. A 4 hetes kultúrák tápközegének ph értékei 1ppm, illetve 1ppm szemikarbazid tartalom mellett meghaladták a kontroll táptalajokban mért értékeket. A 1ppm és 1ppm szemikarbazidot tartalmazó MS folyékony táptalajok ph-ja ezzel szemben nem érte el a kontroll táptalajokét (11/B. ábra). A fényen nevelt tenyészetek esetében mind a kontroll szöveteknél, mind pedig a szemikarbazid kezelések mellett magasabb tápközeg ph értékeket mértünk (11/B. ábra). A szemikarbazid mentes táptalajon, sötétben fejlodo szövetek hioszciamin és szkopolamin tartalma (,93mg/g, illetve,59mg/g) meghaladta a fényen nevelt kultúrákban mért értékeket (,78mg/g hioszciamin és,46mg/g szkopolamin), szemikarbazid hatására azonban a 1ppm alkalmazásának kivételé vel fényen mértünk magasabb tropán alakloid tartalmat (12. ábra). Bár 1ppm szemikarbazid tartalmú tápközegen, sötétben magasabb hioszciamin és szkopolamin tartalmat mértünk (,68mg/g, valamint,36mg/g), ezek az értékek azonban nem érték el a kontroll szövetek alkaloid tartalmát (12/A. és 13/A ábrák). A dimedon alkalmazásához 4.9 Tápközeg ph sötét fény Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm) B A 115

132 B Alkaloid tartalom (mg/g) Alkaloid tartalom (mg/g) A Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm) Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm) hioszciamin szkopolamin apoatropin hioszciamin szkopolamin apoatropin 12. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek tropán alkaloid tartalma különbözo szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B), 4 hetet követoen. 13. ábra A tropán alkaloid tartalom meghatározásához, D. innoxia #41 hairy root klón felhasználásával készült kivonatok HPLC kromatogramja (4. héten át sötétben tenyésztve, A: 1ppm szemikarbazid és B: 1ppm szemikarbazid a tápközegben). B Alkaloid produkció (mg/kultúra) A Alkaloid produkció (mg/kultúra) Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm) Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm) hioszciamin szkopolamin apoatropin hioszciamin szkopolamin apoatropin 14. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek alkaloid produkciója különbözo szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B), 4 hetet követoen. B A hasonlóan, 1ppm szemikarbazid tartalom mellett a szövetekben csupán nagyon kis mennyiségben mértünk tropán alkaloidokat (12. és 13/B. ábrák). A kultúrák tropán alkaloid produkciója egyenletesen csökkent a táptalaj szemikarbazid tartalmának emelésével sötétben és fényen egyaránt. A fényen nevelt szövetek alkaloid produkciója minden vizsgált szövetben alatta maradt a sötétben kapott értékeknek (14. ábra). 116

133 A fényen nevelt kultúrákból az 1ppm szemikarbazid kezelés kivételével - rendelkezésre álló minták feldolgozásával, hasonlóan a dimedon kezeléshez, OPLC technika segítségével meghatároztuk a szövetek endogén HCHO tartalmát (15. ábra). A kapott eredmények alapján elmondható, hogy a szemikarbazid tartalmú táptalajokon nevelt D. innoxia hairy root szövetek HCHO tartalma, ha kis mértékben is, de fokozatosan csökkent a kontroll (345µg/g liofilizált szövet) tenyészetekhez képest egészen a 1ppm szemikarbaziddal történt kezelésig. Az utóbbi esetben mért HCHO tartalom (286,4µg/g) ugyanakkor már szignifikáns mértékben kisebbnek bizonyult a kontroll értékénél (15. ábra). kontrollnál (sötétben 3,16g; fényen 3,57g) magasabb friss súlyokat mértünk sötétben (3,58g) és fényen (4,42g) egyaránt (89/A. és 16/A. ábrák). Fényen a legtöbb esetben kissé magasabb friss súlyt mértünk, mint sötétben, azonban a 2 hetes kontroll szövetek mellett hasonlóan a dimedon kezeléshez - csupán a 6 hetes 1ppm szemikarbazidot tartalmazó táptalajon nevelt szövetek esetében tértek el szignifikánsan egymástól (89/A. és 16/A. ábrák). Friss súly (g) sötétben 3 fényen 2 1 HCHO tartalom (ug/g liofilizált szövet) Tápközeg szemikarbazid tartalma (ppm) Szárazsúly (g) Tenyésztési ido (hét) sötét fény 15. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek endogén HCHO tartalma különbözo szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen, fényen nevelve, 4 hetet követoen. A 4 hetes kultúrák mellett a dimedon alkalmazásához hasonlóan részletesebben tanulmányoztuk a 2 és 6 hetes szöveteket is, meyek szemikarbazid mentes és 1ppm szemikarbazidot tartalmazó táptalajon fejlodtek. A friss súlyok - melyek értékei növekedtek a 6 hét alatt - 1ppm szemikarbazid alkalmazása mellett nem érték el jelentosen a kontroll szövetek esetében mért értékektol, a 6. héten azonban már a B A Tenyésztési ido (hét) 16. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek friss súlya (A) és szárazsúlya (B) 2, 4 és 6 hetet követoen 1ppm szemikarbazidot tartalmazó folyékony MS tápközegen. A sötétben és fényen fejlodo szövetek szárazsúlya a 4. hétig nott szemikarbazid mentes tápközegen (sötétben,18g; fényen,24g), 1ppm szemikarbazidot tartalmazó táptalajokon azonban még a 6. héten is jelentos szárazsúly gyarapodást észleltünk (sötétben,24g; fényen,31g) (9/A. és 117

