DOKTORI ÉRTEKEZÉS. Szarvas József

Átírás

1 DOKTORI ÉRTEKEZÉS Törzs-összehasonlító vizsgálatok és gyakorlati fejlesztések az ördögszekér laskagomba [Pleurotus eryngii (DC.:Fr.) Quél.] termesztésében Szarvas József Budapesti Corvinus Egyetem, Kertészettudományi Kar Zöldség- és Gombatermesztési Tanszék Budapest 2011

2 A doktori iskola megnevezése: Kertészettudományi Doktori Iskola tudományága: vezetője: Növénytermesztési és kertészeti tudományok Dr. Tóth Magdolna egyetemi tanár, DSc. Budapesti Corvinus Egyetem, Kertészettudományi Kar, Gyümölcstermő Növények Tanszék témavezető: Dr. Győrfi Júlia habilitált egyetemi docens, PhD. Budapesti Corvinus Egyetem, Kertészettudományi Kar, Zöldség- és Gombatermesztési Tanszék témacsoport: Zöldségnövények és termeszthető gomba témacsoport tanszék: Zöldség- és Gombatermesztési Tanszék, tanszékvezető: Dr. Terbe István, DSc., egyetemi tanár A jelölt a Budapesti Corvinus Egyetem Doktori Szabályzatában előírt valamennyi feltételnek eleget tett, a műhelyvita során elhangzott észrevételeket és javaslatokat az értekezés átdolgozásakor figyelembe vette, ezért az értekezés védési eljárásra bocsátható Iskolavezető jóváhagyása. Témavezető jóváhagyása 2

3 A Budapesti Corvinus Egyetem Élettudományi Területi Doktori Tanácsának i határozatában a nyilvános vita lefolytatására az alábbi Bíráló Bizottságot jelölte ki: BÍRÁLÓ BIZOTTSÁG Elnöke: Balázs Sándor, MHAS Tagjai: Rimóczi Imre, DSc Hodossi Sándor, DSc Isépy István, CSc Erős-Honti Zsolt, PhD Opponensek: Szántó Mária, CSc Kovács András, CSc Titkár: Erős-Honti Zsolt, PhD 3

4 TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS CÉLKITŰZÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS A PLEUROTUS NEMZETSÉG BEMUTATÁSA A P. ERYNGII FAJ NEVEZÉKTANA, MORFOLÓGIAI JELLEMZÉSE A P. ERYNGII TAXONÓMIAI PROBLÉMÁI A P. ERYNGII ELTERJEDÉSE, GAZDANÖVÉNYKÖRE MOLEKULÁRIS MÓDSZEREK A ROKONSÁGI KAPCSOLATOK TISZTÁZÁSÁRA MOLEKULÁRIS VIZSGÁLATOK A VÁLTOZATOK IDENTIFIKÁCIÓJÁHOZ MOLEKULÁRIS VIZSGÁLATOK DSRNS MIKOVÍRUSOK KIMUTATÁSÁRA A P. ERYNGII FAJ ÖKOLÓGIAI JELENTŐSÉGE ÉLETTANI MEGVILÁGÍTÁSBAN A P. ERYNGII TERMESZTÉSI VONATKOZÁSAI A P. ERYNGII TÖRZSEK A TERMESZTÉSBEN BIOLÓGIAI HATÉKONYSÁG ÉS PRODUKTIVITÁS KERESKEDELMI JELENTŐSÉG A FAJ BELTARTALMI ÉRTÉKEI MIKROELEMEK SZEREPE AZ EMBER TÁPLÁLKOZÁSÁBAN GOMBÁK MN, ZN ÉS SE TARTALMA A P. ERYNGII FAJ ELEMTARTALMÁVAL KAPCSOLATOS VIZSGÁLATOK P. ERYNGII GYÓGYHATÁSÚ ANYAGAI A MEGOLDANDÓ FELADATOK ISMERTETÉSE MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI VIZSGÁLATOK A TERMESZTÉS GYAKORLATI ALKALMAZÁSAIHOZ KAPCSOLÓDÓ KÍSÉRLETEK BELTARTALMI ÉRTÉK FOKOZÁS LEHETŐSÉGEI ANYAG ÉS MÓDSZER TÖRZSEK BEGYŰJTÉSE, TISZTATENYÉSZETÜK KIALAKÍTÁSA TÖRZSEK ROKONSÁGI VIZSGÁLATAI RAPD-PCR MÓDSZERREL P. ERYNGII IZOLÁTUMOK TEF1a, RPB2 SZEKVENCIAANALÍZISE TÖRZSEKBEN ELŐFORDULÓ DSRNS SPECIESEK VIZSGÁLATA IMMUNOBLOT MÓDSZERREL P. ERYNGII TÖRZSEK VEGETATÍV MICÉLIUMÁNAK NÖVEKEDÉSI TESZTJEI TÖRZS-ÖSSZEHASONLÍTÓ TERMESZTÉSI KÍSÉRLETEK TAKARÁSRA VONATKOZÓ TERMESZTÉSTECHNOLÓGIAI KÍSÉRLETEK MIKROELEM-DÚSULÁS VIZSGÁLATA A TERMŐTESTEKBEN A SZUBSZTRÁTUM MINŐSÉGÉNEK HATÁSA AZ ÁSVÁNYI ELEM ÖSSZETÉTELRE TERMESZTÉS SORÁN MEGJELENŐ KÓROKOZÓ SZERVEZETEK EREDMÉNYEK IZOLÁLÁSOK EREDMÉNYEI IZOLÁTUMOK ROKONSÁGI VIZSGÁLATAINAK EREDMÉNYEI P. ERYNGII IZOLÁTUMOK TEF1a, RPB2 RÉGIÓK SZEKVENCIAANALÍZISÉNEK EREDMÉNYEI DSRNS MIKOVÍRUS VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI A P. ERYNGII TÖRZSEK VEGETATÍV NÖVEKEDÉSI TESZTJEINEK EREDMÉNYEI TÖRZS-ÖSSZEHASONLÍTÓ VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI TAKARÁSRA VONATKOZÓ TERMESZTÉSTECHNOLÓGIAI FEJLESZTÉSEK EREDMÉNYEI MIKROELEM-DÚSULÁS VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI A SZUBSZTRÁTUM HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA AZ ÁSVÁNYI ELEM ÖSSZETÉTELRE A KÓROKOZÓ SZERVEZETEK VIZSGÁLATAINAK EREDMÉNYEI ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK

5 7. ÖSSZEFOGLALÁS SUMMARY MELLÉKLETEK M.1. FELHASZNÁLT IRODALOM M.2. MELLÉKLETEK M.2.1. Melléklet: Izolálás, törzsfenntartás és spórafelvétel készítés M.2.2. Melléklet: RAPD-PCR gélfotók, bináris kódolás és távolságmátrix M.2.3. Melléklet: tef1a és rpb2 régiók szekvenciaanalízisének eredményei M.2.4. Melléklet: Vegetatív növekedési tesztek M.2.5. Melléklet: Törzs-összehasonlító termesztési kísérlet részletes dokumentációja M.2.6. Mellélklet: Takarás hatásának vizsgálata M.2.7. Mellélklet: Termesztésben megjelenő fontosabb mikoparazita és kompetítor taxonok M.2.8. Melléklet: Mikroelem dúsulás vizsgálata M.2.9. Melléklet: Különböző üzemi szintű termesztési kísérleteink fotói M Melléklet: Termesztési útmutató a termesztői gyakorlat számára KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

