Transzszinaptikus pályajelölés rekombináns pseudorabies vírus törzsekkel és a vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladás vizsgálata

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM SZENTÁGOTHAI JÁNOS IDEGTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA Transzszinaptikus pályajelölés rekombináns pseudorabies vírus törzsekkel és a vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladás vizsgálata Doktori értekezés tézisei Dénes Ádám Témavezető: Dr. Kovács Krisztina, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Halasy Katalin, egyetemi tanár, az MTA Doktora Dr. Dobolyi Árpád, tudományos főmunkatárs, PhD Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Nagy György, egyetemi tanár, az MTA Doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Erdei Anna, egyetemi tanár, az MTA Doktora Dr. Madarász Emilia, egyetemi docens, PhD MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Molekuláris Neuroendokrinológia Laboratórium Budapest, 2006

2 BEVEZETÉS A környéki és központi idegrendszer kapcsolatrendszereinek tanulmányozásában a periférián zajló élettani folyamatokat irányító autonóm idegrendszer vizsgálata kiemelt szerepet játszik. Ezen vizsgálatok részét képezik a különféle neuroanatómiai pályajelöléses technikák, melyek többsége ugyanakkor nem teszi lehetővé az egymással szinaptikus kapcsolatban lévő idegi hálózatok komplex vizsgálatát. Az α- herpeszvírus családba tartozó neurotróp pseudorabies vírus (PRV) a rágcsálók környéki és központi idegrendszerében transzneuronális terjedésre képes. Perifériás beadása esetén a vírust a lokális idegvégződések veszik fel és replikációt követően a víruspartikulumok a szinaptikusan kapcsolt idegsejteken keresztül elérik a központi idegrendszert, ami lehetőséget teremt az autonóm idegrendszer centrális elemeinek azonosítására. A PRV-Bartha törzs felhasználásával amely a fertőzött idegsejtekben túlnyomó részt retrográd úton terjed a közelmúltban számos szerv központi idegrendszeri autonóm innervációját térképezték fel. Ugyanakkor vita tárgya az, hogy a Bartha törzs valóban kizárólag retrográd, transszinaptikus terjedést mutat, vagy fertőzhet egymással funkcionális kapcsolatban nem lévő (szomszédos) neuronokat is, amely eredménye a célszerv innervációjában szerepet nem játszó neuronpopulációk jelölődése lenne. A Bartha törzs rekombináns módosításával előállított, attenuált Dup törzsek (Ba-DupGreen, BDG és Ba-DupLac, BDL) specifikus terjedést mutatnak, alacsonyabb infektivitással rendelkeznek mint az eredeti Bartha törzs, lassabban terjednek a különféle idegi hálózatokban és kevesebb idegsejtet fertőznek. A beépített riporter proteinek (GFP a BDG, illetve β-galaktozidáz a BDL esetén) lehetővé teszik a fertőzött idegsejtek gyors azonosítását és neurokémiai fenotípusuk megállapítását, illetve két vírus elkülönítését együttes beadásuk esetén. Kísérleteink során az attenuált BDG és BDL vírusokat használtunk neuroanatómiai pályajelölésre, korábban nem vizsgált szervek esetében. Az immun és idegrendszer kétirányú kommunikációjának funkcionális példája a csontvelő autonóm innervációja. Ismert, hogy a vörös csontvelő (a hematopoezis helye) nagy számú idegrostot tartalmaz és ezek működése befolyásolja a csontvelői vérképző rendszer sejtjeinek maturációját, aktivitását, migrációját. Nem ismert ugyanakkor, hogy melyek azok a

