Nanoszerkezetek és biomarkerek a gyógyítás szolgálatában

Átírás

1 Nanoszerkezetek és biomarkerek a gyógyítás szolgálatában Dékány Imre MTA r.tagja MTA SZTE Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok Kutatócsoport SZTE AK rvosi Vegytani Intézet Szeged, Dóm tér 8.

2 Tartalmi összefoglaló - SPR 2D technológia alkalmazása az adszorpció kvantitativ mérésére: aminosavak és proteinek - Hatóanyagok és toxikius molekulák megkötése funkcioanlizált Au felületeken - Au nanorészecskék lipid membránokban - Au plazmonikus csatolás biomolekulákkal - Hatóanyagok nanokapszulázása

3 Normalized absorbance Au és Ag nanorészecskék optikai tulajdonságai Surface plasmon resonance (SPR) These phenomena occur when electromagnetic field interacts with conduction band electrons and induces the coherent oscillation of electrons. E H 1 transverse oscillation (TSP) longitudinal oscillation (LSP) Ag TSP : λ max1 = nm ~ 1/r Au TSP : λ max1 = nm ~ 1/r Wavelength (nm) Plasmon bands of spherical gold and silver nanoparticles 3

4 Az SPR mérés kísérleti elrendezése The prism coupling (Kretschmannconfiguration) in SPR technique Schematic representation of Kretschmann-configuration

5 Specific adsorbed amount (nmol/cm 2 ) Specific adsorbed amount (nmol/cm 2 ) SPR mérések és adszorpciós izotermák 0,8 0,8 0,7 0,7 0,6 0,6 0,5 Dopamine (b) 0,5 Dopamine (b) 0,4 0,4 0,3 0,2 0,1 Ibuprofen (a) 0,3 0,2 0,1 0 Ibuprofen (a) c (mm) t (min) The plasmonic curves of adsorption of (a) ibuprofen and (b) dopamine on gold surface at different concentrations (0.5, 1, 2, 4, 6, 10 mmol/dm 3 aqueous solutions) The adsorption isotherm of (a) ibuprofen and (b) dopamine from aqueous solution on gold surface

6 Adszorpció és felületi orientáció

7 Specific adsorbed amount (nmol/cm 2 ) 1,2 SPR mérések: Au-cisztein- ibuprofen rendszer 1 0,8 0,6 Gold 0,4 0,2 0.5 mm 1mM 2mM 4mM 6mM 10mM Ibuprofen L-cysteine mM t (min) The plasmonic curves of adsorption of ibuprofen on L-cysteine functionalized gold surface from aqueous solutions ( at 0.5, 1, 2, 4, 6, 10 mmol/dm 3 concentrations )

8 Table 1. The monolayer adsorption capacities (G mono ) and molecular cross section areas (a) on gold surface for different bioconjugated systems as obtained from adsorption isotherms Molecules on gold surface Monolayer capacity, Γ m. /nmol cm 2 Eq. (5) Cross sectional area, a m. /nm 2 Eq. (6) a m /a m,calc Calculated cross sectional area * a m,calc /nm 2 Surface orientation L-Cysteine parallel L-Glutathion parallel Ibuprofen parallel Dopamine perpendicular Molecules on functionali sed gold surface Adsorptio ncapacity, Γ m. /nmol cm 2 Eq. (5) Cross sectional area, a m. /nm 2 Eq. (6) a m /a m,calc Calculated cross section area, *a m,calc /nm 2 Surface orientation L-Cyst- Ibuprofen L-Glut- Ibuprofen L-Cyst- Dopamine L-Glut- Dopamine parallel parallel perpendicular perpendicular

9 Arany nanoszenzorok aflatoxinok kimutatására

10 A, - UV-Vis plazmonikus spektrumok Aminodextran reduced AuNPs NaBH4 reduced AuSHbCD nanodispersion 1.00 Dl= 20 nm l, nm The changes of plasmon bands of aminoldextran reduced gold nanodispersion and AuSHbCD gold nanodispersions(164 mg/ml; 0.5 mm Au) registered by UV-Vis spectroscopy.

