A humán multidrog transzporter MDR1 klinikai és biokémiai vizsgálata

Átírás

1 A humán multidrog transzporter MDR1 klinikai és biokémiai vizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés Dr. Szakács Gergely Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Pathobiokémia Program Témavezető: Dr. Sarkadi Balázs Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet Budapest, 2000

2 Irgalom, édesanyám, mama, nézd, jaj kész ez a vers is! J.A. 2

3 ÖSSZEFOGLALÁS Összefoglalás A humán multidrog transzporter MDR1 klinikai és biokémiai vizsgálata Szakács Gergely Témavezető: Sarkadi Balázs Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet Budapest, 2000 I. A citosztatikus terápia a daganatos sejtek kialakuló rezisztenciája miatt sok esetben nem bizonyul hatékonynak. A kemoterápia kudarcáért többnyire az ABC (ATP Binding Cassette) fehérjék közé tartozó humán multidrog transzporter MDR1 működése tehető felelőssé. Az MDR1 az ATP energiáját felhasználó aktív transzporter, amely megakadályozza a citosztatikus vegyületek sejten belüli felhalmozódását. Kísérleteink első részében vad-típusú és mutáns MDR1 variánsok ATPáz aktivitását tanulmányoztuk. A fehérjéket Sf9 rovarsejtekben termeltettük, aktivitásukat a 8-azido ATP és foszfát-analóg anionok jelenlétében képződő intermedier komplexek vizsgálatával jellemeztük. Kimutattuk, hogy a nukleotid-kötő doménban lévő Walker A (K433M, K1076M) és az ABC-signature (G534V, G534D, G1179D) aminosavak mutációja ellenére az MDR1 eljut az első ATP hidrolízisét jelentő komplexek formálásáig. Mindkét nukleotid kötő domént érintő kettős mutáció a fehérje teljes inaktivációját eredményezte. Az unilaterális mutációk által előidézett térszerkezeti változás mindkét nukleotid-kötő domén működését érintette. A katalitikus aktivitás további vizsgálata kiderítette, hogy az ABC-signature mutánsok parciális reakcióját a drogok gátolták. Eredményeink alapján az MDR1 katalitikus ciklusában a két nukleotidkötő régió rendkívül szoros kooperációban, gyakorlatilag egységes katalitikus szerkezetként működik, melyben a signature-aminosavak közvetlen befolyással bírnak az ATP elhasítására és a drog-indukálta intramolekuláris szignál továbbítására. II. A cisztikus fibrózis kialakulásában szerepet játszó CFTR szintén az ABC fehérjék családjába tartozik, működését a foszforiláció mellett az ATP szabályozza. Kimutattuk, hogy a CFTR katalitikus ciklusában az MDR1-ben detektálthoz hasonló intermedier komplex formálódik. Összhangban a CFTR alacsonyabb katalitikus aktivitásával, az intermedier komplex stabilizáló foszfát analógok nélkül is detektálható volt. A nukleotid-kötő domének szelektív vizsgálata bebizonyította, hogy a CFTR katalitikus egységei különböző funkciót láthatnak el. III. Az ABC fehérjék biokémiai jellemzése mellett tanulmányoztuk az MDR transzporterek klinikai szerepét haematológiai betegségekben. A három évig tartó vizsgálatban 93 de novo akut leukémiás mintát analizáltunk. Célunk az volt, hogy a laboratóriumban rutinszerűen alkalmazott módszert, az MDR1 aktivitását mérő Calceinpróbát klinikai diagnosztikai eljárássá fejlesszük. Eredményeink azt bizonyítják, hogy a Calcein-próba alkalmas rutin klinikai laboratóriumi módszer a haematológiai proliferatív kórképek kezeléssel szembeni rezisztenciájának meghatározására, a hosszú távú túlélés esélyének jóslására és a multidrog rezisztenciához társuló MRP1 aktivitásának szelektív vizsgálatára.

4 SUMMARY Summary Clinical and biochemical characterization of the human multidrug transporter MDR1 Gergely Szakács Supervisor: Balázs Sarkadi National Institute of Heamatology and Immunology Budapest, 2000 I. The expression of the multidrug resistance (MDR1 or P-glycoprotein) protein confers resistance by maintaining the level of a wide range of currently used antineoplastic drugs below a cell-killing threshold in the tumor cells. Drug transport by MDR1 is coupled to substrate-stimulated ATP hydrolysis. In the presence of ATP, a divalent cation and a transition state analogue, a nucleotide is trapped in the molecule, reflecting a drug-stimulated partial reaction of the ATP-hydrolytic cycle. We have investigated the impaired catalytic activity of ATPase-negative MDR1 variants carrying mutations in the conserved Walker A (K433M and K1076M) or in the ABC-signature (G534V, G534D, G1179D) motifs. The mutant proteins were expressed in Sf9 insect cells, and the catalytic activity was followed in experiments using 8-azido ATP as an energy donor substrate and various transition state analogues as trapping agents. MgATP-binding was preserved in each mutant and nucleotide trapping was absent when mutations were introduced into both NBDs (G534D/G1179D, G534D/K1076M and K433M/K1076M). However, all of the single mutations studied allowed nucleotide trapping when fluoro-aluminate or beryllium fluoride was used as complex-stabilizing anions. Drug stimulation of the trapping reactions was observed in the wild type and in the Walker A mutants. In contrast, substrate drugs inhibited nucleotide trapping in the ABC-signature mutants, suggesting a key role for the glycine residues in the interdomain communication regulating drug-induced ATP hydrolysis. Limited trypsin digestion of the mutant MDR1 proteins revealed that whenever a trapping reaction occurred, both ABC domains were involved in the formation of the catalytic intermediates. Our results indicate that the conformational alteration caused a mutation in one ABC domain is propagated to the other, non-mutated domain, suggesting that two ABC domains function as a tightly coupled catalytic system. II. The function of the human CFTR protein as a chloride channel or transport-regulator involves cellular ATP binding and cleavage. The human CFTR expressed in insect (Sf9) cell membranes shows specific, Mg2 + -dependent nucleotide occlusion. By using limited tryptic digestion of the labelled CFTR protein we found that the adenine nucleotide occlusion preferentially occurred in the N-terminal nucleotide-binding domain (NBD). Addition of the ATPase inhibitor vanadate produced an increased nucleotide occlusion and resulted in the labeling of both the N-terminal and C-terminal NBDs. The pattern of nucleotide occlusion indicates significant differences in the ATP hydrolysing activities of the two NBDs, which may explain their different roles in the CFTR channel regulation. III. We evaluated the suitability of the Calcein assay, a fluorescence method for detecting MDR1 activity, as a routine clinical laboratory method for the identification of multidrug resistant phenotype in acute leukaemia. Assays were performed on blast cells of 93 de novo acute leukaemia patients. We show that MDR activity as determined by the Calcein assay is predictive for the response to chemotherapy. We also show that the Calcein assay can be applied to discriminate between MDR1 and Multidrug resistanceassociated protein (MRP1) function.

5 TARTALOMJEGYZÉK Tartalomjegyzék ÖSSZEFOGLALÁS...3 SUMMARY...4 TARTALOMJEGYZÉK A DOLGOZATBAN ELŐFORDULÓ RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE BEVEZETÉS ABC FEHÉRJÉK MULTIDROG REZISZTENCIA (MDR) A multidrog rezisztencia fogalma Az MDR1 szerkezete és működése Az MDR katalitikus ciklusa Intramolekuláris kölcsönhatások Az MDR1 fiziológiai szerepe A klinikai MDR vizsgálati módszerei CÉLKITŰZÉSEK ESZKÖZÖK ÉS MÓDSZEREK EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK KATALITIKUS INTERMEDIEREK VIZSGÁLATA A nukleotid domének katalitikus kooperációja (Walker A mutánsok vizsgálata) A CFTR katalitikus ciklusának vizsgálata Intramolekuláris kommunikáció (ABC-signature mutánsok vizsgálata) A NUKLEOTID-KÖTŐ DOMÉNEK DIMERIZÁCIÓJA KLINIKAI MDR VIZSGÁLATA MALIGNUS HAEMATOLÓGIAI MEGBETEGEDÉSEKBEN EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA IRODALOMJEGYZÉK A DOLGOZAT ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE EGYÉB SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS CSATOLT KÖZLEMÉNYEK...57

6 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 1. A dolgozatban előforduló rövidítések jegyzéke ABC ATP-kötő egység (ATP Binding Cassette) AlF x fluoro-aluminát BeF x berillium fluorid Calcein-AM calcein acetoxi-metilészter CFTR cisztikus fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor CSA ciklosporin A DMSO dimetil-szulfoxid ec extracelluláris FCS borjúszérum (Fetal Calf Serum) FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer FSC-SSC Forward scatter-side scatter h hidrofób aminosav ic intracelluláris MAF Multidrog rezisztencia Aktivitás Faktor MDR1 multidrog rezisztencia fehérje 1 (P-glikoprotein) MRP1 multidrog rezisztenciához társuló fehérje 1 (multidrug resistance-associated protein 1) NEM N-etilmaleimid NBD nukleotid-kötő domén (nucleotide binding domain) PDB Protein Data Bank PBS Phosphate Buffered Saline PVDF polivinilidén-difluorid SDS-PAGE SDS-poliakrilamid gélelektroforézis Sf9 sejt Spodoptera frugiperda ovárium sejt SUR szulfonurea receptor TAP Transporter Associated with antigen Processing TMD transzmembrán domén X bármilyen aminosav 6

7 BEVEZETÉS 2. Bevezetés 2.1. ABC fehérjék Az ABC (ATP Binding Cassette) fehérjék alkotják a ma ismert egyik legnépesebb fehérjecsaládot. A család méretére jellemző adat, hogy az Escherichia Coli genomjának mintegy 5%-a ABC fehérjét kódol 1. A legtöbb ABC fehérje aktív transzportot végez, bár az összes családtagban kötelezően előforduló ABC egység alkalmas más folyamatok energetizálására is. Nem meglepő tehát, hogy az ABC fehérjék, melyek minden eddig ismert organizmusban megtalálhatók 2, a legkülönfélébb fiziológiai funkciókat elláthatják: szerepük van a sejtek tápanyag felvételében, a mérgező vegyületekkel szembeni védekezésben, vegyületek kiválasztásában, a DNS repair funkcióban, jelátadásban, stb. A dolgozat írásakor (a humán genom csaknem teljes ismeretének birtokában) 47 humán ABC fehérje ismert, melynek mintegy felét az elmúlt két évben azonosították 3. Az ABC-fehérjék szerepét különböző kórképek pathomechanizmusában az I. Táblázat foglalja össze. I. Táblázat: ABC-fehérjék szerepe különböző kórképek pathomechanizmusában Név Feltételezett funkció Orvosi Jelentőség ABCA1 (ABC1) koleszterin transzport Tangier-kór (lipidmetabolizmus?) ABCA4 (ABCR) retinoid transzport (?) Örökletes makuláris disztrófiák (Stargardt) P-gp/MDR1 hidrofób vegyületek Multidrog Rezisztencia transzportja TAP1+TAP2 antigén prezentáció (MHCI) Immunodeficiencia MDR3 foszfatidil-kolin transzport Progresszív Familiáris Intrahepatikus Kolesztázis (PFIC3) Sister P-gp, BSEP epesav transzport Progresszív Familiáris Intrahepatikus Kolesztázis (PFIC2) ABCB7 Mitokondriális transzporter X kromoszómához kötött sziderblasztos anémia MRP1 hidrofób vegyületek, Multidrog Rezisztencia glutation-konjugátumok transzportja MRP2 Multispecifikus organikus anion transzporter Dubin-Johnson Szindróma, Multidrog Rezisztencia MRP6 Ismeretlen Pseudoxanthoma Elasticum CFTR klorid csatorna (regulátor) Cisztikus Fibrózis SUR1 sulfonylurea receptor (inzulin szekréció) Gyermekkori familiáris hiperinzulinémiás hipoglikémia ALD Ismeretlen Adrenoleukodisztrófia BCRP hidrofób vegyületek transzportja (?) Multidrog Rezisztencia

