5. Mikrobiális poliszacharidok

Átírás

1 5. Mikrobiális poliszacharidok Poliszacharidok Az ipari léptékben termelt/használt poliszacharidok túlnyomó része növényi eredetű: keményítő, cellulóz, pektin, agar-agar, inulin, guar gum De egyes speciális célokra terjednek a mikrobiális poliszacharidok is: gélképzés viszkozitás növelés (pszeudoplasztikus, tixotróp, viszkoelasztikus oldatok) 2 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 1

2 Poliszacharidok Ipari léptékben termelt extracelluláris mikrobiális poliszacharidok: xantán, dextrán, leván, pullulán, szkleroglükán, kurdlán, (ciklodextrinek) Sőt újabban már az alginátot és a heparint is inkább mikrobiológiai úton termelik. 3 Reológiai tulajdonságok Viszkozitás: függ a hőmérséklettől és a nyírástól Olvadáspont : egy jellemző hőmérséklet (T m ) felett hirtelen csökkenés szerkezeti viszkozitás Nyírás: pszeudoplasztikus jelleg: kis nyíróerő nagy viszkozitás; nagy nyíróerő kis viszkozitás 4 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 2

3 Reológiai tulajdonságok 5 Reológiai alapok viszkozitás = nyírófeszültség nyírósebesség τ µ = γɺ 6 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 3

4 Reológiai alaptípusok 7 Pszeudoplasztikus folyadék kis nyíróerő nagy viszkozitás; nagy nyíróerő kis viszkozitás 8 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 4

5 Poliszacharidok A poliszacharidok biológiai funkciója: Védelem kiszáradás ellen Védelem fagocitózis, fágok ellen Tartalék tápanyag (xantán nem) Immunológiai determináns Lokalizáció: extracelluláris (oldat, nyálka) sejtfalhoz kötve sejtmembránhoz kötve 9 Exopoliszacharidok szerkezete Homopolimerek: egyféle monomerből épülnek fel dextrán (glükóz) leván (fruktóz) kurdlán (glükóz) pullulán (glükóz) alginátok (guluronsav, mannuronsav) szkleroglükán (glükóz) Heteropolimerek: ismétlődő egységei többféle molekulából tevődnek össze xantán (glükóz, mannóz, glükuronsav, ecetsav, piruvát) 10 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 5

6 Homopoliszacharidok 11 Homopoliszacharidok Pullulán: glükóz monomerek statisztikusan (1-4) és (1-6) kötésekkel összekötve 12 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 6

7 Heteropoliszacharid: xantán 13 Poliszacharidok bioszintézise Templát: UDP, GDP 14 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 7

8 A xantán bioszintézise 12 lépés 12 gén egy operonban = xantán cluster 1. az öt szénhidrát a sejten belül épül össze (lipid karrieren) 2. ezeket az alegységeket egy enzim exportálja 3. a sejten kívül történik a polimerizáció és a származékképzés (+acetát, +piruvát) 15 Poliszacharidok fermentációja Közös jellemzők: Tápközeg: normál, C-forrás: glükóz, speciálisan szacharóz (dextrán, leván) bőséges C-ellátás kell (C/N arány > 10) ph=6-7,5 (baktériumok) Levegőztetés: igen intenzív, mert a viszkózus közegben nehéz megfelelő anyagátadást elérni különleges keverők Downstream műveletek: szerves oldószeres kicsapás: metanol, etanol, aceton, propan- 2-ol, n-propanol (porlasztva) szárítás 16 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 8

9 Dextrán Szerkezete: elágazó láncú glükóz polimer, mint az amilopektin, de: a kötések túlnyomó része (1-6), mellette kevés (1-4), (1-2) és (1-3) A lánc elején egyetlen fruktóz van. 17 Dextrán előállítása Bioszintézise: Egylépéses biokonverzió: transzglikozilálás (ld. BIM) Irreverzibilis reakció: ~100% konverzió Lehetne az enzimet tiszta formában kinyerni (extracelluláris), de a fermentlében végrehajtani gazdaságosabb. Cukorgyárakban: léfertőződés - dugulások 18 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 9