3 központi idegrendszeri területek, melyek a csontvelőt innerváló idegsejtek aktivitását szabályozzák. A barna, illetve a fehér zsírszövet centrális autonóm beidegzését korábbi pályajelöléses kísérletek vizsgálták. Ezen vizsgálatok egymástól függetlenül számos megegyező, illetve átfedő agyterületet azonosítottak a két zsírszövet típus esetén. Nem ismert ugyanakkor, hogy a fehér zsírszövet innervációjában szerepet játszó centrális autonóm neuronok mennyiben alkotnak elkülönült populációt a barna zsírszövet beidegzésében részt vevő központi idegrendszeri sejtektől. Ez a kérdéskör kettős vírusbeadással vizsgálható. Régóta ismert, hogy az agyi immunkompetens sejtek fontos szerepet játszanak a centrális vírusfertőzések elleni védekezésben. A korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a mikroglia sejtek és asztrociták részt vesznek a neurotróp herpeszvírusok centrális terjedésének korlátozásában. Ezen kutatásokat nagy virulenciát és gyors transzneuronális terjedést mutató törzsekkel végezték, ami megnehezítette az agyi immunfolyamatok cellularis szintű vizsgálatát. A BDG alacsony virulenciája és lassabb centrális terjedése miatt lehetőség nyílik sejtszintű vizsgálatokra. Emellett, az immediate early kinetikával kifejeződő GFP riporter protein és a virális strukturális fehérjék együttes kimutatásával az érintett neuronok fertőzöttségi állapota megállapítható, ami lehetőséget teremt a vírusfertőzés hatására kialakuló immunfolyamatok időbeli tanulmányozására.

4 CÉLKITŰZÉSEK 1. A csontvelő autonóm beidegzésében részt vevő központi idegrendszeri struktúrák azonosítása rekombináns pseudorabies vírus törzsek felhasználásával, transzszinaptikus pályajelöléssel. 2. Az epididimális fehér zsírszövet és az interscapularis barna zsírszövet innervációjában szerepet játszó centrális autonóm neuronok lokalizációjának és fenotípusának felderítése, kettős virális pályajelöléssel. A vizsgálatok célja, hogy megállapítsa, vajon a két zsírszövettípus eltérő működése és funkcionális szerepe betudható-e a lokális innerváció által közvetített eltérő központi-idegrendszeri autonóm szabályozásának. 3. A pseudorabies vírus fertőzést kísérő centrális immunfolyamatok sejtszintű vizsgálata és szerepük bizonyítása a vírus nem specifikus terjedésének megakadályozásában.

5 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Vírusok. A rekombináns pseudorabies vírus törzseket (Ba-DupGreen, BDG; Ba- DupLac, BDL) Dr Boldogkői Zsolt (Szegedei Tudományegyetem) bocsájtotta rendelkezésünke, melyeket a Bartha törzs módosításával állítottak elő. A BDG GFP, a BDL β-galaktozidáz riporter fehérjét fejez ki immediate early kinetikával, hcmv promoter irányítása alatt. Kísérleti állatok. A kísérleteket grammos hím Wistar patkányokon végeztük (Toxi-Coop, Budapest, illetve MTA KOKI Orvosi Géntechnológiai Részleg, Budapest). Az állatkísérleteket az Európai Unió vonatkozó irányelvei (86/609 EEC) és a Magyar Kormányzat 243/98 direktívája szerint a 3256/002/203 iktatási számú, Neuroanatómiai pályajelölés retrográd vírusokkal című állatkísérleti engedély alapján végeztük. Sejtkultúrák és in vitro víruskinetikai vizsgálatok. Annak megállapítására, hogy a BDG vírus struktúrális (kapszid és burok) fehérjéinek (PRV) kifejeződése milyen latenciával követi az immediate early (IE) kinetikával expresszált GFP riporter protein megjelenését a fertőzött sejtekben, in vitro vizsgálatokat végeztünk. Ennek során PK- 15 (disznó vese sejtvonal) és NE-4C (immortalizált neuroectodermális sejtvonal) sejteket fertőztünk BDG-vel, majd 30 perces inkubációt követően a nem kötődött virionokat PBS-el történő mosással eltávolítottuk. A fertőzést követően, az 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 és 10 órával a kultúrákat 2%-os PFA oldatban fixáltuk (2% PFA 0.1 M PBSben, ph 7.4). Vírus injektálás a csontvelőbe. A bal femur distalis epiphysisének csontvelejébe BDG vírust injektáltunk, hogy megfertőzzük a csontvelői idegvégződéseket a transszinaptikus pályajelöléses kísérletekhez. A vírusfertőzés időbeli progressziójának vizsgálatához különböző túlélési időket választottunk: 4 nap (n=4), 5 nap (n=6), 6 nap (n=7) és 7 nap (n=5). Annak ellenőrzésére, hogy a fertőzés valóban a csontvelőből eredt, a kísérleti állatok egy-egy csoportjánál BDG vírust injektáltunk a (1) bal femur proximális epiphysisébe, (2) a perioszteumra, (3) a bal femurt körülvevő izmokba; (4) kettős vírusbeadással egyszerre fertőztük a femorális csontvelőt (BDG vírus beadása)