11 A, - A, - UV-Vis mérések B 1 -aflatoxin CH 3 Hydrophobic S-H group substituted g-cyclodextrin Attachment of Aflatoxin B1 molecules to cyclodextrin modified gold surface and b- cyclodextrin on gold crystal surface (111) AuSHb CD naodispersion l max = 539 nm ng/ml AfB l, nm The changes of plasmon bands of AuSHbCD gold nanodispersions (164 mg/ml; 0.5 mm Au) added AfB1 (in concentration range 3-33 ng/ml AfB1 and ng/ml AfB2) to the solution are also registered by UV-Vis spectroscopy in dilute acetonitril solution AuSHbCD naodispersion l max = 539 nm l, nm nm ng/ml AfB

12 Adsorbed amount Specific adsorbed amount (ng/cm 2 ) Wavelength Adsorption Desorption SPR mérések AfB1 molekulával n S t(otal adsorbed amount) = n S phys + n S chem Reversible Weak physical interactions 6 Irreversible Strong physical or chemical interactions 5 4 Adsorption Desorption Time 3 AfB1: 0.4 ng/cm 2 ( ng/ml) 2 1) Aflatoxin B1 (AfB1) molecules 1 H 3 C H 3 C H 3 C Au layer (50 nm) Glass surface Time (min) Fig. 7. Results of SPR measurements: AfB1 solution ( ng/ml) to gold surface.

13 Specific adsorbed amount (ng/cm 2 ) 2) SH modified bcd (bcd-sh) molecules 200 Adsorbed amount (ng/cm 2) Au layer (50 nm) Glass surface c SHbCD, mg/ml 5 4 SH-b -CD: 169 ng/cm 2 (0.5-3 mg/ml) 3) AfB1 to bcd-sh covered surface Time (min) Au layer (50 nm) Glass surface Fig. 8. Results of SPR measurements: bcd-sh (0.5-3 mg/ml) to gold surface.

14 Adsorbed amount (ng/cm 2 ) Specific adsorbed amount (ng/cm 2 ) 4) 5) AfB1 molecules attach to bcdsholes of AuNPs with bcd-sh (bcdaunps) bcdaunps AuNP Au layer (50 nm) Glass surface H 3C Au nanodispersion: 87 ng/cm 2 AuNP Au layer (50 nm) H 3C Glass surface 60 H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C c Au (ng/cm 2 ) 20 0 AuSHb CD: 0-10 ng/cm Time (min) Results of SPR measurements: AuSHbCD gold nanodispersions (0-10 ng/ml Au).

15 Specific adsorbed amount (ng/cm 2 ) AfB1 molecules attach to bcdsholes of bcdaunps H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C H 3C Adsorbed amount (ng/cm 2 ) ) 5) AuNP H 3C H 3C H 3C H 3C Au layer (50 nm) Glass surface AuSHb CD: 35 ng/cm 2 10 (3.28 mg/ml) 20 AfB1: 16.3 ng/cm 2 (1-60 pg/ml) Time (min) c AfB1 (ng/cm 3 ) Fig. 11. Results of SPR measurements: in first step Au nanodisperson and after added AfB1 (in concentration range 0-32 ng/ml AfB1) in dilute acetonitril solution.

16 Biomarker Nanorészecske Antitest-2 Antigén-1 Antitest-1 Membránfehérje Foszfolipid kettősréteg

17 Az animáció kattintásra indul.

18 12 10 Blokkoló oldat Biotinált foldamer Ab oligomer oldatok nm Ab oligomer 1 mm Dl, nm Dl, nm Streptavidin t, min t, min Közeg: PBS puffer oldat Áramlási sebesség: 20 ml/perc 500 ml folyadéktérfogatok kerültek beadagolásra 1. Lépés: Streptavidin 10 mm 2. Lépés: BSA 1% oldata 3. Lépés: Biotinált foldamer 20 mm oldata 4. Lépés: Ab oligomer 100 nm 5. Lépés: Ab oligomer 1 mm

19 A plazmonikus csatolás lehetőségei Schematic figures of the prepared AuNP samples (a) AuNP(Trp), (b) AuNP(CysTrp), (c) AuNP(Lys) and (d) the plasmonic coupling effect

20 Fluoreszcencia spekrtumok Au-lizozim rendszereken

21 HRTEM images of the (a) AuNP(CysTrp) and (b) AuNP(Lys) samples with the ratio of m Lys /m Au = 5

22 XRD mérések (A) XRD pattern of (a) bulk gold, (b) AuNP(cit), (c) AuNP(Lys) and (d) AuNP(Cys) samples (B) The SAXS curve of (a) AuNP(Lys) sample (c Lys =1 mg/ml) and the calculated SAXS curve (GNM fit)

23 SAXS mérések (A) The SAXS curve of the AuNP(Lys) nanoparticles in Kratky representation (B) calculated pair distance distribution function of the AuNP(Lys) samples m Lys /m Au = 5 (C) the SAXS curves of Porod representation m Au /m Lys = 1:5 (a), 1:15 (b), 1:20 (c)

