POLISZACHARIDOK (BIOPOLIMEREK) FERMENTÁCIÓJA

Átírás

1 POLISZACHARIDOK (BIOPOLIMEREK) FERMENTÁCIÓJA A növényi poliszacharidokat régen alkalmazzák: keményítı, cellulóz, agar-agar, alginát, pektin, inulin (ß(2 1). A mikróbiális poliszacharidokat csak néhány évtizede használják, pedig sokféle van belılük: dextrán, xantán, pullulán, szkleroglukán, leván, ciklodextrin Funkció a természetben: Lokalizáció a sejtekben: kiszáradás ellen fagocitózis, fágok ellen tartalék tápanyag immunológiai determináns sejtfal komponens (felületi makromolekulához kapcsolódik) Extracelluláris komponens: nyálkahártya: zselés kolónia, viszkózus tenyészoldat Felhasználás: Egyedülálló kolloidikai tulajdonságok: Viszkozitás-növelés, állag javítás Pszeudoplasztikus tulajdonságok: kis nyíróerı: nagy viszkozitás nagy nyíróerı: kis viszkozitás Jó szivattyúzhatóság, porlaszthatóság, festékek Szerkezeti viszkozitás: áramlás xantán Folyási hımérséklet: a viszkozitás függ a hımérséklettıl és a nyírástól Olvadáspont A T m feletti hımérsékleten már viszonylag kicsi a viszkozitás változása

2 Más polimereknél is fellép a jelenség, csak magasabb hımérsékleten: Polimer T m (kb.) ºC xantán 120 szukcinoglikán 70 szkleroglikán 150 velán 150 Gélképzés: (gélek: ld. Fiz-kém) általános poliszacharid tulajdonság: agar gél, pektin gél, alginát (Ca-ot igényel, poliglükuronát) 2. Exopoliszacharidok szerkezete: Alkotó komponensek: nagy változatosság, a szénhidrátok mellett szerves savak Cukorsavak: -on-savak, -uron-savak, -ár-savak. Ecetsav, propionsav, piroszılısav, glicerinsav, borostyánkısav. Aminosavak: szerin, glutaminsav Felépítés szerint: Homo-poliszacharidok Hetero-poliszacharidok - Homo poliszacharidok: egyféle monoszacharid egység polimerjei: Ábrázolási módok (LINEÁRIS) CURDLÁN (OLDALLÁNC) SZKLEROGLIKÁN (ELÁGAZÓ) DEXTRÁN 2

3 A pullulán szerkezete: - Hetero poliszacharidok: különbözı cukrokat tartalmazó, több tagból álló, ismétlıdı alegységekbıl épülnek fel. példa: a xantán szerkezete háromféleképpen ábrázolva 3

4 A poliszacharidok közé sorolhatók még: Poli-hidroxi-butirát: 3-OH vajsav észterkötéses polimer (lehet 4-OH vajsav is) 3. A poliszacharidok bioszintézise általában: a bioszintézis a citoplazmában történik, ezután (közben) kijut a külsı térbe dextrán, leván: extracelluláris szintézis: transzglükozilálás Fontos anyagcsereutak: - energiatermelés a poliszacharid szintézishez - cukor és cukor-foszfát interkonverziók (ábra): A monomer-bioszintézis tipikus templátja: UDP, GDP + Acetil CoA: ecetsav transzfer 4

5 Példa: xantán bioszintézise: A bioszintézis genetikai háttere: a Xanthomonas campestrisben egy operonban található a 12 gén: a Xantán cluster nagy operon: 16 Kb DNS szekvencia: 12 gén hasítás BAM H1 restrikciós enzimmel 1 Az egyes gének biokémiai funkciói: I-V: transzferáz, I-V. Acy: acetiláz, I-II Ket: ketáláz, Pol: polimeráz, Exp: export 2 Xantán gének, gumb-m 3 BAM H1 restrikciós térkép, amely megadja a 16 Kb-os xantán cluster fragmenseinek hozzávetıleges méretét (Kb) 4. POLISZACHARID FERMENTÁCIÓ (általános elvek) Tápközeg: szénforrás: szacharóz (dextrán, leván), glükóz (többi poliszacharid) + a szokásos kiegészítık Fermentor: m 3, különleges keverıvel (a nagy viszkozitás miatt problémás a megfelelı levegıztetés) Feldolgozás: - betöményítés (pl. ultraszőréssel) - oldószeres kicsapás 5

