Szilárd fázisú biokatalizátorok

Átírás

1 Szilárd fázisú biokatalizátorok SZFB.indd :01:28

2 SZFB.indd :01:29

3 Boross László Sisak Csaba Szajáni Béla SZILÁRD FÁZISÚ BIOKATALIZÁTOROK Előállításuk, tulajdonságaik és gyakorlati alkalmazásuk AKADÉMIAI KIADÓ, BUDAPEST SZFB.indd :01:29

4 A kötet megjelenésének támogatói: Chinoin Zrt., Magyar Biokémiai Egyesület, Magyar Tudományos Akadémia, Pannon Egyetem Lektorálta: Dr. Nyeste László ny. egyetemi tanár ISBN Kiadja az Akadémiai Kiadó, az 1795-ben alapított Magyar Könyvkiadók és Könyvterjesztők Egyesülésének tagja 1117 Budapest, Prielle Kornélia u Első magyar nyelvű kiadás: 2008 Boross László, Sisak Csaba, Szajáni Béla, 2008 Akadémiai Kiadó, 2008 Minden jog fenntartva, beleértve a sokszorosítás, a nyilvános előadás, a rádió- és televízióadás, valamint a fordítás jogát, az egyes fejezeteket illetően is. Printed in Hungary SZFB.indd :01:29

5 TARTALOM ELŐSZÓ BEVEZETÉS TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS SZILÁRD FÁZISÚ BIOKATALIZÁTOROK ELŐÁLLÍTÁSA Rögzítés fizikai módszerekkel Bezárás féligáteresztő hártyák közé Bezárás gélek vagy szálak üregeibe Mikrokapszulázás, kapszulázás Koacerváció Határfelületi polimerizáció Előgéloldás Folyadékcseppképzés Gyöngyök és kapszulák nagy léptékű termelése Liposzómaképzés Adszorpció nagy felületű hordozókon Rögzítés kémiai módszerekkel Ionos rögzítés Kovalens kötések kialakítása Biokatalizátorok közötti intermolekuláris kovalens kötések Kémiai beépítés polimerek szerkezetébe Fémkelátkomplexek Hordozók szilárd fázisú biokatalizátorok előállításához Természetes eredetű gélképzők Alginátok Karragenátok Pektinek Gellánmézga Kitozán Agar (agaróz) Dextrán Fehérjealapú gélképzők Szintetikusan előállított gélek Poliakrilamid SZFB.indd :01:29

6 Poli(vinil-alkohol) (PVA) Egyéb bezáró közegek Adszorbensek Üveg Cellulóz Poliuretán Biospecifikus (affinitás) adszorbensek Ioncserélők Poliszacharid alapú ioncserélők Polisztirol származékok Az enzimek rögzítését befolyásoló tényezők Az aktiváló reagens szerkezetének hatása A reakcióelegy összetételének hatása A reakcióelegy ph-jának hatása A reakcióelegy ionerősségének hatása A hordozó porozitásának hatása A hordozó mátrix és a funkciós csoport közötti kar (spacer) hatása A sejtek rögzítését befolyásoló tényezők Gyökös polimerizáció hatása a sejtekre Szerves oldószerek hatása a sejtek bezárására SZILÁRD FÁZISÚ BIOKATALIZÁTOROK TULAJDONSÁGAI Rögzített enzimek tulajdonságai Katalitikus tulajdonságok Katalitikus aktivitás A katalitikus aktivitás ph-függése A katalitikus aktivitás hőmérséklet-függése A szubsztrátkoncentráció hatása Specifitás Stabilitás Hőstabilitás ph-stabilitás Szerves oldószerekkel szembeni stabilitás Fehérjebontó enzimekkel szembeni stabilitás Karbamiddal és guanidin-hidrokloriddal szembeni ellenállás Tárolási stabilitás Működési stabilitás Rögzített sejtek tulajdonságai A sejtek elhelyezkedése a hordozóban A rögzített sejtek morfológiai tulajdonságai A rögzítés hatása a sejtek életképességére és anyagcseréjére A fermentációs közeg ph-jának hatása a rögzített sejtekre A fermentációs elegy hőmérsékletének hatása a rögzített sejtekre Mérgek hatása a rögzített sejtekre A rögzítés hatása a plazmidstabilitásra Rögzített sejtes rendszerek működési stabilitása SZFB.indd :01:30