134 17/B. ábrák). A kultúrák szárazanyag tartalma 1ppm szemikarbazid hatására elérte és meghaladta a kontroll szövetek esetében kapott értékeket, azonban utóbbiakhoz hasonlóan értéke a 4. hétre kis mértékben megnott, majd a 6. hétre lecsökkent sötétben és fényen egyaránt (91/A. és 17/A. ábrák). A 1ppm szemikarbaziddal kezelt szövetek növekedési értékei 2 hét elteltével (sötétben,2; fényen,26) még nem érték el a kontroll tenyészeteknél kapott értékeket (sötétben,85; fényen 2,8), a 4. és 6. hétre azonban (4 hét után sötétben és fényen 2,68 és 1,78; 6 hét után 3,2 és 5,34) elérték és meghaladták a kontroll szövetek növekedését (4 hét után sötétben és fényen 2,86 és 1,6; 6 hét után 2,81 és 5,27) (92/A. és 17/B. ábrák) B Szárazanyag tartalom (%) Növekedési érték A Tenyésztési ido (hét) Tenyésztési ido (hét) sötét fény sötét 17. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek szárazanyag tartalma (A) és növekedési értékei (B) 2, 4 és 6 hetet követoen 1ppm szemikarbazidot tartalmazó folyékony MS tápközegen. fény Tápközeg ph Tenyésztési ido (hét) sötét fény 18. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek tápközeg ph értékei 2, 4 és 6 hetet követoen 1ppm szemikarbazidot tartalmazó folyékony MS tápközegen. A tápközegek ph értéke a kontroll szöveteknél mért értékekhez hasonlóan fokozatosan nott a 2. és a 6. hét között 1ppm szemikarbazid alkalmazása mellett, a kapott értékek pedig a 6. hétre (sötétben ph 5,75; fényen ph 5,8) kissé meghaladták a szemikarbazid mentes táptalajban mért ph-kat (sötétben ph 5,12; fényen ph 5,42) (93/A. és 18. ábrák). A 1ppm szemikarbazidot tartalmazó MS tápközegen, fényen nevelt szövetek hioszciamin, szkopolamin és apoatropin tartalma (,63mg/g,,92mg/g, valamint,12mg/g) az átoltást követo 2. hétre fényen jelentosen meghaladta a sötétben fejlodo szövetekben mért értékeket (,41mg/g,,3mg/g, valamint,4mg/g), a 6. hétre azonban a sötétben nevelt kultúrák hioszciamin és szkopolammin tartalma volt magasabb (,92mg/g,,59mg/g, valamint,14mg/g) (19. ábra). Adataink alapján a 1ppm szemikarbazidot tartalmazó táptalajon, fényen, 2 hét elteltével a szkopolamin tartalom felülmúlta a szövetek hioszciamin tartalmát, más esetekben azonban a hioszciamin volt a foalkaloid (19. ábra). A 1ppm szemikarbaziddal kezelt szövetek alkaloid tartalma ugyanakkor nem érte el a 2-6 hetes 118