8 BEVEZETÉS Amint az I. Táblázatban feltüntetett kórképek mutatják, az ABC fehérjék az emberi szervezetben többnyire transzporter funkciót látnak el. Kivételnek tekinthető a cisztikus fibrózis kialakulásában szerepet játszó CFTR, mely - a jelenlegi elképzelés szerint 4 - kloridcsatornaként működik, vagy a SUR1, amely egy ATP-szenzitív K + -csatornát szabályozó fehérje. Az ABC fehérjék szerkezete Valamennyi eddig ismert humán ABC fehérjére jellemző, hogy membránhoz asszociálódik és működése során ATP-t hasít. E két tulajdonság szerkezeti alapjául a membránba ágyazódó transzmembrán domén (TMD) ill. az ATP megkötéséért felelős nukleotid-kötő régió (Nucleotide Binding Domain, NBD) szolgál. A transzmembrán domének tipikusan hat, membránt átívelő hélixből állnak. Az ABC fehérjéket összehasonlítva feltűnő a citoplazmatikus nukleotid-kötő egységek három, az evolúció során megőrzött szekvenciája: a Walker A és B régiók, valamint az ún. ABC-signature szekvencia. A Walker A (GXXGXGKS/T) és B (hhhhd) konszenzus szekvenciák más ATP-t kötő fehérjékben is előfordulnak, míg a signature-szekvencia (LSGGQQ/R/KQR) az ABC fehérjék sajátja. A humán ABC fehérjék funkcionális egysége a transzmembrán domén és a nukleotidkötő domének tandem duplikációjából áll (1. ábra), melyet kódolhat egy (pl. MDR1), vagy több (TAP1-2) polipeptid lánc. Ez az alapszerkezet egyes esetekben kiegészülhet: a CFTR a két TMD és ABC egységen túl egy regulátoros (R) domént, az MRP1 pedig egy jellegzetes, N-terminálison található transzmembrán domént (TMD 0 ), valamint egy citoplazmikus linker (L 0 ) régiót tartalmaz (részletesen lásd egyéb saját közlemények/1,3). Ismert, hogy a transzmembrán és a nukleotid-kötő domének sorrendje felcserélődhet (BCRP). A közös szerkezeti séma alapján feltételezhető, hogy az ABC fehérjék hasonló mechanizmussal működnek. Bizonyítottnak tekinthető, hogy az ATP hidrolízise a nukleotid-kötő doménekben történik, nem ismert viszont, hogy a felszabaduló energia hogyan kapcsolódik a fehérje működéséhez. Szerkezeti adatok hiányában az ABC fehérjékről alkotott modellek nagyrészt biokémiai és genetikai kísérleteken alapulnak. Az egyik legtöbbet tanulmányozott modell-fehérje a daganatos sejtek rezisztenciáját biztosító MDR1 transzporter. 8

9 BEVEZETÉS 1.ábra: Az ABC fehérjék szerkezeti elemei és variánsai 2.2. Multidrog rezisztencia (MDR) A multidrog rezisztencia fogalma A daganatos megbetegedések korszerű gyógyítása a sebészi beavatkozás és a sugárterápia mellett gyógyszeres kezelésen alapul. Általános tapasztalat szerint a citosztatikus terápia a daganatos sejtek kialakuló rezisztenciája miatt sok esetben nem bizonyul hatékonynak. Az elfajult sejtek túlélését számos biokémiai mechanizmus biztosítja (drogok intracelluláris metabolizmusát befolyásoló enzimek aktivációja, a DNS károsodását helyreállító repair-funkció, stb.), a kemoterápia kudarcáért azonban a legtöbb esetben a multidrog rezisztencia kialakulása tehető felelőssé. A multidrog rezisztens daganatsejtek keresztrezisztenciát mutatnak a szerkezetükben és hatásmechanizmusukban is igen különböző citotoxikus szerekkel szemben. A jelenség in vitro modellezhető: szenzitív sejteket emelkedő citosztatikus koncentrációban tenyésztve olyan populáció szelektálódik, mely rezisztens a szelektáló ágenssel, valamint több, a klinikumban alkalmazott vegyülettel szemben. Ismereteink szerint legalább három ABC transzporter áll a multidrog rezisztencia hátterében. Az in vitro szelektált sejtekből elsőként az MDR1-et (Multidrug Resistance Protein 1) azonosították 5. A rezisztens fenotípus egy 170 kda méretű fehérje emelkedett 9

10 BEVEZETÉS expressziójával társult, melyet P-glikoproteinnek (Permeabilitás) neveztek el. A P- glikoprotein (MDR1) felfedezése után hamar kiderült, hogy a rezisztens sejtekben más efflux-rendszerek is működnek. Az MRP1-et (Multidrug Resistance-associated Protein) olyan rezisztens, kis-sejtes tüdő karcinóma sejtvonalakban fedezték fel, melyen MDR1 expresszió nem volt detektálható 6. Hasonlóképpen, a BCRP-t (Breast Cancer Resistance Protein) olyan rezisztens sejtvonalban azonosították, melyet antraciklinnel szelektáltak verapamil (egy MDR1 inhibitor) jelenlétében 7. Az MDR fehérjék az ATP energiáját felhasználó aktív transzporterek, amelyek megakadályozzák, hogy a citosztatikus vegyületek a sejten belül felhalmozódjanak. Az MDR transzporterek szerepe a klinikai drog rezisztencia fenntartásában általánosan elfogadottnak tekinthető Az MDR1 szerkezete és működése Az MDR aminosavból épül fel (2. ábra). A fehérje két homológ félből áll, melyeket egy flexibilis linker (aa ) köt össze. A két molekulafélben megtalálhatóak az ABC transzporterekre jellemző transzmembrán és nukleotid-kötő (TMD ill. NBD) domének. 2. ábra 8 : Az MDR1 membrántopológiája (kék: Walker A, rózsaszín: Walker B, zöld: signature régió). A jelenleg rendelkezésre álló legnagyobb felbontású (elektron mikroszkópos) szerkezeti képen 9 az MDR1 kb. 10x8 nm nagyságú, henger alakú membránfehérjeként 10

11 BEVEZETÉS ábrázolódik. A szerkezet közepén, a membrán síkjára merőlegesen egy kb. 5 nm átmérőjű pórus látható. A pórus falát hatos tagolódású gyűrű alkotja, mely talán a transzmembrán hélixeknek felel meg. A sejten belüli térrészben két elkülönült (kb. 3 nm átmérőjű) egység látható, amik valószínűleg a nukleotid-kötő doménekkel azonosak. Transzmembrán domén Az ABC család tagjai között a szekvenciális hasonlóság a transzmembrán régiót alkotó aminosavak között a legkisebb. Biokémiai és genetikai vizsgálatok szerint az MDR1 transzmembrán hélixei elsősorban a drog-szubsztrátok felismerésében és transzportjában játszanak szerepet. Számos bizonyíték szól amellett, hogy a drog-kötő hely létrehozásában több TM hélix is részt vesz. A transzportált szubsztráttal a való interakciót, azaz a drogok megkötését érintő mutációk valamennyi régióban megtalálhatók, elsősorban azonban az 5-6. és a transzmembrán hélixeket, illetve az azokat összekötő hurkokat kódoló aminosavakat érintik 10,11,12,13,14,15. Fotoaktív droganalógok ugyanezt a két szakaszt jelölik 16, ami arra utal, hogy a transzportált drogok megkötéséért elsősorban ezek a régiók felelnek. Nem ismert, hogy az MDR két felében azonosított analóg szakaszok külön-külön, vagy közösen alakítják ki a drogkötő felszín(eke)t. Az általánosan elfogadott modell szerint a transzmembrán domén 2x6 transzmembrán hélixből áll, melyek a fehérje harmadlagos szerkezetében több drogkötő hellyel rendelkező, egyetlen funkcionális egységet alkotnak (single-barreled). Egy másik, egyelőre kevésbé elfogadott modell szerint a transzmembrán domének β- redőkbe szerveződnek, melyek a harmadlagos szerkezetben két elkülönült drog-kötő és transzportáló egységet képeznek (double-barreled) 19,20,21. A multidrog transzporterek egyik legrejtélyesebb sajátossága a fehérjék promiszkuitása, vagyis az a képességük, hogy rendkívül sok, szerkezetükben és méretükben különböző vegyületet képesek transzportálni. Az MDR1 szubszrátjai között a daganatellenes szerek mellett több fontos, a gyógyászatban használt vegyület található (lásd II. Táblázat). A transzportált drogok közös tulajdonsága, hogy valamennyien hidrofób és amfipatikus vegyületek. a Valójában az ABC transzporterek igazi, enzimatikus átalakulást szenvedő szubsztrátja az ATP. Ennek ellenére az irodalomban a transzportált vegyületeket szintén szubsztrátnak nevezik. A dolgozatban transzportált és katalitikus szubsztrátot különböztetek meg. 11

12 BEVEZETÉS II. Táblázat: Az MDR1 által transzportált gyógyszerek 22 Daganatellenes szerek Vinka-alkaloidok (vincristine, vinblastine) Antraciklinek (doxorubicin, daunorubicin, epirubicin) Epipodophyllotoxinok (Etoposide, Tenoposide) Paclitaxel (taxol) Actinomycin D Topotecan Más citotoxikus ágensek Colchicine Emetin Puromycin Peptidek Gramicidin D Valinomycin HIV proteáz inhibitorok Ritonavir Indinavir Saquinavir A transzmembrán domén, ill. a kötőfelszín pontos szerkezete nem ismert. Elképzelhető, hogy az MDR1 széles szubsztrát-specifitású kötőhelye a közelmúltban kristályosított BmrR transzkripciós faktor felszínére hasonlít. A B. subtilis-ból izolált BmrR a Bmr multidrog transzporter transzkripcióját szabályozza 23, aktivációja során a legkülönbözőbb vegyületeket köti meg. A transzkripciós faktor széles szubsztrátspecifitásának szerkezeti alapja az, hogy a kötőfelszín nem alakít ki precíz orientációt igénylő specifikus kötéseket, a szubsztrátok a hidrofób felszínhez kizárólag másodlagos kölcsönhatások révén kapcsolódnak. A hidrofób kölcsönhatásokat a kötő felszín mélyén található glutaminsavval kialakított elektrosztatikus kötések egészítik ki. A glutaminsavhoz vezető hidrofób folyosót (és benne a megkötött szubsztrátot) egy flexibilis csapóajtó (alfa hélix) zárja el a vizes fázistól. Nukleotid-kötő domén Jelentős áttörést jelentett a szerkezet-funkció kutatásban az első ABC fehérjék, a S. typhimurium-ból származó HisP és az E. Coli-ban található RbsA kristályszerkezetének meghatározása 24,25 (3. ábra). A HisP a hisztidin transzportját végző periplazmikus hisztidin permeáz, a RbsA a ribóz felvételéért felelős Rbs katalitikus alegysége. A két térszerkezet nagyon hasonlít egymásra, annak ellenére, hogy szekvenciális azonosságuk mindössze kb. 25%-os. Az ABC-szerkezet egy β-redőkből álló központi régióra (I) és egy ettől L alakban elágazó, főként alfa hélixekből álló egységre (II) tagolódik. Az ATP a béta redőkből font zsebben fekszik, adenin gyűrűje hidrofób kölcsönhatások révén rögzített. A kötő felszín kialakításában a konzervált Walker A és B szakaszok vesznek 12