6 1. BEVEZETÉS Az ehető gombák alacsony energiatartalmú, ugyanakkor magas beltartalmi értékkel rendelkező táplálékai az emberiségnek. Az egészséges reform és diétás táplálkozásban betöltött szerepük kiemelkedő. Mindezeken felül számos gombafaj tartalmaz különböző gyógyhatással rendelkező bioaktív komponenseket, amelyek a humán gyógyászatban mind preventív, mind kuratív célokra egyaránt használhatóak. Amíg a legtöbb ázsiai országban komoly hagyománya van a gombák fogyasztásának, hagyományos gyógyászati célú alkalmazásának, addig Európában sajnos nem élünk a gombákban rejlő lehetőségekkel. Mindezek mellett ma már egyre nagyobb érdeklődés övezi a gombák környezetvédelmi ( mycorestoration ) célokra történő alkalmazását. A baktériumok, alacsonyabbrendű gombák mellett, a termesztett gombáink egyaránt részesei lehetnek a különféle környezetvédelmi problémák megoldásának. A gombák kedvező táplálkozás-élettani hatásainak ellenére, a hazai gombafogyasztás helyzete sajnos korántsem kedvező. A fogyasztók és a termesztők is elsősorban a kétspórás csiperkegombát (Agaricus bisporus) részesítik előnyben, holott számos más gombafaj kínál lehetőségeket az intenzív termesztés számára. A korábban laskatermesztő országnak is nevezett Magyarországon a laskagomba-termesztés volumene napjainkra jelentősen lecsökkent. A laskagomba termesztésen ma a kései laskagomba (Pleurotus ostreatus) hibridek termesztését értik, azonban számos Pleurotus-faj ismert, amelyek termesztési vonatkozásokban mindenképpen nagyobb figyelmet érdemelnének. Ilyen perspektivikus fajnak tartom a P. eryngii-t (ördögszekér laskagomba), amelyet a gombák között az egyik legízletesebb, a Pleurotus nemzetségen belül pedig a legjobb ízű étkezési gombának tartanak. A megfelelő törzsek szelekciójával, keresztezésével és a termesztéstechnológia helyes megválasztásával, akár felülmúlható a kései laskagombánál felső határnak számító, átlagosan 20 kg/100 kg termésmennyiség. Egyedülálló érzékszervi tulajdonságaival az ördögszekér laskagomba faj kiváló lehetőségeket rejt magában friss piaci formában és feldolgozott gombatermékként (szárítmány, konzervipari termékek stb.) egyaránt. A P. eryngii faj taxonómiai vonatkozásai kapcsán, ma fajkomplex -ről beszélnek, és az ebbe tartozó taxonok tagjainak rendszertani helyzete, rokonsági viszonyai, filogenetikai kérdései még tisztázatlanok. Sok ellentmondás van a faj, pontosabban az ernyős virágzatú növények társaságában megjelenő P. eryngii fajkomplex populációinak taxonómiailag helyes megítélésében. A P. eryngii sensu lato a Pleurotus nemzetségen belül az egyedüli taxon, amely természetes élőhelyén fakultatív biotrófként, elsősorban az Apiaceae, ritkábban a Compositae növénycsaládok bizonyos fajaival asszociáltan fordul elő. A növények gyökerén és szárán, mint gyenge parazita, 6

7 illetve mint szaprobiont, fehérkorhasztásra képes gomba fordul elő, azonban lényeges, hogy intenzív termesztés esetén nem igényli ezeknek a növényi tápanyagforrásoknak a jelenlétét. A világon először hazánkban, az 1950-es években kezdődtek a fajjal kapcsolatos termesztési kísérletek, de a benne rejlő lehetőségek ellenére megfeledkeztünk a fajról. Mára a jelentősebb ördögszekér laskagomba termesztéssel is foglalkozó országok Japán, Kína, Korea és Európában Olaszország. A termesztés fejlesztéseinek irányai elsősorban az optimális táptalaj kidolgozása, megfelelő agrotechnikai módszerek kiválasztása és a termesztés környezeti körülményeinek törzsspecifikus reményeim szerint későbbiekben fajtaspecifikus megválasztása. A cél a jó minőségű termés előállítása mellett a jelenlegi termesztési gyakorlatban tapasztalt kis biológiai hatékonyság helyett, nagyobb biológiai hatékonyság (Biological Efficiency, BE%) elérése. A fenti országokban használt alapanyag-összetétel, termesztés-technológia gyakran nem biztosítja a legmagasabb terméskihozatalt, a magyarországi termesztés megkezdéséhez pedig szükség van a hazai alapanyagokra (mezőgazdasági, erdészeti hulladékok, melléktermékek) adaptált termesztéstechnológia kidolgozására. Természetes élőhelyén számos gomba képes mikroelemeket (fémeket) felhalmozni vagy akkumulálni, így ezt kihasználva, lehetőség kínálkozik intenzív módszerekkel termesztett fajok esetén, céltudatosan a fogyasztók számára esszenciális mikroelemekben gazdag, funkcionális élelmiszertermék előállítására. Véleményem szerint pusztán az alapanyag megválasztása is lehetőséget biztosíthat bizonyos beltartalmi értékek meghatározott korlátok melletti fokozására. A Pleurotus-fajok közül, kutatási munkámban elsősorban az ördögszekér laskagomba (P. eryngii) fajban rejlő termesztési lehetőségekre kívánok fókuszálni. A disszertációt tartalmi szempontból három részre kívánom felosztani. Az első részben molekuláris biológiai vizsgálatok segítségével szeretnék képet kapni, a rendelkezésemre álló izolátumok rokonsági kapcsolatairól, továbbá arról, hogy az izolátumok tartalmaznak-e mikovírusokra utaló dsrns specieseket. A dolgozat második tartalmi részében a faj hazai termesztési vonatkozásait vizsgálom, amellyel adatokat kívánok szolgáltatni a termesztési gyakorlat számára. A harmadik tartalmi egységben a faj beltartalmi értékeinek fokozási lehetőségeit tanulmányozom, funkcionális élelmiszer előállítása céljából. Képet szeretnék továbbá kapni a termesztési alapanyag és a termőtestek ásványi elem tartalma közötti összefüggésekről. A dolgozat végén a saját és az irodalmi adatokra épülő termesztési összefoglalót adok közre a termesztői gyakorlat számára. Bízom benne, hogy mind az alapkutatás, mind a gyakorlati vonatkozások terén is hasznosíthatóak lesznek a disszertációmban foglalt eredmények. 7

8 1.1. CÉLKITŰZÉS A vonatkozó szakirodalom kritikai elemzése alapján az alábbi fő célkitűzéseket teszem: - RAPD módszer segítségével képet kapjak a saját P. eryngii izolátumok rokonsági kapcsolatairól, továbbá két gén meghatározott régiójának szekvencia analízisével keressem a varietas szintű identifikáció lehetőségét. - Kiderítsem, hogy az izolátumokban előfordulnak-e mikovírus fertőzésre utaló dsrns molekulák. - Eredményeket kapjak a rendelkezésemre álló törzsek in vitro vegetatív növekedési jellemzőiről, valamint termesztési tulajdonságairól. - Megalapozzam a faj hazai termesztési gyakorlathoz történő adaptálását, és képet kapjak a biológiai hatékonyság fokozásának termesztési lehetőségeiről. - Képet kapjak arról, hogy van-e lehetőség a termesztett gomba beltartalmi értékeinek fokozására, az alapanyag összetételének változtatása, valamint a szubsztrátumhoz kevert elemek adagolása révén. - Tisztázzam a takaróföld termésmennyiségre gyakorolt hatását, továbbá az ásványos táplálkozásban, vízforgalomban betöltött szerepét. - A faj hazai termesztésének előmozdítása érdekében, a saját eredményeim és az irodalmi adatok alapján, olyan termesztési útmutató összeállítása, amelyet a hazai termesztők sikeresen használhatnak. Mottó: Végtelen számú kísérlet sem bizonyíthatja, hogy igazam van, de egyetlen kísérlet is bizonyíthatja, hogy tévedtem. (Albert Einstein) 8

