Transzszinaptikus pályajelölés rekombináns pseudorabies vírus törzsekkel és a vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladás vizsgálata

Átírás

1 SEMMELWEIS EGYETEM SZENTÁGOTHAI JÁNOS IDEGTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA Transzszinaptikus pályajelölés rekombináns pseudorabies vírus törzsekkel és a vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladás vizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés Dénes Ádám Témavezető: Dr. Kovács Krisztina, az MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Halasy Katalin, egyetemi tanár, az MTA Doktora Dr. Dobolyi Árpád, tudományos főmunkatárs, PhD Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Nagy György, egyetemi tanár, az MTA Doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Erdei Anna, egyetemi tanár, az MTA Doktora Dr. Madarász Emilia, egyetemi docens, PhD MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Molekuláris Neuroendokrinológia Laboratórium Budapest, 2006

2 Tartalomjegyzék 1. Rövidítések jegyzéke Bevezetés Az autonóm idegrendszer Az immunszervek autonóm beidegzése A csontvelő innervációja: A lép innervációja: A fehér és barna zsírszövet autonóm beidegzése A fehér zsírszövet (WAT) innervációja: A barna zsírszövet (BAT) innervációja: A neuroanatómiai pályajelölés (tracing) Neuroanatómiai pályajelölés pseudorabies vírussal A vírus replikációja, transszinaptikus terjedése: Transszinaptikus pályajelölés: Rekombináns második generációs vírus tracerek ripoter fehérjék beépítése: Rekombináns második generációs vírus tracerek a Dup vírusok: A pseudorabies vírus fertőzés hatására kialakuló gyulladásos folyamatok a központi idegrendszerben Célkitűzések Anyagok és Módszerek Vírusok Kísérleti állatok Sejtkultúrák és in vitro víruskinetikai vizsgálatok Vírusok injektálása Vírus injektálás a csontvelőbe: Vírus injektálás a fehér és barna zsírszövetbe: Vírus injektálás a lépbe: Leukociták izolálása és ex vivo jelölés vitális fluoreszcens festékkel CMTMR-el jelölt sejtek injektálása vírusfertőzött állatokba Bromodeoxyuridine (BrdU) beadás Transzkardiális perfúzió és szövetek kezelése Immunhisztokémia Immunperoxidáz hisztokémia: Immunfluoreszcencia: Pre-embedding immuncitokémia és elektronmikroszkópia Analízis Eredmények A csontvelő központi idegrendszeri autonóm beidegzése A vírussal fertőződött idegsejtek agyi lokalizációja a BDG vírus csontvelői beadását követően Jelölődés a szimpatikus határláncban és a gerincvelőben Jelölődés az agytörzsben Jelölődés az előagyban A BDG vírussal fertőződött autonóm neuronok neurokémiai jellemzése Kontroll kísérletek A centrális vírusfertőzés okozta gliális aktiváció és fagocitózis Az epididimális fehér zsírszövet és az intercapsularis barna zsírszövet centrális autonóm beidegzésének vizsgálata

3 A BAT és WAT innervációjában szerepet játszó centrális autonóm neuronok lokalizációja az agytörzsben A BAT és WAT innervációjában szerepet játszó centrális autonóm neuronok lokalizációja az előagyban Hypothalamus Limbicus rendszer és agykéreg A vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladásos folyamatok vizsgálata A vírus centrális terjedése lépbe törtőnő beadás után A BDG vírus riporter fehérjéje, a GFP és a virális struktúrfehérjék (PRV) kifejeződése in vitro A vírusfertőzés három stádiuma in vivo Gyors mikrogliális válasz a lokális vírusfertőzésre az érintett neuronok körül kialakuló mikrogliális barrier struktúra szerveződése és szerkezete Az ED1 -pozitív makrofágok részt vesznek a fertőzött neuronokat kölülvevő gliális barrier kialakításában Ex vivo jelölt leukociták beáramlása a perifériáról a fertőzött neuronokhoz A vírusfertőzés indukálta sejtproliferáció a fertőzött területeken A vírussal fertőzött idegsejtek és környezetük ultrastruktúrális vizsgálata Az eredmények megvitatása A csontvelő autonóm beidegzése Metodikai szempontok A csontvelő beidegzését végző autonóm idegi hálózat anatómiája A csontvelő beidegzésében szerepet játszó neuronhálózat funkcionális jelentősége Az epididimális fehér zsírszövet és az interscapularis barna zsírszövet centrális autonóm beidegzésének vizsgálata Metodikai szempontok A BAT és ewat beidegzését végző autonóm idegi hálózat anatómiája és ennek funkcionális jelentősége A vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladásos folyamatok vizsgálata Következtetések Összefoglalás Summary Irodalomjegyzék Saját közlemények jegyzéke Az értekezés alapjául szolgáló közlemények Előadáskivonatok Köszönetnyilvánítás

4 1. Rövidítések jegyzéke ASP putative antisense promoter BAT brown adipose tissue (barna zsírszövet) BDG Ba-DupGreen BDL Ba-DupLac β-gal béta-galaktozidáz BNST bed nucleus of the stria terminalis (nucleus interstitialis striae terminalis) CAN central autonomic nucleus (centrális autonóm mag) cc canalis centralis CCK kolecisztokinin CeA centralis amygdala ChAT kolin acetiltranszferáz CTB cholera toxin beta CRH corticotropin releasing hormon CGRP calcitonin gene-related peptide DA dopamin DBH dopamin-β-hidroxiláz DMN dorsomedial hypothalamic nucleus (nucleus dorsomedialis hypothalami) DMV dorsal motor nucleus of the vagus (nucleus motorius nervi vagi) ewat epididymal white adipose tissue (epididimális fehér zsírszövet) FB Fast Blue GABA gamma-amino-vajsav GFP green fluorescent protein (zöld fluoreszcens protein) Gi nucleus reticularis gigantocellularis HPA hypothalamus-hypophysis mellékvesekéreg HRP horse radish peroxidase (torma peroxidáz) HSV herpes simplex vírus 5-HTT 5-hydroxytryptamine transporter (szerotonin-transzporter) IE immediate-early IFNγ interferon gamma IL-4 interleukin-4 IML intermediolaterális sejt oszlop KPBS kálium-foszfát puffer LAT latency assotiated transcript (latencia-asszociált transzkriptum) LHA lateral hypothalamic area (area hypothalamica lateralis) LPGi lateral paragigantocellular nucleus (nucleus paragigantocellularis lateralis) LY Lucifer Yellow MCP-1 monocyte chemoattractant protein-1 MEM Minimum Essential Medium MePOA mediális preopticus area (area preoptica medialis) MOI multiplicity of infection NDS normal donkey serum (normál szamár szérum) NGS normal goat serum (normál kecske szérum) nnos neuronális nitrogén oxid szintetáz NTS nucleus tractus solitarius NPY neuropeptid Y NY Nuclear Yellow PAG periaqueductal gray matter (substantia grisea centralis) 4