13 BEVEZETÉS részt. A Walker A régió által alkotott P-loop (anion hole) az ATP foszfátjai fölött ível át, a lizin (GXXGXGK) a β foszfáttal létesít kötést. Az ATP β és γ foszfátjaihoz kapcsolódó Mg 2+ ion koordinálásában a Walker B aszparaginsav (hhhd) és (a RbsA szerkezetben) a Walker A szerin (GKST) vesznek részt. Meglepő, hogy míg a Walkermotívumok (a számítógépes algoritmusokon 26, illetve a F 1 -ATPáz korábban megismert szerkezetén alapuló 27 predikcióknak megfelelően) a nukleotid köré szerveződnek, addig az ABC fehérjék nukleotid-kötő doménjában kötelezően előforduló harmadik motívum nincs közvetlen kapcsolatban az ATP-vel. A signature régió a II. kar egyik központi hélixén, az ATP-től 16 Å-re található. 3. ábra A. A HisP szerkezete. A képet a PDB koordináták felhasználásával (1BOU), a SwissPDB Viewer programmal készítettem. B. Az MDR1 C-terminális nukleotid-kötő doménjének (aa ) homológia modellje. Zöld: β-redő, sárga: α-hélix, kék: Walker A (GSSGCGKST), rózsaszín: Walker B (LLLDE), piros: signature szekvencia (LSGG). 13

14 BEVEZETÉS Az MDR1 működési modelljei Egyes elképzelések szerint az MDR1 közvetetten, pl. a sejtek membránpotenciáljának vagy ph-jának megváltoztatása révén fejti ki hatását 28. Bár a rezisztens sejtek a fenti paraméterekben különbözhetnek szenzitív társaiktól (valamint a modell frappáns magyarázatot kínál a széles szubsztrát specifitásra is), a kísérleti adatok (drog-kötés, drog-stimulált ATPáz aktivitás, ATP-függő transzport, stb.) arra utalnak, hogy az MDR1a drogokkal direkt módon kölcsönhat és a rezisztencia aktív transzporthoz kötött. Az általánosan elfogadott pumpa modell szerint az MDR1 az ATP energiáját felhasználva biztosítja a drogok transzportját. A transzport folyamat molekuláris részletei nem ismertek. Nem világos, hogy a szubsztrát megkötése a citoplazmában ( csatorna-modell ), vagy pedig már a membránban történik ( hidrofób porszívó modell 29,30 ). Egy harmadik elképzelés szerint az MDR1 flippázként működik, vagyis a drogokat a membrán belső szegmenséből a külső szegmensbe forgatja. Ez utóbbi elképzelés mellett szól, hogy az MDR1 közeli rokona, az MDR3 valóban flippázként működik, ráadásul képes egyes MDR1-szubsztrátok transzportjára (részletesen lásd egyéb saját közlemények/2) Az MDR katalitikus ciklusa Az MDR1 (ill. az ABC transzporterek általában) ATPáz aktivitásának részletes megismerése az alapkutatás szempontjából különösen érdekes, mivel e fehérjék katalitikus aktivitása eltér más, részletesen vizsgált aktív transzporterektől (F 1 F 0 ATPáz, NaK ATPáz, stb.). Ugyanakkor a katalitikus ciklus feltérképezése egyben klinikai kihívás is, mivel a szerkezet és funkció összefüggésének megértése hatékony gátlószerek kifejlesztéséhez vezethet (példa lehet erre a protonpumpát gátló szulfhidril reagens omeprazol, melyet kiterjedten alkalmaznak a gyomorfekély terápiájában). A pumpa-modell -el összhangban az MDR1 jól mérhető ATPáz aktivitással rendelkezik, melyet a transzportált drog-szubsztrátok jelentős mértékben serkentenek. Az ATPáz katalitikus ciklusa az alábbi reakció egyenlettel írható le: MDR1+MgATP MDR1 MgATP MDR1 MgADP Pi MDR1 MgADP+Pi MDR1+MgADP 14

15 BEVEZETÉS A reakció kinetikája, egyensúlyi állandói pontosan nem ismertek. Az ATPáz aktivitás (a felszabaduló anorganikus foszfát (Pi) mennyisége szerint) 5-15 µmol ATP/perc/mg fehérje, ami másodpercenként kb. 10 ATP hidrolízisének felel meg 31,32. A folyamat egyes lépései megfelelő kísérleti körülmények között külön tanulmányozhatók (lásd Módszerek). A katalitikus ciklus az ATP megkötésével kezdődik. Szemben más nukleotid-kötő fehérjékkel (F 1 F 0 ATPáz, miozin), az MDR1- hez az ATP alacsony affinitással kötődik (K D µM). A két nukleotid-kötő domén affinitása megegyezik, telítési körülmények között az MDR1 2 ATP megkötésére képes. Az ATP energiájának felszabadítása több lépésben zajló folyamat. Az MDR1 a P-típusú ATPázoktól eltérően nem alakít ki nagy energiájú foszforilált intermediert. Az ATP megkötése (MDR1 MgATP) után bekövetkező hidrolízis egy nagy energiájú komplex kialakulásához vezet (MDR1 MgADP Pi), amit az anorganikus foszfát (Pi), majd az ADP disszociációja követ. Az MDR1 ATPáz aktivitását a vanadát mikromólos koncentrációban gátolja. A gátlás valószínű mechanizmusa az, hogy a szerkezetükben hasonló vanadát és anorganikus foszfát helyet cserélnek 33, ezért a reakció a nagy energiájú komplex stabilizációja következtében megakad 34 : MDR1+MgATP MDR1 MgATP MDR1 MgADP Pi MDR1 MgADP+Pi ( MDR1+MgADP) MDR1 MgADP Vi Ennek alapján az MDR1 MgADP Vi komplex a katalitikus ciklusban formálódó nagy energiájú MDR1 MgADP Pi komplex stabil analógjának tekinthető. Hasonló mechanizmussal gátolja az MDR1 ATPáz aktivitását két másik foszfát analóg, a fluoroaluminát (AlF x ) 35 és a berillium-fluorid (BeF x ) 36. A gátlás reverzibilis: a kapcsolat felbomlásakor - egy ADP távozásával - az MDR1 ATPáz aktivitása helyreáll. A 3. ábrán bemutatott kristályszerkezetben az ATP-kötő zseb viszonylag nyitott szerkezetű. Valószínű, hogy a katalízis előrehaladtával az ATP körül felsorakozott (konzervált) aminosavak átrendeződnek, ami egy zártabb, az elhasadt nukleotidot szorosabb gyűrűbe fogó konformációt eredményez (nukleotid okklúzió). 15

16 BEVEZETÉS Transzportált szubsztrátok (drogok) hatása az ATP hidrolízisére A transzportált szubsztrátok a katalitikus ciklust jelentősen felgyorsítják (drog-stimulált ATPáz aktivitás). Az MDR1 ún. alap ATPáz aktivitása (mely transzportált szubsztrátok nélkül mérhető) egyes elképzelések szerint a membránban jelen lévő, endogén szubsztrátok stimulációjának tudható be. Egy másik modell szerint az MDR1 transzportáló és hidrolitikus apparátusa csak laza kapcsolatban állnak, vagyis az ATP transzportált drogok hiányában is elhasadhat 37. Mivel a drogok sem az ATP kötését, sem az ATPáz aktivitás ATP-koncentráció függését (K M ATP) nem befolyásolják 38, a katalitikus ciklusra kifejtett hatásukat nem az ATP affinitásának növelésével, mintsem inkább az ATP kötést követő lépések gyorsításával érik el. A katalitikus ciklus részletes vizsgálata kiderítette, hogy a transzportált szubsztrátok ATPáz aktivitásra gyakorolt hatása már a katalitikus intermedier képződésekor jelentkezik 39,40. Az MDR1 transzportált drog-szubsztrátjai a vanadát-függő intermedier képződését a teljes ATPáz ciklushoz hasonló (koncentrációjuktól függő) módon fokozzák, ugyanakkor a MDR1 MgADP Vi komplex disszociációjára nincsenek hatással 31. Ennek alapján a kísérletekben detektálható MDR1 MgADP Vi komplex a teljes katalitikus ciklus parciális reakciójának tekinthető. Valószínű, hogy a nagy energiájú intermedier (MDR1 MgADP Pi) képződése a teljes ciklus sebességét meghatározó lépés (rate limiting step), mely a transzportált szubsztrátok kontrollja alatt áll. Az ATP-hidrolízis hatása a drogok transzportjára A transzportált szubsztrátok (drogok) ATP nélkül 41, sőt, a nukleotid-kötő domének hiányában 42 is képesek (a transzmembrán domének által alkotott) kötő helyre kötődni, ami arra utal, hogy a drogok és az ATP megkötése független folyamatok. Az ATP hidrolízise során, az MDR1 MgADP Vi komplex képződésével azonban a drogok kötődése drasztikus mértékben megváltozik. Dey és munkatársai kísérleti eredményei szerint az N- és C-terminális molekulafélben azonosított szubsztrát kötő régiók (lásd fent) valójában két független drog-kötő helynek felelnek meg. Modelljükben a transzportra váró drog a C-terminális, magas affinitású ON helyre köt. Amikor a katalitikus ciklus eljut a vanadáttal stabilizálható nagy energiájú intermedierig (az első ATP hidrolízise) a drog affinitása az ON hely iránt jelentősen csökken 43. Ekkor a transzportált szubsztrát az OFF helyre, majd feltehetőleg az extracelluláris térbe kerül. 16

17 BEVEZETÉS Ahhoz, hogy az ON hely újra magas affinitású helyzetbe kerüljön (és a ciklus újra elinduljon), nem elég a katalitikus intermedier szétesése (az ADP disszociációja), hanem egy újabb ATP hidrolízisére van szükség. A modell szerint tehát a drogkötőhely(ek) affinitása szorosan követi a katalitikus ciklus állomásait, egy molekula transzportjához két ATP szükséges Intramolekuláris kölcsönhatások A szerkezetileg elkülönülő doménekben zajló drog-kötés és ATP hidrolízis szoros kapcsolata intramolekuláris kölcsönhatások révén valósul meg (4. ábra). A transzportált szubsztrát kötődése nyomán jelentős konformáció változás figyelhető meg, amit (a katalitikus reakció felgyorsulása mellett) az NBD2-ben található triptofán intrinszik fluoreszcenciájának, valamint a két NBD fizikai távolságának megváltozása bizonyít 41,48. A drog-kötő hely és a katalitikus centrum szoros kapcsolatával magyarázható, hogy egyes vegyületek (pl. CSA) vagy antitestek (UIC2) kötődése, a transzmembrán doménekben lévő mutációk (Q128R) 44, valamint a 6. és 12. transzmembrán hélixek kémiai keresztkötése gátolja az ATP hidrolízisét. A nukleotidkötő domén működése szintén konformáció változást idéz elő, amit az ON kötőhely affinitásának csökkenése mellett a (sejtfelszíni komplex epitópot felismerő) UIC2 antitest kötődésének 45, a fehérje tripszines hasítási profiljának 46, valamint a TM6 és TM12 relatív pozíciójának 47 ATP hidrolízisét követő megváltozása mutat. Az ABC fehérjék szerkezet-funkció kutatásának egyik legnagyobb kihívását az összehangolt működést irányító szignál molekuláris szintű azonosítása jelenti. Általános vélekedés szerint az intramolekuláris kapcsolat elsősorban az ABC-signature régió révén valósul meg (lásd fejezet). Bár a HisP helikális (II. kar) régiójában lévő mutációk a transzmembrán doménekkel való interakciót gátolják 24, a fehérje más részeiről, így pl. a nukleotid-kötő domén egyik konzervált hisztidinjéről is feltehető, hogy közvetlen kapcsolatban van a drog-hatást és/vagy az energia felszabadulását közvetítő molekuláris láncolattal. A HisP 211-es hisztidinje egy vízmolekulán keresztül az ATP gamma foszfátjával kapcsolódik, a RbsA-ben (mely ADP jelenlétében kristályosodott) az analóg hisztidin az ADP-től elfordulva található. A feltételezések szerint a hisztidin két különböző konformációja a hidrolízis függvényében váltja egymást (histidine switch). 17