9 2.1. A PLEUROTUS NEMZETSÉG BEMUTATÁSA 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS A laskagombák a Fungi országba, a Dicarya alországba, a Basidiomycota törzsbe, az Agaricomycotina altörzsbe, az Agaricomycetes osztályba, az Agaricomycetidae alosztályba, az Agaricales rendbe és a Pleurotaceae családba tartoznak. A Pleurotus (Fr.) Quel. nemzetség típusfaja a Pleurotus ostreatus (Jacq. et Fr.) Kummer. A Pleurotus név etimológiája: pleura (görög) = oldalt; ours, otos (görög) = fül. A Pleurotus genus számos ehető gombafajt foglal magába. Ezek kiváló ízükről, viszonylag olcsó és egyszerű termesztési módszereikről ismertek. A laskagombák (Pleurotus spp.) termesztése a világ gombatermelésének 15%-át teszi ki, így a kétspórás csiperkegomba (Agaricus bisporus) és shii-take (Lentinula edodes) után a harmadik helyet foglalja el (RODRIGUEZ ESTRADA, 2008). A Pleurotus genusba tartozó taxonok faji szintű identifikációja sokszor nehézségbe ütközik, mivel a termőtestek morfológiája és színe a környezeti feltételektől függően jelentős változatosságot mutat. Fontos mikromorfológiai bélyeg a spóra mérete, azonban ez a fajok között átfedhet, megnehezítve ezzel a spóraméret alapján történő elkülönítést. A kereskedelmi forgalomban lévő gombatörzsek, -izolátumok elnevezése szintén hozzájárul a taxonok nevezéktani zűrzavarához (RODRIGUEZ ESTRADA, 2008). Az 1970-es évektől alkalmazzák az ún. mating vagy párosodási teszteket (interkompatibilitás) a Pleurotus genuson belül, a különböző biológiai fajok közötti határok tisztázására. A reproduktív barrierek okozhatnak teljes vagy részleges inkompatibilitást, amelyek a P. eryngii és más taxonok esetében is jól dokumentáltak. A fajokat 15 intersterilitási csoportba sorolják, melyek közül a P. eryngii a VI. intersterilitási csoportba tartozik (a P. ferulae, P. nebrodensis, P. hadamardii, P. fossulatus rokon, sok esetben bizonytalan faji minősítésű taxonokkal együtt). Máig hozzávetőlegesen 51 Pleurotus-fajt tartanak nyilván. Az Index Fungorum alapján (internetes hivatkozás 1.), a világon eddig összesen 746 Pleurotus taxont írtak le, jelenleg 51 Pleurotus taxon érvényes (HAJDÚ, 2008). A molekuláris vizsgálatok használata az elmúlt 15 évben elvezetett ahhoz, hogy jobban megértsük a Pleurotus genus és más bazídiumos gombák faji minősítésű egységeit, genetikai változatait, valamint filogenetikai kapcsolatait. Az interspecifikus és intraspecifikus kapcsolatokat RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) markerekkel és a DNS különböző régióinak szekvencia analízisével vizsgálták, mind a nukleáris, mind pedig az extrakromoszómális örökítő 9

10 anyagban (VILGALYS & SUN, 1994; ZERVAKIS et al., 1994; GONZALES & LABARERE, 2000; ZERVAKIS et al., 2004; RODRIGUEZ ESTRADA, 2008). VILGALYS & SUN 1994-ben a nagy riboszómális alegység rdns szekvenciája alapján rokonsági kapcsolatokat bemutató fát állított föl a különböző Pleurotus intersterilitási csoportok esetén. A morfológiai, interkompatibilitási, biokémiai, élettani, molekuláris biológiai és filogenetikai adatok segítségével lehetővé vált, hogy jobban megértsük a faji szintű, valamint a faj alatti kategóriákat, felderítsük a faji minősítésű és faj alatti taxonok rokonsági kapcsolatait, és képet kapjunk a csoport evolúciós vonatkozásairól. A napjainkban zajló intenzív módszertani, molekuláris biológiai fejlődés ellenére még mindig sok a megválaszolatlan kérdés, amelyekre a jövő kutatásai fogják megadni a választ A P. ERYNGII FAJ NEVEZÉKTANA, MORFOLÓGIAI JELLEMZÉSE A P. eryngii (De Candolle ex Fries) Quelet sensu lato országonként különböző neveken ismert: the king oyster mushroom (Egyesült Államok), seta de cardo (Spanyolország), cardoncello (Olaszország), kruisdisteloesterzwam vagy krauterseitling (Németország) és Pleorote du Panicaut (Franciaország). Egyéb gyakori elnevezések az argonane, bouligoule, champignon de garrigue és Boletus of the steppes, King Trumpet Mushroom (STAMETS, 2000; RODRIGUEZ ESTRADA, 2005; RODRIGUEZ ESTRADA & ROYSE, 2005; OEI, 2006). A Pleurotus eryngii (DC.) Quél. szinonim nevei az Index Fungorum (2011) alapján: Agaricus eryngii (DC.), Dendrosarcus eryngii (DC.) Kuntze, Pleurotus fuscus Battarra ex Bres. (internetes hivatkozás 1.). Leírás: Kalap: (3-)5-15 cm átmérőjű; kezdetben domború, majd ellaposodik, végül kissé tölcsérformájú lesz; széle fiatalon begöngyölt, majd kiegyenesedik, és hullámossá válik; szürkésbarna, kávébarnás ritkán piszkosfehéres; felülete fiatalon kissé nemezes, majd csupasszá válik, vagy ritkán benőtten sugarasan szálas (ALBERT et al., 1995). Tönk: 3-10 cm hosszú, 1-3 cm vastag, oldaltálló vagy többé-kevésbé központi helyzetű; gyakran gyökerező; színe fehéres (ALBERT et al., 1995). A tönk is fogyasztható. Termesztésben gyakori a kis kalap és a hasas tönk. Lemezek: Mélyen lefutók, egymástól viszonylag távol állnak, gyakran elágazók. Fiatalon fehéresek, krémszínűek, idővel többé-kevésbé megszürkülnek (ALBERT et al., 1995). 10

11 Spórák: Átlagos méretük: µm (STAMETS, 2000). Néhány változat esetében közölt spóraméretek: var. elaeoselini 10,1 14,0 5,2 7,1 μm; nebrodensis 13,2 17,4 5,5 8,2 μm (BOISSELIER-DUBAYLE, 1983; VENTURELLA et al., 2000; ZERVAKIS et al., 2001a; ZERVAKIS et al., 2001b). A spórapor színe: fehér. Termőhely: Hazánkban legelőn, réten, kertben, többnyire ernyős virágzatú növények közelében, azok gyökerein, szárán nő (SZILI, 1994; ALBERT et al., 1995). Ritkán erdei füves tisztásokon, dombvidékeken is megtalálható. A termőtestek önállóan vagy csoportosan fejlődnek; a termesztésre az utóbbi jellemző. A faj a nevét a mezei iringóról (Eryngium campestre) kapta, amelynek hajtásai letörve, majd ördögszekérként gurulva szórják a magvaikat. Termesztési körülmények között, konkuráló szervezetek nélkül más, dúsított lignocellulóz alapanyagon is jól fejlődik, nem igényli a természetben előforduló ernyős virágzatú növények jelenlétét. Hazánkban viszonylag gyakori, hidegtűrő, májustól decemberig termő, de dominánsan őszi faj, főként októbertől decemberig gyűjthető (SZILI, 1994; ALBERT et al., 1995). A fajnak több változata ismert, amelyekről a következőkben még lesz szó. A különböző P. eryngii var. eryngii törzsek, valamint az egyes változatok keresztezésével új, a gombaipar számára alkalmas hibridek előállítására van lehetőség. A gomba rendkívül jó ízű, más laskagomba-fajok ízét is felülmúlja A P. ERYNGII TAXONÓMIAI PROBLÉMÁI A P. eryngii (De Candolle ex Fries) Quelet sensu lato taxonhoz kapcsolódó, bizonytalan taxonómiai minősítésű csoportok miatt bevezették az ún. fajkomplex koncepciót, amely mára széles körben elterjedt az olyan közelrokon fajok esetében, amelyek teljesen vagy részlegesen interkompatibilisek, és amelyek egy adott intersterilitási csoporthoz tartoznak. A Pleurotus-fajok között több fajkomplex felállítását is javasolták (ZERVAKIS et al., 2001a; BAO et al., 2004; RODRIGUEZ ESTRADA, 2008). Eredetileg Quelet, Lanzi és Inzenga ismerték föl, hogy a P. eryngii (Agaricus eryngii ), P. ferulae (A. ferulae ) és a P. nebrodensis (A. nebrodensis ) külön fajok (CANDUSSO & BASSO, 1995). A párosodási vizsgálatok képezték tanulmányozásuk alapjait, amelyekkel kimutatták az interkompatibilitás bizonyos mértékét e három csoport között, támogatva a mikológusok azon javaslatát, miszerint e három csoport tagjai egy különálló biológiai fajhoz tartozzanak (LAMOURE, 1981; ZERVAKIS & BALIS, 1996). Másrészről URBANELLI és munkatársai (2002) genetikai és ökológiai megfigyeléseik alapján javasolták, hogy a P. eryngii var. eryngii és a P. eryngii var. ferulae két különböző biológiai faji minősítést kapjon (RODRIGUEZ ESTRADA, 2008). 11