6 TERMÉKEK, TECHNOLÓGIÁK XANTÁN A legnagyobb mennyiségben termelt poliszacharid: t/év 408 M USD/év Törzs: Xanthomonas campestris növénypatogén: káposzta, gyümölcsfák Minden kimenı anyagot sterilezni! Könnyen befertızıdik: xantán burok miatt t g =nagy, lassan növekszik Glükóz + NH 3 : N-forrás szabja meg a végsı %-ot (N-limit) (a glutamátot helyettesítheti) Törzsfenntartás, inokulum-készítés: Cseppfolyós N 2 (t < - 80 C), liofilezett törzstenyészet Papírcsík inokulum : 1 évig stabil 4 C - on Fermentáció: ph: 6 7,5 (xantán opt. ph: 7; ph: 5 alatt a folyamat lelassul!) Hımérséklet: az elviselhetı maximumig emelik: viszkozitás csökken, OTR: nı OTR: lásd alábbi ábra 3% xantán viszkozitása: cp felett! Elmenı levegı: szőrés. Növénypatogén! Oxigen transfer rate OTR 6

7 Kinetikája: I típusú fermentáció: Ábra: xantán gumi batch fermentációja X. campestris-szel 4 5 % glükóz g xantán/l; konverzió: 70 % -os. ph szabályozás: 7 ± 0,3. (Savképzıdés: termékképzés lelassul, leáll.) Oxigénátadás: ne legyenek holt terek Nagy átmérıjő keverı (kavaró). Buborékok: ha nagy: gyorsan felszáll és kis relatív felület: OTR kicsi ha kicsi: stabil diszperzió (áll a buborék) egyensúlyi gázösszetétellel: OTR kicsi SZUKCINOGLIKÁN: III. típusú fermentáció, N-limit. Ábra: Szukcinoglikán batch fermentációja Pseudomonas fajjal 7

8 DEXTRÁN glükóz polimer: lineáris rész: α(1-6), elágazás α(1-4) kötéssel Bioszintézis: transzglikozilálás Szacharóz Leuconostoc mesenteroides Dextrán szacharáz dextrán +(n-1) fruktóz Irreverzibilis 100 %-os konverzió. Molekulatömeg: Cukorgyárakban: léfertızıdés Fermentáció: % szacharóz + 2% CSL. Elıbb a sejtnövekedés, aztán a termékképzıdés. A dextránképzéshez nem kell levegıztetés, csak keverés = O 2 limit (2 nap) 0,5 g/l baktérium 80 g/l dextránt termel Gyakorlatilag nyugvósejtes technológia. Elvileg lehetne enzimesen is, de nem gazdaságos Tejsavképzıdés: a ph szabályozás közönbösíti Feldolgozás: kicsapás metil-alkohollal, szőrés, oldás pirogénmentes vízben, újabb metilalkoholos kicsapás. Felhasználás: Vérplazma-pótló: a) részleges sósavas hidrolízis 100 C-on. lebontás (viszkozitás csökkenés.) Frakcionált kicsapás kis molekulatömegő vérplazma, nagy molekulatömegő: visszavezetés a hidrolízisre b) Enzimes hidrolízis: dextranáz P. funiculosum Dextrán gél (kromatográfiás töltet): térhálósítani kell, vízoldhatatlan, inert, hidrofil szemcsék c) vizes kétfázisú extrakciónál fázisképzı LEVÁN: Szacharóz Leván szacharáz leván +fruktóz+glukóz Aerobacter levanicum Bacillus subtilis Konverzió: 62 % 2 3 fruktozid kötés : fruktóz polimer Polihidroxibutirát (PHB) (3-OH vajsav polimer): észter (lehet 4-OH polimer is) Polihidrroxi-alkanoát (PHA): (5 15 szénatomos sav) Alcaligenes enthrophus ICI 1982 Szabadalom: ipari törzs: BIOPOL A sejt 80 %-a PHB: granulumban: tartalék tápanyag Biodegradábilis, biokompatibilis polimer monomer. 1. DOWN STREAM mőveletek a.) Ultraszőrés (+porlasztva szárítás) 5 10 szeres koncentrálás (xantán). - dezinficiálni az oldatot (biol. Lebontás) hátrány! 8