5 PALS periarteriolar lymhoid sheat (periarteriális hüvely) PFA paraformaldehid PGE2 prosztaglandin E2 PNMT feniletanolamin-n-metiltranszferáz POA preopticus area PRV pseudorabies vírus PVN paraventricular nucleus (nucleus paraventricularis hypothalami) RMg nucleus raphe magnus SP substance P TB True Blue TBS tris buffered saline (tris puffer) TH tirozin hidroxiláz TLR toll-like receptor TRH thyrotropin-releasing hormone VHS virion host shutoff protein VIP vasoactive intestinal peptide (vazoaktív intesztinális polipeptid) VMN ventromedial hypothalamic nucleus (nucleus ventromedialis hypothalami) WAT white adipose tissue (fehér zsírszövet) 6-OHDA 6-hidroxi-dopamin 5

6 2. Bevezetés 2.1. Az autonóm idegrendszer A vázizomzat szenzoro-motoros beidegzésének kivételével az autonóm idegrendszer szolgáltatja a gerincesek szerveit beidegző idegrostokat és szabályozza ezek aktivitását. Mivel az autonóm folyamatok nagy többségükben nem állnak tudatos kontroll alatt, ezért indokolt az autonóm (független) rendszer elkülönítése a szomatomotoros idegrendszer elemeitől. Anatómiailag az autonóm idegrendszer három komponensre tagolható: a szimpatikus (noradrenerg) és paraszimpatikus (kolinerg) rendszerekre, melyek idegsejtjei a központi idegrendszerben (agy, illetve gerincvelő) erednek, valamint az enterális idegrendszerre, amely a gasztointesztinális traktusban helyezkedik el 1. Az enterális rendszer, amely közelítőleg annyi idegsejtet tartalmaz mint a gericvelő 2 az intesztinális folyamatokat szabályozza, ugyanakkor a szimpatikus és paraszimpatikus rendszerektől is kap moduláló innervációt 3. Az autonóm rendszer működése során a perifériáról eredő viszceroszenzoros információ eléri a centrális autonóm szenzoros területeket, majd feldolgozás után a viszceromotoros rendszer szimpatikus vagy paraszimpatikus impulzust küld a célszerveknek, ami megváltozott működést eredményez. A viszceroszenzoros információ az agyat a craniális idegeken át (ezt a rendszert nevezik paraszimpatikus viszceroszenzoros rendszernek is 4 ) valamint a spinális idegeken keresztül ( szimpatikus viszceroszenzoros rendszer) éri el. Az agyi bemenetet négy agyideg szolgáltatja: a nervus trigeminus rendszere (arc, fej területéről származó viszcerális információ); a nervus facialis rendszere (ízlelés); a nervus glossopharyngeus rendszere (kemény szájpad, oropharynx, glomus caroticum beidegzése); a nervus vagus rendszere (oropharynx alsó részének, larynx, trachea, esophagus és számos thoracális, illetve abdominális szerv beidegzése, a pelvicus zsigerek kivételével, ezeket a sacralis spinális idegek innerválják 5,6 ). A négy agyidegből eredő viszcerális afferensek a nucleus tractus solitarius-ban (NTS) végződnek, topografikus organizációt követve 5. Az NTS ből felszálló axonok az agy számos területét elérik, mint a ventrolaterális medulla, a hypothalamus, az amygdala, vagy a nucleus interstitialis striae terminalis (BNST) 7 de a legfőbb viszceroszenzoros átkapcsoló állomás a parabrachialis mag. A parabrachialis mag legalább 13 almagot 6

7 tartalmaz, melyek kiterjedt innervációt adnak az agytörzs, a hypothalamus, a bazális előagy, a thalamus és az agykéreg több területére A felszálló rostok mellett, az NTS neuronok egy része az agytörzsi autonóm premotoros idegsejteken végződik és részt vesz a viszceroszenzoros információ továbbításában a viszceromotoros rendszer felé 13. Az agyidegek által szállított információk mellett a cirkumventrikuláris szervek felől is érkezik viszceroszenzoros információ. A subfornicalis szerv (SFO), az organum vasculosum laminae terminalis (OVLT) és a perifornicalis mag angiotenzin II tartalmú rostokat küldenek a nucleus paraventricularis hypothalami (PVN) magnocellularis és parvocellularis neuronjaihoz 14. A keringő adrenomedullin a PVN autonóm neuronjait aktiválja, mely hatás az area postrema adrenomedullin-érzékeny idegsejtjeinek hypothalamusba futó projekciói révén valósul meg 15,16. A gerincvelői (spinális) viszceroszenzoros rendszer szállítja a belső szervekből jövő zsigeri információt, amely a központi idegrendszert a gerincvelői idegeken keresztül éri el. A hátsó gyökérben elhelyezkedő hőérzékeny, nociceptív neuronok viszcerális információt továbbítanak mechanikai, kémiai vagy termális stimulus hatására 17,18. Ezek a felszálló pályák nagymértékű átfedést mutatnak a szomatikus afferensekkel, ugyanakkor működésük legtöbbször nem válik tudatossá, kevesebb ingerülettípust továbbítanak és a viszcerális (tudatosult) fájdalom lokalizációja pontatlanabb. Viszonylag kis számú viszcerális szenzoros rost lép be közvetlenül a hátsó szarvba 19, legnagyobb részük a lamina I-ben, a IV-V, illetve a VII és X es rétegben végződik, emellett kis számban az intermediolaterális sejt oszlopban (IML) elhelyezkedő idegsejteket is elérhetik Általánosan jellemző, hogy a felszálló pályák kollaterálisai konvergálnak a cranialis idegek viszceroszenzoros rendszerével a központi idegrendszer minden szerveződési szintjén 24,25. A lamina I ben elhelyezkedő idegsejtek spinothalamikus axonjainak 80%-a küld kollaterálisokat a parabrachiális magba patkányok esetén 26. A parabrachiális magból kiinduló rostok a medulla, hypothalamus, amygdala vagy az intralamináris thalamicus mag területére vetülnek 9,11,27,28. A gerincvelői felszálló projekciók egy része az agytörzsben végződik, majd az agytörzsi A1, A6 katekolaminerg magvakból felszálló rostok a ventrális noradrenerg köteghez csatlakozva innerválják a neuroendokrin hypothalamusz idegsejtjeit A rostrális raphe magokban elhelyezkedő szerotonin tartalmú idegsejtek a hypothalamusba és a limbikus rendszer felé proiciálnak 32. A spinális afferensek előagyi vetületei a thalamus és agykéreg szintjén a craniális rendszernek megfelelő területeken találhatók és a craniális rendszer poszterolaterális folytatásának tekinthetők 25. 7

8 A centrális viszceroszenzoros rendszer általános szerveződését végigkövethetjük az 1. ábrán, a felszálló nociceptív idegpályák példáján bemutatva. 1. ábra. A spinoretikulothalamikus traktus. Az ábrán a hypothalamusba és a limbikus rendszerbe felszálló nociceptív idegpályák láthatók. 1, Az agytörzsi katekolaminerg sejtekhez és a formatio reticularis neuronjaihoz futó projekciók; 2, az intalamináris és középvonali thalamikus magokban végződő terminálisok; 3, thalamikus projekciók a cortex cingularis és piriformis területére. A1, A2 A1 és A2 noradrenerg sejtcsoportok; CC cortek cingularis; CN centralis amygdaloid nucleus; CP cortex piriformis; GR nucleus reticularis gigantocellularis; LC locus coeruleus; LHA area hypothalamica lateralis; PL nucleus paragigantocellularis lateralis. Az eredeti ábra Pacak és Palkovits közleményében jelent meg 13. A viszceromotoros autonóm rendszer centrális része számos előagyi, agytörzsi magot és magcsoportot tartalmaz, melyek a szimpatikus, paraszimpatikus autonóm idegsejtek működésének szabályozásában vesznek részt vagy a neuroendokrin hypothalamus magcsoportjait innerválják. A funkcionális képalkotó eljárások eredményei szerint az 8