12 Szintén újabb kutatásokra alapozva, molekuláris, kvalitatív és morfológiai jellegzetességek alapján javasolták, hogy a P. eryngii var. nebrodensis-nek fajszintűnek kellene lennie (VENTURELLA, 2000; ZERVAKIS et al., 2001a,b; DE GIOIA et al., 2005). A kutatás molekuláris és minőségi (termőtest színe, textúrája, szemcsék jelenléte stb.) jellemzőket vett figyelembe, amelynek eredményeképpen javasolták, hogy a P. eryngii var. nebrodensis taxont emeljék faji szintre (VENTURELLA, 2000; ZERVAKIS et al., 2001a; DE GIOIA et al., 2005). Néhány morfológiai jellegzetesség hasznos lehet ezen fajkomplex tagjainak megkülönböztetéséhez (RODRIGUEZ ESTRADA nyomán, 2008): - A vad P. eryngii var. eryngii-re jellemző a viszonylag rövid tönk ( cm) és a gyakran barna színű kalap. - A P. eryngii var. ferulae nagyobb méretű tönkkel rendelkezik ( cm), mint a var. eryngii és a kalap színe mindig barna. A var. ferulae kalapja szintén nagyobb (6 25 cm), mint a var. eryngii-é (5 15 cm) (BOISSELIER-DUBAYLE, 1983; ZERVAKIS & BALIS, 1996; URBANELLI et al., 2002). - A P. eryngii var. elaeoselini kalapjának átmérője 5-14 cm, színe fehérestől a halvány krémszínűig terjed. A tönk mérete 4 7,5 1,2 2,8 cm. A spórák (10,1 14,0 5,2 7,1 μm) alig nagyobb méretűek, mint a var. eryngii és ferulae spórái. (VENTURELLA et al., 2000; ZERVAKIS et al., 2001a,b). - A P. eryngii var. nebrodensis jellemzően fehér, krémszínű, lemezei mélyen tönkre lefutók és egyesülnek a tönkön, a spórák nagyobb méretűek 13,2 17,4 5,5 8,2 μm (BOISSELIER- DUBAYLE, 1983; ZERVAKIS et al., 2001a,b). A P. eryngii var. elaeoselini változatot VENTURELLA és munkatársai írták le 2000-ben. Ez a változat makroszkopikus, morfológiai jellemzőiben hasonlít a var. nebrodensis változatra, azonban mikroszkopikus jellemzőikben (spórák, cheilocystida) és ökológiai vonatkozásaikban különböznek egymástól. Az elaeoselini változat az Elaeoselinum asclepium subsp. asclepium-mal együtt jelenik meg, míg a nebrodensis változat az Opopanax chironium-mal és Cachrys ferulacea-vel él együtt (VENTURELLA et al., 2000). E két változat azonosításának félreérthetősége az A. nebrodensis első Olaszországban történő leírására vezethető vissza. VENTURELLA és munkatársainak (2000) megállapítása szerint ez a P. eryngii var. elaeoselini példány az Inzenga által, 1863-ban leírt A. nebrodensis taxon tagjának tekinthető. LEWINSOHN és munkatársai (2002) leírtak egy új változatot: P. eryngii var. tingitanus, amely az izraeli Ferula tingitana-val együtt fordul elő. A P. hadamardii és P. fossulatus bizonytalan 12

13 helyzetű taxonok, kétségbe vonható érvényességű taxonómiai nevekkel, ugyanis feltételezik, hogy a P. eryngii var. elaeoselini és var. nebrodensis téves identifikációjának eredményeképpen jelentek meg (ZERVAKIS et al., 2001 a,b; RODRIGUEZ ESTRADA, 2008). A P. eryngii fajkomplexbe tartozó csoportok rendszertani pozíciója, valamint az evolúciós, rokonsági viszonyaik még ma sem tisztázottak, annak ellenére, hogy több szerző foglalkozott már a kérdéssel. Mindezek ellenére a taxonómiai, filogenetikai, speciációs kérdések még ma sem lezártak. A jelenlegi ismereteink alapján a következőket állapíthatjuk meg. A P. eryngii fajkomplexum több változatot és fajt foglal magába, amelyek (jelenleg) a következők: var. eryngii (DC.: Fr) Quel.; var. ferulae Lanzi /syn.: P. fuscus var. ferulae/; var. elaeoselini Venturella et al.; var. nebrodensis (Inzenga) Sacc.; var. tingitanus Lewinsohn et al.; var. tuoliensis C. J. Mou; P. hadamardii Constantin; P. fossulatus (Cooke Sacc.) (CANDUSSO & BASSO, 1995; VENTURELLA, 2000; ZERVAKIS et al., 2001a,b; LEWINSOHN et al., 2002; KAWAI et al., 2008; RODRIGUEZ ESTRADA, 2008; RODRIGUEZESTRADA et al., 2010). A vad P. eryngii var. nebrodensis ritkán fordul elő a természetben, mégis gyűjtik, és friss állapotban értékesítik Észak-Szicíliában ban a Természetvédelmi Világszövetség (World Conservation Union) a kritikusan veszélyeztetett fajok (Critically Endangered - CR) közé sorolta a fajt, és felvették a veszélyeztetett fajok vörös listájára (internetes hivatkozás 2.). Összefoglalva elmondható, hogy sok ellentmondás van a faj, pontosabban a P. eryngii fajkomplex populációinak taxonómiailag helyes megítélésében (HILBER, 1989). Több kutató a legtöbb vagy az összes ökotípust külön fajnak tekinti (BOISSELIER-DUBAYLE, 1983; JOLY et al., 1990), egyesek változatnak tartják (HILBER, 1982; BRESINSKY et al., 1987), míg mások a két álláspont között foglalnak állást. A taxonómiai viták végére átfogó molekuláris biológiai, speciációs és koevolúciós kutatások tehetnek pontot A P. ERYNGII ELTERJEDÉSE, GAZDANÖVÉNYKÖRE A P. eryngii fajkomplex földrajzi és ökológiai eloszlása meglehetősen változatos. Az ernyős virágzatúakkal asszociált Pleurotus-fajok az északi félgömbön helyezkednek el a 30. és 50. szélességi fok között (ZERVAKIS & BALIS, 1996). Ezek a fajok elsősorban a Földközi-tenger szubtrópusi régióiban találhatók, ezen kívül Közép-Európában, Oroszországban, Ukrajnában, Közép-Ázsiában és Iránban. A P. eryngii megtalálható a sztyeppéken, a száraz mezőkön, sőt akár a hegyvidéki zónákban is. A P. eryngii fajkomplex egyedülálló a nemzetségen belül, mert fakultatív biotrófként növekedik az Apiaceae (Umbelliferae) család számos faján (többek között Eryngium campestre, E. maritimum, E. alpinum, E. moroccanum, E. planum, Ferula communis, F. sinkiangensis, Laserpitium latifolium, L. siler, Elaeoselinum asclepium, Thapsia garganica, 13

