Szőlőtőkékből izolált endofita Trichoderma izolátumok micéliális növekedése és kompetíciós képessége

Átírás

1 Kovács Csilla Sándor Erzsébet Peles Ferenc Szőlőtőkékből izolált endofita Trichoderma izolátumok micéliális növekedése és kompetíciós képessége Mycelial growth rate and mycoparasitic ability of endophytic Trichoderma isolates from grapevine trunks Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet, PhD. hallgató Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet, egyetemi docens Debreceni Egyetem, Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási Kar, Élelmiszertudományi Intézet, adjunktus Összefoglalás A szőlő tőkeelhalás (GTD) napjainkban az egyik legfontosabb betegség világszerte, mely már hazai ültetvényekben is jelen van. A Trichoderma fajokat már korábban is használták biopeszticidként különböző kórokozó gombák ellen. A nemzetség az Ascomycota törzs, Sordariomycetes osztály, Hypocreaceae családjába sorolható. Vizsgálataink célja a tokaji borvidékről, szőlőtőkékből származó Trichoderma izolátumok micéliális növekedésének és kompetíciós képességének vizsgálata volt. A vizsgálat tíz Trichoderma izolátum közül nyolcat molekuláris markerek (ITS1,2 és tef1 szekvenciák) alapján Trichoderma harzianum, Trichoderma orientalis fajként, illetve Trichoderma viride fajcsoportba tartozó fajként azonosítottuk. A növekedést Petri-csészén, burgonya-dextróz agar táptalajon mért micéliális növekedés alapján, a gombatelep két átmérőjének átlagából határoztuk meg. Az egyes Trichoderma izolátumok micéliális növekedését eltérő hőmérsékletek (18,5; 22,5; 25; 30 és 37 C) beállításával, négy napon keresztül, három ismétlésben mértük. A TR05 (T. harzianum) és a TR06 (T. orientalis) izolátumok minden vizsgált hőmérsékleten erőteljes növekedést mutattak. Minden vizsgált izolátum biokontroll indexe 100% volt a GTD kórokozóként ismert Diplodia seriata gombával szemben. Kulcsszavak: Trichoderma sp., biopeszticid, micéliális növekedés, mikoparazita képesség, szőlőtőke elhalás BEVEZETÉS A szőlő tőkeelhalás (GTD) napjainkban az egyik legfontosabb betegség világszerte, mely már hazai ültetvényekben is jelen van. A tőkeelhalásban különböző kórokozó gombák szerepét bizonyították, melyek közül a legfontosabbak a Phaeoacremonium aleophilum, Phaeomoniella chlamydospora, Eutypa lata, Fomitiporia mediterranae, Diplodia seriata (Bertsch et al., 2012). 180

2 A gombaspórák főként a metszési sebeken keresztül jutnak be a növénybe. Védekezési lehetőségként a betegség ellen a megfelelő higiéniás fertőtlenítés alkalmazása, valamint fertőzés csökkentésére irányuló fitotechnikai eljárások (például fertőzött oltványok kiszűrése) jelenthetnek a megoldást. Jelenleg sajnos nincs olyan hatékony fungicid, mely a betegség ellen hatásosan alkalmazható lenne. A nátrium-arzenitet, melyet korábban Nyugat-Európában alkalmaztak a betegség kezelésére (Mugnai et al., 1999), környezetre gyakorolt toxikus és karcinogén hatása miatt betiltották. Manapság a különböző fungicidekkel és a biológiai védekezési lehetőségekkel foglalkozó kutatások elsősorban a metszési sebek védelmére irányulnak (Halleen et al., 2010). A Trichoderma (teleomorf: Hypocrea) fajok talajlakó mikoparaziták, melyek antagonista képességgel rendelkeznek és mikotoxikus vegyületeket termelnek (Kubicek et al., 2007). Biopeszticidként különböző növényi kórokozó gombák ellen alkalmazzák. A nemzetség az Ascomycota törzs, Sordariomycetes osztály, Hypocreaceae családjába sorolható. A Trichoderma fajok konídiumtartói hifákon képződnek, konídiumai egysejtűek, melyeket nagytömegben fehér szín vagy zöld árnyalat jellemez. A hifafonalak rendkívül vékonyak, innen eredeztetik a faj nevét is, mely a görög tricho (hajszál) szó jelentéséből származik. Növekedésük optimális hőmérséklete C között van. Gyors növekedésüknek és mikoparazita aktivitásuknak köszönhetően kiszorítják a patogén kórokozókat a növény környezetéből. A Trichoderma fajok biológiai védekezésben nyújtott szerepe 1930 óta ismert. A növény kórokozókkal szembeni ellenállása is növelhető egyes Trichoderma törzsekkel, a szisztémás és lokális védekezés indukálása révén (Harman et al., 2004). Vizsgálatok bizonyították, hogy az Eutypa lata okozta betegség előfordulási gyakorisága jelentősen csökkent a Trichoderma kezelések hatására a kontroll mintákhoz képest (Tran, 2010). Weindling 1932-ben részletesen leírta, hogyan pusztítja el a mikroparazita (hiperparazita) a kórokozó gombákat. A Trichoderma harzianum például rátekeredik a parazitált gomba hifájára (1. kép), majd hausztóriumot fejleszt, és kitináz enzimet termelve kilyukasztja a sejtfalát (Kotze et al., 2011). 1. kép: A Diplodia seriata köré tekeredő Trichoderma harzianum Fotó: Kovács Csilla A vizsgálat célja a tünetmentes szőlőtőkéről származó Trichoderma izolátumok micéliális növekedésének és kompetíciós képességének vizsgálata volt. ANYAG ÉS MÓDSZER