9 emberi agykéreg területén az anterior cinguláris kéreg, az insularis kéreg és az orbitofrontalis kéreg idegsejtjei valamint az amygdala részt vesznek az autonóm válaszok generálásában 33,34. Anterográd és retrográd pályajelöléses kísérletek eredményei szerint majmokban az infralimbikus és prelimbikus areák innerválják a nucleus accumbens, amygdala, lateralis, medialis preopticus area, nucleus ventromedialis hypothalami (VMN), nucleus tuberomamillaris, a substantia grisea centralis (PAG) és a dorsomedialis, lateralis, posterior hypothalamicus magok neuronjait 35. A centrális autonóm folyamatok egyik fő integrálója a hypothalamus ezen belül nucleus paraventricularis hypothalami (PVN). Rágcsálókban a PVN számos limbikus agyterületről kap innervációt. Ezeknek a bemeneteknek nagy része indirekt úton valószínűleg GABA-erg interneuronok közvetítésével, kisebb része átkapcsolás nélkül végződik a parvocelluláris neuroszekréciós idegsejteken és a dorsalis, ventralis-mediális parvocelluláris projekciós neuronokon 36. A limbikus területek közül a ventrális subiculumból, a prefrontális cortex területéről, az amygdalából, a BNST ből bizonyítottan érkezik innerváció a PVN-be A hypothalamus területén a nucleus dorsomedialis hypothalami (DMN) és a mediális preopticus area (MePOA), a nucleus arcuatus, nucleus premammillaris ventralis és a lateralis hypothalamicus area (LHA) szintén beidegzik a PVN neuroszekretoros és projekciós autonóm idegsejtjeit 40. A hypothalamusból eredő autonóm pályarendszerek alapvetően három részre oszthatók: (1) projekciók az agytörzsben vagy gerincvelőben elhelyezkedő preganglionális idegsejtekhez (2) projekciók azokhoz az agytörzsi ketekolaminerg sejtcsoportokhoz melyek preganglionális neuronokat innerválnak (Ilyenek pl. az agytörzsi A5 katekolaminerg pre-autonóm neuronok, melyeket a PVN-ből jövő rostok bizonyítottan beidegzik 41 ), (3) azon hypothalamikus idegsejtek projekciói a gerincvelőben és az agytörzsben elhelyezkedő szenzoros neuronokhoz, amik direkt vagy indirekt viszcero- illetve szomatoszenzoros innervációt kapnak (visszacsatolásos szabályozás) 42. A gerincvelőbe és az agytörzsbe leszálló hypothalamikus rostok nagy százaléka oxytocin és vazopresszin tartalmú idegsejtekből ered 31 de számos más neuropeptid, (enkefalinok, dynorphinok, neurotensin, POMC, angiotenzin II, galanin) is expresszálódik a projekciós a neuronokban Az A11 dopaminerg projekció kivételével ezek a leszálló rostok peptidergek 43,44. A hypothalamus területén a PVN autonóm neuronjaiból eredő agytörzsi és gerincvelői projekciók kiemelkedő fontosságúak az autonóm szabályozásban 46,47. Emellett a nucleus arcuatus, 9

10 perifornicalis, supraopticus, mediális preopticus, dorsomediális, ventromediális és tuberomamilláris magcsoportok, valamint az A11, a retrochiasmaticus és a lateralis hypothalamikus areák idegsejtjei adnak innervációt az agytörzsi és gerincvelői autonóm idegsejtek számára Az agytörzsi katekolaminerg, viszceromotoros neuronok a locus coeruleusban (A6), a subcoeruleus régióban, valamint az A2, A5 és A7 noradrenerg és a C1, C3 adrenerg sejtcsoportokban helyezkednek el a vertolaterális medullában. Ezek innerválják a gerincvelői preganglionális neuronokat melyek többsége az IML ben és a centrális autonóm magban (CAN) helyezkedik el Az agytörzsben lévő pre-autonóm neuronok integrálják a centrális autonóm idegsejtekből beérkező impulzusokat, szabályozzák a szimpatikus tónust, éberséget, a kardiovaszkuláris folyamatokat és a szimpatikus rendszer általános aktivitását A paraszimpatikus preganglionális neuronok a nyúltvelőben helyezkednek el, kisebb részük pedig a sacralis gerincvelőben (cranio-sacralis rendszer). Az agytörzsben a nucleus motorius nervi vagi (DMV), a superior és inferior salivatorius magok, valamint a caudalis medullában elhelyezkedő diffúz neuronpopuláció a nucleus ambiguus és a DMV közötti területen vesznek részt a centrális paraszimpatikus autonóm szabályozásban. A szimpatikus preganglionális neuronok alkotják a gerincvelő oldalsó szarvában, az intermediolaterális sejtoszlopot a thoracalis és első lumbális szegmentumokban (thoraco-lumbalis rendszer). Ezen kolinerg idegsejtek axonjai a paravertebrális dúclánc ganglionjain végződnek. A thoraco-lumbális, zömében noradrenalin tartalmú szimpatikus ganglionokból eredő posztganglionális rostok csatlakoznak a perifériás idegekhez és beidegzik a különféle célszerveket. A mellékvese velő kromaffin sejtjeit, melyek 4:1 arányban adrenalint illetve noradrenalint szintetizálnak és a határlánc ganglionokhoz hasonlóan dúcléc eredetűek, kolinerg preganglionális rostok innerválják 1. A szimpatikus idegrendszer a hypothalamus-hypophysis mellékvesekéreg (HPA) tengellyel együttműködve felelős a homeosztázis fenntartásáért és bármilyen stressz hatására a két rendszer elemei gyorsan aktiválódnak, ami a katekolaminok, glükokortikoidok perifériás elválasztásának emelkedését eredményezi. A katekolaminok ezen belül a kardiovaszkuláris tónus, szívritmus, metabolizmus és a termogenezis fő regulátorai. A centrális autonóm rendszer főbb efferens idegpályáit a 2. ábra foglalja össze. 10

11 2. ábra. A centrális autonóm rendszer főbb leszálló idegpályái. A jobb átekinthetőség kedvéért csak az ismert kapcsolatok egy részét ábrázoltam és az egyes idegpályákat unilaterálisan tüntettem fel. 1 A limbikus területekről kiinduló projekciók a hypothalamus és az agytörzs felé (rózsaszín); 2 a 11