7 5. BIOREAKTOROK A bioreaktorok általános szerkezeti és működési jellemzői Bioreaktor típusok szilárd fázisú biokatalizátorral Szakaszos működésű mechanikusan kevert tankreaktor Folyamatos átáramlású kevert tankreaktor Állóágyas oszlopreaktor Fluidizációs reaktor Cirkulációs reaktor Membránreaktorok Közvetlen érintkezésű membránreaktorok Diffúziós membránreaktorok Többfázisú membránreaktorok A különböző típusú bioreaktorok működésének összehasonlítása A bioreaktorok működését befolyásoló tényezők A hordozó tulajdonságainak hatása A biokatalizátor inaktiválódásának hatása a bioreaktor teljesítményére A szubsztrátkoncentráció hatása A közeg összetételének hatása Az oxigénigény biztosítása Külső és belső anyagátadási hatások A hőmérséklet hatása Reaktorméret Nyomásesés A visszakeveredés hatása A működtetés módja Integrált termékeltávolítás SZILÁRD FÁZISÚ BIOKATALIZÁTOROK GYAKORLATI ALKALMAZÁSAI Szilárd fázisú biokatalizátorok ipari alkalmazása Szilárd fázisú biokatalizátorok élelmiszeripari alkalmazása Tejipar Cukoripar, édesipar, cukrászat Keményítőfeldolgozás Cukorszirupok előállítása Ciklodextrinek előállítása Tartósítóipar Húsipar Növényolajipar Erjedésiparok Etanolgyártás Sörgyártás Borászat Ecetgyártás Egyéb erjedésipari termékek SZFB.indd :01:30

8 Szilárd fázisú biokatalizátorok könnyűipari alkalmazása Papíripar Szilárd fázisú biokatalizátorok gyógyszeripari alkalmazása Antibiotikumok előállítása Szteroidátalakítások Alkaloidok biotranszformációja Monoklonális antitestek Hormonok, biológiailag aktív anyagok Egyéb gyógyszeripari termékek Szilárd fázisú biokatalizátorok vegyipari alkalmazása Finomkémiai termékek Enzimek előállítása Koenzimek előállítása Aminosavak Aminosavak előállítása rögzített sejtekkel Szintetikus aminosav-racemátok rezolválása rögzített enzimekkel Aminosav-származékok, peptidek Szerves savak Cukor-foszfátok Mesterséges édesítőszerek és adalékanyagaik Egyéb finomkémiai termékek Vegyipari termékek Szilárd fázisú biokatalizátorok környezetvédelmi alkalmazása Fenolos szennyvizek kezelése Klórozott szénhidrogénekkel szennyezett vizek kezelése Nehézfémionok eltávolítása szennyvizekből Nitrifikáció-denitrifikáció rögzített sejtekkel Biofilterek Szilárd fázisú biokatalizátorok analitikai alkalmazása Szakaszos analitikai eljárások Folyamatos rendszerek Bioszenzorok Bioszenzorok előállítása Enzimelektródok Rögzített sejtes bioszenzorok Szilárd fázisú biokatalizátorok gyógyászati alkalmazása Rögzített enzimek gyógyászati alkalmazása Rögzített sejtek gyógyászati alkalmazása IRODALOM SZFB.indd :01:30