6 és a femur környéki izmokat (BDL beadása), valamint (5) denervációs kísérleteket végeztünk a virális fertőzés terjedésének gátlására. Vírus injektálás a fehér és barna zsírszövetbe. Az interscapularis barna zsírszövet (BAT) és az epididimális fehér zsírszövet (ewat) központi-idegrendszeri innervációjának összehasonlítása érdekében kettős vírusbeadást alkalmaztunk. A BAT-ba BDG, az ewat-ba BDL vírust injektáltunk és 4, illetve 5 napos túlélési idő után az állatokat perfundáltuk. Vírus injektálás a lépbe. A lépbe BDG vírust injektáltunk a vírus által okozott centrális fertőzés hatására kialakuló gyulladás vizsgálata céljából. A túlélési idők: 4 nap (n=3), 5 nap (n=8), 6 nap (n=5), 7 nap (n=4) és 10 nap (n=3). Leukociták izolálása és ex vivo jelölés vitális fluoreszcens festékkel. Altatott, kezeletlen állatok szívéből vért vettünk és a monocitákat, limfocitákat tartalmazó frakciót grádiens centrifugálással izoláltuk. Ezt követően az életképes sejteket vitális fluoreszcens festékkel (CMTMR) jelöltük. CMTMR-el jelölt sejtek injektálása vírusfertőzött állatokba. A kísérleti állatok lépébe BDG vírust injektáltunk, majd 72, illetve 96 órával később a CMTMR-el jelölt leukocitákat a juguláris vénán keresztül a keringésbe juttattuk. Az állatokat 5 nappal a vírus beadását követően perfundáltuk, hogy az exogén sejtek agyba történő infiltrációját tanulmányozzuk. Bromodeoxyuridine (BrdU) beadás. A vírusfertőzés hatására az agyban bekövetkező sejtproliferáció vizsgálatához a BDG lépbe történő beadása után 4 nappal intraperitoneálisan BrdU-t injektáltunk a kísérleti állatok egy csoportjánál. Transzkardiális perfúzió és szövetek kezelése. A kísérleti állatokat Zamboni fixálóval, illetve az ex vivo jelölt leukociták beadása esetén 4% -os PFA oldattal transzkardiálisan perfundáltuk. Utófixálást és krioprotekciót követően az agy, gerincvelő esetén 30, illetve 50 mikronos metszeteket készítettünk szánkamikrotómmal. A szimpatikus határlánc preparátumokat kriosztáton metszettük. Az elektronmikroszkópos vizsgálatra szánt szöveteket Zambóni oldattal, 0,08% glutáraldehid jelenlétében fixáltuk.