10 Dextrán fermentációja BIOGAL technológia: L. mesenteroides tejsavbaktérium, anaerob előbb a sejtszaporítás, aztán a termékképzés tápoldat: 10-20% szacharóz + 2% CSL + foszfát levegőztetés nem kell, csak keverés ph szabályozás: 5,0 5,2 a képződő tejsavat közömbösíteni kell 0,5 g/l baktérium ~80 g/l dextránt (átlagos móltömeg: ~ ) termel, + esetleg a fruktóz is hasznosítható Kinyerés: kicsapás alkoholokkal, szűrés 19 Dextrán felhasználása Vérplazma pótlásra: csak a Daltonos frakció felel meg (6%-os oldat), ezért hidrolízissel aprítani kell: - sósavas hidrolízis 100 C-on, vagy - enzimes hidrolízis: dextranáz (P. funiculosum) azután: frakcionált kicsapás alkoholokkal: a kis molekulatömegű (40-60 kda) frakció vérplazma pótló nagy molekulatömegű frakció vissza a hidrolízisbe Sephadex gélek (gélkromatográfia): térhálósított dextrán 20 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 10

11 Leván Fruktóz polimer (2-3 fruktozid kötés) Bioszintézis: analóg a dextránnal: transzglikozilálás Sokféle törzs termeli Konverzió: ~62% Felhasználás: élelmiszeripar gyógyszeripar kozmetikai és festékipar (gumiarábikum helyett) 21 Xantán Szerkezete még egyszer: Móltömeg: 2-15 millió 2-3 lánc spirált alkothat 22 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 11

12 Xantán termelés Bioszintézise: már volt Gyártás: ~ t/év (erősen ingadozik) Törzs: Xanthomonas campestris növénypatogén (káposzta, gyümölcsfák) a technológiából nem kerülhet ki élő sejt (kimenő levegő szűrése, lé utópasztőrözése) A xantán burok miatt rossz az anyagátadás a környezettel lassan növekszik, más törzsek könnyen túlnövik Törzsfenntartás, inokulum készítés: Papírcsík inokulum technika 23 Xantán fermentáció C-forrás: glükóz (4-5 %), N-forrás: komplex, szerves anyagok (0,05-0,1%) Hőmérséklet: C ph: 7 ± 0,3, a képződő savakat közömbösíteni kell, ph = 5 körül a termelés már lelassul. Fermentációs idő: óra Konverzió: %, azaz g/l A (látszólagos) viszkozitás cp (= millipa.s) -ig emelkedhet 24 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 12

13 Xantán fermentáció levegőztetése Levegőztetés: a viszkózus lé miatt rossz a tömegátadás, speciális, nagy átmérőjű keverők, ne legyenek holt terek. A buborékok nehezen szállnak fel BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 13

14 A xantán feldolgozása Hőkezelés: 90 C-on pasztőrözés, a mikrobák elölése Kicsapás: valamelyik alkohollal (metanol izopropanol) Elválasztás: ülepítő centrifugával Szárítás: max. 50 C-on, tálcás vagy vákuum szárító Őrlés 27 Xantán felhasználása 60 % Élelmiszeripar: cukorkamáz, saláta-dresszing, fagylalt, jam, szósz: viszkozitás növelő 15 % fogpaszta, emulziós festékek (cseppenésmentes festék), textilipar 15 % olajipar: fúrásnál másodlagos olajkinyerés (víz helyett), fúróöblítő folyadék 28 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 14

15 Xantán felhasználása Fúróöblítő folyadék: olajfúrásnál a fúrófej körül erős nyírás érvényesül kicsi a viszkozitás, jó a hűtés. A felszálló áramlásban kicsi a nyírás nagy a viszkozitás, lassítja a kőtörmelék ülepedését. 29 Egyéb mikrobiális poliszacharidok Pullulán törzs: Aureobasidium pullulans, élesztőszerű gomba a-1,4- és a-1,6 glükán szerkezet Változó molekulatömeg Vízoldható, vizes oldata igen viszkózus Jó adhéziós tulajdonság Nem toxikus Fermentáció: 4 % cukor, 5 nap, ~70 % hozam Felhasználás: filmek, fóliák készítése 30 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 15