3 A mikrobiológiai vizsgálatokat a Debreceni Egyetem MÉK Élelmiszertudományi Intézet mikrobiológiai laboratóriumában végeztük el. A vizsgálatokhoz 10 Trichoderma izolátumot (TR01-TR10) használtunk, melyek a Tokaji borvidékről származtak. A Trichodermákat egészséges szőlőtőkékből izoláltuk. Micéliális növekedés A Trichoderma izolátumokat különböző hőmérsékleten növesztettük (18,5; 22,5; 25; 30 és 37 C). A növekedést Petri-csészén, burgonya-dextróz agar táptalajon mért micéliális növekedés alapján, a gombatelep két átmérőjének átlagából határoztuk meg. A különböző Trichoderma izolátumok kompetíciós képességének vizsgálata A mikoparazita képesség vizsgálatát Szekeres et al. (2006) által leírt módszer alapján végeztük el. A Trichoderma sp. és a Diplodia seriata fajokat burgonya-dextróz (PDA) táptalajon növesztettük. A kísérletekhez két napos Trichoderma és három napos Diplodia seriata izolátumokat használtunk. Először a növényi patogén (Diplodia seriata) leoltását végeztük el malátás agarra Schubert et al. (2008), a Petri-csésze közepétől 1,5 cm-re, majd 24 óra után pedig a Trichoderma micéliumot oltottuk le a patogéntől 3 cm-re. 10 nappal később készítettünk fotót a tenyészetről. 10 nap után meghatároztuk a Biokontroll Indexet (BCI). DNS izolálás A gombasejtek feltárását MagNaLyser (Roche) készülékkel végeztük el, majd a DNS izolálásához NucleoSpin Plant II (Macherey-Nagel) kitet használtunk. A DNS koncentrációkat NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) készülékkel mértük meg. Az izolált DNS-t 0,8% agaróz gélben történő futtatással ellenőriztük. PCR amplifikáció és szekvencia analízis Az ITS1 and ITS2 szakaszokat tartalmazó riboszómális DNS régió felszaporításához SR6R és LR1 univerzális primereket alkalmaztunk (Smolik et al., 2011). A Trichoderma fajokat a tef1 markerszekvencia (EF1 728F és EF1 986R) segítségével azonosítottuk (Carbone-Kohn, 1999; Druzhinina et al., 2005). A PCR termékek tisztításához NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Macherey-Nagel) kitet alkalmaztunk. A szekvenciák meghatározását a Microsynth Austria GmbH végezte. A szekvenciákat a Trichoderma (TrichoBLAST adatbázisba blasztoltuk. A szekvenciák összerendezését Clustal-X program segítségével végeztük el (Larkin et al., 2007). A filogenetikai törzsfákat a MEGA 6 programmal (Tamura et al. 2013) készítettük. Statisztikai értékelés A mikrobiológiai paraméterek és az egyes tényezők közötti összefüggés statisztikai vizsgálatához varianciaanalízist és Tukey-tesztet, illetve nem paraméteres Kruskal-Wallis próbát és Dunn-féle összehasonlító tesztet alkalmaztunk. 5%-os P-érték alatt tekintettük a próbákat szignifikánsnak. Az eredmények kiértékeléséhez GraphPad Prism 3.02 (Motulsky, 1999) statisztikai programokat használtunk. 182