18 BEVEZETÉS 4. ábra Intramolekuláris kölcsönhatások. A rajz arányai kb. megfelelnek az MDR1 elektron mikroszkópos szerkezeti képének 9 és a FRET-technikával mért molekuláris távolságoknak 48. A nukleotid-kötő doméneket a HisP kristályban talált dimer elrendeződése szerint ábrázoltam. A nyilak a drog-kötő és az ATP-kötő domének közti funkcionális kölcsönhatást jelzik. A drog hatásának közvetítésében elsősorban olyan aminosavak szerepelhetnek, melyek sem a drog, sem az ATP kötésében nem vesznek közvetlenül részt, mutációjuk mégis az MDR1 szubsztrát-specifitásának megváltozásához vezet (pl. G185 49, ERGA (aa ) 50, K563 51, T578 44,22 ). A drog hatására bekövetkező konformáció változás végeredménye valószínűleg az, hogy megváltozik az aktiváló vízmolekulát pozícionáló aminosav helyzete (a HisP-ben Q100 vagy E179), ami a vízmolekula polarizációján keresztül az ATP hidrolíziséhez vezet. Az egér MDR3-ban (mely gyakorlatilag a humán MDR1-nek felel meg) az analóg glutamin mutációja (Q471A és Q1114A) jelentősen csökkent alap ATPáz aktivitását eredményez, melyet a transzportált szubsztrátok a vad típustól elmaradó mértékben stimulálnak 52. A nukleotid-kötő domének kooperációja Az MDR1 mindkét nukleotid-kötő régiója képes az ATP megkötésére és hidrolízisére. Telítési körülmények mellett 1 MDR1 2 ATP-t köt meg, a katalitikus ciklus következő detektálható állomásán (vanadát-függő nukleotid okklúzió) azonban egy (mól) MDR1- hez már csak egy (mól) nukleotid asszociálódik 53. Radioaktív ATP-derivátummal 18

19 BEVEZETÉS végzett okklúziós kísérletekben (lásd Módszerek) az MDR1 közel szimmetrikusan jelölődik, ami arra utal, hogy a katalitikus ciklus első lépése bármelyik oldalon megtörténhet. Mindebből az következik, hogy a magas energiájú intermedier komplex (MDR1 MgADP Vi) egyszerre csak az egyik nukleotid-kötő doménban formálódhat. Az alternáló katalízis modell döntő bizonyítékát a vanadát-indukálta fotokémiai reakció vizsgálata szolgáltatta. UV sugárzás hatására a MDR1 MgADP Vi komplex az okklúdált vanadáthoz közeli Walker A szekvencia egyik peptidkötése mentén elhasad 54. A keletkező MDR1-fragmensek analíziséből egyértelműen kiderült, hogy vanadatátfüggő komplex mindkét oldalon keletkezik, de sosem egy fehérjén belül. Az alternáló katalízis csak úgy valósulhat meg, ha az egyik oldalon történő ATP hidrolízis intramolekuláris kölcsönhatások révén egyben gátolja a másik oldal katalitikus aktivitását. A kísérleti eredmények azt bizonyítják, hogy az MDR1működéséhez mindkét homológ fél jelenléte és interakciója szükséges. A félbevágott MDR1-mutáns megtartja ATP kötését (csekély ATPáz aktivitása is marad), a teljes fehérjére jellemző drog-stimulált ATPáz aktivitás azonban csak a két fél együttes expressziója esetén detektálható 55. A molekuláris interakció szférikus feltételeit a linker régió (lásd 2. ábra) biztosítja. A linker deléciója vagy rigid szerkezetű peptiddel történő helyettesítése esetén a fehérje elveszti katalitikus aktivitását. A két nukleotid-kötő domén közti katalitikus kooperáció további bizonyítékát genetikai vizsgálatok szolgáltatták. A kísérletek azt mutatták, hogy mindkét centrum szükséges az aktivitáshoz, mivel bármely nukleotid-kötő domén kritikus aminosavainak kémiai vagy genetikai módosítása inaktiválta a molekulát. A féloldali mutánsokban sem ATPáz aktivás, sem transzport nem mérhető 40,56, az ATP kötés azonban jellemző módon megmarad Az MDR1 fiziológiai szerepe Az MDR1 szerepe természetesen nem korlátozódik a daganatsejtek védelmére. A P-gp fiziológiai szerepe toxikus vagy sejtidegen molekulák transzportja, expressziója kimutatható a szervezet első védelmi vonalában (gasztrointesztinális traktus epitélsejtjei), szekretoros szervekben (epeutak hámja, proximális tubulusok apikális hámja), hemopoetikus őssejtekben, vagy valamely fontos szerv védelmét ellátó sejtekben (vér-agy gát, vér-here gát, placenta). Az MDR fehérjék fiziológiai szerepéről a legtöbb információt a knock-out állatkísérletek szolgáltatták 57. Az MDR1 -/- egerek 19

20 BEVEZETÉS életképesek voltak, ám további vizsgálatok során kiderült, hogy fokozottan érzékennyé váltak centrális toxicitású vegyületekkel szemben (pl. ivermectin). A fokozott érzékenység az MDR1 vér-agy gát fenntartásában betöltött funkciójával magyarázható. Az agyi kapillárisokban az MDR1 a kapilláris-endotél luminális oldalán expresszálódik, a transzport iránya megakadályozza a toxikus vegyületek likvortérbe kerülését. A fenesztrált endotélt tartalmazó plexus choroideus esetében a likvortér védelmét az ereket burkoló neuronális ependyma sejtek biztosítják. Mivel az ependyma sejtek az érfal endotéljéhez képest fordított orientációjúak, a transzportért itt a bazolaterális felszínen expresszálódó MRP1 felel (vér-likvor gát) 58. Az MDR1 széles szubsztrát-sepicifitásának, expressziós mintázatának köszönhetően alapvető szerepet játszik a gyógyszerek biológiai hozzáférhetőségének szabályozásában. Az MDR1 a bélben a gyógyszerek felszívódását, a vesében és a májban a kiválasztását, a vér-agy gátban a megoszlását, a (daganat)sejtekben a sejtekbe való jutását szabályozza. Az MDR1 gyógyszeres gátlása a knock-out kísérletek eredménye szerint az élettel összeegyeztethető. Világszerte jelenleg több vegyület áll klinikai kipróbálás alatt (a legismertebb a ciklosporin-a analóg PSC833). A mellékhatások (centrális tünetek) miatt egyelőre azonban a multidrog rezisztencia gyógyszeres megelőzése nem tekinthető megoldottnak A klinikai MDR vizsgálati módszerei A klinikai MDR megbecsülésére számos módszer kínálkozik (II. közlemény). Egyes laborok az MDR fehérjék expresszióját vizsgálják, mások az mrns szintjét mérik, megint mások funkcionális tesztek eredményeit próbálják a terápiás érzékenységgel összevetni. Több közlemény foglalkozik a különböző megközelítések összehasonlításával 59,60,61,62,63, következtetéseik azonban gyakran ellentmondóak. Az ellentmondás mögött az alkalmazott módszerek variabilitása (antitestek koncentrációja, mintafeldolgozás, stb.), más szóval az egységes metodológia hiánya áll. A nemzetközi ajánlások 64,65,66,67,68,69,70 ellenére ugyanis máig sem létezik olyan laboratóriumi módszer, mely a rezisztencia detektálását standard módon szabályozná. További problémát jelent, hogy nincsenek megbízható összehasonlító adatok a különböző típusú eredmények és a betegségek klinikai lefolyása közötti összefüggésekről 71. A legalaposabban vizsgált haematológiai megbetegedés, az akut mieloid leukémia (AML) esetében a legtöbb tanulmány inverz összefüggést talált a citosztatikumok hatékonysága és a P-glikoprotein 20

21 BEVEZETÉS expresszió között, a klinikai kimenetel azonban leginkább a funkcionális próbák eredményeiből volt megjósolható. Az MDR fehérjék aktivitására jelzett drogok (daunorubicin, doxorubicin) vagy fluoreszcens festékek (rhodamin123, DiOC 2 ) megoszlásából lehet következtetni. E módszerek azonban többnyire technikailag kedvezőtlenek, nehezen kvantitálhatók. A laboratóriumunkban korábban kidolgozott Calcein-próba 72 a tumor sejtek in vitro rezisztenciájának meghatározására szolgál. A hidrofób Calcein-AM az MDR fehérjék (MDR1, MRP1) szubsztrátja, mely a sejtbe kerülve intracelluláris észterázok hatására zölden fluoreszkáló szabad calceinné alakul. A sejtek rezisztenciájára, azaz az MDR pumpák aktivitására a felhalmozódó fluoreszcencia mértékéből lehet következtetni. A rezisztencia kvantitatív mértékét (MDR Aktivitási Faktor, MAF) a verapamillal gátolt, ill. gátlószer nélküli calcein akkumuláció aránya adja meg. 21

22 CÉLKITŰZÉSEK 3. Célkitűzések Kutatásaink célja az ABC fehérjék katalitikus ciklusának vizsgálata, valamint az MDR transzporterek klinikai szerepének jellemzése volt. 1. Feltételeztük, hogy az AlF x - ill. BeF x -dependens intermedier komplexek az MDR1 MgADP Vi intermedierhez hasonlóan az MDR1 katalitikus ciklusának részreakcióját tükrözik. Ennek bizonyítására vizsgálni kívántuk az AlF x - ill. BeF x - dependens nukleotid okklúzió idő- és ATP-függését, valamint a transzportált szubsztrátok hatását. 2. A munkacsoportunk korábban több olyan ATPáz negatív MDR1 variánst állított elő, melyekben a mutáció az első vagy a második nukleotid-kötő domén konzervált aminosavait érintette. Célunk az volt, hogy a mutáns fehérjék ATPáz aktivitásának részletes vizsgálatával megpróbáljuk közelebbről meghatározni a kérdéses aminosavak katalitikus szerepét. 3. Az eredmények birtokában az ABC-signature régió funkciójának részletesebb vizsgálatát és további mutánsok előállítását tűztük ki célul. 4. Ismert volt, hogy a CFTR által formált kloridcsatorna funkcióját a foszforiláció mellett az ATP szabályozza. Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk, a CFTR katalitikus ciklusa tartalmaz-e vanadát-függő katalitikus intermediert. A katalitikus aktivitás detekciójának beállítása után jellemezni kívántuk a reakció idő- és koncentrációfüggését, gátolhatóságát, stb., valamint a két nukleotid-kötő domén szerepét. 5. Az ABC fehérjék biokémiai jellemzése mellett vizsgálni kívántuk az MDR transzporterek klinikai szerepét haematológiai betegségekben. Célunk az volt, hogy a laboratóriumban rutinszerűen alkalmazott módszert, a Calcein-próbát klinikai diagnosztikai eljárássá fejlesszük, és alkalmassá tegyük az MRP1 szelektív kimutatására. 22