12 hypothalamusból eredő projekciók, melyek közvetlenül, vagy az agytörzsben történő átpakcsolódás után érik el a szimpatikus, illetve paraszimpatikus preganglionális neuronokat (barna); 3 a gericvelői intermediolaterális sejtoszlopból kiinduló projekciók a szimpatikus határlánc ganglionokhoz (kék); 4 a szimpatikus határlánc neuronokból eredő posztganglionális idegrostok (zöld); 5 - a nervus vagus paraszimpatikus rostjai (piros). Rövidítések: A5 A5 katekolaminerg sejtcsoport, Amb nucleus ambiguus, Arc nucleus arcuatus, BNST nucleus interstitialis striae terminalis, C1 C1 katekolaminerg sejtcsoport, CeA centrális amygdala, DMV nucleus motorius nervi vagi, GiA nucleus reticularis gigantocellularis, IL cortex infralimbicus, IML intermediolateralis sejt oszlop, LC locus coeruleus, MeA medialis amygdala, PAG substantia grisea centalis, PeF nucleus perifornicalis, pir. - cortex piriformis, PoA area preoptica, PVN nucleus paraventricularis hypothalami, PrL cortex prelimbicus, RCh retrochiasmaticus area, RMg nucleus raphe magnus, S szimpatikus határlánc, Sol nucleus tractus solitarius, VG vegetatív ganglion Az immunszervek autonóm beidegzése Az első eredmények a limfoid szervek beidegzéséről még a 19. század végén születtek, amikor olyan idegrostokat azonosítottak, amik belépnek a nyirokcsomókba 62. Az idegrendszer és immunrendszer kapcsolatát később funkcionális vizsgálatok is megerősítették. A korai humán kutatások során kimutatták például, hogy szubkután adrenalin injekció hatására intenzív leukocitózis figyelhető meg, valamint tuberkulózisban szenvedő páciensek esetén a fagocita sejtek csökkent aktivitását írták le a betegek pszichogén stresszorokkal teli életperiódusában 1. Mindezek ellenére, a csontvelő és a tímusz hematopoézisben és limfopoézisben betöltött szerepének részletes megismerését megelőzően, ezek a vizsgálatok nem tudták az immun- és idegrendszer kapcsolatrendszerét megfelelően értelmezni. Az immunológia és a neuroanatómiai pályajelöléses technikák fejlődésével az immunszervek beidegzése és ennek szerepe az immunfolyamatokban fokozatosan vált ismertté. Ebben a fejezetben az immunszervekben fénymikroszkópos immunhisztokémiával és elektronmikroszkópiával azonosított idegrostok típusait és lokalizációját tárgyalom röviden, külön kiemelve a csontvelő és a lép beidegzését. A limfoid szervek a vérerekhez hasonlóan elsősorban szimpatikus innervációt kapnak, mely elsősorban noradrenalin és neuropeptid Y (NPY) tartalmú idegsejtektől ered 63. Számos tanulmány igazolta a limfoid szervek általános noradrenerg innervációjának meglétét az eddig vizsgált különféle állatfajokban mind az elsődleges (csontvelő és tímusz) mind a másodlagos nyirokszervekben (lép, nyirokcsomók) Általánosan jellemző, hogy a posztganglionális idegrostokat tartalmazó idegek a vaszkuláris elemekkel együtt lépnek be az immunszervekbe, ahol kisebb kötegekre oszlanak, majd az erek falának közelében végződnek vagy a szerv parenchymájában szabad idegvégződések formájában találhatók. A tímusz esetén a szervbe belépő 12

13 posztganglionális szimpatikus rostok zöme a kéregállományban, a szeptumok között és szubkapszuláris régióban található, míg csak elvétve találhatók meg a velőállományban 66, A legsűrűbb plexusok a kéregállomány külső részében találhatók, ahol az éretlen tímociták fejlődnek és a kortex mély rétegeiben ahol jelentős a tímociták migrációja. A dopamin β-hidroxiláz (DBH) és TH immunpozitív rostok jelentős része a vaszkulatúrával asszociált 71. Ultrastruktúrális vizsgálatok szerint ugyanakkor, a noradrenerg varikozitások közvetlen környezetében tímociták, hízósejtek, fibroblasztok és eozinofil granulociták találhatók 72. A test különböző területén található nyirokcsomók beidegzésére általánosan jellemző, hogy noradrenalin tartalmú szimpatikus rostok az erekkel asszociáltan a hilus területén lépnek be, majd elágaznak és a vaszkuláris elemekkel együtt haladnak a nyirokcsomó velőállományán át. A velőállományban és a paracorticalis régióban a rostok egy része elágazik és az erektől függetlenül halad tovább 73. A noradrenerg axonok innerválják a corticalis és paracorticalis T-sejt gazdag régiókat, de hiányoznak a B-sejt gazdag germinális centrumok területéről 74. Érdekes módon, az emberi torokmandulák nyiroktüszőinek nincs noradrenerg beidegzése 75. Az immunszervek általános szimpatikus beidegzésének az egyik legismertebb funkcionális példája a katekolaminok immunmoduláns hatása (amit a mellékvese kéregből felszabaduló kortikoszeteroidokkal együtt fejtenek ki) 76, A csontvelő innervációja: A (vörös) csontvelő gazdagon vaszkularizált szerv, a hematopoézis elsődleges helye, ahol a vér sejtes elemei folyamatosan keletkeznek az élet során. A csöves csontokba belépő központi artéria longitudinális artériákra ágazik el, melyek újabb elágazások után kapillarizálódnak, majd vénás szinuszoidokban folytatódnak. A vérképző folyamatok a csontvelőben a vérerek közti, fibroblaszt jellegű retikulumsejtekkel kitöltött kötőszövetben mennek végbe Itt a hematopoetikus szövettel együtt fibroblasztok, adipociták, oszteoblasztok és számos egyéb sejttípus is megtaláható 78,79. Az idegek a vérerekkel együtt lépnek be a csontvelőbe, a vaszkuláris plexusokkal együtt elérik a velőállományt, elágaznak a parenchymában és a hematopoetikus sejtek között, vagy a szinuszoidok falában végződnek. Immunhisztokémiával rágcsálókban a csontvelő állományában calcitonin gene-related peptid (CGRP), substance P (SP), NPY, 13

14 tirozin hidroxiláz (TH), és dopamin (DA) tartalmú idegrostokat azonosítottak. A rostok jelentős része az erek falában vagy annak közelében végződik, de direkt kontaktust is kimutattak az idegvégződések és a sztrómasejtek, illetve a hematopoetikus sejtek között 1, Ugyanakkor, a csontvelőben előforduló neurotranszmitterek/neuropeptidek receptorai is expresszálódnak számos hematopoetikus sejttípusban, ami az idegsejtekből felszabaduló anyagok lokális, hematopoézisre gyakotolt hatására utal A rágcsálókban végzett vizsgálatok szerint a csontvelői innerváció a fötális élet késői szakaszában alakul ki, éppen a hemopoetikus aktivitás kezdetét megelőző időszakban 82,87. A szimpatikus innervációnak a vérsejtek érésében és mobilizációjában lehet szerepe 88. Nem ismert ugyanakkor, hogy milyen központi idegrendszeri struktúrák vesznek részt a csontvelőben zajló folyamatok szabályozásában és hogy az ezek által megvalósuló moduláció milyen súllyal esik latba a humorális szabályozó faktorok mellett A lép innervációja: A lépbe belépő splanchnicus ideg rostjainak 98%-a szimpatikus rost 89, és több tanulmány eredményei szerint a lép innervációjának egészét tekintve a szimpatikus tónus a domináns. A noradrenerg posztganglionális rostok a ganglion mesenterica/coeliaca ból erednek és az idegek az arteria splenica-val együtt lépnek be a lép állományába. A vérerekkel együtt elágaznak és a trabeculák mentén trabecularis plexusok formájában haladnak tovább 66. Noradrenerg rostok a legnagyobb sűrűségben a fehér pulpa centrális artétiájával asszociáltan fordulnak elő, a periarteriális hüvelyek (PALS) zónájában. Denz rosthálózat és varikozitások találhatók a periarteriális plexustól távolabb, a parenchymában is. A szimpatikus idegrostok a T-sejtes area, makrofágok és a B-sejt gazdag marginális régióban található sejtek között futnak és a marginális szinuszok (itt lépnek be a limfociták a lépbe) noradrenerg innervációja is jelentős 68,90. A lokális innerváció immunmoduláns hatására utal, hogy a lép műtéti denervációja patkányok esetén gátolja az IL-1β és az IL-6 mrns, illetve protein expresszióját mind a Trypanosoma brucei által fertőzött, mind pedig intakt állatok peritoneális makrofágjaiban