9 - Kis molekulatömegő komponensek (tápoldatból) eltávoznak elıny. - Olcsóbb, nincs oldószervisszanyerés b.) Szerves oldószeres kicsapás: Metanol, Etanol, aceton, propan -2-ol Xantán: oldószer mennyisége csökkenthetı (4x-re): Ca, K adagolásával. (Melegítés: C, 1 15 ) Szárításnál vigyázni: robbanásveszély. Szárazon tárolandó: biológiai lebontás. Élelmiszer célra (FDA): sejt/g max! Propilén-oxidos dezinficiálás + hı : megöli a sejteket. Kicsapás: Metanol; ph=5,6; 25% MeOH: viszkozitás csökkenés: centrifugálással: a sejt és a lebegı részek eltávolíthatók + 2 % KCl + 70 % MeOH: csapadék, szőrés 2. ALKALMAZÁS - Por (élelmiszer célra: dezinficiálás) - Oldat 8 % ( + dezinficiáló anyag eltartás) Xantán: 60 % Élelmiszeripar: cukorkamáz, salátadresszing, fagylalt, jam, szósz: viszkozitás növelı 15 % fogpaszta, emulziós festékek (cseppenésmentes festék), textil 15 % olajipar: fúrásnál másodlagos olajkinyerés (víz helyett) (Ca alginát sejt enzim immobilizálás: enyhe körülmények!) Dextrán: Vérplazma pótló: 6 %-os oldat, Molekulatömeg Sephadex: gélkromatográfia Vizes kétfázisú rendszer elválasztás: kis felületi feszültség Liganddal: Enzimek PEG-Dextrán: növelni a megoszlást PEG-hez kapcsolt 3. CIKLODEXTRINEK (CD) (Schardinger dextrinek) (Szejtli J.) α - amilázzal hidrolizált (burgonya) keményítı ciklodextrin-glikoziltranszferáz (CGT-áz) (lineáris és) győrős dextrinek CD izolálás CGT-áz: 1. Bac. macerans 2. Alkalofil Bakt Klebsiella pneumoniae (patogén) klónozták B. subtilis-be. CGT-áz gyártás: mikroba tenyésztés, CGT-áz izolálás CD gyártás: 1. Elıhidrolízis: α amilázzal 5 % keményítı 10DE értékig 2. Konverzió: CGT-ázzal 34 C-on. 58 % konverzió 3. α-, β-, γ- CD arány szabályozása (6,7,8 glükóz) 9