24 Langmuir monoréteg vizsgálatok DPPC (mn/m) asolectin Kibron MicroTroughS A (mm 2 ) Surface pressure area isotherms of the model membrane materials: DPPC and asolectin DPPC: dipalmytoil-phosphatidylcholine pure phospholipid asolectin: mixture of phospholipids and fatty acids

25 Au nanorészecskék beépülése a lipid membránba 1. Preparation of phospholipid monolayer at liquid/air interface

26 Schematic representation of the nanoparticles penetration into lipid membrane 1. Preparation of phospholipid monolayer at liquid/air interface 2. Compression 3. Penetration of functionalized nanoparticles into membrane

27 A monomolekulás réteg átvitele szilárd felületre Langmuir-Blodgett method Solid supported monolayer membrane with Au NPs incorporated

28 Au- cisztein beépülése monoréteges membránba Au-cys NPs H 2 N C CH H 2 C - S S S CH2 H 2 N CH C - D, mn/m Asolectin DPPC (mn/m) Δπ time (s) Change in the surface pressure of the monolayer during the incorporation , mn/m Surface pressure increase (Δπ) as a function of the initial surface pressure (π 0 ) due to the nanoparticle incorporation

29 Au - glutation beépülése a monoréteges memránba NH 2 H 2 H H 2 H CH C N C C H C CH2 C CH NH C H 2 C S 4 Au-gsh NPs H 2 H C H C C CH N CH CH2 NH C NH 2 S H 2 C S S C C H H 2 D, mn/m 3 2 DPPC Asolectin (mn/m) Δπ time (s) Change in the surface pressure of the monolayer during the incorporation , mn/m Surface pressure increase (Δπ) as a function of the initial surface pressure (π 0 ) due to the nanoparticle incorporation

30 Biofunkcionalizált Au NR beépülése a DPPC membránba Penetration of the biofunctionalized Au NPs into the different model membranes at different compactnesses ( eg. initial surface pressures) D, mn/m 5 Au-cys Rod AR Au-gsh 10 nm Au-cys 15 nm Au-gsh 15 nm Au-cys 10 nm increase in surface pressure means the penetration of the particles into the membrane composition and initial surface pressure have marked influence on the penetrated amount , mn/m

31 Biofunkcionalizált Au NR és a phospholipid monoréteg DPPC Air Aqueous subphase ph P - P - P - P - P N + N + N + N + N + Au nanoparticles CH C H 2 N H 2 C S S Au - CH C H 2 N H 2 C S S Au - and DPPC zwitterionic form S CH2 CH C H 2 N - S CH2 CH C H 2 N -

32 TEM image of the 10 nm spherical Au NPs anduv-vis absorbance spectra of different sized, bioconjugated Au NPs.

33 TEM image of the Au nanorods, UV-Vis absorbance spectra of the aqueous dispersions of the Au NRs.

34 Maximum insertion pressure (MIP) and synergy values obtained for the different sized, shaped, surface functionalized nanoparticles with DPPC membrane.

35 Zn-Au plazmonikus csatolás

36 Au és Zn nanohibrid filmek Schematic representation of the sample Schematic representation of the sample Zn (d=3 nm) Langmuir-Blodgett layer stearic acid (SA) Langmuir-Blodgett layers Au nanoparticles d=10 nm spray coating technique quartz Zn (d=3 nm) Langmuir-Blodgett layer stearic acid (SA) Langmuir-Blodgett layers Au film - 47 nm thickness SPR substrate glass layer numbers: 0, 1, 2 spacer layers between Au and Zn layer numbers: 0, 1, 2, 3, 4, 6

37 integrated intensity (a.u.) PL intensity (a.u.) PL intensity (a.u.) Au-Zn nanoszerkezetek fotolumineszcenciája Au NPs based samples Visible emission 100 exc.: 350 nm Zn Au/Zn 80 Au/SA1/Zn Au/SA2/Zn UV emission Zn Au/Zn Au/SA1/Zn Au/SA2/Zn wavelength (nm) 10 0 exc.: 350 nm wavelength (nm) l max (nm) wavelength Zn on quartz distance (nm) Zn on quartz intensity distance (nm)