15 2.3. A fehér és barna zsírszövet autonóm beidegzése Az emlős szervezetben a glikogén szolgál gyorsan mobilizálható, de mennyiségét tekintve nagyon korlátozott energiaforrásként. Az energiatárolás elsődleges helye a fehér zsírszövet (WAT), ahol a táplálékból felvett energia lipidek, elsősorban triacilglicerol formájában raktározódik 92. A zsírzsövetben tárolt energia mobilizálásának folyamataiban az autonóm idegrendszer szerepe kiemelkedően fontos. A barna zsírszövet (BAT) fontos szerepet játszik a hideghatás-indukálta hőtermelés folyamataiban, valamint a túlzott mennyiségben bevitt táplálék energiatartalmának gyors felszabadításában. Ezekben a folyamatokban az autonóm beidegzés bizonyítottan részt vesz A fehér zsírszövet (WAT) innervációja: Régóta ismert, hogy a mellékvese velőállományából felszabaduló katekolaminok, elsősorban az adrenalin szekréciója stimulálja a zsírszövet lipidraktárainak mobilizációját. A központi idegrendszer autonóm magvai által iniciált szimpatikus aktiváció a preganglionális, majd posztganglionális szimpatikus rostokon át a szimpatikus tónus növekedésével stimulálja a mellékvese kromaffin sejtjeit, melyek adrenalint és noradrenalint juttatnak a keringésbe 96,97. Sokáig úgy vélték, hogy nincs direkt beidegzése a WAT zsírsejtjeinek és a zsírszövetben azonosított idegrostokat a vaszkuláris innerváció elemeinek tartották 98,99. Később nyilvánvalóvá vált (éheztetett állatok zsírsejtjeinek vizsgálata során, amik lipidtartalmukat elvesztve zsugorodtak és a beidegző rostok láthatóak lettek), hogy az adipociták és az erek is kapnak szimpatikus innervációt 100,101. A fehér zsírszövetben adrenalin 102, noradrenalin 103,104, CGRP 105 tartalmú rostokat azonosítottak A barna zsírszövet (BAT) innervációja: Elhelyezkedése szerint, a legtöbbet vizsgált barna zsírszövet típus, rágcsálókban könnyű megközelíthetősége miatt az interscapularis barna zsírszövet. Az interscapularis BAT szimpatikus innervációját az intercostalis idegek szállítják, melyek a két különálló interscapularis zsírpárnát szeparáltan idegzik be 106. Fluoreszcens mikroszkópiával gazdag noradrenerg innervációt mutattak ki az erek falának közelében és a zsírsejtek 15

16 között is. 6-hidroxi-dopamin (6-OHDA) al végzett kémiai denerváció hatására a barna zsírszövet noradrenalin tartalma radikálisan lecsökkent 107. A BAT ban található noradrenerg varikozitások száma és a zsírsejtek noradrenerg innervációja hideg vagy meleg környezethez akklimatizált genetikusan sovány, illetve kövér (ob/ob, leptindeficiens) egerekben elsősorban a külső hőmérséklet, nem az elhízottság függvénye 108. A patkány mediasztínális barna zsírszövetében acetilkolin tartalmú paraszimpatikus rostokat is kimutattak szimpatikus, noradrenerg rostokkal együtt A neuroanatómiai pályajelölés (tracing) Az elmúlt 30 évben, a különféle neuroanatómiai pályajelöléses módszerek alkalmazása sok új információval szolgált az idegrendszer szerveződésére és működésére vonatkozólag. A különböző alkalmazott módszerek közös célja az idegsejtek közötti kapcsolatrendszerek felderítése. A korai neuroanatómiai pályajelöléses technikák egyszerű degenerációs módszert használtak: az idegrostok átmetszése vagy terminális mezők roncsolása a proximális rostok pusztulását eredményezi, ami ezüst impregnációs módszerrel kimutatható 110. A modern jelölőanyagok (tracerek) az idegsejtek passzív vagy aktív transzportfolyamatait használják fel. Az axonális transzport mechanizmusok (axoplazmatikus áramlás, motorfehérjék) felhasználása szerint a neuroanatómiai tracerek alapvetően kétféle csoportba sorolhatók: - Retrográd tracerek, melyek terjedése retrográd axonális transzportfolyamatok felhasználásával megy végbe. Ezek alkalmazásakor az adott területre vetülő idegrostok terminálisai (többnyire endocitózissal) a tracert felveszik, majd a sejttestbe szállítják, így a beadás helyére proiciáló idegsejtek lokalizálhatók. Ilyenek a torma peroxidáz (HRP), a cholera toxin beta (CTB) vagy a Fast Blue (FB) - Anterográd tracerek, melyek terjedése anterográd axonális transzportfolyamatok felhasználásával megy végbe. Ebben az esetben a beadás helyén elhelyezkedő idegsejtek dendritjei/sejtteste veszik fel a tracert és a mikrotubuláris rendszer segítségével a nyomjelző anyag a sejt szinaptikus terminálisai felé transzportálódik 111. Ilyen a Phaseolus vulgaris leucoagglutinin 112, a DiI vagy a fluoreszcens dextrán-amin konjugátumok 113. A különféle tracerek kimutatása történhet: (I) hisztokémiai reakcióval, ilyen pl. a HRP, (II) immunhisztokémiával, ilyen a CTB, illetve a Phaseolus lectin vagy (III) 16