7 Immunhisztokémia. A PRV vel fertőzött idegsejtek azonosításához poliklonális, nyúlban termeltetett antitestet használtunk 1:10000 higitásban, melyet biotinilált szekunder szérummal és standard avidin-biotin-peroxidáz módszerrel tettünk láthatóvá, DAB/nikkel-ammónium-szulfát kromogén segítségével. Ezt követően, a szöveteken háttérfestést végeztünk Nuclear Fast Red (Fluka) segítségével. A kettős vagy hármas immunfluoreszcens jelöléshez a primer antitesteket megfelelő kombinációban együtt inkubáltuk (egér anti-gfp, nyúl anti-β-galaktozidáz, egér antiβ-galaktozidáz, egér anti-th, nyúl anti-npy, kecske anti-orexin A, egér anti-ed1, egér anti-ox42, nyúl anti-iba1, egér anti-brdu), majd mosást követően a megfelelő, fluorokrómmal konjugált szekunder antitestek keverékét adtuk a szövetekhez (szamárban és kecskében termeltetett Alexa 350 (kék), 488 (zöld), 594 (piros)). Bizonyos esetekben a kötődött primer antitesteket biotinilált szekunder antitest és szteptavidin-alexa 350, illetve 594 konjugátum segítségével mutattuk ki. Pre-embedding immuncitokémia és elektronmikroszkópia. A vírusfertőzött agyszövetből vibratómon 50 μm-es metszeteket készítettünk, majd feltárást és BSA/zselatin blokkolást követően a metszeteket 1:5000 higítású nyúl anti-prv primer szérumban inkubáltuk. TBS mosást követően 1 nm átmérőjű arannyal konjugált kecske anti-nyúl IgG-vel inkubáltunk, majd az arany szemcséket Aurion R- gent (Amersham) reagenssel intenzifikáltuk. Dehidrálás után a metszeteket Durcupanba ágyaztuk. Analízis. Az agyban és gerincvelőben a régiók vagy magok azonosításához, illetve határaik megállapításához a Paxinos és Watson által készített sztereotaxikus atlaszt használtuk. A lépbe történő BDG beadás esetén a kvantitatív elemzést digitális képeken végeztük, a fertőzött sejteket manuálisan, az infiltrálódó leukocitákat az Image J szoftver segítségével számoltuk. Statisztikai vizsgálatokhoz a STATISTICA 6.0 programcsomagot használtuk.

8 EREDMÉNYEK A csontvelő központi idegrendszeri autonóm beidegzése A legkorábbi fertőzött idegsejtek a paravertebralis dúclánc lumbális szakaszán jelentek meg, 4 nappal a BDG csontvelői beadása után. A sejtek egy része pozitivitást mutatott neuropeptid Y (NPY) ra. Ennél a túlélési időnél kis számú, vírusantigéneket tartalmazó preganglionális neuron már megfigyelhető volt a gerincvelői T8-L1 szelvényekben az intermediolaterális sejt oszlopban (IML), valamint a centrális autonóm magban (CAN). 5 nappal a vírus beadása után a gerincvelőben a fertőzött sejtek száma megnőtt, miközben a fertőzés megjelent az agytörzsi katekolaminerg C1, A5, A7 területeken, ahol az érintett neuronok 30-60%-a tirozin hidoxiláz (TH) enzimet tartalmazott. Emellett a ventromediális medullában (RVMM), locus coeruleusban, illetve több hypothalamikus pre-autonóm területen, mint a nucleus paraventricularis hypothalami (PVN), area hypothalamica lateralis (LH), nucleus preifornicalis, nucleus ventromedialis hypothalami és a retrochiasmaticus area találtunk fertőzött idegsejteket. 6 nappal a BDG csontvelői beadása után a fertőzött sejtek száma az előagy területén megnőtt és a fertőzés retrográd terjedésének eredményeképp virális jelölődés jelent meg az amygdala, nucleus interstitialis striae terminalis (BNST), septum laterale, cortex insularis és piriformis, valamint a cirkumventricularis szervek területén. Ugyanakkor, a korábban fertőződött területeken (mint az A5, C1 régió az agytörzsben vagy a PVN) a fertőzött sejtek degenerációja volt megfigyelhető, ami számuk csökkenését eredményezte. 7 napos túlélésnél a cortex insularis és piriformis területén a fertőzött sejtek száma tovább emelkedett, miközben az agytörzs és a hypothalamus korán fertőződött pre-autonóm területeiről szinte teljesen eltűntek a vírussal fertőződött idegsejtek. Azt a felvetést, hogy a BDG vírus csontvelői beadása eredményeként fertőződött idegsejtek centrális eloszlása jellemző-e a csontvelőre, számos kontroll kísérlettel igazoltuk: - A femur proximális epiphysisébe történő BDG injektálást követően a fertőzött neuronok száma és lokalizációja az agy területén teljesen megegyezett a distalis epiphysisbe történő beadások esetén tapasztaltakkal.