38 Mag-héj kompozitok Gyógyszermolekula Negatív töltésű polimer Mag Pozitív töltésű polimer Hatóanyag leadás

39 Absorbance BSA maggal előállított mag-héj kompozitok Amid I ( C=) Amid II ( CN, NH) BSA/IBU/PSS/Chit Random coil Random coil BSA/IBU/PSS b sheet 1642 cm cm cm cm -1 BSA/IBU Random coil b sheet BSA b sheet Wavenumber (cm -1 ) -helix BSA/IBU/PSS/Chit TEM képe BSA, BSA/IBU, BSA/IBU/PSS valamint a BSA/IBU/PSS/Chit infravörös spektruma, valamint a másodlagos szerkezet változása az amid I sáv eltolódása alapján BSA/IBU/PSS/Chit fénymikroszkópos képe

40 Hatóanyag leadás vizsgálata IBUPRFEN meghatározása: BSA mag jelenlétében: 264 nm, 272 nm Szilika mag jelenlétében: 222 nm, 264 nm, 272 nm Mérés: Foszfát pufferben (PBS, ph=7,4) HANSN cellavertikális diffúzió cella Két kamrából áll: donor and receiving (fogadó) chambers Membrán :Dialysis tubing cellulose membrane Cella térfogata: 4ml, de a pontos térfogatot meg kell határozni Keverés sebességet állandó értéken kell tartani a mérés során.

41 Release % t (min) Elsőrendű Sebességi Modell a kioldódás mechanizmusára BSA/IBU BSA/IBU/PSS BSA/IBU/PSS/Chit First-order Rate Model R 2 =0,9097 k d =0,0051s First-order Rate Model R 2 =0,9823 k d =0,0016s -1 First-order Rate Model R 2 =0,9822 k d =0,0017s

42 Mezopórusos szilika maggal előállított mag-héj kompozitok 1547 cm cm cm cm cm cm cm -1 Abszorbancia C= N-H CH 2 as S 3 - s S 3 - as Si- C-C (benzol vázrezgése) SIL/IBU/PEI/PSS Si--Si 437 cm cm cm cm -1 SIL/IBU/PEI SIL/IBU 1051 cm -1 s Si-H as Si- SIL SIL/IBU/PEI TEM képe Hullámszám (cm -1 ) A szilika, valamint a mag-héj kompozitok infravörös spektruma A szilanol csoportok, valamint az ibuprofen karboxil csoportjai közt létrejött H- kötések a szilika pórusaiban

43 Release rate % Elsőrendű Sebességi Modell a kioldódás mechanizmusára SIL/IBU SIL/IBU/PEI SIL/IBU/PEI/PSS First-order Rate Model R 2 =0,9846 k d =0,0024s First-order Rate Model R 2 =0,9854 k d =0,001s -1 First-order Rate Model R 2 =0,9902 k d =0,0014s t (min)

44 Hollow spheres előállítása biokompatibilis poliszacharidokból kitozán, alginát - biokompatibilis, biodegradábilis, -alkalmazhatóságát széleskörűen vizsgálják hatóanyagok és vakcinák szállítására nyálkahártyán keresztül CaC 3 -nem toxikus, -mérete és morfológiája szabályozható, -könnyen eltávolítható, CMC -összekapcsolódik a Ca + ionokkal, ezáltal szabályozza a képződő CaC 3 részecskék méretét, -úgy viselkedik mint egy ragasztó, összefogja a nanorészecskéket egymással és gömb alakú mikrorészecskéket formál. (a) Kitozán, (b) Na-alginát és (c) karboximetil-cellulóz (CMC) szerkezeti képlete

45 Kitozán alginát hollow spheres előállítása CaC 3 (CMC) templát + kitozán NaCl közeg, ph=5 + alginát NaCl közeg, ph=5 + n (kitozán, alginát) + EDTA +Glutáraldehid

46 CaC 3 (CMC) + n 0.05% kitozán (0.5M NaCl, ph=5) 0.1% alginát(0.5m NaCl, ph=5) CaC 3 (CMC) templát (Fénymikroszkópos felvétel) CaC 3 (CMC)-(chit-alg) 3 (TEM felvétel) CaC 3 (CMC )-(chit-alg) 3

47 + Rhodamin B + 1% Glutáraldehid + 0.2M EDTA CaC 3 (CMC)/(Chit-Alg) 3 Rhodamin B fénymikroszkópos felvétele (chit-alg) 3 hollow spheres fénymikroszkópos felvétele

48

49

50 Munkatársak MTA-SZTE Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok Kutatócsoport Juhászné Dr. Csapó Edit Dr. Majzik Andrea Juhász Ádám Dr. Benkő Mária Garabné Ábrahám Nóra Varga Viktória Dr. Janovák László Tallóssy Szabolcs Szalmáné Ménesi Judit Veres Ágnes Dr. Sebők Dániel Varga Noémi

51

52

53