135 kontroll szövetekben mért értékeket (93. és 19. ábrák). A táptalajban lévo 1ppm szemikarbazid hatására a 6. hét végéig fokozatosan nott a szövetek tropán alkaloid produkciója. A dimedon alkalmazásával ellentétben, szemikarbazid hatására nem tért el Alkaloid produkció (mg/kultúra) hioszciamin szkopolamin apoatropin jelentosen a tenyészetek tropán alkaloid produkciója sötétben és fényen (11. ábra). A 6. hétre ugyanakkor mind a sötétben (,23mg Tenyésztési ido (hét) hioszciamin,,15mg szkopolamin és,3mg.3 apoatropin/liofilizált kultúra), mid pedig a fényen nevelt kultúrák (,23mg hioszciamin,,21mg Alkaloid produkció (mg/kultúra) hioszciamin szkopolamin apoatropin Alkaloid tartalom (mg/g) Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin B A Tenyésztési ido (hét) 11. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek alkaloid produkciója 2, 4 és 6 hetet követoen 1ppm szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B). B Alkaloid tartalom (mg/g) A Tenyésztési ido (hét) hioszciamin szkopolamin apoatropin 19. ábra D.innoxia # 41 hairy root klón szöveteinek alkaloid tartalma 2, 4 és 6 hetet követoen 1ppm szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen sötétben (A) és fényen nevelve (B). szkopolamin és,6mg apoatropin/liofilizált kultúra) alkaloid produkciója a sötétben nevelt szövetek szkopolamin produkciójának kivételével elérte, vagy meghaladta a megfelelo korú, kontroll szövetekben kapott értékeket (sötétben,21mg hioszciamin,,2mg szkopolamin és,3mg apoatropin/liofilizált kultúra, fényen,24mg hioszciamin,,22mg szkopolamin és,6mg apoatropin/liofilizált kultúra) (94. és 11. ábrák). Összefoglalva a szemikarbazid D. innoxia #41 hairy root klón növekedésére gyakorolt hatását elmondhatjuk, hogy a vegyület a dimedonnal 119

136 ellentétben bizonyos koncentrációkban határozottan serkenti a szövetek fejlodését. Az 1ppm szemikarbazid hatására szignifikáns mértékben nott a tenyészetek friss súlya és a számított növekedési érték (utóbbi csupán sötétben), 1ppm és 1ppm szemikarbazid azonban egyértelmuen gátolta a szövetek fejlodését (1/A. és 11/A. ábrák). Az alkaloid tartalom (sötétben 1ppm és 1ppm kivételével) és alkaloid produkció alakulására nem volt pozitív hatással a szemikarbazid alkalmazása, mivel az értékek fokozatosan csökkentek az 1ppm táptalaj szemikarbazid tartalomig ( ábrák) A dimedonnal és szemikarbaziddal kezelt hairy root kultúrák szövettani vizsgálata - A szövetek HE festése A dimedont és a szemikarbazidot tartalmazó táptalajokon nevelt D. innoxia #41 hairy root klón szöveteinek vizsgálata során, a HE festést követoen a kontroll szövetekkel elle ntétben nagy számban sikerült megfigyelni a sejtmagokat, melyek azonban nem mutatták az apoptotikus folyamatokra jellemzo morfológiai változásokat (pl. a sejtmag zsugorodása) (111. és 112. ábrák). A B 111. ábra 4 hetes, dimedon tartalmú folyékony MS tápközegen, fényen nevelt D. innoxia hairy root kultúrákból (# 41 klón) készült metszetek, HE festést követoen (A: 1ppm dimedon a tápközegben, 4x os nagyítás; B: 1ppm dimedon a tápközegben, 4x os nagyítás. a: rhizodermisz, b: gyökérszorök, c: hipodermisz, d: kéregparenchima, g:edények hálózatos és vermesgödörkés sejtfalvastagodással). 12