9 - A perioszteum fertőzése során az agyban talált vírusantigéneket kifejező idegsejtek száma nagyon alacsony volt, ugyanakkor 5 napos túlélésnél a csontvelői beadásokkal ellentétben jelölődést tapasztaltunk a nucleus tractus solitariusban (NTS). Ez arra utalt, hogy a csontvelőbe történő vírus beadás során a fertőzés a csontvelő állományában futó idegrostokból és nem a perioszteumból eredt. - A femur műtéti denervációja a csontvelőbe történő vírusbeadást követően jelentősen csökkentette, illetve az injektált állatok felénél teljesen megszüntette az agyi virális jelölődést. - A BDG csontvelőbe és a BDL femur környéki izmokba történő együttes injektálását követően (kettős vírusbeadás), az agy területén csak kis számú, mindkét vírussal fertőződött idegsejtet találtunk, ami a csontvelő elkülönült innervációjára utal. Az epididimális fehér zsírszövet és az interscapularis barna zsírszövet centrális autonóm beidegzésének vizsgálata 4 nappal a BDG vírus interscapularis BAT-ba és a BDL vírus epididimális WAT-ba törénténő injektálása után a gerincvelőben a β-gal pozitivitást mutató (WAT felől visszatöltődött) neuronok az alsó thoracalis és első lumbális szelvények, a GFP-t kifejező (BAT felől visszatöltődött) sejtek a thoracalis T1-T5 szelvények IML és CAN magcsoportjaiban helyezkedtek el. A medullában az A2, A5, C1 katekolaminerg sejtcsoportok és RVMM neuronjai között BDG-vel és BDL-el fertőzött sejteket is találtunk, melyek száma az 5. napra emelkedett. Az agyterületek többségében nem volt megfigyelhető valamely vírus kizárólagos jelenléte, ugyanakkor a nucleus motorius nervi vagi (DMV) neuronjai szinte kizárólag BDL-el fertőződtek, míg a BDG-t tartalmazó neuronok zöme az NTS területén volt megtalálható. Ennek ellenére cholera toxin β (CTB) epididimális WAT-ba történő beadását követően csak nagyon kis számban voltak megtalálhatók retrográd módon jelölődött, CTB-pozitív sejtek a DMV területén. A DMV ewat monoszinaptikus kapcsolatot tehát nem sikerült meggyőzően igazolni, ugyanakkor a DMV BDL-el történő erős fertőződése az ewat szignifikáns, centrális paraszimpatikus innervációját jelzi. Számos, az NTS- DMV területén található BDL-el fertőződött neuront NPY tartalmú rostok innerváltak. TH

10 immunfestést követően a különböző agytörzsi katekolaminerg magvakban nem találtunk szignifikáns különbséget a kolokalizáló GFP illetve β-gal-pozitív sejtek arányát tekintve. Az agytörzs területén a mindkét vírussal fertőződött idegsejtek aránya alacsony volt. Annak eldöntésére, hogy lehet-e bármilyen interferencia a két izogén vírustörzs között, a BDG-t és BDL-t összekevertük és a víruskeveréket az epididimális WAT-ba injektáltuk. 4 nappal a vírus beadása után az agy területén található fertőzött idegsejtek több mint 70%-a fertőződött mindkét vírussal. A hypothalamus területén 4 nappal a vírusok beadása után a fertőzött sejtek elsősorban a PVN-ben, a retrochiasmaticus areában és a lateralis hypothalamusban voltak megtalálhatók. 5 napos túlélésnél a hypothalamicus ventromedialis, dorsomedialis, supraopticus, suprachiasmaticus, periventricularis, perifornicalis, arcuatus magokban is megfigyeltünk érintett sejteket. A nucleus arcuatusban mind a β-gal, mind a GFP tartalmú neuronok egy részét NPY tartalmú rostok innerválják. A PVN területén a β-gal tartalmú neuronok 24.9 %-a, a GFP t tartalmazó neuronok 14.8 %-a és a két vírussal fertőzött sejtek 25.3 %-a fejezett ki oxytocint. Az LH esetén a β-gal-t expresszáló sejtek 29.5, a GFP-t expresszálók 26.6, míg a két vírussal fertőzött sejtek 35.7 százaléka tartalmazott orexint. A nucleus perifornicalisban talált β-gal-t kifejező neuronok 35.6, a GFP-kifejező neuronok 17.3, a kettősen fertőzött neuronok 29.8 %-a volt orexinerg. Mindemellett nem világos, hogy a BAT és WAT innervációjában szerepet játszó centrális autonóm sejtek milyen neurokémiai tulajdonságaikban különböznek és ezek milyen hatással vannak a két zsírszövet típus működésére. Az előagy területén a BNST, a septum laterale, az amygdala centrális és mediális magja, valamint a cortex insularis tartalmazott mind BDG-vel, mind BDL-el fertőzött sejteket és kis számú két vírussal fertőzött neuront. Összefoglalva, vizsgálataink azt mutatják, hogy a BAT és ewat centrális autonóm innervációját zömében elkülönült sejtpopulációk végzik, melyek ugyanakkor átfedő agyterületeken találhatók.