9 ELŐSZÓ Napjaink egyik vezető tudományterülete a biotechnológia, amelyen belül kiemelt jelentőségű a biokatalizátorok (enzimek, sejtek, sejtalkotórészek) gyakorlati alkalmazása, az alkalmazott biokatalízis. Ahhoz, hogy a biokatalizátorokat egymást követő reakcióciklusokban ismételten felhasználhassuk, illetve hogy folyamatos eljárásokban alkalmazhassuk, nagy előnyökkel jár szilárd fázisú hordozón történő rögzítésük. Így jönnek létre az ún. szilárd fázisú biokatalizátorok. Ezekkel kapcsolatban a széles gyakorlati alkalmazhatóságon túlmenően jelentős elméleti kérdések is felmerülnek, amelyeknek megválaszolása gazdagíthatja a tudományt. Több évtizedes kutatásaink és a szilárd fázisú biokatalizátorok gyakorlati alkalmazása terén szerzett tapasztalataink alapján célul tűztük ki egy átfogó monográfia elkészítését. Reményeink szerint egy ilyen mű elősegítheti ennek a fontos alkalmazott kutatási területnek a színvonalas hazai művelését. További szempontunk volt, hogy a biológiai iparokban dolgozó szakemberek anyanyelvükön is hozzáférhessenek a korszerű ismeretekhez. Bemutatjuk a könyvben a szilárd fázisú biokatalizátorok előállításának legfontosabb módszereit, tulajdonságaikat, az alkalmazásukhoz nélkülözhetetlen, korszerű bioreaktorokat és gyakorlati felhasználásuk példáit. Természetesen az elmúlt mintegy négy évtizedben megjelent közlemények ezrei és a korlátozott terjedelem nem tették lehetővé a teljességre való törekvést. Könyvünk megjelentetése nem nélkülözhette a szponzori támogatást. Ezért köszönettel tartozunk a Magyar Tudományos Akadémia Kémiai és Biológia Osztályának, a Magyar Biokémiai Egyesületnek, a Pannon Egyetem Műszaki Kémiai Kutató Intézetének, a Veszprémi Universitas Alapítványnak, valamint a Chinoin Gyógyszer és Vegyészeti Termékek Gyára Zrt.-nek. Az ábrák jelentős részének közlését az Elsevier Media, Amsterdam, The Netherlands, a John Wiley & Sons Inc., New York, USA és az Academic Press, San Diego, USA kiadók engedélyezték. Hálánkat fejezzük ki a mű lektorának, Nyeste László ny. egyetemi tanárnak, a kémiai tudomány doktorának, aki nagy szakmai tudásával és tapasztalataival jelentősen segítette munkánkat. Köszönet illeti dr. Biró Eszter szerkesztőt rendkívüli gondosságáért és türelméért. Budapest Veszprém, szeptember Boross László Sisak Csaba Szajáni Béla SZFB.indd :01:30