4 EREDMÉNYEK Tíz Trichodema izolátum micéliális növekedését vizsgáltuk. A TR01-TR05 izolátumok hasonlóan növekedtek 18 és 25 C között (1. ábra). Az izolátumok 30 C hőmérsékleten növekedtek a leggyorsabban. Az izolátumok növekedésének mértéke 37 C-on csökkent, de ez a csökkenés nem volt szignifikáns. 1. ábra: TR01-TR05 Trichoderma izolátumok micéliális növekedése különböző hőmérsékleteken A TR07-TR10 Trichoderma izolátumok micéliális növekedése szignifikánsan alacsonyabb (P<0,05) volt 37 Con (2. ábra), mint a TR01-TR05 izolátumok esetén (1. ábra). Növekedésük 18,5 és 30 C között egyenletes volt. 2. ábra: TR07-TR10 Trichoderma izoátumok micéliális növekedése különböző hőmérsékleteken A két csoport (TR01-05 és TR07-10) két-két izolátumát a TR06-al összehasonlítva (3. ábra) jól látható, hogy a TR06 minden vizsgált hőmérsékleten szignifikánsan magasabb növekedési értéket mutatott. A TR01, TR04, és TR05 izolátumokra 37 C-on az alacsony növekedés volt jellemző, mely azonban nem volt szignifikáns. A TR

5 és TR09 izolátumok viszont szignifikánsan alacsonyabb növekedési aktivitással rendelkeztek a többi izolátumhoz képest ezen a hőmérsékleten (3. ábra). 3. ábra: TR01, TR04, TR05, TR06, TR08 és TR09 Trichoderma izolátumok micéliális növekedése különböző hőmérsékleten Trichoderma izolátumok kompetíciós képességének vizsgálata A 2. képen a TR07 izolátum és a Diplodia seriata kórokozó interakciója látható. A Biokontroll-index értéke 100% volt, vagyis a Trichoderma fajok a kórokozó Diplodia seriata fajokat túlnőtték. Jól látható volt a mikoparazita spóraképzése is. Az általunk vizsgált valamennyi Trichoderma izolátum azonos Biokontroll-index értéket mutatott. Minden esetben megfigyelhető volt a mikoparazita a pusztító hatása a Diplodia seriata patogén ellen (2. kép). Diplodia seriata Trichoderma TR07 2. kép: A Trichoderma harzianum és a Diplodia seriata interakciója Fotó: Kovács Csilla 184

6 A B 4. ábra: Az ITS 1, 2 (A), és a tef1 (B) szekvenciák alapján, a MEGA 6 programmal készített Maximum Likelihood törzsfa. A TR01-10 a saját izolátumokat jelöli, a fajnevek előtti számok a deponált szekvenciák azonosítója a GeneBank adatbázisban. Az elágazások hossza arányos a szekvenciákban található nukleotid eltérések számával, a skála alul található. A vonalak felett és mellett található kék számok a Bootstrap analízis (n=1000) eredményét mutatják. (Csak az 50%-nál nagyobb értékeket jelöltük). A szőlőtőkékről izolált Trichoderma fajok riboszómális DNS régiójának, és transzlációs elongációs faktor 2 (tef1) szekvenciája alapján a TR01-05, TR07, TR09 és TR10 izolátumok Trichoderma harzianum (tel. Hypocrea lixii) fajhoz tartoznak (4. ábra). A minden vizsgált hőmérsékleten a leggyorsabb növekedést mutató TR06 (3. ábra) az ITS1,2 szekvencia alapján a Trichoderma longibrachiatum csoportba, a tef1 szekvenciája alapján ezen belül a Trichoderma orientalis fajhoz tartozik. A TR08 az ITS1,2 szekvencia alapján a Trichoderma viride csoportba sorolható. A pontos faji identifikálást a későbbiekben a kitináz (Chit gén) szekvencia alapján végezzük el. A fenti szekvenciák felhasználásával ugyanezt a besorolást kaptuk TrichoBLAST programmal (1. táblázat). 1. táblázat: Trichoderma izolátumok identifikálásának eredménye ITS 1és 2 és tef1 rdns szekvenciák alapján, a TrichoBLAST program segítségével Izolátum megnevezése Besorolás ITS alapján Besorolás tef1 alapján Section 1 Pachybasium Trichoderma harzianum TR01-05, TR07, TR09, TR10 Clade 1 Harzianum (teleomorf: Hypocrea lixii) TR06 Section 2 Longibrahiatum Clade 14 Longibrachiatum T. orentalis