11 A vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladásos folyamatok vizsgálata A különféle beadási területek közül a lép esetén volt megfigyelhető a leghosszabb túlélési idő. 5 nappal a vírus beadása után az agytörzsi és hypothalamikus preautonóm magokban (C1, A5, RVMM, PVN), míg 7 napos túlélésnél már számos előagyi területen (cortex insularis, piriformis, amygdala) megfigyelhetők voltak a fertőzött idegsejtek. A virális fertőzés retrográd terjedésének és - a csontvelői beadásokhoz hasonlóan a korábban fertőződött területeken található érintett neuronok degenerációjának eredményeképp, 10 napos túlélésnél a cerebrális kéreg területén számos fertőzött sejt volt megfigyelhető, míg az agytörzsből szinte teljesen eltűntek az érintett neuronok. A virális strukturális fehérjék és a mikroglia sejtek együttes immunfluoreszcens kimutatásával láthatóvá vált, hogy a fertőzött idegsejteket a mikroglia sejtek körülveszik, barrier-szerű háromdimenziós struktúrát alkotva. Ezt a jelenséget a csontvelőbe történő beadások esetén is megfigyeltük. A degenerálódott neuronok vírusantigéneket tartalmazó törmeléke kimutatható volt a mononukleáris fagociták citoplazmájában. A vírus riporter proteinje, a GFP, a virális strukturális fehérjék (PRV), valamint lectin, OX42 vagy Iba1 mikrogliális markerek együttes kimutatásával megállapítottuk, hogy a mikrogliális barrier struktúra már a fertőzés korai szakaszában kialakul, amikor a PRV fehérjék detektálhatóvá válnak (azaz a fertőzött idegsejtek mind GFP-t, mind PRV fehérjéket kifejeznek). A késői fertőzöttséget mutató idegsejtek körül kompakt mikrogliális barrier alakul ki. In vitro víruskinetikai vizsgálatokkal kimutattuk, hogy vírus fertőzött sejtekben történő replikációjának kezdete után (kizárólag GFP expresszió) 4-6 óra telik el, mire a PRV fehérjék nagyobb mennyiségben detektálhatóvá válnak. Adataink alapján a mikrogliális barrier kialakulása a fertőzött idegsejtek körül ezen időintervallumon belül végbemegy in vivo, ami rendkívül gyors mikrogliális válaszra utal. Megállapítottuk, hogy az ED-1-pozitív mononukleáris fagociták ugyancsak részt vesznek a fertőzött idegsejtek izolálásában és eltakarításában, ugyanakkor eredményeink azt mutatták, hogy ezen sejtek zöme perifériás eredetű. Ennek ellenőrzésére ex vivo módon jelölt leukocitákat injektáltunk vírussal fertőzött állatokba és igazoltuk, hogy a fertőzött neuronok körül kialakuló sejtgyülem részben csontvelő, illetve vér eredetű infiltrálódott sejtekből (monociták, limfociták) áll. A

12 mikroglia és a perifériás eredetű sejtek egy része proliferációs aktivitást mutatott a virális fertőzés hatására. Elektronmikroszkópos vizsgálatokkal igazoltuk, hogy a mikroglia sejtek körülveszik a fertőzött neuronokat mielőtt azok membránja szétesne, ezzel megakadályozva a fertőzés lokális tovaterjedését, miközben maguk a fagociták nem mutattak produktív virális fertőződést.