16 Egyéb mikrobiális poliszacharidok Szkleroglükán Törzs: (Sclerotium rolfsii, S. glucanicum) β-glükán: nagyrészt β1-3 és kevés β 1-6 kötés Vízoldható Pszeudoplasztikus tulajdonság Felhasználás: kőolajfúrási iszapok stabilizálására festékek, tinták készítésére növényi magbevonat ragasztójaként 31 Egyéb mikrobiális poliszacharidok Alginát, alginsav Mannuronsav β(1-4) polimer, α-guluronsavval, homopolimer blokkok váltják egymást anionos jellegű (vö. pektin) Barnamoszatok sejtfalában fordul elő (Laminaria fajok), innen nyerték ki, ma fermentálják is (Ps. aeruginosa, Azotobacter vinelandii). 32 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 16

17 Alginát Viszkózus, gumiszerű anyag, vízben nem oldódik, de sok vizet köt meg. Kationkötő, kationcserélő, Ca 2+ ionokkal gélt képez (sejtek bezárása) Felhasználása: a gyógyszeriparban széles körben alkalmazzák égési sérülések esetén elősegíti a sérült rész gyógyulását fémmérgezés esetén fémek megkötésére használják élelmiszerekben sűrítőanyagként, stabilizálószerként, zselésítő anyagként, valamint emulgeálószerként használják E400 néven. 33 HIALURONSAV Diszacharid egységekből (1-3 glükuronsav glükózamin) álló polimer. Polfoka változó, több milliós móltömegig. Az élőlényekben sok helyen fordul elő, legnagyobb koncentrációban a kakastaréjban. Gyógyszerként: Zn-hialuronát Curiosin 34 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 17

18 HIALURONSAV 2. Szerepe többféle: Kenőanyag izületi felszíneken Sejtek mechanikai védelme Sebgyógyulás folyamata Magzati fejlődés, differenciálódás Alkalmazásai: Égések, forrázások, sebgyógyulás Izületi súrlódások kezelése injekcióval Plasztikai sebészet: feltöltés, implantátum Kozmetikumok 35 HIALURONSAV GYÁRTÁSA Kétféle eljárást használnak: - szervextrakció - fermentáció A fermentációs gyártás valamivel olcsóbb, de az injekciós minőséget nehezen éri el (endotoxinok, mikrobák) 1. A szervek aprítása 2. Fehérjebontás alkálikus proteázzal (ph= 8) 3. Főzés híg savas oldatban 4. Szűrés 5. Kicsapás benzalkónium-kloriddal, szűrés 6. Visszaoldás NaCl oldatban 7. A maradék benzalkónium-klorid butanolos extrakciója 8. Kicsapás, mosás etanollal. 36 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 18

19 HEPARIN Majdnem minden szervben előfordul szervextrakció. Többféleképpen szulfonált mukopoliszacharid, Ca-só formájában hozzák forgalomba. Antikoaguláns = véralvadásgátló 37 Egyéb mikrobiális poliszacharidok Foszfomannán (Hansenula, Pichia, Pachyselon nemzetség egyes fajai) Mikrobiológiai lebontással szemben ellenálló Jó viszkozitásnövelő Stabilizáló Diszpergáló hatású Kitozán (Mucor rouxii, Absidia coerulea) Nitrogéntartalmú poliszacharid Felhasználás: flokkuláló szerként, papíripari ragasztóként, kelátképzőként 38 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 19

20 Ciklodextrinek (CD, Schardinger dextrinek) 39 A ciklodextrinek méretei 40 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 20

21 Ciklodextrinek előállítása Egylépéses biokonverzió: ciklodextrin-glikozil-transzferázzal (CGTáz) Több törzs is termeli: 1. Bacillus macerans 2. Alkalofil bakt Klebsiella pneumoniae (patogén) klónozták B. subtilis-be. 4. Bacillus circulans Izolált, oldott enzimet használnak. 41 Ciklodextrinek előállítása 42 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 21