10 Ábra: a ciklodextrinek szerkezete n = glükopiranóz egységek száma. n = 0: α-cd, 1: β-cd, 2: γ-cd a.) Mikrobától is függ: 1,3 kezdetben elsısorban α-t 2. Kezdetben elsısorban β-t. b.) Toluol adagolás: β-val zárványkomplex (α β), a végén: 90 % β CD, 1 % αcd. c.) 1-dekanol adagolás: 36 % αcd és 3,7 % β CD d.) Enzim mennyiség 15 E CGT-áz/g keményítı : 24 % CD 90 E CGT-áz/g keményítı : 56 % CD β CD termelés: 33 %-os Keményítı. ph=7,2 (HCl), Ca(OH) 2 + B. subtilis α-amiláz 80 C, 10 hidrolízis. E. inaktiválása: 120 C, 30 Konverzió: 50 C CGT-áz, 5 % toluol + keverés 105 h! Komplex szőrés, vákuum bepárlás (toluol elmegy), szőrés, krist. α CD termelés: jól oldódik, kristályosítani nehéz. Komplexáló vegyület: decanol Konverzió. Oldékonyság 140 mg/ml. Nincs β és γ Kitermelés: 50 %. Dekanol vízgızzel eltávolítható γ CD termelés: β CD gyártás mellékterméke. 750 g keményítıbıl 14 g γ CD nyerhetı ioncserélı oszlopon. Komplexáló szerrel: metil-etilketon-α-naftol keveréknél Konverzió CGT-ázzal. Oldhatatlan komplex. Metanolban oldódik. Ioncsere, aktívszenes tisztítás. Kitermelés: 20 % Elágazó CD: az 1,6 kötés beépülésekor 1,2,3 glükóz lehet a győrőn CD származékok: OH-hoz köthetı. Legnagyobb mennyiség: metil, hidroxipropil CD. (Fig.4) Ilyenkor az oldhatóság, a komplexképzı tulajdonság, és a vendégmolekula reaktivitása is módosul A CD gazda molekula adduktot, inklúziós komplexet képez a vendégmolekulával (Fig.3.) α, β, γ és származékok: gazdamolekula választék: különbözı vendéget köt. Így növelni lehet az oldhatóságot: terfenadin (antiallergikum): 60 mg/6 l víz 60 mg komplex/1 ml víz. A reaktivitás is változik: ált. csökken (Fig.6.) + Gyógyszerek 10

11 Ábra: Az inklúziós komplexek képzıdésének vázlata. A kis körök jelölik a vízmolekulákat, amelyeket mind a hidrofób p-xilol molekula (potenciális vendég molekula), mind a ciklodextrin hidrofób ürege taszítja. Az inklúzió hajtóereje fıként az apoláros-poláros kölcsönhatások (pl.: az apoláros CD-üreg és a víz, vagy az apoláros vendégmolekula és a víz között) apoláros-apoláros kölcsönhatásokra (vendégmolekula CD-üreg) való kicserélıdése jelenti. 11

12 Alkalmazás 1. Gyógyszer: oldhatóság nı, felszívódás Biohozzáférhetıség nı Gyors oszcilláció Injekciók: vízben nem oldható vegyületek üreg méret: 1 mol: 1 g: Ábra: a β-ciklodextrinek szerkezete és az α,β illetve γ ciklodextrinek hozzávetıleges üregméretei Stabilizál: nem párolog el, oxidálás ellen, hıstabilitás nı Irritáló hatás csökken (indometacin) Prostaglandin E 2 - β-cd: szublingualis (szülés indítás) Prostaglandin E 1 - α-cd: injekció (érszőkület) Benexate- β-cd: gyomorfekély Fokhagymaolaj β-cd: koleszterin csökkentés Prognózis: néhány 100 t/év felhasználás 2. Élelmiszer, kozmetikum: Íz, zamat: illó vegyület stabilizál. Oxidálás ellen véd. Hagyma β-cd: Élelmiszeraromák (Magyarországon 1983 óta) Alacsony koleszterint tartalmazó vaj elıállítása (Belgium): olvadt vaj + β-cd, 1 lépésben a koleszterin 90 %-a eltávolítható 12