14 Cachrys ferulacea), valamint az Asteraceae (Compositae) család bizonyos fajain (ZADRAZIL, 1974; ZERVAKIS & BALIS, 1996; ZERVAKIS et al., 2001a,b; LEWINSOHN et al., 2002; RODRIGUEZ ESTRADA, 2008). A P. eryngii var. eryngii általában az Eryngium ssp. tagjaival fordul elő, a P. eryngii var. ferulae a Ferula spp. gyökerein növekszik a Földközi-tengert övező mediterrán területeken és Közép-Európában. A P. eryngii var. nebrodensis általában a Cachrys-fajokkal együtt található meg Európában és Ázsiában szubalpesi zónák m magasságában. Szintén megtalálták Kínában a Ferula sinkiangensis-szel asszociáltan (BOISSELIER-DUBAYLE & BAUDOIN, 1986; ZERVAKIS et al., 2001a,b; ZHANG et al., 2005). Összességében megjegyezhető, hogy több jellemző (termőtest morfológiája, a gazdakör stb.) átfedhet a taxonok között, ami az identifikációt jelentősen megnehezíti (ZHANG et al., 2006) MOLEKULÁRIS MÓDSZEREK A ROKONSÁGI KAPCSOLATOK TISZTÁZÁSÁRA A nukleinsav-vizsgálati módszerek még nem tartoznak a gombataxonómia mindennapos laboratóriumi gyakorlatához, azonban a jövő rendszertani, filogenetikai kutatásaiban egyre szélesebb körben fognak elterjedni (SZÉCSI et al., 2003). Természetesen a morfológiai bélyegek szerepe az identifikációban továbbra is szükséges marad. A molekuláris módszerek használata számos esetben vezetett új rendszertani felismerésekhez (fajokat vontak össze, új fajokat azonosítottak, nemzetségeket bontottak szét stb.). A valós rokonsági viszonyok alapján történő, filogenetikai összefüggéseket tükröző rendszerek megszületése a molekuláris jellemzőkre épülő numerikus taxonómiai eljárások eredménye (SZÉCSI et al., 2003). RAPD (Random amplifikált polimorf DNS) A RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) módszerrel a genom ismeretlen DNS szekvenciáit lehet amplifikálni egy vagy két, 10 nukleotidból álló (dekamer) random primerrel. Az amplifikáció kiindulását képező primer(ek) a genomon véletlenszerűen hibridizál(nak) a komplementer szekvenciával. Alapvető különbség a RAPD és a többi DNS vizsgálati módszer között, hogy a RAPD analízishez nem kell ismernünk azokat a DNS szakaszokat, lókuszokat, amelyeknek a polimorfizmusát vizsgáljuk. A módszer hátránya, hogy gélen a RAPD-mintázat kevésbé jól reprodukálható. A gélen primerenként változó számú (maximum 10) és méretű (néhány 100 bp bp) fragmentumokat látunk. A fragmentumok méretét a mintákkal együtt futtatott DNS-markerek segítségével állapítjuk meg (HAJÓSNÉ, 1999). Munkám során az egyes izolátumok RAPD-PCR mintázataiból kívántam rokonsági kapcsolatokat tükröző fát rekonstruálni. 14

15 Törzsfa-szerkesztés és programcsomagok A molekuláris biológiai módszerek kiértékelése során legáltalánosabban használt módszer az átlagos súlyozatlan párosításos módszer (Unweighed Pair Group Method with Averages, UPGMA), amelyről matematikai eljárásokkal bebizonyították, hogy a taxonómiai struktúrák leírására a legalkalmasabb módszer. A módszer két csoport halmazában a csoportokat alkotó valamennyi egyed közötti távolságot kiszámítja, és ezek átlagát jeleníti meg, mint a két csoport közötti távolságot. A korszerű programcsomagok (pl. PHYLO, PHYLIP) mind azonos elven működnek, azaz a leghasonlóbb egységeket párokba, majd klaszterekbe (csokrokba) gyűjtik. A gyűjtés során a klaszterek egyre gyarapodnak, túlnövik magukat és ekkor alcsokrokra bomlanak, végül egy fenogram (dendrogram) vagy törzsfa képében lehet ábrázolni a rokonsági viszonyokat (SZÉCSI et al., 2003). Ezt a csokrosítva csoportosítást klaszter analízisnek nevezik. Hogy a fenogram mennyire valósághűen tükrözi vissza a hasonlósági mátrix adatait, arra a kofenetikus korrelációs analízis révén kaphatunk választ. Ennek során a fenogram alapján a számítógép leképez egy hasonlósági mátrixot, majd ezt összeveti az eredeti hasonlósági mátrix-szal. A koefficiens értéke 1 (teljes egyezés) és -1 (fordított arányosság) között változik, 0 esetén az összefüggés véletlenszerű. A filogenetikai taxonómia által alkalmazott egyik módszer a maximális takarékosságon alapuló besorolás (Maximum Parsimony). Ennek során azt a fenogrammot tekintik a legjobbnak, melynél a teljes fahossz (az ágak hosszának az összege) a legkisebb, tehát a létrehozásához a legkevesebb evolúciós lépés szükséges. Ilyen evolúciós változás, pl. nukleotidcsere, restrikciós felismerőhelyek elvesztése. A megfelelő törzsfa kiválasztása után a módszer meghatározza az ősi formát, és az ágak hosszára is megad egy közelítő értéket. A módszer hátránya, hogy minőségi jellemzőkre nem használható, valamint, hogy távoli rokon taxonok esetében félrevezető eredményeket ad. A maximális valószínűségen (Maximum Likelihood) alapuló módszer hasonlóan az előzőhöz, elsősorban a szekvencia-adatok analízisére szolgál. Az elemzés során azt a törzsfát tekinti a módszer a legjobbnak, mely esetében az észlelt nukleotidcserék a legnagyobb valószínűséggel következnek be (SZÉCSI et al., 2003). A taxonómiában központi fontosságú a leszármazási (evolúciós), rokonsági viszonyok vizsgálata, az evolúciós utak rekonstruálása. A leszármazási mintázatokat kereső metodológiát kladisztika néven foglaljuk össze, ahol a leszármazási viszonyok, fa-gráfok formájában ábrázolhatók ( tree thinking ). Manapság a kladisztikai programcsomagok piacát négy program uralja, mert ezek adják a legtöbb lehetőséget a kladisztikai adatelemzésre (1. táblázat). 15