137 szemikarbazid mentes folyékony MS alaptápközegen nevelt hairy root-ok felépítésétol sem a sötétben, sem pedig a fényen történt tenyésztés után (111. és 112. ábrák). - HISZTOKÉMIAI VIZSGÁLATOK DRAGENDORFF REAGENS ALKALMAZÁSÁVAL A dimedon, vagy szemikarbazid tartalmú tápközegen (sötétben és fényen) nevelt hairy root szövetek között hasonlóan a szövettani felépítéshez az alkaloidok lokalizációja tekintetében sem észleltünk különbségeket (113. ábra). Az 1ppm szemikarbazid és 1ppm dimedon kezelések kivételével a vizsgált szövetek mindegyikében sikerült alkaloidokat kimutatni, a A B C 112. ábra 4 hetes, szemikarbazid tartalmú folyékony MS tápközegen nevelt D. innoxia hairy root kultúrákból (# 41 klón) készült metszetek, HE festést követoen (A: 1ppm szemikarbazid a tápközegben, fényen, 2x os nagyítás; B: 1ppm szemikarbazid a tápközegben, fényen, 2x os nagyítás; C:1ppm szemikarbazid a tápközegben, sötétben, 1x os nagyítás. a: rhizodermisz, b: gyökérszorök, c: hipodermisz, d: kéregparenchima, e: fanyalábok, f: háncsnyalábok, g: edények hálózatos és vermes-gödörkés sejtfalvastagodással). A szövetek morfológiailag a sejtmagok jelenlétét kivéve - nem különböztek a dimedon és A B 113. ábra 4 hetes, folyékony MS tápközegen nevelt D. innoxia hairy root kult úrákból (# 41 klón) készült metszetek, Dragendorff reagenssel történt hisztokémiai reakciót követoen (1x os nagyítás, A: 1ppm dimedon a tápközegben, 121

138 fényen és B: 1ppm szemikarbazid a tápközegben, sötétben). csapadékkristályok elhelyezkedése pedig megegyezett az in vitro gyökereknél és kezeletlen hairy root-oknál megfigyeltekkel, tehát a sejtfal közelében, leggyakrabban a kéregparenchima rhizodermisz és hipodermisz közelében elhelyezkedo sejtjeiben, valamint a háncs- és fanyalábok közelében található parenchima sejtekben helyezkedtek el (113. ábra). - TUNEL rekació alkalmazása az apoptotikus sejtmagok kimutatására Annak igazolására, hogy a HE festést követoen megfigyelheto jellegzetes morfológiai változások (pl. sejtmeg zsugorodása) hiánya az apototikus folyamatok elmaradását jelzi, a kontroll kultúrák mellett a dimedonnal, vagy szemikarbaziddal kezelt szövetek esetében is elvégeztük a TUNEL reakciót. Ennek eredménye alátámasztotta, hogy a kezelt (dimedon, vagy szemikarbazid) szövetekben nem lehet apoptotikus sejtmagokat kimutatni (114. ábra). A B C 114. ábra 4 hetes, folyékony MS tápközegen nevelt D. innoxia hairy root kultúrákból (# 41 klón) készült metszetek, TUNEL reakciót követoen (A: 1ppm dimedon a tápközegben, sötétben, 2x os nagyítás; B: 1ppm dimedon a tápközegben, sötétben, 2x os nagyítás; C:1ppm szemikarbazid a tápközegben, fényen, 2x os nagyítás. a: rhizodermisz, c: hipodermisz, d: kéregparenchima, e: fanyalábok, f: háncsnyalábok, g: edények hálózatos és vermesgödörkés sejtfalvastagodással) Terápiában alkalmazott vegyületek hatása D. innoxia hairy root szövetek fejlodésére és alkaloid termelésére Tanulmányoztuk néhány, terápiában alkalmazott vegyület hatását D. innoxia #41 hairy root klón 122

