PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR

Átírás

1 PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR ÁLLAT- ÉS AGRÁRKÖRNYEZETTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA DOKTORI ISKOLAVEZETŐ: PROFESSZOR DR ANDA ANGÉLA. D. Sc TÉMAVEZETŐ: DR. SZÉKELY CSABA, c. egyetemi tanár, tudományos tanácsadó VIZSGÁLATOK BALATONI-, VALAMINT MALAJZIAI ÉDESVÍZI- ÉS TENGERI BIOTÓPOKON ÉLŐSKÖDŐ HALPARAZITA NYÁLKASPÓRÁSOKON DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI Készítette: MUHAMMAD HAFIZ BORKHANUDDIN KESZTHELY, HUNGARY

2 1. BEVEZETÉS Jóllehet a szabadon élő halak általában parazitákkal fertőzöttek, és bizonyos mértékig károsodnak, ezek a paraziták csak extrém körülmények között fenyegetik a populációk életét a természetben. Ugyanakkor, ha a halakat viszonylag nagy sűrűségben tartjuk, vagy ilyen állapotba kényszerítjük, nagy valószínűséggel megbetegedések alakulnak ki. A tenyésztett halak nagy tömegben való tartása esetén mindig számíthatunk arra, hogy állományunk életben maradását paraziták és pathogen organizmusok fogják fenyegetni (Rückert és társai, 2008). A Myxozoa Grasse, 1979 Phylumhoz tartozó fajokról jól ismert, hogy azok jelentős pathogen hatást gyakorolnak gazdáikra. A Myxozoa Pylumnak két osztálya van. 1) A Malacosporea osztály és a 2) Myxosporea osztály. A myxozoák kutatása során kapott eredmények arra ösztönözték a kutatókat, hogy ennek a csoportnak az eredetét és törzsfejlődési problémáit behatóan tanulmányozzák. Az alapvető kérdés az volt, hogy ezek a szervezetek vízi gerinctelenekben alakultak-e ki és terjedtek át halakra, vagy fordítva. Mindezideig a Myxozoa Phylum alapvető filogenetikai helyzete bizonytalan (Canning és Okamura, 2004). A Myxosporea osztály képviselőivel kapcsolatos kísérletekhez annelidáknak, mint alternative gazdáknak a gyűjtése szükséges, míg a Malacosporea osztálynak a képviselői, eddigi ismereteink szerint, csak bryozoa alternatív gazdákban fejlődnek. A Myxosporea Osztályba tartozó élősködők fejlődését illetően általánosan elfogadott, hogy fejlődési ciklusuk két gazdában zajlik le, két fejlődési fázissal, melyben myxosporák illetve aktinospórák alakulnak ki. A myxospóra fázis gerincesekben megy végbe (halak, kétéltűek, hüllők), ahol a spórák általában nagy plasmodiumokban alakulnak ki, melyekben pánsporociszták képződnek. Ezzel szemben az aktinosporák iszaplakó annelida gazdák bélhámjában fejlődnek. Újabb ismeretek szerint a myxozoák (nyálkaspórások) gazdaköre kiterjed néhány szárazföldi emlősre és madárra is. Jelen vizsgálatok során különös figyelmet szenteltünk Magyarország és Malajzia édesvízi ökoszisztémái Myxosporea osztályba tartozó parazitáira, de bevontunk vizsgálatainkba néhány malajziai tengeri és brakkvízi régiót is. A magyarországi édesvízi biotópokon a myxosporeák széleskörű diverzitását figyeltük meg. Ezen a faunaterületen mintegy száz, különböző nemzetségkhez tartozó (Henneguya, Hoferellus, Myxidium, Myxobilatus, Myxobolus, Sphaerospora, és Thelohanellus) myxozoa előfordulását regisztrálták Magyarországon (Molnár et Székely, 1995, 1999; Székely et Molnár, 1996; Molnár et al. 2006c). Ezzel szemben a myxozoák diverzitása Malajziában jóval inkább alábecsült. Ennek ellenére az utóbbi években Malajziában mind tenyésztett és vadon élő halakban talált nyálkaspórások nagy taxonómiai diverzitást mutatnak (Molnár et al., 2006a, b; Székely et al., 2009a, b). Ezen fajoknak a gazdákkal való kacsolata, fajlagossága és regionális elterjedtsége meglehetősen ismeretlen. A myxozoa paraziták előfordulására és specifikációjára történő vizsgálatok csak egy részét képezik az értekezésnek. A nyálkaspórások kutatásában a molekuláris vizsgálatok széles skálájának alkalmazása egy új irányzat a kutatásban, elsősorban a fajok jellemzésére és klasszifikációjára. Néhány fajnak a rendkívüli morfológiai hasonlósága és mérete miatt a rendszertannal foglalkozó szakemberek igénylik ezt a tudományos módszert, és beiktatják munkájukba a genetikai analízis végzésénél, hogy egyéb eredményeiket alátámasszák. 2