23 ESZKÖZÖK ÉS MÓDSZEREK 4. Eszközök és módszerek DNS konstrukciók készítése Az irányított mutagenezist PCR-es technikával végeztük 73. Az overlap extension PCR mutagenezis lényege röviden a következő: a kérdéses DNS szakaszra a kívánt mutációt hordozó komplementer primer párt terveztünk. Az első PCR reakcióban a két mutagén primer egy-egy (5 ill. 3 irányba eső) külső primerrel egymással részlegesen átfedő DNS szakaszokat amplifikál. A második ciklusban a keletkezett (mutáns) DNS szakaszok egymással átfedő részeik révén komplementálódnak, a külső primerek a komplementált, mutáns DNS-t amplifikálják. (A módszer részletes leírását lásd a V. közlemény Materials and Methods fejezetében). A cdns konstrukciókat (módosított) expressziós vektorba (pacuw21-l) ligáltuk. Heterológ expressziós rendszer: Bakulovírus-Sf9 rovarsejtek Laboratóriumunkban számos ABC transzportert expresszálunk az Sf9 (Spodoptera frugiperda) ovárium sejtjeiben. A rendszer előnye, hogy nagy mértékű expresszió érhető el (az expresszált ABC fehérje mennyisége elérheti a rovarsejt membránfehérjéinek 2-3%-át). A rovarsejtben expresszált humán fehérjék nem alakíthatják ki fiziológiás kapcsolataikat, a rendszer közvetlen működésük tanulmányozását teszi lehetővé. Az Sf9 sejteket szuszpenziós kultúrában tenyésztettük 27 o C-on, 10% FCS-el, 100 egység/ml penicillinnel és 100 µg/ml sztreptomicinnel kiegészített TNM-FH médiumban. A sejteket az expressziós vektorba ligált cdns-t tartalmazó rekombináns bakulovírussal fertőztük, a gyártó cég (BaculoGold Transfection Kit, Pharmingene) előírásainak megfelelően. A vírusfelülúszóból végponthígítással (end-point dilution) egyedi klónokat nyertünk, a kísérletekben a legmagasabb expressziót biztosító klónt használtuk. Membránpreparátum készítése, standard laboratóriumi módszerek Az Sf9 rendszer tranziens expressziót tesz lehetővé, ezért a vírusfertőzést követő harmadik napon a sejteket learattuk, és a membránfrakcióval dolgoztunk tovább. A sejtek membránfrakcióját differenciál centrifugálással izoláltuk, a preparátumokat - 80 C-on tároltuk. SDS-Poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE), Western blot, stb. standard módszerekkel történtek. 23

24 ESZKÖZÖK ÉS MÓDSZEREK A katalitikus ciklus vizsgálata Az ABC ATPázok szubsztrátjának tulajdonképpen az ATP tekinthető. A katalitikus ciklus egyes lépései meghatározott kísérleti körülmények mellett külön tanulmányozhatók. A teljes ciklusról az ATPáz aktivitás tudósít, a további lépéseket jelzett azido-atp segítségével követhetjük nyomon. A [α- 32 P]8-azido-ATP az MDR1 (ATP-től alig különböző kinetikai paraméterekkel rendelkező) energia-donor szubsztrátja, azido csoportja ultraibolya fény hatására kovalens kötést létesít a környezetében található tirozin oldalláncokkal (fotoaktiváció). Az MDR1-ben jelölődő tirozin a nukleotid-kötő doménben, a Walker A motívum lizinjétől 35 aminosavnyi távolságra található. Az ATP megkötését (a ciklus első lépését) 0 o C-on vizsgáltuk (ilyenkor a fehérje nem működik, így a hidrolízis további lépéseitől eltekinthetünk). Az intermedier komplex képződését gátló anion jelenlétében, 37 o C-on vizsgáltuk. A katalitikus aktivitás kontrolljaként a reakció Mg 2+ -függőségét (EDTA), NEMérzékenységét (az NEM a Walker A motívumban lévő ciszteinekhez kötődik) vizsgáltuk. A radioaktív ATP analóg specifikus kötődését jelöletlen ATP-vel való kompetícióval ellenőriztük. ATPáz aktivitás Az izolált membránok MDR1 specifikus (drog-stimulált, vanadát-szenzitív) ATPáz aktivitását a felszabaduló anorganikus foszfát szintjét mérő kolorimetriás módszerrel jellemeztük 32. A háttér aktivitás csökkentése érdekében a reakciót az Sf9 fehérjék ATPáz aktivitását gátló vegyületek (ouabain, EGTA, azid) jelenlétében végeztük. ATP kötés A vizsgálni kívánt ABC fehérjét expresszáló Sf9 membrán vezikulákat (100 µg fehérje) jégen inkubáltuk. A reakció 0,1-0,2 MBq [α- 32 P]-8-azido-ATP jelenlétében, 50 mm Tris-KCl, ph 7,0; 0,1 mm EGTA; 2 mm MgCl 2 összetételű oldatban zajlott. 5 perc elteltével a mintákat UV fénnyel megvilágítottuk, majd jéghideg Tris-EGTA-MgATP pufferben kétszer megmostuk (centrifugálás 4 o C-on 20 percig, g), végül a csapadékot SDS-tartalmú mintafelvevő pufferben oldottuk. Elektroforézis és PVDF membránra történő blottolás után a kérdéses ABC fehérjékhez asszociált radioaktivitást Phospho-Imager készüléken (Bio-Rad) mértük meg. Az autoradiogramon jelölődő fehérjét ugyanazon blot specifikus antitestekkel történő előhívásával azonosítottuk. 24

25 ESZKÖZÖK ÉS MÓDSZEREK Kontroll kísérletekben jelöletlen ATP-t adtunk a rendszerhez, a kötődést akkor ítéltük specifikusnak, ha a [α- 32 P]8-azido-ATP radioaktív jelét a hideg ATP leszorította. Foszfát-analóg anionok készítése 35 A fluoro-aluminát 1 mm AlCl 3 és 5 mm NaF elegyítésével állítható elő. A berilliumfluoridot 200 µm BeSO 4 és 1 mm NaF keverésével készítettem. Az ionok pontos összetétele nem ismert, ezért a képletüket AlF x - és BeF x -ként adtam meg. Nukleotid okklúzió (trapping) Mint az a bevezetésből kiderült, az MDR1 katalitikus ciklusa foszfát analóg anionokkal (vanadát, AlF x, BeF x ) megakasztható. Az intermedier [α- 32 P]8-azido-ATP jelenlétében is kialakul, besugárzás után azonban a komplex nem esik szét, így SDS gélen vizsgálhatóvá válik. Ahhoz, hogy az intermedier komplex kialakuljon, enzimatikus reakcióra van szükség. Ezért a kívánt fehérjét expresszáló vezikulákat (100 µg fehérje) 37 o C-on inkubáltuk, 0,1-0,2 MBq [α- 32 P]-8-azido-ATP (5-100 µm), 200 µm vanadát (vagy fluoro-aluminát, ill. berillium-fluorid) jelenlétében, 50 mm Tris-KCl, ph 7,0; 0,1 mm EGTA; 2 mm MgCl 2 összetételű oldatban perc elteltével a reakciót jéghideg Tris-EGTA-MgATP oldat hozzáadásával leállítottuk, a vezikulákat ugyanebben az oldatban kétszer megmostuk (centrifugálás 4 o C-on 20 percig, x g). A csapadékot SDS-tartalmú mintafelvevő pufferben vettük fel, elektroforézis és PVDF membránra történő blottolás után a kérdéses ABC fehérjékhez asszociált radioaktivitást Phospho- Imager készüléken (Bio-Rad) mértük meg. Az autoradiogramon jelölődő fehérjét ugyanazon blot specifikus antitestekkel történő előhívásával azonosítottuk. Fontos hangsúlyozni, hogy (szemben a kötési kísérletekkel) az intermedier komplex formálódását követő kísérletekben az UV besugárzás a 10 mm MgATP-t tartalmazó oldattal történt mosás után történt. Az intermedier komplexben a nukleotid a katalitikus centrum egy eldugott belső zsebébe kerül. Kétszeri mosás után csak ez, a külső hideg ATP elől elzárt (okklúdált, trapped) nukleotid marad a fehérjéhez asszociált állapotban. A reakció drog-függését általában verapamil jelenlétében vizsgáltuk. Mivel a foszfát analóg anionok tartós gátlást idéznek elő, a drogok hatása az időegység alatt felgyülemlő komplexek számával (az ezekben rekedt nukleotid analóg radioaktív jelével) jellemezhető. 25

26 ESZKÖZÖK ÉS MÓDSZEREK Limitált tripszinolízis Az MDR1 és CFTR fehérjéket a limitált tripszines kezelés nagyjából két egyforma, az N- és a C-terminális nukleotid-kötő domént tartalmazó félre darabolja. A kívánt fehérjét expresszáló vezikulákat a radioaktív ATP-vel történt UV jelölés után 40 mm Mops- Tris, ph 7,0; 50 mm KCl; 0,5 mm EGTA; 2 mm DTT összetételű oldatban, 20 µg tripszin jelenlétében inkubáltuk 10 percen át jégen. A reakciót tripszin inhibitorral állítottuk le, majd a membránokat a fenti pufferben megmostuk. A keletkező termékeket az autoradiogramon az N- ill. a C-terminális nukleotid-kötő doménekre specifikus antitestekkel azonosítottuk. Homológia modellezés Az MDR1 nukleotid-kötő doménjének szekvenciája 20 %-ban megegyezik a HisP szekvenciával. Az MDR1 C-terminális nukleotid-kötő doménjének térszerkezeti modelljét az interneten elérhető Swissmodel programmal készítettem ( Templátként a HisP szerkezete szolgált (PDB 1BOU). A modellezés alapjául szolgáló szekvencia illesztés a Clustalw honlapján készült ( Betegek kiválasztása, klasszifikáció Az 1997-től 1999-ig tartó vizsgálatsorozat az Országos Haematológiai és Immunológiai Intézetben és a Debreceni Orvostudományi Egyetem klinikáin ápolt betegek adatait dolgozta fel. Összesen 93 akut leukémiás beteg mintáin végeztünk méréseket (65 akut mieloid leukémia (AML), 28 akut limfoid leukémia (ALL), átlag életkor 50.5 év). A szubtípusok az alábbi megoszlást mutatták (FAB-kritériumok szerint): M1:9, M2:11, M3:6, M4:25, M5:7, M6: 1, M7:3, bifenotípusos: 3. A betegeket 7+3-as remissziós indukciós protokollal kezelték. A komplett remisszió kritériuma: 0% blaszt a perifériás vérben és 5%-nál kevesebb blaszt a csontvelői mintában. A klinikai laborvizsgálatok A klinikai laborvizsgálatok (immunofenotipizálás, LDH aktivitás, stb.) standard laboratóriumi módszerekkel történtek. 26