16 1. táblázat. A négy legfontosabb programcsomag (PODANI, 1997 nyomán). Módszer PHYLIP PAUP HENNIG MacClade Saitou Nei szomszéd összevonó + Fitch Margoliash + Wagner távolság + Rendezetlen kar. parszimónia (pl. DNS) Wagner parszimónia Dollo parszimónia Sztratiográfiai parszimónia + Camin-Sokal parszimónia + Branch and bound Invariánsok módszere + + Maximum likelihood + Karakter kompatibilitás + A PHYLIP programcsomag (FELSENSTEIN, 1993; FELSENSTEIN, 1995) mellett szól a sok opció, és a forrásnyelvi, valamint a futtatható változatok ingyenessége és sokfélesége, míg ellene, a viszonylagos lassúságot hozzák föl legtöbbször (SANDERSON, 1990; PODANI, 1997). A disszertációban a molekuláris információn alapuló törzsfa-szerkesztést a PHYLIP programcsomag (internetes hivatkozás 3.) segítségével végeztük el MOLEKULÁRIS VIZSGÁLATOK A VÁLTOZATOK IDENTIFIKÁCIÓJÁHOZ Korábban már ismertetésre került, hogy a P. eryngii fajkomplexum számos változatot és néhány bizonytalan faji minősítésű taxont foglal magában. Ezekben közös, hogy természetes élőhelyükön legtöbbször Apiaceae (Umbelliferae) és Asteraceae (Compositae) növénycsaládok bizonyos fajaival asszociáltan, fakultatív biotrófként vagy elhalt növényi anyagaikon fehérkorhasztóként jelennek meg (CANDUSSO & BASSO, 1995; VENTURELLA, 2000; ZERVAKIS et al., 2001a,b; LEWINSOHN et al., 2002; KAWAI et al., 2008; SINGH et al., 2011). Az egyes taxonok identifikációjához hagyományosan használt klasszikus, zömében mikroés makromorfológiai bélyegeket elfedhetik a gombára gyakorolt környezeti hatások, így az identifikáció gyakran komoly nehézségekbe ütközik. A taxonómusok a megoldást gyakran a nukleinsavak vizsgálatában látják. A gombák között legismertebb, leggyakrabban vizsgált terület, a riboszómális génklaszterben található ITS (Internal Transcribed Spacer) régió. A P. eryngii esetében ezt a lókuszt, továbbá egy részleges β-tubulin gént vizsgáltak abból a célból, hogy föltárják a filogenetikai kapcsolatokat a P. eryngii fajkomplex tagjai között. Sajnos egyik régió sem mutatott megfelelő variabilitást ahhoz, hogy filogenetikai vizsgálatokhoz vagy a változatok differenciálására lehessen használni (RO et al., 2007b.; RODRIGUEZ ESTRADA, 2008; RODRIGUEZ ESTRADA & ROYSE, 2008; RODRIGUEZ ESTRADA et al., 2010). 16

17 A transzláció elongációs faktort (EF1a) és az RNS-polimeráz II második legnagyobb alegységét kódoló gének (rpb2) meghatározott régióit alkalmasnak vélik molekuláris filogenetikai vizsgálatokra és a varietas szintű identifikáció céljaira (LIU et al., 1999; ROGER et al., 1999; MATHENY et al., 2002; MATHENY, 2005; MATHENY, internetes hivatkozás 4.; RO et al., 2007b; RODRIGUEZ ESTRADA, 2008; RODRIGUEZ ESTRADA et al., 2010). Az EF1α egy kötő fehérje, amely riboszomális fehérjeszintézishez szükséges az eukarióta sejtekben. MARONGIU és munkatársai (2005) arról számoltak be, hogy az EF1α génje (tef1a) nukleotid szubsztitúciókat tartalmaz, amelyek hasznosak lehetnek az eryngii és ferulae két változatának elkülönítésében. Az rpb2 gén 12 erősen konzervált doménnel rendelkezik, melyek megfelelő primer feltapadási helyek lehetnek a PCR során. Az rpb2 gént (más genomi régiókkal) Cortinarius és Inocybe genus-ok fajainak identifikációjában is használták (FROSLEV et al., 2005; MATHENY, 2005). Munkánk során a saját izolátumainkon az utóbbi két lókusz szekvenciájának polimorfizmusait kívántuk megvizsgálni MOLEKULÁRIS VIZSGÁLATOK DSRNS MIKOVÍRUSOK KIMUTATÁSÁRA A gombasejtek az organellum DNS-eken kívül egyéb extrakromoszómális elemeket is tartalmazhatnak. A gombák egyes csoportjaiban, fajaiban cirkuláris, vagy lineáris kettősszálú DNS plazmidok, lineáris kettősszálú RNS plazmidok, mikovírusok, vagy vírusszerű partikulumok (Virus-Like Particles VLP) találhatók (KEVEI et al., 1999). A gombák vírusai a mikovírusok. Számos gombataxon esetében leírtak már mikovírusokat, amelyek gyakran csak látens formában (tünetmentesen) vannak jelen a gombában (BUCK, 1986), de léteznek olyanok is, amelyek jelentős változást idéznek elő a gazdában. Az irodalomban találkozhatunk még a VLP elnevezéssel is, ami azt jelenti, hogy a gombasejtekben jellegzetes, szabályos vírusfelépítéshez hasonló, vírusszerű részecskék láthatók. Természetesen ezek a VLP-k nem mindig figyelhetők meg a vírussal fertőzött sejtekben. Mivel a vírus nukleinsav gyakran nem okoz tüneteket, és sokszor nem is enkapszidálódik, így a mikovírusok detektálásának legbiztosabb módja az átvihető vírusnukleinsavak leggyakrabban dsrns kimutatása. A mikovírusok többsége dsrns örökítőanyaggal rendelkezik (GHABRIAL, 1998; GHABRIAL & SUZUKI, 2009), és jellemző rájuk, hogy hiányzik az extracelluláris fertőzési út. Ezek vagy proteinekkel enkapszidálódnak, és így nm-es virionokat képeznek (BUCK, 1986), vagy membránvezikulumokkal asszociáltak (NUSS & KOLTIN, 1990). 17

18 Egy-két évtizeddel ezelőtt a mikovírus-kutatásokban az elektronmikroszkópos eljárások voltak elterjedtek, majd ezt követően jelentek meg a gélelektroforetikus módszerek. Ez utóbbi esetben már az etídium-bromiddal festett gélekben megjelenő, meghatározott méretű RNS fragmensek vírusra jellemző mintázatát vizsgálták (SONNENBERG et al., 1995). A vírusnukleinsavak száma és mérete adott mikovírusra specifikus lehet. A dsrns molekulák kimutatását még érzékenyebbé lehet tenni az ún. immunoblot módszer egy speciális alkalmazásával. Az immunoblot elve, hogy a dsrns nukleinsavakat nem denaturáló körülmények között pozitív töltésű membránra blottolják, és specifikusan a dsrns-eket mutatják ki monoklonális ellenanyagok segítségével (SCHÖNBORN et al., 1991; LUKÁCS, 1994). Mindezek mellett, amennyiben rendelkezünk szekvenciaadatokkal a vírusnukleinsavról, úgy lehetőség van vírusspecifikus primerek segítségével RT-PCR alapú víruskimutatásra is. Amennyiben a virion izolálható a gombából és rendelkezünk vírusellenes ellenanyaggal, úgy lehetőség van az adott vírust szerológiai, immunológiai módszerekkel is detektálni. A legelterjedtebbek az ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) alapú módszerek (pl. TAS-ELISA Triple Antibody Sandwich ELISA stb.) Természetesen ezeken kívül még más módszerek is ismertek a vírusok kimutatására. A mikovírusok horizontálisan hifaanasztomózisokkal (szomato- vagy citogámiával) fertőzésszerűen képesek terjedni (SONNENBERG & VAN GRIENSVEN, 1991; IHRMARK et al., 2002). Amennyiben a spórákban is megjelennek, akkor spóraszórást követő anasztomózisok révén is képesek egészséges kultúrákat fertőzni (IHRMARK et al., 2002; CHU et al., 2003). A mikovírusok osztályozását, jellegzetességeit a 2. táblázat foglalja össze. 2. táblázat. Mikovírusok taxonómiai csoportjai (ICTV* alapján). Familia Genus Nukleinsav Morfológia Gazda Totiviridae Totivirus dsrns izometrikus gomba (4-7 kb) virion Partitiviridae Partitivirus dsrns izometrikus gomba (2-3 kb) virion Chrysoviridae Chrysovirus dsrns izometrikus gomba (3-3,6 kb) virion Hypoviridae Hypovirus dsrns citoplazmatikus gomba (9-13 kb) vezikulum - Endornavirus dsrns (14-18 kb) citoplazmatikus vezikulum növény, gomba, Protista Naraviridae Mitovirus ssrns ribonukleoprotein gomba Naravirus (2-3 kb) komplexek gomba 18