3 Felismerve a haltenyészetekben potenciálisan pathogen myxozoák kórtani jelentőségét jelen disszertáció magába foglalja a Magyarországon és Malájziában lévő biotópokról kimutatott édesvízi nyálkaspórás kollekciót, kiegészítve néhány malajziai folyótorkolati myxozoára vonatkozó adattal. Az értekezés alapelve az volt, hogy mind halakból (myxospora), mind annelidákból (actinospora) spórákat gyüjtsünk beható morfológiai elemzésre. A mélyebb, az alapvető tudást segítő munka erre a parazitacsoportra vonatkozóan a molekuláris módszerek alkalmazásával valósult meg, melynek segítségével a fajok azonosítása mellett sor kerülhetett a vizsgált élősködők genetikai analízisére is. A morfológiai értékelés és a 18S rdns szekvenciák genetikai vizsgálatai alapján ez a munka a következő tárgykörökre terjed ki: 1. A Malajziában gyűjtött, vadon élő és tenyésztett halakat fertőző Myxosporea osztályba tartozó fajok azonosítása. 2. A Balaton és a Kis Balaton viztározó actinosporea faunájának feltárása Magyarországon. 3. A Magyarországon gyűjtött kollekció alapján a Myxosporea osztályba tartozó myxosporeák actinospora és myxospora stádiumainak azonosítása. 2. ANYAG ÉS MÓDSZER 2.1. Malajziai Myxozoa Gyűjtemény A gyűjtéseket A Kuala Teregganu Állam, Terengganu város közeli édesvízi és torkolati biotópokon végeztük. A halakat A Tasik Kenyir Víztározóból ( N, E) és a Merang torkolatnál ( N, E) fogtuk kopoltyúhálóval. A halakat az Institute of Tropical Aquaculture (AKUATROP), University Malaysia Terengganu (UMT) laboratóriumába szállítottuk, és szellőztetett akváriumban tartottuk. A halakat dekapitálással kiirtottuk,, boncoltuk és a fogás után két napon belül feldolgoztuk. Néhány fontosabb szervet, mint a kopoltyút, uszonyokat és az izomzatot különös figyelemmel vizsgáltuk. A myxozoa plazmódiumokkal fertőzött szerveket Nikon MM-800 mikroszkóppal tanulmányoztuk. A gazda átvizsgálása után a plazmódiumokat óvatosan eltávolítottuk a szövetek közül, egy finom tűvel tárgylemezre helyeztük és felnyitottuk. A szétnyitott plazmódiumokból nyert spórákat egy Nikon Model Eclipse 80i fénymikroszkóppal vizsgáltuk tovább. Alkalmanként 30 spórát tanulmányoztunk és mértünk Lom és Arthur (1989) útmutatásai szerint. A spórákat további molekuláris biológiai analízis céljára 80 %-os alkoholban őriztük meg. A voucher spórákat a Magyar Természettudományi Múzeum Zoológiai Gyűjteményébe küldtük. A spórákról kapott méreteket és rajzokat az adott gazdáról vagy hasonló fajokról gyűjtött szakirodalomban már közölt fajokkal hasonlítottuk össze, és szekvenciáikat a filogenetikai fán is összevetettük. 3