27 ESZKÖZÖK ÉS MÓDSZEREK Calcein assay 74,75 A csontvelői, illetve perifériás vérből származó mononukleáris sejteket Ficollgrádiensen (Histopaque-1077, Sigma, St Louis, MO) szeparáltuk, majd kétszer megmostuk PBS-ben. A blaszt sejteket HPMI-ben (ph 7.4) vettük fel (5x10 5 /ml), majd µm verapamil (Sigma) jelenlétében (oldószeres kontroll: DMSO) inkubáltuk 37 C-on. 5 perc elteltével a rendszerhez 0.25 µm calcein-am-t (Molecular Probes, Eugene, OR) adtunk, a sejteket további 10 percig inkubáltuk 37 C-on. A reakciót gyors centrifugálással állítottuk le (15 sec, rpm), a sejteket 5 µg/ml propidium-jodidot (PI) tartalmazó PBS-ben vettük fel. A mintákat áramlási citométeren elemeztük (FACScan és FacsCalibur, Becton Dickinson Biosciences. San Jose, CA). Az élő (PI negatív) blaszt sejtek azonosítása után (FL3 és FSC-SSC plot) a sejtek zöld (calcein) fluoreszcenciáját rögzítettük (FL1). A sejtek rezisztenciáját a Multidrog Rezisztencia Aktivitás Faktorral (MAF) fejeztük ki. MAF = 100X(MFI V -MFI 0 )/MFI V, ahol MFI V a verapamil jelenlétében, MFI 0 az oldószer DMSO jelenlétében mért átlagos fluoreszcencia (MEAN). Az MRP1 által okozott rezisztencia számolásakor a verapamilt az MRP1-specifikus gátlószer MK571 helyettesíti: MAF(MRP1)=(F(MK571)- F(DMSO))/F(verapamil). 27

28 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 5. Eredmények és megvitatásuk 5.1. KATALITIKUS INTERMEDIEREK VIZSGÁLATA A nukleotid domének katalitikus kooperációja (Walker A mutánsok vizsgálata). Mint azt a Bevezetés részletesen tárgyalta, az MDR1 két nukleotid-kötő doménje minden jel szerint szoros kooperációban működik. A vanadáttal stabilizált intermedier (mely csak az egyik nukleotid-kötő doménban alakul ki) mindkét oldal katalitikus aktivitását felfüggeszti. Hasonlóképpen, a katalízisben kulcsszerepet játszó kritikus aminosavak egyoldali mutációja vagy kémiai módosítása az MDR1 teljes inaktivációjához vezet, az ATPáz aktivitás a mérhető küszöb alá csökken, a rezisztencia megszűnik. Munkám során a laboratóriumunkban korábban előállított 76 Walker A mutánsok (K433M, K1076M, K433M/K1076M) katalitikus aktivitását vizsgáltam. A térszerkezeti adatok szerint a Walker A motívumban (P-loop) található lizin (GCGKS) az ATP β-foszfátjával létesít kapcsolatot. A KM mutáció ATPáz negatív fenotípust eredményez, az ATP kötése azonban megmarad. Munkacsoportunk mutatta ki elsőként, hogy a Walker A mutánsokban vanadát-függő nukleotid okklúzió nem detektálható, ami arra utal, hogy a kérdéses lizin az ATP megkötése után formálódó katalitikus intermedier kialakításában válik fontossá. Ez utóbbi megfigyelés alapozta meg azt az általánosan elfogadott nézetet, hogy az MDR1 katalitikus ciklusában a két nukleotidkötő domén már a katalitikus folyamat korai szakaszában kooperál 39,52,77. Foszfát analógok szerepe a katalitikus intermedierek stabilizálásában Az ötlet, hogy tovább vizsgáljuk a Walker A mutánsok - jelek szerint hiányzó - katalitikus aktivitását, a miozin térszerkezetének tanulmányozásából született. A miozin motor doménját több gátló anion jelenlétében kristályosították, az intermedier komplexek szerkezete az anionoktól (VO 4 -, AlF x, BeF x ) 33,78,79 függően különböző volt. Mindhárom anion az ATP lehasadt terminális foszfátjának helyén található (az intermedierek az ATP hidrolízise után formálódnak, lásd Bevezetés). A BeF x pontosan az ATP γ foszfátjának helyén ül, a β-foszfáttól mért távolsága megegyezik az ATP β-γ kötés távolságával. Ezzel szemben a vanadát és AlF x β-foszfáttól mért távolsága az ATP β-γ foszfát távolságánál nagyobb, ezek a szerkezetek a már megnyúlt β-γ kötéssel rendelkező ATP-t mutatják. Az intermedier komplexek közti különbség kiegészül az 28

29 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK aktív centrumot alkotó aminosavak eltérő szerveződésével. Ennek alapján az egyes szerkezetek a miozin katalitikus ciklusának különböző állomásaihoz rendelhetők: a BeF x -komplex a katalitikus centrum ATP hidrolízis előtti állapotát mutatja (ground state), míg a vanadát-komplex a hidrolízis átmeneti (intermedier) állapotának felel meg. Az MDR1 ATPáz aktivitását a fluoro-aluminát és a berillium-fluorid a vanadáthoz hasonló mechanizmussal gátolja. Néhány kísérleti adat arra utal, hogy az egyes anionok által stabilizált intermedierek az MDR1-ben is különbözhetnek egymástól. Így a vanadáttal és a berillium-fluoriddal stabilizált komplexben kizárólag ADP található, ezzel szemben az AlF x ADP mellett ATP-t is okkludál 80. Szemben a másik két anionnal, ha BeF x szerepel foszfát analógként, az intermedier komplex formálódása pirofoszfáttal gátolható 81. Közös jellemző, hogy a komplexek csak 37 0 C-on, Mg ++ jelenlétében alakulnak ki, vagyis a ciklus mindhárom esetben az ATP hidrolízisének egy közbülső állomásán akad el. A vanadát-függő nukleotid okklúzió az MDR1 katalitikus ciklusának részreakcióját tükrözi, melyet a transzportált szubsztrátok a teljes ATPáz ciklushoz hasonlóan serkentenek. Nem volt ismert, hogy az AlF x - ill. BeF x -dependens intermedier komplex keletkezése fokozható-e a transzportált szubsztrátokkal. Elsőként ezért az AlF x - ill. BeF x -dependens okklúzió drog-függését vizsgáltuk meg. Mint azt a II. közlemény 1. ábrája mutatja, a verapamil (mely az MDR1 jól jellemzett szubsztrátja) mindhárom komplex képződését felgyorsítja. Vanadát esetében a drog-stimulus 5 perces reakcióidőnél, ill. 20 µm ATP mellett már nem mutatható ki (az összes kötőhely telített, az effektus nem fokozható). A fluoro-aluminát ill. berillium-fluorid mellett mért komplex képződés ATP függése és kinetikája ettől eltér, a verapamil 50 µm ATP mellett, még 10 percnél is fokozza a jelölődést. K433 és K1076 szerepe a katalitikus ciklusban A fenti eredmények arra utalnak, hogy a három foszfát-analóg által stabilizált komplex egymástól némileg különbözik, azonban mindhárom az MDR1 drog-stimulált katalitikus ciklusába illeszkedik. Ezek után joggal tettük fel a kérdést, vajon a vanadátfüggő reakcióban nem jelölődő (és ezért inaktívnak hitt) Walker A mutánsok képesek-e BeF x - ill. AlF x -dependens komplexek formálására? A válasz a II/2. ábráról leolvasható: mindkét egyszeres mutáns (K433M, K1076M) jelölődött, azaz képes volt az ATP megkötését követő katalitikus lépésre. A gyengébb jelölődéstől eltekintve a mutánsok a BeF x - ill. AlF x -dependens okklúziós kísérletekben a 29

30 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK vad-típusú MDR1-gyel minden tekintetben megegyezően viselkedtek. Így a jelölődést gátolta az SH-reagens NEM (500 µm), EDTA (1 mm) és a hideg MgATP-val történő preinkubáció. A komplex képződését a transzportált drogok gyorsították, stabil komplex csak anion jelenlétében formálódott. A fenti eredmények szerint a katalitikus centrumban lévő Walker A lizin egyoldali mutációja ellenére az MDR1 nem veszti el teljesen katalitikus aktivitását. Szemben a korábbi elképzelésekkel, a Walker A szekvenciában található lizin mutációja az egyik nukleotid-kötő doménben megengedi legalább egy ATP hidrolízisét. Mi magyarázza ezek után a mutánsokban az ATPáz aktivitás hiányát? Az egyik lehetséges modell szerint az érintetlen ( vad típusú") nukleotid-kötő doménban az ATP kötése (lásd ATP kötés) és hidrolízise (lásd AlFx- ill. BeFx-dependens okklúzió) megtörténik, esetleg az ADP disszociál (azaz a teljes ciklus végbemegy), a mutáns centrum azonban az ATP megkötése után a hidrolízisre már nem képes, így az összehangolt katalitikus aktivitás elakad. Lehetséges-e azonban, hogy az ATP hidrolízise egyetlen nukleotid-kötő doménban végbemenjen? Ebben az esetben megdőlne a modell, mely szerint a katalitikus aktivitás már az első ATP hidrolízisénél kooperatív működést igényel. Az MDR1 limitált tripszines emésztéssel nagyjából két egyforma, az N- és a C- terminális nukleotid-kötő domént tartalmazó félre vágható. A kérdés megválaszolásához ezért az UV jelölés után a mintákat tripszines kezelésnek vetettük alá (lásd Módszerek). A kísérlet eredménye nem támasztotta alá a fenti elképzelést (egyoldali működés esetén a fehérje két nukleotid-kötő doménje a mutáció oldaliságával összefüggésben aszimmetrikusan jelölődne), a parciális katalitikus reakcióban jelölődő Walker A mutánsok jelölődése a vad-típusnál tapasztaltakkal megegyező eloszlást mutatott (II/3. ábra). Függetlenül a mutáció oldaliságától, a nukleotid-kötő doméneket tartalmazó fél MDRek nagyjából egyformán, enyhe C-terminális preferenciával jelölődtek (N/C 0.6). Ez az eredmény megerősíti azt a feltételezést, hogy az MDR1 két nukleotid-kötő doménje ekvivalens funkciójú. Az irodalomban találkozhatunk ellentétes véleménnyel. A jelölődés II/3. ábrán látható, vad típusban is jelentkező C-terminális túlsúlya egyes szerzők szerint az MDR1 aszimmetrikus működésére utal. Hrychyna és munkatársai kísérleteiben azt találta, hogy az ATP kötés (telítési koncentráció alatt) az N-terminális NBD-re korlátozódik, míg a vanadát indukálta okklúzió döntően a C-terminális nukleotid-kötő doménban fordul elő 82. Az aszimmetrikus jelölődés a nukleotid-kötő domének katalitikus sorrendiségét tükrözheti. Ha az első katalízis minden fehérjén a C- 30