7 TR08 Section 4 Trichoderma: Clade 12 Viride - KÖVETKEZTETÉS ÉS ÖSSZEFOGLALÁS Eredményeink alapján elmondható, hogy az általunk vizsgált izolátumok 18,5 C-on alacsony növekedési aktivitással rendelkeztek, és a TR01-TR05 és TR07-TR10 izolátumok magasabb 37 C-on lassabb növekedést mutattak. A TR05 és TR06 izolátumokat minden vizsgált hőmérsékleten a többieknél szignifikánsan magasabb növekedés jellemezte, mely 30 és 37 C hőmérsékleten volt a legintenzívebb. A TR05 és TR06 izolátumok maximális biokontroll indexük (BCI=100%) alapján potenciális biopeszticideknek tekinthetők, hiszen tág hőmérsékleti határok között is aktív növekedésre képesek. A riboszómális DNS régió ITS1,2, illetve a transzlációs elongációs faktor 2 (tef1) szekvenciák alapján az izolátumokat Trichoderma harzianum, Trichoderma orientalis fajként, illetve Trichoderma viride fajcsoportba tartozó fajként azonosítottuk. További vizsgálataink célja az izolált Trichoderma fajok felhasználási lehetőségeinek vizsgálata a tőkeelhalás (GTD) visszaszorításában. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A kutatás az Európai Unió és Magyarország támogatásával a TÁMOP A/ azonosító számú Nemzeti Kiválóság Program Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése konvergencia program című kiemelt projekt keretei között valósult meg. A publikáció elkészítését a TÁMOP-4.2.2/B-10/ számú, valamint a TÁMOP-4.2.1/B-09/1/KONV számú projekt is támogatta. Sándor Erzsébet munkáját a Debreceni Egyetem belső kutatási pályázata támogatta. A kutatások a COST FA1303 keretében zajlottak. SZAKIRODALMI JEGYZÉK Bertsch C., Ramírez-Suero M., Magnin-Robert M., Larignon P., Chong J., Abou-Mansour E., Spagnolo A., Clément C., F. Fontaine. (2012): Grapevine trunk diseases: complex and still poorly understood. Plant Pathology, Carbone I., Kohn L.M. (1999): A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes. Mycologia, Druzhinina I.S., Kopchinskiy A.G., Komoj M., Bissett J., Szakacs G., Kubicek C.P. (2005): An oligonucleotide barcode for species identifcation in Trichoderma and Hypocrea. Fungal Genetics and Biology,

8 Jukes T.H., Cantor C.R. (1969): Evolution of protein molecules. In Munro HN, editor, Mammalian Protein Metabolism, Academic Press. New York, Halleen F., Fourie P.H., Lombard P.J. (2010): Protection of grapevine pruning wounds against Eutypa lata by biological and chemical methods. South African Journal of Enology and Viticulture, Harman G. E., Howell C. R., Viterbo A., Chet I., Lorito M, (2004): Trichoderma species opportunistic, avirulent plant symbionts. Nature Reviews Microbiology, 2, Kotze C., Niekerk J.V., Mostert L., Halleen F., Fourie P. (2011): Evaluation of biocontrol agents for grapevine pruning wound protection against trunk pathogen infection. Phytopathology Mediterranea, 50, Supplement, S247-S263. Kubicek C.P., Komon-Zelazowska M., Sándor E., Druzhinina I. (2007): Facts and challenges in the understanding of the biosynthesis of peptaibols in Trichoderma. Chemistry and Biodiversity, Larkin MA.. Blackshields G., Brown NP.. Chenna R., McGettigan PA., McWilliam H., Valentin F., Wallace IM., Wilm A., Lopez R.,Thompson JD., Gibson TJ., Higgins DG. (2007): ClustalW and ClustalX version 2.0. Bioinformatics Advance Access, 2. Motulsky H. J. (1999): Analyzing Data with GraphPad Prism. GraphPad Software Inc., San Diego CA Mugnai L., A. Graniti A., Surico G. (1999): Esca (black measels) and brown wood-streaking: two old and elusive diseases of grapevines. Plant Disease, Schubert M., Siegfried F., Francis W.M.R. Schwarze F.W.M.R. (2008): Evaluation of Trichoderma spp. as a biocontrol agent against wood decay fungi in urban trees. Biological Control, Smolik M., Krupa-Małkiewich M., Smolik B., Wieczorek J., Predygier K. (2011): rdna Variability Assessed in PCR Reactions of Selected Accessions of Acer. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, Szekeres A., Leitgeb B., Kredics L., Manczinger L., Vágvölgyi Cs. (2006): A novel, image analysis-based method for the evaluation of in vitro antagonism. Journal of Microbiological Methods, Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. (2013): MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution Tran N.H.A. (2010): Using Trichoderma species for biological control of plant pathogens in Vietnam. Journal of International Society for Southeast Asian Agricultural Sciences (ISSAAS) Weindling R. (1932): Trichoderma lignorum as a parasite of other soil fungi. Phytopathology,