19 Familia Genus Nukleinsav Morfológia Gazda Barnaviridae Barnavirus ssrns bacilliform virion gomba (4 kb) Pseudovirus Pseudovirus ssrns (5-8 kb) ismeretlen növény, gomba, gerinctelen Hemivirus növény, gomba, gerinctelen Metaviridae Metavirus ssrns (4-10 kb) ismeretlen gomba, gerinctelen - Rhizidovirus dsdns izometrikus gomba (27 kb) virion (*The Universal Virus Database of International Committee on Taxonomy of Viruses alapján Internetes hivatkozás 5.) Míg bizonyos fajoknál a dsrns-ek jelenléte semmiféle vírusbetegséggel, vagy fenotípusos bélyeggel nem kapcsolható össze (pl. Aspergillus-fajokban), addig más gombák esetében jelentős változásokat okoznak (pl. Cryphonectria parasitica hipovirulenciája) (KEVEI et al., 1999). A gazdaságilag is legfontosabb nagygomba fajunkban, az Agaricus bisporus-ban kimutatható extrakromoszomális dsrns kapcsolatba hozható a termesztési tulajdonságok leromlásával, amivel jelentős termésveszteség párosul. Mikovírusokat már számos termesztett nagygomba-fajból leírtak: Flammulina velutipes (MAGAE & HAYASHI, 1999); Lentinula edodes (INOUE, 1970); Agrocybe aegerita (BAROSSO & LABARERE, 1990); Pleurotus ostreatus (GO et al., 1992; VAN DER LENDE et al., 1995; PARK & KIM, 1996; YU et al., 2003; LIM et al., 2005) és Agaricus bisporus. Utóbbi faj legismertebb, gazdasági szempontból legfontosabb vírusai a LIV La France Isometric Virus (SINDEN & HAUSER, 1950; HOLLINGS, 1962; ROMAINE & GOODIN, 2002) és az MVX Mushroom Virus X (GAZE, 1997; GAZE et al., 2000; GROGAN et al., 2003; GEÖSEL et al., 2008). A gyakorlati gombatermesztésben az olyan mikovírus fertőzéseknek van jelentősége, amelyek termőtestek morfológiáját, számát, színét, a termesztési tulajdonságok elvesztését, és a termés mennyiségének csökkenését okozzák. Máig egy irodalom foglalkozott P. eryngii mikovírus kutatással, diagnosztikával. RO és munkatársai 2007-ben egy koreai farmról származó deformált termőtestből tudtak kimutatni egy vírust, melyet Pleurotus eryngii spherical virus -nak (PeSV) neveztek el. A PeSV egy 31 nm átmérőjű, szférikus, ssrns-t tartalmazó vírus. Ezzel szemben máig senki nem vizsgálta meg, hogy a P. eryngii faj tartalmaz-e dsrns specieseket. Mivel a gombatermesztésben megjelenő mikovírusok dominánsan dsrns-t tartalmaznak, érdemesnek tartottuk a fajt dsrns jelenlétére is megvizsgálni. A dolgozat kísérletes részében a rendelkezésemre álló 16 izolátumot immunoblot 19

20 módszerrel vizsgáltuk dsrns molekulák jelenlétére abban a reményben, hogy a törzsek közötti jelentős különbségre magyarázatot találunk A P. ERYNGII FAJ ÖKOLÓGIAI JELENTŐSÉGE ÉLETTANI MEGVILÁGÍTÁSBAN A laskagombák lehetnek gyengültségi paraziták, azaz képesek behatolni és parazitálni az ellenálló képességében gyengült gazdanövényt. Más esetben szaprobiontként elpusztult növényi szervesanyag lebontására is képesek. A faanyagok felépítése, kémiai összetétele, víz- és levegőtartalma, ph értéke, fungisztatikus anyagai sajátos élőhelyet és tápanyagforrást biztosítanak a farontó gombák számára (JAKUCS & VAJNA, 2003). A fa lebontása a farontó gombafajok révén már élő állapotban megkezdődik és folytatódik 5-30 éven át. A faanyagok lebontása soktényezős, enzimatikus folyamat. A fő szénforrás a fában a cellulóz, hemicellulóz és a lignin. Nitrogén viszonylag kis mennyiségben van jelen a fában (MANCZINGER et al., 2003). Általánosságban elmondható, hogy a laskagombák is az ilyen szubsztrátumhoz adaptálódott szervezetek. A lignocellulóz anyagok bontását enzimek, enzimrendszerek végzik: celluláz enzimrendszer (endocelluláz, exocelluláz, ß-glükozidáz, cellobióz-kinon-oxidoreduktáz, cellobióz-oxidáz, glükózoxidáz); hemicellulázok (heteropolimer jellegből és az elágazó szerkezetből adódóan több enzimből álló, bonyolultabb enzimrendszer végzi a bontást, pl.: endoxilanázok, β-xilozidáz, acetil-xilánészteráz stb.); ligninázok (lignin peroxidázok /LiP/, mangán-peroxidáz /MnP/, fenoloxidázok, valamint a hidrogén-peroxidot generáló enzimek, pl.: glükóz-oxidáz stb.) (NÉMETH, 1998; MANCZINGER et al., 2003). A lignocellulóz bontásának celluláz és lignináz enzimrendszerei közösen reguláltak. A fehér korhadás és a faanyag nagymértékű lágyulása a lignin degradációjának a következménye. A fehér korhadáskor mindhárom fő alkotó (cellulóz, lignin és hemicellulóz) szimultán bomlik, csaknem azonos mértékben. A gombák lignolitikus és más egyéb enzimrendszerei lehetőségeket kínálnak környezetvédelmi problémák megoldására, xenobiotikumok környezetbarát eliminálására is (STAMETS, 2005; ASGHER et al., 2008) A P. ERYNGII TERMESZTÉSI VONATKOZÁSAI Termesztéstörténeti vonatkozások A P. eryngii var. eryngii-t és nebrodensis-t egyes irodalmak szerint (RODRIGUEZ ESTRADA, 2008) 1970 és 1987 között vonták termesztésbe, azonban mindenképpen kiemelendő, hogy a faj intenzív termesztése Magyarországon kezdődött meg az 1950-es években komposztált széna és fűrészpor keveréken (KALMÁR, 1960; SZILI & VÉSSEY, 1980; SZILI, 1994; KIRBAG & AKYÜZ, 20

21 2008). Később, a 60-as évek végén Véssey is próbálkozott a steril alapanyagon történő termesztésével (VÉSSEY, 1971). CAILLEUX és DIOP búzaszalmát, zabot tartalmazó steril táptalajt használt a termesztéshez (CAILLEUX & DIOP 1974; CAILLEUX & JOLY, 1987). Napjainkban már termesztik több ázsiai országban, és jelen van több európai ország (pl. Olaszország) gombatermesztő farmján és piacain is. Az Egyesült Államokban az eryngii változat termesztésével 2000-től kezdtek foglalkozni. A termesztési alapanyagok köre jóval szélesebb, mint amennyiről a különböző irodalmak beszámolnak. Ezek általában mezőgazdasági, erdészeti melléktermékek, hulladékok közül kerülnek ki. Ilyenek a különböző gabonafélék szalmái, bizonyos fafajok fűrészporai, gyapot-, szójaszalma, kukoricaszár, Cyperus alternifolius szár, kukoricaliszt, főzött gabonamagvak, maláta, bambusz por, búzakorpa, rizskorpa stb. (SAWA, 1996; OHGA, 1999; OHGA, 2000; SZARVAS és SZARVAS, 2002; OHGA & ROYSE, 2004). Az egyes országoknak saját maguknak kell fölmérniük, hogy milyen könnyen hozzáférhető, olcsó, a faj termesztésére alkalmas alapanyagok állnak a rendelkezésükre, és ennek megfelelően kell a szubsztrátum összetételt meghatározni. Az alapanyagot nedves hőkezeléssel, xerotherm eljárással vagy steril technológiával állíthatják elő (KÓSZÓ, 1997; SZARVAS és SZARVAS, 2002). Szaporítóanyag A kereskedelemben megtalálható legtöbb törzs európai eredetű. Szaporítóanyagként az esetek többségében szemcsírát használnak föl, de szintén előfordul a plug csíra használata is. A termesztés lehetőségei Az alapanyag hőkezelése alapján lehetőség van száraz hőkezelésre, azaz xerotherm eljárásra (100 C-on történő 1-1,5 órás hőkezelés, nedvesítés és csírázás); nedves hőkezelésre (alapanyagok keverését, nedvesítését, prizmába húzását követő indoor pasztörözés, kondicionálás, hűtés és csírázás); sterilizálásra (autoklávokban történő teljes csíramentesítés, hűtés, majd csírázás) és egyéb elsősorban hobbi termesztésben használt lehetőségekre. Jelenleg a steril eljárás az egyik legcélravezetőbb módszer az alapanyag dúsítása és összetétele miatt. Az alapanyag zsákos, blokkos, továbbá üveges, PP-üveges és ládás kiszerelésben kerülhet a termesztésbe. Lehetőség van a takarás nélküli termesztésre, amikor a termőtestek a szabad lignocellulóz alapú, átszövetett szubsztrátum-keverék felszínéről fejlődnek, valamint a takarással történő termesztésre, amikor az alapanyagot a csiperketermesztésben használt tőzeges takaróföldkeverékkel takarják, és így a termés a takaróföldről, illetve azon keresztül fejlődik a blokkokról. 21