17 autofluoreszcencia alapján, ilyenek a Fluorogold, FB, True Blue (TB), Nuclear Yellow (NY), Lucifer Yellow (LY), vagy a fluoreszcens dextrán-amin konjugátumok. A poszt-mortem minták vizsgálatánál a különféle lipidoldékony anterográd nyomjelző anyagok, mint DiI széles körben használtak és fixált szöveteknél is alkalmazhatók 114. A klasszikus neuroanatómiai pályajelöléses módszereket az autonóm idegrendszer perifériás vagy centrális kapcsolatrendszereinek felderítésében számos tanulmány alkalmazta. A periférián a lokális szimpatikus és paraszimpatikus rostok eredetét a különféle szervek esetében retrográd jelölőanyagokkal vizsgálták. Cholera toxin-torma peroxidáz konjugátum hasnyálmirigybe és gyomorfalba injektálását követően retrográd módon jelölődött idegsejteket mutattak ki vagus dorsalis motoros magjában (DMV) patkányok esetén 115,116. A fehér zsírszövetbe vetítő szimpatikus, T13-L3 határláncganglionsejteket FluoroGold inguinális és epididimális WAT-ba történő injektálásával azonosították. A neuroanatómiai kapcsolat meglétét úgy is igazolták, hogy egyidejűleg anterográd DiI jelölőanyagot juttattak a határlánc-ganglionokba, amely a zsírsejtek között futó rostokban kimutatható volt 103. Hasonlóképpen, a centrális autonóm szabályozásban részt vevő magokban - mint a PVN- elhelyezkedő projekciós idegsejteket, melyek agytörzsi és gerincvelői autonóm magokba vetítenek, retrográd tracerekkel térképezték fel 46,47. Problémát okoz, hogy a klasszikus, monoszinaptikus tracerek nem képesek a szinaptikus kapcsolatban lévő funkcionális idegsejt-hálózatok többszintű feltérképezésére, csak monoszinaptikus kapcsolatok kimutatására alkalmasak. A transszinaptikusan terjedő neurotróp vírusok neuroanatómiai tracerként történő felhasználása ezért, számos új információval szolgált az idegsejtek kapcsolatrendszereinek felderítésében. Az alfa-herpeszvírus családba tartozó herpes simplex vírust (HSV) 117, pseudorabies vírust (PRV) 118 és az előbbiekkel nem rokon, de szintén neurotróp veszettség vírust 119 sikeresen használták pályajelölésre. Mindazonáltal, a PRV- tracinget alkalmazó kísérletek vezettek a legtöbb eredményre és váltak a neuroanatómiai vizsgálatok legelterjedtebb gyakorlati eszközévé Neuroanatómiai pályajelölés pseudorabies vírussal A neurotróp pseudorabies vírus természetes gazdaállata a sertés, amelynek főleg fiatal egyedeiben okoz a vírus akut, gyakran fatális megbetegedést (Aujeszky betegség) 120. Emellett, rágcsálókban képes a környéki és központi idegrendszer elemeinek 17

18 fertőzésére, ami alkalmassá teszi pályajelöléses kísérletekre. Mivel emberekben (valószínűleg a primáták szérumában jelenlévő neutralizáló antitestek miatt) 121 a vírus nem okoz megbetegedést, ezért a szükséges biztonsági előírások szigorú betartása mellett biztonságosan alkalmazható A vírus replikációja, transszinaptikus terjedése: A pseudorabies vírus (az alfa-herpeszvírus család többi tagjával együtt) örökítő anyaga lineáris, kétszálú DNS, ami hozzávetőlegesen 80 gént kódol. A virális gének körülbelül 50%-a nem szükséges a vírus replikációjához sejtkultúrákban, viszont fontos szerepet töltenek be a vírus neurotrofizmusában in vivo. A PRV genom a vírus kapszidban helyezkedik el, melyet egy, speciális fehérjék által felépített tegument és egy külső, glikoproteinekből álló burok envelope vesz körül 122. A produktív infekciót megelőzően, a vírus partikulumok a sejtek plazmamembránján lévő speciális receptorokhoz kötődnek. A vírus envelope glikoprotein D-vel a nectin molekulacsalád (vírusreceptor) tagjai lépnek kapcsolatba, amik nagy affinitásbeli variabilitást mutatnak a különböző herpeszvírus törzsek tekintetében 123,124. A vírus adhézióját követi a virális burok (envelope) és a sejt membránjának fúziója, melynek során a nukleokapszid a körülvevő tegumenttel együtt a citoplazmába kerül. A kapszid a perikarion felé migrál, ahol a DNS a tegument fehérjékkel együtt a sejtmagba jut és elkezdődik a replikáció. A litikus ciklus során a virális gének időben szabályozott kaszkád szerint fejeződnek ki, először az immediate-early (IE), majd az early (E) és végül a késői late (L) gének 125. A kellő számú kópia elérése után a vírus DNS kapszidokba csomagolódik, amik kijutnak a magból. Az endoplazmatikus retikulumon áthaladva kerülnek a kapszidok a Golgi apparátusba, ahol kettős membrán burkolat alakul ki körülöttük 122,126. Az érett víruspartikulumok a perikarionban és a dendritekben mindenütt megtalálhatók. A vírus replikációs ciklusa idegsejtekben körülbelül 6 óra 127. Az idegsejtből való kilépéskor a vírus külső membránja fúzionál a plazmamembránnal és a virionok kijutnak az intracelluláris térből. A folyamat összefoglalása a 3. ábrán látható. Elektronmikroszkópos vizsgálatok igazolták, hogy a víruspartikulumok túlnyomó többsége nem kerül ki az extracelluláris térbe, hanem a szinaptikus végződéseken keresztül bejut az afferens idegsejtekbe (retrográd transszinaptikus tejedés) 126. Arra is vannak adatok, hogy a vírus az idegsejtekben kapszidok és envelope fehérjék formájában, és nem mint összeszerelődött, egész virion terjed 128,

19 3. ábra. α-herpeszvírus fertőzés. A. A víruspartikulumok specifikus sejtfelszíni receptorokhoz kötődnek, majd a virális envelope fúzionál a plazmamembránnal, aminek eredményeképp a nukleokapszidok a citoplazmába jutnak. A vírus DNS és a tegument fehérjék bejutnak a sejtmagba, ahol megtörténik a vírusgenom replikációja. A DNS az időközben összeszerelődött kapszidokba csomagolódik. Ezt követően a nukleokapszidok elhagyják a sejtmagot, átjutnak az endoplazmatikus retikulumon és exocitotikus vezikulába csomagolódva kijutnak a sejtből (B). Az eredeti ábra Boldogkői és munkatársai közleményében jelent meg

20 A morfológiailag eltérő típusú, szinaptizáló afferens rostok között nem találtak lényeges eltérést a vírus felvételében, sem a sejttesten, sem a dendriteken végződő terminálisok esetén 126. Itt kell megjegyezni, hogy gazdaállataik idegsejtjeiben az alfaherpeszvírusok elsősorban anterográd módon terjednek és a szinaptikusan kapcsolt posztszinaptikus idegsejteket fertőzik 122. A pseudorabies vírus vad típusú törzsei mint a PRV-Becker- retrográd és anterográd terjedésre is képesek rágcsálókban. Az axonon belüli terjedés sebessége megfelel a kinezin (anterográd) és dinein (retrográd) motorfehérjék sebességének, 1,97 illetve 1,28 μm/s 129,130. Az α-herpeszvírusok terjedésének folyamatait a fertőzött idegsejtben a 4.ábra foglalja össze. 4. ábra. Az α-herpeszvírusok terjedése a fertőzött neuronokban. A replikációt és összeszerelődést követően az érett virionok kijutnak a szinaptikus résbe, ahol megfertőzik a szinaptikusan kapcsolt neuronokat. Az eredeti ábra Boldogkői és munkatársai közleményében jelent meg 122. Az anterográd terjedésért a vírus glikoprotein E és glikoprotein I fehérjéi felelősek 131, melyek közül a glikoprotein E az attenuált (természetes mutáns) Bartha törzs genomjából hiányzik 132. Ezért a vírus szinte kizárólag retrográd módon terjed 133. Ez a tulajdonság, valamint a vad törzseknél alacsonyabb infektivitása tette a Bartha törzset alkalmassá a neuroanatómiai pályajelöléses kísérletekben történő alkalmazására Transszinaptikus pályajelölés: Az első pályajelöléses kísérleteket pseudorabies vírussal Strack és munkatársai végezték a 80-as évek végén, amikor PRV mellékvesébe injektálását követően retrográd virális fertőzést mutattak ki a szimpatikus preganglionális neuronokban a gerincvelőben, valamint agytörzsi és hypothalamikus magokban 134. Kimutatták, hogy a gerincvelői fertőzés ugyanazokban a szelvényekben fordul elő, ahol a monoszinaptikus, 20