139 növekedésére és tropán alkaloid termelésére. Kísérleteinkhez az aminoguanidint melyet a cukorbetegség terápiájában alkalmaznak -, illetve a vérnyomáscsökkento hatású hidralazint (1- hidrazino-ftalazin) választottuk. - Az aminoguanidin hatása A kultúrák folyékony MS alaptápközegéhez a Szárazanyag tartalom (%) Tápközeg aminoguanidin tartalma (ppm) dimedon és szemikarbazid kezeléshez hasonlóan 1ppm, 1ppm, 1ppm és 1ppm aminouanidint adagoltunk, majd a sötétben tenyésztett szövetek növekedési jellemzoit és tropán alkaloid termelését 4 hét elteltével vizsgáltuk. A szövetek szárazanyag tartalma csak kis mértékben változott az emelkedo aminoguanidin tartalommal összefüggésben (115/A. ábra). A kontroll tenyészetekhez viszonyítva 1ppm és 1ppm aminoguanidin hatására nem változott szignifikáns mértékben a százalékos szárazanyag tartalom (8,88% és 9,92%), 1ppm alkalmazását követoen azonban jelentosebben, 11,81%-ra nott, 1ppm aminoguanidin hatására pedig nagyobb mértékben, 7,88%-ra csökkent (115/A. ábra). B Növekedési érték A Tápközeg aminoguanidin tartalma (ppm) 115. ábra A tápközeg aminoguanidin tartalmának hatása D. innoxia #41 hairy root klón szárazanyag tartalmára (A) és növekedési értékére (B) (4 hetet követoen, sötétben tenyésztve). A szövetek növekedési értékei ezzel szemben jellegzetes eltérést mutattak. A kontroll tenyészetekhez (4,26) viszonyítva 1ppm és 1ppm aminoguanidin alkalmazását követoen (7,24 és 6,25) jelentosen megnottek a hairy root kultúrák növekedési értékei, majd 1ppm és 1ppm hatására hirtelen lecsökkentek (3,58 és,6) (115/B. ábra). A 1ppm aminoguanidin adagolását követoen a szövetek növekedési értéke még megközelítette a kontroll tenyészeteknél kapott értéket, 1ppm hatására azonban csaknem teljesen megszunt a kultúrák növekedése (115/B. ábra). A szövetek tropán alkaloid tartalmának HPLC vizsgálata azt mutatta, hogy a hioszciamin, szkopolamin és apoatropin tartalom a 1ppm és 123

140 1ppm aminoguanidint tartalmazó táptalajokon jelentosen meghaladja az egyéb szövetekben mért 2.5 értékeket (116. és 117/A. ábrák). Az 1ppm aminoguanidin alkalmazását követoen a tenyészetek növekedési értékei jelentosen felülmúlták a kontroll kultúráknál kapott értékeket Alkaloid tartalom (mg/g) hioszciamin szkopolamin apoatropin (115/A. ábra), de elobbiek tropán alkaloid tartalma (,47mg/g hioszciamin,,46g/mg Tápközeg aminoguanidin tartalma (ppm) szkopolamin és,13mg/g apoatropin) alatta maradt a kontroll szövetekének (,73mg/g hioszciamin,.8,6mg/g szkopolamin és,25mg/g apoatropin) (117/A. ábra). Alkaloid produkció (mg/kultúra) hioszciamin szkopolamin apoatropin Tápközeg aminoguanidin tartalma (ppm) B A 117. ábra A tápközeg aminoguanidin tartalmának hatása D. innoxia # 41 hairy root klón tropán alkaloid tartalmára (A) és alkaloid produkciójára (B) (4 hetet követoen, sötétben tenyésztve). A 1-1ppm aminoguanidin hatására csökkentek ugyan a számított növekedési értékek (117/A. ábra), ezzel párhuzamosan azonban a tenyészetek hioszciamin és szkopolamin tartalma jelentosen megnott (1,53-1,68mg/g hioszciamin, B A 116. ábra A tropán alkaloid tartalom meghatározásához, D. innoxia #41 hairy root klón felhasználásával készült kivonatok HPLC kromatogramja (4 héten át sötétben tenyésztve, A: aminoguanidin mentes MS tápközegben és B: 1 ppm aminoguanidin a tápközegben). 1,7-1,25mg/g szkopolamin és,21mg/g apoatropin) (117/A. ábra). A szövetek hioszciamin és szkopolamin tartalma még 1ppm tápközeg aminoguanidin alkalmazása mellett is (,47mg/g és,41mg/g) csaknem elérte az 1ppm aminoguanidin esetében kapott értékeket (117/A. ábra). A szárazsúlyra vonatkoztatott alkaloid produkció értékei megfeleltek az alkaloid tartalom meghatározásánál kapott eredményeknek (117/B. ábra). A legnagyobb értékeket a 1ppm és 124