13 Kellemetlen íz, illat eltávolítás: kávé, tea, keserő íz. Kávé oldószermentes koffeinmentesítése Kozmetikumok: hosszú ideig megtartják az illatot 3. Biotechnológia: Mikrobiológiai konverzió Hidrokortizon β-cd prednisolon (Udvardyné 1983) aciláz Lanatozid C dimetil CD digoxin Hozam:20 % % Β-glükozidáz Ábra: a lantanozid C enzimes hidrolízise digoxinné. D = digitoxóz, G = D-glükopiranóz, Ac = acetil csoport Bordatella pertussis: zsírsav inhibeálja a növekedédt. + β-cd zsírsav komplex: jó szaporodás Mycobacterium leprae: nem szaporodott fermenterben, mivel az esszenciális palmitin és sztearinsavat nem tudta a vizes fázisból felvenni + dimetil β-cd: növekedés A dimetil β-cd zsírsav komplex helyettesíti a szérumot állat szövettenyészetekben: interferon, MCAB termelés Szennyvíz detoxifikálás. Klórozott aromás vegyületeknél: β-cd szennyvíz kis konc. nagy konc. nagy konc. eleveniszap nem toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a metabolizmus megy toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a metabolizmus leáll nem toxikus a mikroorganizmusokra nézve, a metabolizmus megy Ábra: a mérgezı vegyületek tolerálható szintjét növeli a CD hozzáadása a mérgezı szennyvízhez 13

14 Biospecifikus elválasztás: amilázok megkötése Mátrix CD D E CD D CD D S E- komplex CYCLODEXTRIN GLIKOZILTRANSFERÁZ (Bac. Circulans) EC Klebsiella pneumoniae: E. klónozás B. subtilis-be α- amilázzal hidrolizált keményítı 10 DE-ig E Lineáris és győrős dextrinek CD izolálás β-cd elıállítás 1.) 33 %-os keményítı: ph: 7,2, Ca ++, α- amiláz, 80 C, 1 h: hidrolízis 2.) 100 C, 30, E, inaktiválás 3.) 50 C, 100 h, 5 % toluol, E 2, konverzió 4.) Bepárlás: toluol elmegy Kristályosítás: Hozam: 90 % β-cd α-cd elıállítás Konverzió: dekanol. Csak α-cd képzıdik Hozam: 50 % Dekanol vízgızzel eltávolítható 14

15 Ciclodextrin (CD): α(6c), β(7c), γ(8c). Származékok Ábra: A kristályos heptakisz(2,6-di-o-metil)-β-ciklodextrin (DIMEB) és a véletlenszerően hidroxipropilált β-ciklodextrin szerkezete. Az iparilag elıállított nem kristályosítható, véletlenszerően metilezett β-ciklodextrin (RAMEB) ugyancsak kb. 14 metoxi csoportot tartalmaz, de véletlenszerő eloszlással. 15

16 Oldott enzim, vizes fázis: α, β és γ keverék képzıdik ph: 6, T= 55 C Hozam: α=23 %, β=11 % A ciklodextrin inhibitálja az enzimet. α megkötés: sztearinsav ligandon kitozán hordozón. Szelektivitás: 100 %. β megkötés: ciklohexán propánamid és n-kapronsavval. Toluol. α β (90 %) Az adszorbciós kolonnába vezetés elıtt hőtés 30 C-ra és 3 5 NaCl adagolás: megakadályozza az E. adszorpcióját a kolonnán MARCIAN Co. Japan termelés A CD gazdamolekula vendégmolekula. Addukt inklúziós komplex Ábra: a β-ciklodextrinek szerkezete és az α,β illetve γ ciklodextrinek hozzávetıleges üregméretei 16

17 Ábra: A gazda-vendég kölcsönhatás vázlatosan. Az inkúziós komplex egy igen mozgékony tároló, amely az egyébként lassan oldódó szabad vendégmolekulát konstans koncentrációban tartalmazza. Ábra: A megfelelı vendégmolekulákkal alkotott duplex CD szerkezetekkel létrejöhetnek akár K dis dm 3 /mol inklúziós komplexek is 17

18 Ösztradiol Progesztreron ampicillin prosztaglandin F Ábra: hatóanyag-ciklodextrin komplexek 18