13 KÖVETKEZTETÉSEK 1. Az attenuált, izogén pseudorabies vírus törzsek (BDG és BDL) alkalmasak transszinaptikus pályajelöléses kísérletekre és az így kapott eredmények alapján megismerhetjük a célszervet innerváló központi idegrendszeri autonóm neuronok lokalizációját. A vírusok terjedésének specificitásáért jelentős részben a mikroglia felelős, ami a fertőzött idegsejtek korai izolálásával és a degenerálódott sejtek eltakarításával lehetővé teszi a virális fertőzés lokális terjedésének gátlását. A rendkívül gyors mikrogliális aktiváció, toborzás és gyulladásos effektor működés mechanizmusainak mélyebb megismerése számos, központi idegrendszert érintő elváltozás kezelésében szolgálhat jelentős információkkal a jövőben. 2. A transsszinaptikus virális pályajelöléssel feltérképezett, csontvelőt innerváló autonóm neuronok lokalizációja információkkal szolgál arra nézve, hogy központi idegrendszer mely területei vehetnek részt a hematopoezis szabályozásában. Ez a centrális neuronhálózat konrollálja a csontvelői progenitor, prekurzor és érett sejtalakok proliferációját, maturációját, aktivációját és elválasztását a szisztémás keringésbe. 3. Az epididimális fehér zsírszövet és az interscapularis barna zsírszövet beidegzését nagyrészt elkülönült idegsejt populációk végzik a központi idegrendszer területén, melyek többsége ugyanakkor az agy azonos magcsoportjaiban található. Ezen eredményeink hozzájárulnak a termoreguláció, metabolikus szabályozás és a táplálékfelvétel szabályozásában résztvevő neuronhálózat működésének megértéséhez.

14 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik segítettek, támogattak az évek során és lehetővé tették, hogy munkámat a legjobb körülmények között végezzem. Mindenek előtt hálával tartozom témavezetőmnek, Dr. Kovács Krisztinának, aki türelmet és energiát nem sajnálva, állandóan azon fáradozott, hogy ebből az izgága, nyughatatlan ifjúból (azaz belőlem) eredményes kutatót faragjon. Amennyiben ez mégsem sikerült volna tökéletesen, aziránt a felelősség nem őt terheli Segített a tudományos gondolkodás elsajátításában és engesztelhetetlenül gyomlálta ki elkövetett hibáimat, elírásaimat, segítve, hogy az elvégzett munka a lehető legjobb minőségben kerüljön a tudományos közösség elé. Szeretnék emellett köszönetet mondani közelebbi kollégáimnak, a Molekuláris Neuroendokrinológia Laboratórium minden tagjának: Bosca Zoltánnak, Darida Miklósnak, Dr. Bali Balázsnak, Földes Annának, Dr. Gerencsér Andreának, Jelencsics Kírának, Ladjánszky Veronikának, Dr. Miklós Ildikónak, Pintér Ottónak, Dr. Szalay Katalinnak, Szalay Orsolyának, Szegő Évának, Tőkési Viktóriának, barátságukért és sokéves segítségükért. Ugyancsak köszönettel tartozom a Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet minden munkatársának, közülük sokakkal sikerült értékes személyes kapcsolatot is kialakítani az évek során és vannak köztük olyanok is, akiket barátomnak mondhatok. Nagy köszönettel tartozom Prof. Palkovits Miklósnak, akihez bármikor fordulhattam és akitől rengeteget tanultam az évek során. Folyamatosan segítségemre volt Dr. Boldogkői Zsolt, aki a rekombináns vírustörzseket rendelkezésemre bocsájtotta és akitől sok szakmai támogatást kaptam. Hálás vagyok Prof. Nancy Rothwell, Dr. Stuart Allan és Prof. Risto Kauppinen önzetlen segítségéért, akik a University of Manchester kiváló kutatóiként megismertettek egy másfajta tudományos gondolkodással, aminek azóta is nagy hasznát veszem. Végezetül, de egyáltalán nem utolsósorban, nem tudom (és soha nem is leszek képes) megköszönni szüleimnek, nagyszüleimnek, dédmamámnak hogy egészséges gondolatvilágú és boldog gyermekként nézhettem a felnőttkor viszontagságai elé, testvéreimnek, hogy mindig mellettem álltak és feleségemnek, kislányomnak, akik miatt most már tudom, hogy miért is érdemes dolgoznom.