10 SZFB.indd :01:30

11 1. BEVEZETÉS A természet erőforrásait feltáró és hasznosító ipari forradalom után előtérbe kerültek a biológiai erőforrások. A rohamosan növekvő számú emberiség mennyiségi és minőségi igényeit csak ezek minél tökéletesebb kiaknázásával lehet biztosítani. A fosszilis energiahordozók fogyása, az élelmiszer-ellátás javítása, a hulladék- és szennyvízkezelés megoldása, a természeti környezet védelme újszerű megközelítést igényel. A biológiai tudományok és a mezőgazdasági-, illetve ipari technológiák alkotó összekapcsolásának eredményeképpen létrejött a biotechnológia. A biotechnológia egyik fontos területe a biokatalízis gyakorlati alkalmazhatóságának kutatása. Biokatalizátoroknak az élőlények katalitikus aktivitású fehérjéit, az enzimeket tekintjük, bár ma már tudjuk, hogy egyes nukleinsavak (a ribozimok), illetve egyes antitestek (az abzimek) is rendelkeznek katalitikus aktivitással. Az enzimek bizonyos tulajdonságai, mint az általuk igényelt enyhe reakciókörülmények és a nagyfokú fajlagosság (reakciófajlagosság és szubsztrátfajlagosság) a gyakorlati hasznosítás szempontjából rendkívüli előnyöket nyújtanak. A gyakorlatban sokszor magát az élő- vagy holt sejtet, illetve annak egyes enzimtartalmú alkotórészeit alkalmazzák biokatalizátorként, különösen olyan esetekben, amikor az átalakulás egynél több enzimet vagy a katalízishez viszonylag drága kofaktort igényel. Bár valamennyi élő szervezet termel enzimeket, gyakorlati, elsősorban ipari célokra a mikrobiális enzimek a legelterjedtebbek. A mikrobiális enzimek hatásuk helye szerint lehetnek extracellulárisak vagy intracellulárisak. Az extracelluláris enzimeket a sejtek a környezetükbe, a tápközegbe bocsátják ki, és hatásukat ott, vagyis a sejten kívül fejtik ki, majd hasítási termékeik aktív vagy passzív transzport révén jutnak a sejt belsejébe. Extracellulárisak általában a makromolekulákat bontó enzimek. Ilyenek a fehérjebontó (proteolitikus), illetve a keményítőbontó (amilolitikus) vagy a cellulózbontó (cellulotikus) enzimek. Az intracelluláris enzimek hatásukat a sejten belül fejtik ki. Az intracelluláris enzimeknél esetenként indokolt a teljes sejtek vagy a sejtalkotórészek (sejtszervecskék) alkalmazása a kivonás és az elválasztás bonyolultsága, illetve az izolált enzim instabilitása miatt. Mivel a biokatalizátorok natív állapotban gyakran nem elégítik ki a gyakorlati felhasználás által támasztott követelményeket, célszerű a módosításuk, illetve rögzítésük megfelelő módszerekkel. A rögzített (immobilizált) biokatalizátorok döntő többsége a kémiai reakciókban hasonló módon alkalmazható, mint a hagyományos katalizátorok. Ilyen értelemben használjuk a szilárd fázisú biokatalizátorok elnevezést. Figyelembe véve a különböző meghatározásokat (Chibata és mtsai, 1986; Kierstan és Coughlan, 1985; The Working Party on Immobilized Biocatalysts, 1983) a szilárd fázisú SZFB.indd :01:30

12 biokatalizátorok olyan enzimek és mikrobiális (baktérium, alga, gomba), növényi- és állati sejtek vagy sejtalkotórészek, amelyek katalitikus aktivitásukat megtartva a tér bizonyos meghatározott részén fizikai vagy kémiai kötésekkel lokalizálva vannak, és amelyeket ismételten vagy folyamatos eljárásban lehet felhasználni. Az elmúlt mintegy négy évtizedben közlemények ezrei jelentek meg a szilárd fázisú biokatalizátorok előállításával, tulajdonságaival és gyakorlati alkalmazásával kapcsolatban. Ugyanakkor a tényleges gyakorlati, elsősorban az ipari felhasználásuk köre meglehetősen korlátozott, amelynek oka igen összetett. Könyvünk célja éppen az, hogy a szilárd fázisú biokatalizátorokkal kapcsolatos ismeretek összefoglalása révén elősegítsük szélesebb körű alkalmazásukat, és egyúttal felhívjuk a figyelmet az egyes fontosabb kutatási irányokra. 12 SZFB.indd :01:30