31 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK terminálison történik, akkor a vanadát érthető okoknál fogva döntően a C-terminálison állítja le a reakciót. Ha ez igaz, akkor a katalízis lassításával a C-terminális túlsúlynak tovább kell erősödnie, ugyanis ekkor vanadát mellett még kevesebb fehérjében juthat el a ciklus az N-terminusig. A jelölődés enyhe C-terminális túlsúlya azonban szobahőn végzett kísérletben sem változik (az N-oldal ugyanúgy jelölődik, 5. ábra, sáv). A két oldal eltérő jelölődését magyarázhatja a nukleotid-kötő domének eltérő ATP iránti affinitása is. Mivel az enyhe C-terminális túlsúly a kísérletekben alkalmazott 8-azido- ATP koncentráció teljes tartományában (2,5-50 µm) állandó volt, ez a magyarázat sem meggyőző (5. ábra, sáv). 5. ábra. Vad-típusú MDR1 N- és C-terminális katalitikus centrumának vanadát-függő jelölődése. Vad-típusú MDR1-et expresszáló vezikulákat (100 µg fehérje) inkubáltunk szobahőn (1. sáv), illetve 37 o C-on (2.-6. sáv), [α- 32 P]-8-azido-ATP (1.-3. sáv: 2,5µM; 4.sáv: 5 µm; 5. sáv: 20 µm; 6. sáv 50µM) és 200 µm vanadát jelenlétében 2 percig, a Módszerek fejezetben leírtaknak megfelelően. A mintákat mosás és UV sugárzás után tripszines emésztésnek vetettük alá. Az N/C érték az N-, ill. a C-terminushoz (az ábrán nyíllal jelölve) asszociált radioaktivitás hányadosa. Az autoradiogram egy reprezentatív kísérletet mutat be. 31

32 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK Véleményünk szerint (egyetértve Senior megfigyelésével 36 ) az erősebb C-terminális jelölődés inkább az N-terminus tripszines túlemésztettségével, mintsem valódi katalitikus preferenciával magyarázható. A nukleotid domének közti katalitikus kooperáció A mutánsok tehát eljutnak a BeF x /AlF x -függő komplexek formálásáig, ami arra utal, hogy a Walker A lizin mutációja az első ATP hidrolízisét követő lépést (pl. az ADP disszociációját, a következő ATP elhasítását) gátolja. A hiányzó ATPáz aktivitás egyben bizonyítja, hogy a katalitikus ciklus kieső lépése csak két ép nukleotid-kötő domén katalitikus kooperációja esetén megy végbe. Fenntartható-e ezek után az a modell, mely szerint az MDR1 katalitikus ciklusában a két nukleotid-kötő domén már a katalitikus intermedierek képződésekor kooperál? A mutáció nem akadályozza meg az intermedier komplex kialakulását, a K1076M MDR1 jelölődése vanadát jelenlétében mégis elmarad (az N-terminális K433M mutáns vanadát mellet is jelölhető). A látszólagos ellentmondás feloldására két magyarázat adódik. Az egyik lehetőség szerint a három foszfát analóg anion a katalitikus ciklus különböző stádiumában állítja le a reakciót. A mutáns fehérje eljuthat a fluoro-aluminát és a berillium-fluorid által stabilizálható állapotig, a vanadát számára hozzáférhető intermedier azonban már nem alakul ki. A másik magyarázat szerint a vanadát-függő komplex is kialakul, detekciója azonban térszerkezeti okok miatt nem lehetséges. A katalitikus centrumban megkötött (vagy okklúdált) [α- 32 P]-8-azido-ATP kísérletes detekciója az azido-csoport és egy közeli tirozin között kialakuló UV-indukált kovalens kötésen alapul 83. Előfordulhat, hogy a nukleotid régióban létrehozott KM mutáció úgy változtatja meg a katalitikus centrum térszerkezetét, hogy a vanadát által stabilizált nukleotid azido csoportja távol kerül a kritikus tirozintól (a fluoro-aluminát és berillium-fluorid által stabilizált intermedier térszerkezetében a kovalens kötődés létrejön). Ismert, hogy az MDR1 katalitikus centrumát 2-azido-ATP-vel nem lehet megjelölni, annak ellenére, hogy a 2-azido-ATP a 8-azido-ATP-vel egyenrangú katalitikus szubsztrátnak tekinthető. Véleményünk szerint hasonló okokkal magyarázható, hogy a D551N (Walker B) mutánsban radioaktív azido ATP mellett vanadát-függő nukleotid okklúzió nem volt kimutatható, annak ellenére, hogy a tripszines hasítási profil szerint a fehérjében intermedier komplex képződött 84. Az C-terminális mutáció által előidézett térszerkezeti változás mindkét oldalt egyformán érinti: vanadát jelenlétében sem a mutáns, sem a vad-típusú centrum nem 32

33 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK jelölődik. Ez csak úgy lehetséges, ha a két nukleotid-kötő domén rendkívül szoros kapcsoltságban működik, melynek során az egyik centrumban előidézett változás a másik oldalon is ugyanazt azt a hatást idézi elő. Eredményeink arra utalnak, hogy a két nukleotid-kötő domén a katalitikus ciklus folyamán végig szoros kooperációban, gyakorlatilag egy katalitikus egységként viselkedik (lásd fejezet). A féloldali mutációk ellenére a katalitikus egységben egy ATP hidrolízise még végbemegy. Kétoldali mutáció hatására a kooperáció (katalitikus egység) felbomlik, a fehérje katalitikus gépezete leáll A CFTR katalitikus ciklusának vizsgálata Nukleotid okklúzió vanadát jelenlétében és hiányában Patch-clamp kísérletek szerint (melyekben akár egyetlen fehérje működése vizsgálható) a CFTR által formált kloridcsatorna funkcióját a foszforiláció mellett az ATP szabályozza. Ismert volt, hogy a vanadát gátolja a CFTR működését (a csatornákat nyitott állapotban rögzíti), valamint az is, hogy a CFTR alacsony szintű ATPáz aktivitással bír. Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk, a CFTR katalitikus ciklusa tartalmaz-e vanadát-függő katalitikus intermediert. A kísérletek előtt meggyőződtünk arról, hogy az Sf9 sejtekben expresszált fehérjék aktív csatornákat képeznek, működésük nem igényel további foszforilációt. Az MDR1 vizsgálatánál bevált stratégia szerint a CFTR-t expresszáló Sf9 membránvezikulákat vanadát és [α- 32 P]-8-azido-ATP jelenlétében inkubáltuk 37 o C-on, majd jelöletlen ATP-t (10 mm) tartalmazó eleggyel történő kétszeri mosás után a mintákat UV fénnyel sugaraztuk (lásd Módszerek). A III/2 ábrán látható, hogy az MDR1-hez hasonlóan, a CFTR-ben vanadát jelenlétében stabil intermedier komplex alakul ki. A reakció hőmérséklet függése, NEM-, ill. EDTA-érzékenysége alapján a CFTR-ben a vanadát-függő komplex képződése a katalitikus ciklus parciális reakciójának felel meg. Az MDR1-ben a nagy sebességű katalitikus aktivitás miatt az intermedier komplex (MDR1 MgADP Pi) rövid életidejű, ezért kizárólag foszfát analóggal stabilizált állapotában vizsgálható. A CFTR katalitikus gépezete lassabb (az MDR1 kb.10, a CFTR kb.1 ATP-t hasít el másodpercenként). A reakció viszonylag alacsony sebességének köszönhetően a CFTR-ben a nukleotid okklúzió vanadát nélkül is detektálható, a reakcióelegy gyors lehűtése alatt a ciklusban formálódó intermedier komplex nem esik szét (III/2. ábra). A vanadát nélküli jelölődés csak 37 o C-on jön létre, 33

34 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK az okklúdált nukleotid nem mosható ki hideg ATP-vel. Ha a membránokat a mosás után, de még besugárzásuk előtt 37 o C-ra tettük, a jelölődés eltűnt. Mindezek alapján a vanadát nélküli radioaktív jelölődés a CFTR katalitikus ciklusának hosszú életidejű intermedierét mutatja. Nukleotid domének szerepe az intermedier komplexek formálásában Gadsby és munkatársai 4 a CFTR katalitikus működését ATP-analógokkal végzett kísérletekben vizsgálták. Eredményeik szerint a CFTR két nukleotid-kötő doménje a csatorna szabályozásában különböző funkciót lát el. Modelljükben az NBD1-ben történő ATP hidrolízis a csatornát nyitja és lehetővé teszi az NBD2 magas affinitású kötőhelyén az ATP megkötését. Mikor az NBD2 elhasítja az ATP-t, a csatorna bezárul és az NBD1-ről leválik az ADP. A katalitikus aktivitás közvetlen detekciója lehetővé tette, hogy megvizsgáljuk a CFTR két nukleotid-kötő doménjének működését. Az okklúdált nukleotidokat tartalmazó fehérjéket az UV sugárzás után limitált tripszines kezelésnek vetettük alá. Az III/3. ábrán bemutatott eredmény megerősíti, hogy a CFTR két nukleotid doménje különböző katalitikus tulajdonságú. A C-terminális nukleotid-kötő doménben zajló hidrolízis az MDR1 katalitikus ciklusához hasonlít, parciális reakciója során képződő intermedier csak vanadát jelenlétében detektálható. Ezzel szemben az N-terminális nukleotid-kötő domén vanadát jelenlétében és hiányában is jelölődik, ami arra utal, hogy az intermedier komplex itt is gyorsan kialakul, ám a teljes ciklus a komplex csökkent disszocációja miatt lelassul. Az MDR1 (minden jel szerint) szimmetrikus működésű nukleotid-kötő doménjei 60%- ban megegyező aminosavakból épülnek fel. A CFTR két nukleotid-kötő doménje mindössze kb. 33%-ban egyezik meg egymással. Az eltérő katalitikus aktivitást talán a két NBD konzervált aminosavaiban lévő különbség magyarázza (az NBD1 Walker A és B régiója közötti szekvencia 11 aminosavval rövidebb, az NBD2 signature régiója pedig a harmadik pozícióban szokatlan módon hisztidint tartalmaz (LSHG)). Az ABC transzporterekkel szemben, ahol az ATP hidrolízise a transzportot energetizálja, a CFTR katalitikus aktivitása szabályozó funkciót lát el. Az NBD1 lassult működése talán a szabályozó szereppel járó visszafogott ATP fogyasztást teszi lehetővé. A kísérletek nem válaszolják meg azt a kérdést, hogy az NBD1 a nukleotid elengedése előtt a katalitikus ciklus melyik lépésnél torpan meg. A foszfát analóg nélkül csapdába ejtett nukleotid lehet egyaránt ADP vagy ATP (a kísérletekben használt azido ATP az α foszfáton 34

35 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK hordozza a radioaktív jelet), a lelassult lépés lehet maga a hidrolízis, illetve az ADP vagy az anorganikus foszfát lehasadása b. Eredményeink megerősítik, hogy a CFTR katalitikus egységei egyedi funkciót láthatnak el. Annak eldöntése, hogy a két katalitikus centrum konszekutívan, vagy paralel, akár egymástól függetlenül működik, és a katalízis pontosan hogyan kapcsolódik a CFTR alkotta kloridcsatorna funkciójához, további kísérleteket igényel Intramolekuláris kommunikáció (ABC-signature mutánsok vizsgálata) Míg a Walker A és B motívumok más nukleotid-kötő fehérjékben is megtalálhatók 85, a signature régió kizárólag az ABC család tagjaiban fordul elő. Kísérletek sokasága bizonyítja, hogy a signature szekvenciát alkotó konzervált aminosavak megváltoz(tat)ása a transzporter funkció elvesztésével jár 51,86,87,88,89,90. A signature régió ABC-specifikus szerepe ezzel együtt egyelőre nem ismert. Egyes elképzelések szerint az ABC fehérjék intramolekuláris kölcsönhatásaiban játszik központi szerepet 91,92, más modellekben a nukleotid-kötő felszín kialakításában vesz részt 93. G534 és G1179 szerepe a katalitikus ciklusban A signature szekvencia negyedik pozíciója csaknem valamennyi ABC fehérjében glicint tartalmaz (a Swiss-Prot adatbázisban található 283 NBD szekvencia között mindössze hét olyan található, amelyikben ez a szabály nem érvényesül) 8. A munkacsoportunk által korábban előállított MDR1-mutánsok közül két variáns, az N-terminális signature régióban glicin helyett aszparaginsavat (G534D), vagy valint (G534V) tartalmazó Mindkét mutáns elvesztette ATPáz aktivitását 8. Az MDR1 két nukleotid-kötő doménjének signature szekvenciája azonos (LSGGQKQRIAIAR). Elsőként arra szerettünk volna választ kapni, hogy a C-terminális signature régióban előidézett analóg mutáció (G1179D), és a dupla mutáció (G534D/G1179D) inaktiválja-e az MDR1 ATPázt. A mutációkat PCR-es technikával állítottuk elő. A mutánsokat Sf9 rovarsejtekben termeltettük, a fehérjék expresszióját immunoblotton követtük. Több klón átválogatása után sikerült mind a négy signature-mutáns esetében megközelíteni a vad-típusú MDR1 expresszióját, ami arra utalt, hogy a kérdéses mutációk nem okoztak a fehérjék felcsavarodásában komolyabb problémát (V/1. ábra). b Az ATP és ADP elkülönítése [γ- 32 P]-8-azido-ATP-vel végzett kísérletekkel lehetséges 35