15 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK: Zsolt Boldogköi, Attila Sík, Ádám Dénes, Anikó Reichart, József Toldi, Ida Gerendai, Krisztina J. Kovács, and Miklós Palkovits. Novel Tracing Paradigms Genetically Engineered Herpesviruses as Tools for Mapping Functional Circuits within the CNS: Present Status and Future Prospects. Progress in Neurobiology, 72 (2004) Ádám Dénes, Zsolt Boldogköi, Gabriella Uhereczky, Ákos Hornyák, Miklós Rusvai, Miklós Palkovits and Krisztina J. Kovács. Central Autonomic Control of the Bone Marrow: Multisynaptic Tract Tracing by Pseudorabies Virus. Neuroscience 134 (2005) Ádám Dénes, Zsolt Boldogkői, Ákos Hornyák, Miklós Palkovits, and Krisztina J. Kovács. Attenuated pseudorabies virus-evoked rapid innate immune response in the rat brain. Journal of Neuroimmunology 180 (2006) ELŐADÁS KIVONATOK: Dénes Ádám, Miklós Ildikó és Kovács Krisztina (2002) A hízósejtek morfológiai és funkcionális vizsgálata a fejlődő agyban. X. Sejt és Fejlődésbiológiai Napok, Siófok Ádám Dénes, Krisztina Kovács (2002) Mast cells in the developing rat brain. Elba Summer School, Italy Ádám Dénes, Miklós Palkovits, Zsolt Boldogköi, Ákos Hornyák and Krisztina Kovács (2004) Pseudorabies virus induced CNS inflammation and rapid glial reaction after peripheral inoculation. IBRO International Workshop on Neuronal Circuits: from Elementary to Complex Functions, January, Budapest Dénes Ádám, Boldogköi Zsolt, Palkovits Miklós, Kovács Krisztina (2004) Pseudorabies virus indukálta gyulladás és gyors gliális aktiváció a központi idegrendszerben, perifériás vírusbeadást követően. PHD Tudományos Napok, Budapest Ádám Dénes, Miklós Palkovits, Zsolt Boldogkői, Ákos Hornyák, Krisztina J. Kovács (2004) CNS inflammation and glial reaction against peripherally administered pseudorabies virus. 4th FENS, Lisbon

16 Márton Gábor, Szabó András, Boldogköi Zsolt, Dénes Ádám, Nógrádi Antal (2005) The use of mutant pseudorabies viruses for genetic modification of human embryonic spinal cord neurons. MITT XI., Pécs Boldogkői Zsolt, Dénes Ádám (2005) Viral vectors. MITT XI., Pécs Márton Gábor, Szabó András, Boldogköi Zsolt, Dénes Ádám, Nógrádi Antal (2006) The use of Pseudorabies virus as a gene therapy vector for human embryonic spinal cord neurons. IBRO International Workshop, Budapest Ádám Dénes, Miklós Palkovits, Zsolt Boldogkői, Ákos Hornyák, Krisztina J. Kovács (2006) Rapid microglial barrier formation and innate response control pseudorabies virus spread in the brain parenchyma. PENS Summer School, "The brain as a target for inflammatory processes" 14th-19th May, Berlin Adam Denes, Rishma Vidyasagar, Jianghua Feng, Johanna Närväinen, Barry McColl, Risto A. Kauppinen and Stuart Allan (2006) Endogenous and Exogenous Inflammatory Cell Responses Following Transient Ischaemia in Mice. 14 th ISMRM meeting, Seattle Márton Gábor, Szabó András, Boldogköi Zsolt, Dénes Ádám, Nógrádi Antal (2006) The use of Pseudorabies virus as a gene therapy vector for human embryonic spinal cord neurons. 5th FENS, July 8-12, Wien Miklós Darida, Ádám Dénes, Zsolt Boldogkői, Krisztina Kovács (2006) Dual viral transneuronal tracing of central circuits innervating brown and white adipose tissue. 5th FENS, July 8-12, Wien Ádám Dénes, Rishma Vidyasagar, Jianghua Feng, Johanna Närväinen, Barry McColl, Risto A. Kauppinen and Stuart Allan (2006) Proliferation and supportive role of self-renewing microglia following transient MCAo. 5th FENS, July 8-12, Wien