21 mellékvesébe injektált FluoroGold jelölődés található és megállapították az agyban megjelenő fertőzött idegsejtek fenotípusát 135. A vírus felvételének, terjedésének feltételeit és körülményeit a különböző pályarendszerkben azóta számos tanulmány vizsgálta. Megállapították, hogy az injektált vírus törzs infektivitása, a beadott volumen, a vírus titere, a terminálisok sűrűsége a beadás helyén befolyásolják a fertőzés sebességét, a fertőződő idegsejtek számát és a kísérleti állatok túlélését 122,136,137. Centrális beadás esetén a vírus diffúziója a beadás helyén csekély, ugyanakkor nemcsak a terminálisok, de a beadás helyén átmenő rostok is fertőződnek, igaz, kisebb arányban 127. A PRV-Bartha retrográd úton terjed a központi idegrendszerben, de nem, vagy csak korlátozottan képes anterográd terjedésre 133. A Bartha törzs alkalmazásával számos perifériás szerv központi idegrendszeri autonóm beidegzését térképezték fel, mint a szubmandibuláris nyálmirigy 138, hasnyálmirigy 139, prosztata 140, vese 141, vastagbél 142, szív 143, fehér zsírszövet 144, barna zsírszövet 93, vagy a lép 145. A vírus perifériás szervbe történő injektálása után a fertőzés az autonóm pályákon transszinaptikusan halad retrográd irányban, ami a vírus burokfehérjék ellen termeltetett antitesttel kimutatható 146. A fertőzés képe nagy hasonlóságot mutat a különféle perifériás célszervek (beadási területek) esetében, aminek eredményeképp az autonóm rendszer általános szerveződési szintjeinek leképezését látjuk a fertőződő magcsoportokban. A kísérleti állatok túlélési idejének növekedésével a beadás helyére proiciáló idegsejtek egyre távolabbi szinaptikus partnerei válnak fertőzötté transszinaptikus úton és az infektált neuronok száma növekszik. A vírus által okozott fertőzés a posztganglionális neuronokban jelenik meg először, amik a beadás helyére vetítenek, majd a gerincvelői illetve agytörzsi preganglionális neuronok (IML, illetve centrális autonóm nucleus, CAN) jelölődnek. Monoszinaptikus retrográd tracerek mellékvesébe és a vírus ganglion stellatumba való együttes injektálásával igazolták, hogy a PRV-Bartha törzs által okozott fertőzés a funkcionális kapcsolatban lévő IML neuronokban jelenik meg és nem szomszédos, de nem a célterületre vetítő idegsejtekben 147. A túlélési idő növelésével a fertőzés eléri az agytörzsi, hypothalamikus pre-autonóm sejteket, valamint hosszú túlélés esetén a kapcsolódó corticalis területeket. A monoszinaptikus tracerekhez képest a transszinaptikus virális pályajelölés számos előnnyel jár. A vírus önerősítő, azaz a replikáció miatt, minden szinaptikus kapcsolaton keresztül megfertőzött idegsejtben megsokszorozódik és így válik képessé 21

22 újabb neuronok fertőzésére, ezáltal könnyen detektálható a pályarendszer minden szintjén. A transszinaptikus terjedés lehetőséget ad az idegi hálózatok többszintű vizsgálatára. A virális pályajelölés alkalmas az idegsejtek közötti szinaptikus kapcsolatok kialakulásának, átrendeződésének tanulmányozására sőt funkcionális plaszticitás vizsgálatokra is. Card és munkatársai sikerrel alkalmazták a virális pályajelölést a centralis autonóm projekciók korai posztnatális kialakulásának vizsgálatában patkányokban 148. A maternális depriváció hatására a fejlődő cortexben és a limbikus rendszerben bekövetkező szinaptikus átrendeződéseket is kimutatták retrográd virális tracinggel 149. A virális pályajelölések során ugyanakkor sok a felmerülő probléma és bizonytalansági tényező. A vírus által okozott citopatogenitás miatt a fertőzött idegsejtek degenerálódnak. A kialakuló centrális gyulladás és a vírusfertőzés okozta neuron elhalás miatt az injektált kísérleti állatok elpusztulhatnak, ami (főleg a vírulensebb vírustörzsek beadása esetén) limitálhatja, hogy hány szinapszis távolságra jut el a vírus a beadás helyétől (túlélés problémája). A fertőzött idegsejtekben a vírus által expresszált virion host shutoff (VHS) protein 122,150,151 működése miatt a neuronok által kifejezett transzmitterek mrns-ei degradálódhatnak. Ezért problémát okozhat a fertőzött neuronok neurokémiai karakterizálása, mivel a vírus strukturális fehérjéi (amiket immunhisztokémiával kimutatva a fertőzött idegsejtek azonosíthatók) a fertőzés relatíve késői szakaszában jelennek meg. Mindezek ellenére, a katekolaminerg sejtek általában jól azonosíthatók tirozin hidroxiláz (TH) 141,152, dopamin-β-hidroxiláz (DBH) 145 és feniletanolamin-n-metiltranszferáz (PNMT) 141 enzimek immunhisztokémiai vagy immunfluoreszcens kimutatásával. Emellett, kolin acetiltranszferáz (ChAT), szomatosztatin, substance P (SP), vazopresszin, oxytocin, vazoaktív intesztinális peptid (VIP), szerotonin, tirotropin rilízing hormon (TRH) kimutatásáról is beszámoltak PRV fertőzött idegsejtekben 141,153,154. A fertőzés kizárólag transszinaptikus retrográd terjedése is sokszor megkérdőjelezhető a PRV-Bartha esetén. A vírus dorsalis prefrontalis cortexbe történő injektálását követően a striatum felé történő anterográd transzneuronális terjedés kis mértékű, de kimutatható