13 2. TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Az első rögzített enzimet Nelson és Griffin állították elő 1916-ban, akik invertázt adszorbeáltattak aktív szénen, illetve aluminium-hidroxid-gélen úgy, hogy az enzim megőrizte katalitikus aktivitását. Az első szintetikusan előállított, vízoldhatatlan polimerhez kötött enzimeket Grubhofer és Schleith írták le 1953-ban. Diasztázt, pepszint, ribonukleázt és karboxipeptidázt rögzítettek diazotált poli(amino-sztirol)-on és így vízoldhatatlan, aktív enzim-polimer komplexeket kaptak. Az N-klóracetil-dl-fenil-alanin rögzített karboxipeptidázzal katalizált rezolválása kapcsán rámutattak a rögzített enzimek preparatív munkában való alkalmazásának előnyére: a termék könnyen elválasztható a rögzített enzimtől, amely ismételten felhasználható (Grubhofer és Schleith, 1954). A célirányos kutatás az 1960-as években indult meg. Ebből az időből kiemelendő Katchalski és munkatársainak a mikrokörnyezeti hatások megismerésére irányuló munkája (Goldstein és mtsai, 1964; Levin és mtsai, 1964). A rögzített enzimek ipari alkalmazása terén az első fontos eredmény Chibata és munkatársai nevéhez fűződik, akik aminoaciláz enzimet ionosan rögzítettek, és 1969-ben azt a Tanabe Seiyaku Co. Ltd.-nél, Oszakában (Japán) ipari méretben alkalmazták szintetikusan előállított dl-metionin optikai izomerjeinek szétválasztásánál (vö. Chibata és mtsai, 1972). K. Mosbach és R. Mosbach 1966-ban felhívták a figyelmet arra, hogy ha a szubsztrát és a termék a sejtfalon képes áthatolni, akkor a teljes sejt bezárásával megtakarítható a gyakran nehéz és munkaigényes enzimizolálás. Ennek példájaként a kormos zuzmó (Umbilicaria pustulata) sejtjeit térhálósított poliakrilamidba zárták be, és oszlopreaktorban orcinol és orcinol-monometil-éter előállítására használták. A rögzített sejtes rendszerek előállítása és gyakorlati felhasználása valójában nem újkeletű. Egyik legrégebbi példája a Schützenbach által 1823-ban ismertetett gyors ecetgyártási eljárás. Ennél perforált fenekű kádakat alkalmaztak, amelyeket bükkfaforgáccsal töltöttek meg. A faforgácson ecetsav baktériumokból álló, filmszerű réteget fejlesztettek ki. Ez a mikrobiális film a kádakon átcsörgedeztetett, hígított etanolt ecetsavvá oxidálta. A felülethez kötött mikroorganizmusok alkalmazása régóta fontos részét képezi egyes szennyvízkezelési eljárásoknak (csepegtetőtestes rendszerek). A korszerű rögzített sejtes eljárások kifejlesztése az 1970-es években indult meg. Az első ipari alkalmazás 1973-ban az l-aszparaginsav előállítása volt fumársavból rögzített Escherichia coli sejtekkel, amely szintén Chibata és munkacsoportjának eredménye volt. Ugyanezen munkacsoport 1974-ben megoldotta az l-almasav előállítását fumársavból rögzített Brevibacterium ammoniagenes sejtekkel (vö. Yamamoto és mtsai, 1976, 1977). 13 SZFB.indd :01:30

14 Az 1970-es évektől a figyelem elsősorban a rögzített élesztő- és baktériumsejtekkel történő etanolfermentáció irányába fordult. Japánban 1980-ban a Nemzetközi Kereskedelmi és Ipari Minisztérium (MITI) védnöksége alatt, 23 vállalat összefogásával jött létre a Research Association for Petroleum Alternatives Development (RAPAD). A RAPAD keretei között dolgozták ki a rögzített élesztősejtekkel történő, folyamatos etanolgyártást. A kísérleti üzemi gyártás 1982 áprilisában indult meg, 4 m 3 reaktor-össztérfogattal. A kísérleti üzemben kalcium-alginát-gélbe zárt, megfelelően kiválasztott Saccharomyces cerevisiae sejteket alkalmaztak, fluidágyas reaktorban, nem sterilizált melaszt használva az erjesztéshez áprilisában a Kyowa Hakko cég hofui üzemében két sorba kötött 10 m 3 -es reaktorral félüzemi berendezést építettek, amely 1983 májusában kezdett üzemelni (vö. Nagashima és mtsai, 1983, 1987). A mikrobák rögzítésénél szerzett tapasztalatokra támaszkodva növényi- és állati sejteket, illetve sejtszervecskéket is rögzítenek, de ezek gyakorlati alkalmazása gyakran nehezen megoldható problémákat vet fel. Az utóbbi két évtizedben előtérbe került a szilárd fázisú biokatalizátorokat alkalmazó folyamatos eljárások kivitelezésére alkalmas bioreaktorok fejlesztése, szabályozástechnikája, valamint a működésük során felmerülő anyag- és energiaátadási problémák kutatása. 14 SZFB.indd :01:30