141 1ppm aminoguanidin tartalmú tápközegben fejlodo szövetekben mértük (,4mg hioszciamin,,26mg szkopolamin, valamint,34mg hioszciamin és,28mg szkopolamin/liofilizált kultúra), mely esetekben az alkaloid tartalom alakulásának megfeleloen a hioszciamin produkció szignifikánsan meghaladta a szkopolamin produkció értékeit (117/B. ábra). - A hidralazin hatása Az aminoguanidinhez hasonlóan tanulmányoztuk a hidralazin sötétben, MS folyékony tápközegben 4 héten át nevelt D. innoxia #41 hairy root klón növekedésére és tropán alkaloid termelésére Növekedési érték Szárazanyag tartalom (%) Tápközeg hidralazin tartalma (ppm) gyakorolt hatásait. A szövetek szárazanyag tartalma szemben az aminoguanidin esetében tapasztaltakkal kis mértékben csökkent a tápközeg hidralazin tartalmának emelésével, 1ppm alkalmazását követoen viszont a kontroll értékének (9,1%) közel kétszeresére nott (16,8%) (118/A. ábra). B A Tápközeg hidralazin tartalma (ppm) 118. ábra A tápközeg hidralazin tartalmának hatása D. innoxia #41 hairy root klón szárazanyag tartalmára (A) és növekedési értékére (B) (4 hetet követoen, sötétben tenyésztve). A szárazsúlyra vonatkoztatott növekedési értékek hasonlóan az aminoguanidin kezeléshez alacsony tápközeg hidralazin tartalom mellett megnottek, ez azonban csupán 1ppm hidralazin hatására következett be (118/B. ábra). 1ppm és 1ppm hidralazin hatására fokozatosan csökkent, majd 1ppm alka lmazását követoen teljes mértékben leállt a szövetek növekedése (118/B. ábra). A szövetek hioszciamin, szkopolamin és apoatropin tartalma hasonlóan az aminoguanidin esetében észleltekhez - 1ppm és 1ppm hidralazint tartalmazó táptalajokon (2,-2,35mg/g 119. ábra A tropán alkaloid tartalom meghatározásához, D. innoxia #41 hairy root klón felhasználásával készült kivonat HPLC kromatogramja (4 héten át sötétben tenyésztve, 1 ppm hidralazin a tápközegben). hioszciamin, 1,4-1,41mg/g szkopolamin és,31mg/g apoatropin) jelentosen meghaladta az egyéb szövetekben mért értékeket (119. és 12. ábrák). 125

142 Az 1ppm hidralazin alkalmazását követoen a tenyészetek növekedési értékei ebben az esetben is jelentosen felülmúlták a kontroll kultúráknál kapott értékeket (118/B. ábra), ugyanakkor elobbiek tropán alkaloid tartalma alatta maradt a kontroll szövetekben mért értékeknek (12/A. ábra). A 1-1ppm hidralazin hatására csökkentek ugyan a számított növekedési értékek (118/B. ábra), a tenyészetek hioszciamin és szkopolamin tartalma mégis jelentosen megnott (12/A. ábra). A szövetekben 1ppm tápközeg hidralazin tartalom mellett csupán nyomokban sikerült tropán alkaloidokat kimutatnunk (12/A. ábra). követoen is megfeleltek az alkaloid tartalom meghatározásánál kapott eredményeknek (12/B. ábra). A legnagyobb értékeket a 1ppm és 1ppm hidralazin tartalmú tápközegben fejlodo szövetekben mértük (,47-,7mg hioszciamin,,21-,42mg szkopolamin és,7-,9mg apoatropin/kultúra), mely esetekben az alkaloid tartalom alakulásának megfeleloen a hioszciamin produkció szignifikánsan meghaladta a szkopolamin produkció értékeit. Az aminoguanidin kezeléssel szemben az 1ppm hidralazint tartalmazó MS tápközegben nevelt szövetek 4 hét elteltével gyakorlatilag nem termeltek tropán alkaloidokat (12/B. ábra). 2.5 Alkaloid tartalom (mg/g) hioszciamin szkopolamin apoatropin Tápközeg hidralazin tartalma (ppm) Alkaloid produkció (mg/kultúra) Tápközeg hidralazin tartalma (ppm) hioszciamin szkopolamin apoatropin A B 12. ábra A tápközeg hidralazin tartalmának hatása D. innoxia # 41 hairy root klón tropán alkaloid tartalmára (A) és alkaloid produkciójára (B) (4 hetet követoen, sötétben tenyésztve). A szárazsúlyra vonatkoztatott alkaloid produkciós értékek a hidralazin alkalmazását 126

143 A B C D E F 127