23 Rekombináns második generációs vírus tracerek ripoter fehérjék beépítése: A vírusgenom módosítására és fejlettebb tracer vírusok előállítására többféle megoldás született. Ilyenek a zöld fluoreszcens protein (GFP) vagy LacZ gének beépítése a vírus DNS állományába 122, A vírus replikációja során expresszálódó riporter fehérjék (GFP, vagy LacZ esetén β-galaktozidáz) lehetővé teszik a fertőzött idegsejtek direkt fluoreszcens illetve immunofluoreszcens azonosítását és izogén vírustörzsek koinjektálása során (kettős virális pályajelölés) a különböző törzsek azonosítását. A kettős virális pályajelölés alkalmazása lehetővé teszi annak megállapítását, hogy azonos vagy különböző neuronpopulációk vesznek-e részt két különböző célszerv beidegzésében. Kettős vírusbeadással kimutatták, hogy a menyétben a diaphragmát és rectus abdominis izmot innerváló idegsejtek egy része a nyúltvelői légzőközpontban elkülöníthető populációt alkot (csak egy vírussal fertőződött), de számos neuron kollaterálist küld mindkét izomhoz (mindkét vírussal fertőződött) 159. Két független tanulmány kettős vírusbeadást használva mutatta ki, hogy az agytörzs és a hypothalamus több magcsoportjában olyan (szimpato-motor) idegsejtek találhatók, melyek mind a szomatomotoros, mind az autonóm (viszceromotoros) idegrendszer neuronjaihoz küldenek kollaterálisokat 160,161. A fluoreszcens riporter fehérjék a vírussal fertőzött idegsejtek akut agyszeleten vagy retinális preparátumon történő azonosítását és elektrofiziológiai vizsgálatát is lehetővé teszik 157,162, Rekombináns második generációs vírus tracerek a Dup vírusok: A vírus infektivitása döntő tényező a specifikus terjedés és a túlélési idő szempontjából. A pályajelölés eredményességét tekintve az ideális vírus kis citopatogenitású, lassú, specifikus transzneuronális terjedésre képes (nem fertőz meg szinaptikusan nem kapcsolt idegsejteket) és nem öli meg a kísérleti állatot mielőtt kellő számú (5-7) szinaptikus kapcsolatban lévő idegsejten áthalad. A Dup víruscsalád izogén tagjait (Ba-DupGreen, BDG és Ba-DupRed, BDL) a Bartha törzs rekombináns módosításával állították elő 158. A vírusok terjedési tulajdonságai eltérést mutatnak a PRV-Bartha hoz képest, ami a LacZ (BDL) és GFP (BDG) gén expressziós kazettáknak a virális putative antisense promoter (ASP) régióba történő beépítésének eredménye. Így a BDG vírus által fertőzött sejteket GFP, a 23

24 BDL által fertőzött sejteket β-gal expresszió alapján azonosíthatjuk. Mindkét riporter gén a humán citomegalovírus immediate-early (IE) one promóter irányítása alatt áll. Ezek a rekombináns vírusok az autonóm neuronokat lassabban fertőzik és a fertőzés kevesebb idegsejtet érint mint az eredeti Bartha törzs esetében. A lassabb trasszinaptikus terjedés miatt a Ba-Dup vírusokkal hosszabb túlélési idő valósítható meg, ami magasabb rendű agyterületek transszinaptikus elérését is lehetővé teszi. A citomegalovírus IE promóter által meghajtott GFP és LacZ gének a fertőzött idegsejtekben a fertőzés nagyon korai szakaszában kimutathatók, ami lehetővé teszi azok neurokémiai azonosítását. Így mrns-ek kimutatására is lehetőség nyílik a fertőzött neuronokban, mint például a szerotonin tartalmú neuronokban expresszálódó szerotonin-transzpoter (5-HTT) mrns 158. A ripoter fehérjék az IE expressziós kinetika miatt a fertőzött sejtekben jóval korábban kimutathatók, mint a virális struktúrfehérjék (PRV), melyek a fertőzés későbbi stádiumában jelennek meg (5.ábra). 5.ábra. A BDG vírus génexpressziós kaszkádja. A vírus DNS sejtmagba történő bejutását követően az immediate early (IE) kinetikával kifejeződő IE180 transzaktivátor fehérje azonnal megjelenik a fertőzött sejtekben, más vírusfehérjék jelenlététől függetlenül. Ezt követi a korai (E) gének átíródása (vízszintes fekete nyilak). A késői gének (vízszintes kék nyilak) a vírus strukturális fehérjéit kódolják (L). A BDG esetén a GFP a humán citomegalovírus IE1 promoter kontrollja alatt áll, ami nagyon korai génexpressziót eredményez. A vírus strukturális fehérjéi később jelennek meg a fertőzött sejtekben. A PRV fertőzés késői stádiumában valószínűleg a vírus okozta degradációs folyamatok miatt - a GFP eltűnik a fertőzött sejtekből. Így az újonnan fertőződött sejtek csak GFP-t fejeznek ki, később GFP-t és virális strukturális fehérjéket együtt, majd a fertőzés késői stádiumában csak a vírus strukturális fehérjéi detektálhatók. Rövidítések: UL, unique long region; US, unique short region; IR, internal repeat; TR, terminal repeat; rr1, a ribonukleotid reduktáz gén nagy alegysége; tk; timidin kináz gén; gc, glikoprotein C-t kódoló gén; ep0, early protein 0; gfp, green fluorescent protein; ie180, immediately early 180 gén; ge, glikoprotein E. A nyilak (gének) és gömbök (fehérjék) színkódja: szürke: IE180 gén és fehérje; fekete: korai (E) gének és fehérjék; kék: késői (L) gének és fehérjék. 24

25 A BDG esetén a fertőzés kezdeti stádiumában csak a GFP expresszió detektálható, majd a GFP és PRV fehérjék együttes kifejeződése figyelhető meg. A fertőzés késői stádiumában a GFP eltűnik a fertőzött sejtekből, vagy mennyisége a detekciós küszöb alá esik, így az ilyen sejtek csak a PRV proteineket expresszálják A pseudorabies vírus fertőzés hatására kialakuló gyulladásos folyamatok a központi idegrendszerben Bár a human populáció több mint 90%-a fertőzött valamilyen herpeszvírussal, viszonylag ritkán, főleg immundeficiens egyénekben okoz a herpes simplex virus (HSV) fatális encephalitist és a súlyos akut fertőzések is ritkák 164,165. Ebben minden bizonnyal kiemelt szerepe van az agyi immunkompetens gliális sejtalakoknak mint az asztrocita vagy a mikroglia és a perifériáról beáramló leukocitáknak 166,167. A rágcsálókban illetve a humán ganglion trigeminale-ban és a perifériás ganglionokban a látens herpeszvírus fertőzés során a HSV transzkripcionálisan aktív, de a latenciaasszociált transzkriptumok (LAT) kifejeződése miatt nem okoz litikus fertőzést. Reaktivációkor a vírus expressziós profilja megváltozik, és replikációt követően anterográd terjedéssel a szenzoros neuronok nyúlványain keresztül eléri a bőrfelszínt ahol léziókat okoz, de csak ritkán következik be súlyos cetrális fertőzés 165, Perifériás vagy centrális beadás után, a pseudorabies vírus által okozott fertőzés rágcsálókban akut és döntően retrográd úton terjed. A vírus eléri a központi idegrendszert, ahol a fertőzött idegsejtek száma az idő előrehaladtával nő, ami gyakran a kísérleti állatok pusztulásához vezet. A korai kutatások kimutatták, hogy centrális pseudorabies vírus fertőzés hatására az agyi mikroglia és asztrocita sejtek aktiválódnak rágcsálókban mind virulens, mind attenuált vírus törzsek esetén. A fertőzés kezdeti stádiumában a mikrogliákban az OX42 és az asztrocitákban a GFAP expressziója nő, majd a GFAP immunpozitivitás a fertőzés előrehaladtával fokálisan csökken, míg az OX42 erősödik 172. A fertőzés során ED-1 et expresszáló makrofágok inflitrációja is megfigyelhető, melyek egy része immunpozitív a vírus antigénekre 172. Elektronmikroszkópos vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a degenerálódó fertőzött neuronokból kiszabaduló vírus extraszinaptikus terjedését az asztociták és a mikroglia sejtek korlátozzák. A gliális elemek fertőződhetnek a vírussal, de infektív virionok nem szabadulnak fel ezekből (nonpermisszív infekció)