22 Maga a termesztés történhet indoor (termesztő házakban, termesztő helyiségekben), outdoor (nem termesztő berendezésekben, hanem szabadban történő termesztés) és semi-indoor (a gombatermesztés bizonyos szakaszai indoor, míg más fázisai outdoor zajlanak) módszerekkel. A P. eryngii termesztésével kapcsolatban négy termesztési módszert említenek: zsákos, takarásos, üveges és az outdoor módszer (TAN et al., 2005). Zsákos módszer: Különböző kapacitású filterekkel rendelkező (0,5-3,0 kg, maximum 5 kg) polipropilén esetleg polietilén zsákokat használnak. A zsákok körülbelül a kapacitásuk feléig, háromnegyed részéig tartalmazzák a szubsztrátumot. Az alapanyagot sterilizálják (1,5-3 óra, 121 C), majd egy éjszakán át hűtik. A zsákokat oltják a csírával, majd homogenizálják. Az átszövetés, érlelés átlagos ideje napig terjed C-os hőmérsékleten. Ezt követően a hőmérsékletet lecsökkentik C-ra primordium indukció céljából. A zsákokat a primordiumok kialakulását követően kinyitják, majd ezt követően fokozatosan fejlődnek ki a termőtestek. Az érett gombák a tűfej-képződést követően 6-7 napon belül kifejlődnek. Általában csak az első termőhullámot várják meg a termesztők, mielőtt a szubsztrátumot kitermelik (CAILLEUX & DIOP, 1976; RODRIGUEZ ESTRADA &ROYSE, 2008). Takarásos módszer: A klimatikusan kevésbé kontrollált termesztési környezetben, a szubsztrátum vízvesztésének megakadályozására célszerű takarást végezni. A magas nedvességtartalmú takaróföld véd a kiszáradás ellen, csökkenti a vízveszteséget (OEI, 2006). A szubsztrátumba történő utólagos vízpótlás nem lehetséges. A takarásos termesztés esetén nem világos, hogy a takarásnak a fő funkciója a vízveszteség megakadályozása, vagy más szerepe is van, mint például a kétspórás csiperke termesztésében. A szubsztrátot blokkokba tömörítik, autoklávozható fóliában vagy zsákban sterilizálják (1,5-3 óra 121 C-on) vagy pasztörizálják. A csírázás a blokkok minden részén történő beoltásával valósul meg, majd a zsákokat lezárják (OEI, 2006). Miután a szubsztrát átszövetése megvalósult, a takaró réteget 1,5-3 cm vastagságban rárétegezik a szubsztrátumra. Lehetőség van különböző takaróanyagok használatára (tőzeg, homok, talaj stb.) Ezzel a módszerrel akár három terméshullám is nyerhető (RODRIGUEZ ESTRADA, 2008). GYŐRFI és munkatársai (2007) kimutatták a takarás termésmennyiségre gyakorolt pozitív hatását. Üveges termesztési módszer: A P. eryngii termesztését Japánban, Koreában, Kínában és kis mértékben az Egyesült Államokban is szubsztrátumot tartalmazó polipropilén palackokban ( ml) valósítják meg. Többek között fűrészpor és gyapotmag-héj lehetnek a fő alapanyagok. Búza-, és rizskorpa, őrölt szójabab, gabonák és őrleményeik (kukorica, búza, zab, rozs, köles, és maláta) használatosak, mint táptalaj kiegészítők (RODRIGUEZ ESTRADA & ROYSE, 2005). Hazánkban a darált búzaszalma is fontos alapanyag lehet. A táptalajt összeállítják, majd a nedvességtartalmat 22

23 60-65%-ra állítják be. 16 palackot rendeznek el műanyag ládákban. A szubsztrátumnak palackokba helyezése után függőleges mélyedéseket készítenek a beoltás helyének kialakítására. A táptalajt autoklávozzák (1,5-3 óra 121 C-on), majd hűtik és csírázzák. Koreában a folyadék fázisban lévő csírával történő beoltásnak módszere a P. eryngii és Flammulina velutipes esetén meglehetősen közkedveltté vált. Az átszövetési periódus 28 naptól 35 napig terjed, C hőmérsékleten. Kolonizációt követően a fedőt, és a kolonizált szubsztrát legfelső rétegét eltávolítják, és perforált fóliafilm-borítás kerül az üvegekre. Ezt a primordium-képződést követően távolítják el. A termőtestkezdemények képződéséhez a relatív páratartalom (Relative Humidity RH) szintje 90-95%-ig terjed, míg a termőtest-képzéshez 85% szükséges. Egy termőhullám érhető el az üveges módszer használatával (CAILLEUX & DIOP, 1976; RODRIGUEZ ESTRADA & ROYSE, 2005; RODRIGUEZ ESTRADA, 2008). Outdoor termesztés: A fentiekben említett takarásos módszert outdoor termesztéshez használják. A módszert főként Olaszországban alkalmazzák. A táptalajt tartalmazó műanyag zsákokat pasztörizálják, beoltják, majd indoor inkubálják. Miután a szubsztrátumban az átszövetés teljesen végbemegy, a műanyag zsákokat eltávolítják, és a táptalajt egy, a szabadban kialakított árokban helyezik el, majd bevonják a szabadban lévő talajjal. Árnyékolás és védelem céljából egy fémszerkezetet építenek, amelyre szövetet erősítenek. Az öntözést időszakosan hajtják végre (ZERVAKIS & VENTURELLA, 2002). Annak ellenére, hogy a P. eryngii fejlődése ilyen körülmények között követi a szezonális megjelenést, az outdoor termesztési idő elnyújtható a megfelelő klímájú helyekre történő telepítéssel (RODRIGUEZ ESTRADA, 2008) A P. ERYNGII TÖRZSEK A TERMESZTÉSBEN A termesztésben föllelhető P. eryngii törzsek jelentős része Európából származik, ennek ellenére a törzsek között jelentős különbségek lehetnek a termesztési vonatkozások tekintetében. Ezek a különbségek megnyilvánulnak mind a morfológiai, mind a termesztési tulajdonságok terén. A kereskedelmi forgalomban lévő törzsek nem igazán céltudatos szelekció eredményeként kerültek a piacra, hanem végül a termesztés szelektálta őket. Első lépésben mindenképpen a vad izolátumok szelekcióját szükséges elvégezni a termeszthetőség és a piaci érték szempontjából. A munka során saját izolátumaink összehasonlító termesztési vizsgálatait végeztük el. Irodalmi adatokat nem találtunk arra vonatkozóan, hogy termesztési célokra, hagyományos nemesítési munkával állítottak volna elő hibrideket. YASUSHI és munkatársai 2003-ban protoplasztálással nyert gombasejteket UV hatásának tettek ki. Az indukált mutagenezis eredményeként spórátlan mutáns törzset sikerült előállítaniuk. 23