22 Ciklodextrinek előállítása Mindig többféle CD keveréke keletkezik + lineáris melléktermékek. Termék-inhibíció: a keletkező CD gátolja az enzimet. α-, β -, γ - CD arány szabályozása: Mikrobától is függ: 1.,3. kezdetben α -t termel 2. kezdetben β -t termel Toluol adagolás: β-val zárványkomplex, eltolja az egyensúlyt (α β), végén ~90% β -CD Dekanol adagolás: α irányába tolja el, 36% α-cd, mellette csak 3.7% β -CD 43 Mercian eljárás (J) Bacillus circulans enzim, vizes oldatban: ph=6, T=55 C, 8,3 % elfolyósított keményítő Nem használnak zárvány molekulát. α, βés γ keverék képződik, hozam: α - 22,3%, β - 10,8%, γ - 5,1% Elválasztás szelektív adszorpcióval (folyamatos recirkuláció, hűtés 30 C-ra, majd vissza 55 C-ra) α megkötés: kitozán hordozón sztearinsav ligand szelektivitás: ~100%. β megkötés: ciklohexán propánamid n-kapronsav ligandon 44 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 22

23 Mercian eljárás (J) 45 Irányított gyártások: α-cd előállítás Komplexáló vegyület: dekanol (vízgőzzel eltávolítható) Csak α-cd képződik: jól oldódik (140 mg/ml), nehéz kristályosítani Hozam: ~50% 46 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 23

24 Irányított gyártások: β-cd előállítás Hidrolízis: 33%-os keményítő, folyósítás α-amilázzal, 80 C-on, 1h, ph=7.2, Ca 2+ kell Enzim inaktiválás: C-on 30 percig Biokonverzió: CGT-áz enzim, 50 C, h, keverés Komplexáló vegyület: toluol A komplex szűrése, vákuum bepárlás/stripelés (toluol elávolítása), kristályosítás Hozam: ~90% 47 γ-cd előállítás A β-cd gyártás mellékterméke Konverzió CGT-ázzal Komplexáló szer: metil-etilketon - α-naftol keverék Vízben oldhatatlan komplex, mely metanolban feloldódik Ioncsere, aktív szenes tisztítás Hozam: ~20% 48 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 24

25 A ciklodextrinek alkalmazásai: molekuláris csomagolás Az inklúziós komplexek képződésének vázlata Az apoláris molekulák beilleszkedése az apoláris gyűrűbe energiacsökkenéssel jár. 49 Ciklodextrinek alkalmazása Gyógyszerek formulázása: Oldhatóság nő (felszívódás): vízben nem oldható vegyületek is adhatók injekciókban A hozzáférhetőség nő Stabilizál: kevésbé párolog, véd az oxidálás ellen, a hőstabilitás nő Irritáló hatás csökken (indometacin) 50 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 25

26 Ciklodextrinek alkalmazása Példák: Prostaglandin E2- β-cd: szublingualis (szülés indítás) Prostaglandin E1- α-cd: injekció (érszűkület) Benexate- β-cd: gyomorfekély ( kiékelő molekula: Arg) Fokhagymaolaj β-cd: koleszterin csökkentés Szteroidok 51 Ösztradiol Progeszteron Ampicillin Prosztaglandin F 52 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 26

27 Ciklodextrinek alkalmazása Élelmiszer, kozmetikum: Íz, zamat: illó vegyület, stabilizál, oxidálás ellen véd hagyma - β-cd: élelmiszeraromák Alacsony koleszterin tartalmú vaj előállítása: olvadt vaj + β-cd = bezárja a koleszterint Kellemetlen íz, illat eltávolítása: kávé, tea keserű íze; Kávé oldószermentes koffein-mentesítése Kozmetikumok: az illat hosszabb ideig megmarad 53 Ciklodextrinek alkalmazása Biotechnológia: Mikrobiológiai konverziók szteránvázas vegyületek Lantanozid C enzimes hidrolízise digoxinná dimetil-β-cd zsírsav komplex Szennyvíz detoxifikálás Biospecifikus elválasztás 54 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 27

28 Mikrobiológiai konverziók 55 Toxikus anyagok megkötése Szennyvíztisztításban, talajmeliorációban. 56 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 28

29 Biospecifikus elválasztás A keményítő szerkezetanalógja, lásd a BIM gyakorlatot. 57 BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszertudomány Tanszék 29