36 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK A signature mutánsok (az Sf9 rendszer háttere mellett) magas ATP koncentráció, illetve transzportált szubsztrátok (pl. verapamil) jelenlétében sem mutattak detektálható ATPáz aktivitást. Ezek az eredmények megerősítik, hogy az MDR1 két nukleotid-kötő doménje kooperál, egyben rámutatnak arra, hogy az MDR1 zavartalan katalitikus aktivitásához a negyedik pozícióban lévő glicin nélkülözhetetlen. Az ATPáz aktivitás hiánya nem feltétlenül jelent egyet a katalitikus aktivitás teljes megszűnésével ( fejezet). Célunk az volt, hogy megvizsgáljuk, vajon a signature-mutánsok eljutnak-e az ATP hidrolízisére utaló katalitikus intermedier formálásáig. Elsőként azt vizsgáltuk meg, hogy az ATPáz aktivitással nem rendelkező mutánsaink képesek-e az ATP megkötésére. A V/2. ábrán látható radioaktív jel az immunoblot alapján az MDR1 variánsokhoz asszociált [α- 32 P]-8-azido-ATP-kötődésének tulajdonítható. Látható, hogy a mutánsok ATP kötése nem különbözik a vad-típusú fehérjétől. A specifikus kötődés további bizonyítéka, hogy a radioaktív ATP analóg hideg ATP-vel leszorítható. Ebből az következik, hogy (hasonlóan Walker A mutánsokhoz) a signature régióban kialakított mutációk a katalitikus ciklus valamely későbbi lépését befolyásolják. A következő kísérleteket 37 o C-on, foszfát analógok jelenlétében végeztük el. Amint a V/3. ábráról leolvasható, fluoro-aluminát jelenlétében mind a három egyszeres mutáns (G534D, G534V és G1179D) jelölődött (berillium-fluorid a fluoro-alumináttal megegyező eredményt adta). A radioaktív ATP beépülése a mutánsokban jelentősen elmaradt a vad-típusú fehérjétől (40-60%), a reakció azonban Mg2+-függő, NEMszenzitív volt, a jelöletlen ATP-vel történő preinkubáció a jel eltűnésével járt. A kétszeres mutáns (G534D/G1179D) nem jelölődött. Ez az eredmény arra utal, hogy a féloldali mutációk ellenére a katalitikus centrum eljut addig a konformációig, melyben a nukleotid kívülről már nem hozzáférhető (ez az állapot a vad típusú MDR1-ben az első ATP hidrolízisének felel meg). A gyengébb jelölődés valószínűleg azzal magyarázható, hogy a signature-mutánsokban már az intermedier komplex képződése is lelassul. A 40-60%-os beépülés ezzel együtt nem magyarázza a katalitikus aktivitás defektusát (a mutánsok ATPáz aktivitása a vad-típusú fehérjék aktivitásának maximum 5 %-át érheti el), amiből az következik, hogy a mutáció az első ATP hidrolízisét követő lépés(eke)t (pl. az ADP disszociációját, a következő ATP elhasítását) is gátolja. A G534V mutánsban a radioaktív jel 20-40%-a foszfát analógok nélkül is megmaradt. Ez azt jelenti, hogy ebben a mutánsban (a CFTR N-terminális nukleotid-kötő doménjához 36

37 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK hasonlóan) a nukleotid disszociációja lassabban megy végbe, a reakcióelegy gyors lehűtése alatt az intermedier komplex nem esik szét. Felmerült, hogy a gyengült beépülés az alacsonyabb alap aktivitás következménye, mely esetleg transzportált szubsztrátokkal fokozható. A vad-típusú MDR1-ben a transzportált szubsztrátok gyorsítják az intermedier komplexek formálódását (II/1. ábra). Meglepetésünkre a signature mutánsok jelölődése verapamil jelenlétében tovább gyengült (V/3. ábra). A kísérletet megismételtük több transzportált szubsztrát (calcein- AM, vincristin) jelenlétében, a jelölődést valamennyi drog gátolta (V/4. ábra). Ugyanakkor a vad-típusú MDR1 katalitikus aktivitását nem befolyásoló 5-fluorouracil (mely nem transzportálódik) a signature mutánsokra sem volt hatással. Az ATP és a drog-szubsztrátok megkötése a vad-típusú MDR1-ben függetlenek egymástól. Az ATP kötés verapamil jelenlétében a signature-mutánsokban sem változott, a transzportált szubsztrátok gátló hatása tehát nem az ATP-kötés gátlásával magyarázható. Intramolekuláris kommunikáció A signature régió első pozíciójában (LSGG) az univerzálisan konzervált leucin helyett arginint tartalmazó mutáns szintén elvesztette ATPáz aktivitását. Nem publikált eredményeink szerint az L531R mutáns ATP kötése megegyezik a vad-típussal, a vanadát-függő intermedier komplex képződését (mely csak CoATP jelenlétében detektálható) a drogok gátolták. A tanszportált szubsztrátok meglepő hatása arra enged következtetni, hogy a signature-mutációk a drog-kötő hely és a katalitikus centrum közötti molekuláris kommunikációt zavarták meg. (A Walker A mutánsok ezt a szignált nem érintették, a detektált parciális reakciót a transzportált szubsztrátok a vad-típusú MDR1-hez hasonlóan serkentették). Munkacsoportunk korábban több olyan mutánst jellemzett (G185V, MDR1), melyekben az ATPáz reakció félmaximális aktivitásához tartozó drog-koncentrációk [C 50 ] olykor két nagyságrenddel is megnövekedtek. Az MDR1 szubsztrát-specifitását (szubsztrát-érzékenységét) megváltoztató mutációk többnyire a transzmembrán doménban találhatók. Ugyanakkor a nukleotid-kötő domének részletes mutációs analízise kiderítette, hogy létezik olyan NBD mutáns, mely elsősorban rezisztencia profiljában különbözik a vad típustól. (Érdekes módon a mutációk a közvetlenül az N- terminális signature szekvencia előtt található ERGA motívumot érintették, lásd fejezet). A kísérletek szerint azonban a megváltozott profilú NBD mutánsokban a drog kötése nem szenvedett zavart. 94 Mindezek alapján joggal feltételezhető, hogy a 37

38 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK vizsgálatba vont signature mutánsok katalitikus aktivitását a transzportált szubsztrátok nem a drogfelismerés primer zavara miatt gátolják. Valószínű, hogy a hiba a drogkötő hely(ek)ről érkező szignál továbbításában van. Eredményeink megerősítik azt az általánosan elterjedt feltételezést, hogy a signature régió a katalitikus apparátus és a drog-szubsztrát kötő helyek között zajló információáramlást biztosítja. A HisP monomerben elfoglalt pozíciója alapján a signature régió képes lehet effajta információ továbbítására (lásd Bevezetés). Az intradomén szignál (a drog-kötő helytől a signature hélixen keresztül a katalitikus felszínig) a signature régió és az ATP közti távolság miatt csak közvetetten, más aminosavakat érintve valósulhat meg. Mutációk vizsgálatából kiindulva a molekuláris láncolat egyes tagjai talán azonosíthatók, a HisP szerkezetén alapuló modell azonban nem magyarázza, hogy a signature mutánsok minden általunk vizsgált drog esetén ATPáz negatívak maradtak (A HisP S155F signature mutációja szintén ATPáz negatív fenotípust eredményezett 24 ) A NUKLEOTID-KÖTŐ DOMÉNEK DIMERIZÁCIÓJA Valamennyi eddig ismert ABC ATPáz funkcionális egysége dimert alkot. A két ATPkötő domén közti együttműködés megismerése kulcsfontosságú az ABC fehérjék általános működésének megértéséhez. Szerkezeti adatok hiányában az MDR1 két nukleotid-kötő doménje közti szoros kooperáció molekuláris részleteit bakteriális ABC fehérjékben talált dimerek mintájára képzelhetjük el. Jelenleg két dimer szerkezete ismert. A HisP dimerben az ABC egységek egymásnak hátat fordítanak, az ATP-kötő felszínek a dimer ellentétes oldala felé néznek (2.4. ábra). A Walker A és B motívumok által határolt nukleotid-kötő felszín periferiális, nyitott helyzetű. A dimerizációs felszínt az I. kar β-redői alkotják, a kapcsolat hidrofób kötéseken keresztül valósul meg. Egy teljesen eltérő dimer létezésére utal a HisP szerkezetét közlő cikk egyik ábrája, melyen az ATP kötésében közvetlenül szerepet játszó aminosavak vannak feltüntetve. Az ábra (melyet a szerzők nem diszkutálnak és a koordináták sem elérhetők) egy alternatív dimerizációjú kristályszerkezet alapján készült 24 előbb. Az alternatív dimerben az ATP-kötő zsebet az egyik fehérje Walker régiói a másik HisP molekula signature régiójával közösen alakítják ki. Megegyező szerveződést mutat a Pyrococcus furiosus DNS-repair komplexének egyik alkotórésze, a Rad50 95 dimerje is. A Rad50 lineáris szerkezetében megtalálható konszenzus elemek szerint az ABC ATPázok 38

39 EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK családjába tartozó fehérje. A DNS kötő felszín kialakítása a katalitikus (ABC) alegység ATP-függő dimerizációja során alakul ki. A Rad50 katalitikus ABC doménjének alapszerkezetében megtalálható a β-redőkből álló központi régió (I) és az attól L alakban elágazó helikális egység (II). A nukleotid-kötő felszín kialakításában a Walkerszekvenciák mellett a signature régió is részt vesz, oly módon, hogy az egyik alegység signature-aminosavai a másik alegységen kötött ATP-vel hatnak kölcsön ( head-to-tail orientáció, 6. ábra). 6. ábra A Rad50 dimer szerkezete 2 ATP-vel. A fej-láb orientáció következtében az ATP-kötő zsebet az egyik alegység Walker régiói (kék: Walker A, rózsaszín: Walker B) a másik alegység signature régiójával (piros) közösen alakítják ki. A képet a PDB koordináták (1F2U) felhasználásával, a SwissPDB Viewer programmal készítettem. A komplementált kötőhelyben az ATP az egyik alegység P-loop-ja és a másik alegység signature régiója között helyezkedik el. A signature-szekvencia szerinje és a negyedik glicin (LSGG) közvetlenül kapcsolódnak az ATP γ-foszfátjához. A HisP-szerkezet által javasolt dimerizációs felszínt érintő mutációk a Rad50 működésében nem okoztak 39