4 2.2 Magyar Myxozoa gyűjtemény Az actinosporea fauna vizsgálatát a Balatonbólszármazó 2011 április 16-tól szeptember 25 között gyújtött oligochaetákon végeztük. A gyűjtési pontok a következők voltak: Keszthely, Tihany, Balatonvilágos, Balatonszemes, Siófok, Zala folyó és Kis Balaton Tározó. Iszapot gyűjtöttünk, lehetőleg a vízi növények környezetéből m mélységből. Az iszapból litert 1000 μm szembőségű szitán átszürtük, hogy a durva részeket eltávolítsuk. Az üledékben, vegetáción és elhalt anyagokon fennmaradt oligochaetákat egy kisebb vízmennyiséggel laboratóriumba szállítottuk. Az oligochaetákat tálcákon klórtalanított vizben szabad kézzel válogattuk ki. Azonosításuk Timm (1999) határozó kulcsa szerint történt. A nehezebben diagnosztizálható fajok azonosításához Tarmo Tim észt specialista segítségét kértük, amit ő fotók, vagy a hozzá eljuttatott példányok alapján végzett el. Az oligochaetákat u.n. cell-well platekre különítettük el Yokoyama és mtsai (1991) módszere szerint. Az oligochaetákat egyenként helyeztük a plasztik edény mélyedéseibe mintegy 200 μl klórmentes vízbe. Minden egyes mélyedést Zeiss Trewal 3 inverz mikroszkóppal tekintettünk át az esetleg kibocsátott actinospórák kimutatása céljából. A kibocsátott actinosporákat pipettával kigyűjtöttük, és mikroszkóp alatt vizsgáltuk. Az actinospórákról fotókat készítettünk egy Olympus BH-2 mikroszkóppal, fény- illetve fáziskontraszt megvilágítással, DP 20 digitális kamerával. A mikroszkópos fotók alapján rajzokat készítettünk a spórákról. Az aktinospórák méreteit változó számú egyedről vettük fel (az oligochaetából nyerhető egyedek száma alapján), de lehetőleg 30 példányt vizsgáltunk. Az egyes actinospora típusok spóraméretét a Lom és mtsai. (1997) által adott szempontok szerint rögzítettük 2.3 DNS izolálás. PCR, Myxozoák szekvenálása Az etanolban tartósított spórákból a DNeasyTM Blood and Tissue kit (Qiagen) segítségével vontuk ki a DNS-t, a gyártó használati utasításait követve. Ezután kétkörös, ún. nested PCR-t használtunk a 18S rdns gén specifikus felerősítésére. Az első körben univerzális eukarióta primerekkel dolgoztunk: ERIB1, 5 -ACC TGG TTG ATC CTG CCAG-3 és ERIB10, 5 -CTT CCG CAG GTT CAC CTA CGG-3 (Barta és mtsai, 1997). A 25µl végtérfogatú reakcióelegy 2µl kivont genomi DNS-t tartalmazott, továbbá 5µl dntp-t (dezoxiribonukleotid-trifoszfát, MBI Fermentas), 0,25µl-t a fenti primerekből; 2,5µl 10 DreamTaq puffert (MBI Fermentas), 0,1µl DreamTaq polimerázt (2U, MBI Fermentas) és 15µl vizet. Az amplifikáció során a következő hőprofilt alkalmaztuk: a kezdeti denaturációt 95 C-on 3percig végeztük, majd 35 cikluson keresztül a következők ismétlődtek: 95 C 1 perc, 55 C 1 perc, 72 C 2 perc. A ciklust egy végső lánchosszabbító lépés követte, 72 C-on 7 percig. A második körben Myxozoa specifikus primereket használtunk, hogy célzottan felerősítsük a csak erre a taxonra jellemző 18S rdns szakaszokat: Myx1F, 5 -GTG AGA CTG CGG ACG GCT CAG-3 és SphR, 5 -GTT ACC ATT GTA GCG CGC GT-3. Az 50µl végtérfogatú reakcióelegy 1µl templátot tartalmazott, mely az első PCR kör során felszaporított termék volt, továbbá 10µl 1mM-s dntp-t (MBI Fermentas), 0,5µl-t a Myxozoa specifikus primerekből, 5µl 10 DreamTaq puffert (MBI Fermentas) és 33µl vizet. A második kör hőprofilja a 4

5 következőképpen alakult: 95 C 3perc kezdeti denaturációs lépés, majd 35 cikluson keresztül 95 C 50mp, 50 C 50mp, és 72 C 1 perc, majd végül 7 perces lánchosszabbító lépés 72 C-on. A PCR reakciókat a PTC-200 (MJ Research) PCR készülékkel végeztük el. Az így kapott termékeket 1%-os agaróz gélben futtattuk meg, amihez Tris-Acetát-EDTA puffert és 1% etidium bromid festéket használtunk. A megfelelő méretű amplikonokat ezután kitisztítottuk az EZ-10 Spin Column PCR Purification Kit (Bio Basic Inc) segítségével, a gyártó használati utasítása szerint. A tisztított termékeket Myxozoa specifikus primerekkel szekvenáltuk a BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies) és az ABI PRISM 3100 Genetic Analyser (Life Technologies) segítségével. A kapott szekvencia szakaszok összerendezéséhez a MEGA 5.10 es szoftvert (Tamura és mtsai, 2011) használtuk, ezen belül a Clustal W algoritmust (Thompson és mtsai, 1994). A manuális korrekciókhoz és a filogenetikai analízisekhez a minták páronkénti hasonlóságát a Tamura-Nei szubsztitúciós modell alapján határoztuk meg. A myxospórák filogenetikai helyzetét Maximum Likelihood (ML) és Bayesian inference (BI) analízisekkel állapítottuk meg. MEGA 5.10-es program segítségével kiválasztottuk a mintáinkra legjobban passzoló szubsztitúciós modellt az Akaike-féle információs kritérium (Akaike Information Criterion, AIC) szerint, ez esetünkben a GTR+G+I modell (General Time Reversible model + Gamma distribution + Invariant sites) volt. A kapott filogenetikai fa pontosságának és megbízhatóságának tesztelését bootstrap vizsgálattal végeztük, 1000-es újramintavételezési számot alkalmazva. A BI filogenetikai fát Topali 2.5 szoftverrel számítottuk ki Milne és mtsai, 2008).A filogenetikai elemzéshez használt referencia fajokat a mi spóra izolátumainkhoz való hasonlóság alapján választottuk ki a BLAST alkalmazás segítségével. Ezek legtöbbje kopoltyú-élősködő, de megtalálhatóak más szerveket, szöveteket megtámadó paraziták is köztük. A hozzájuk tartozó szekvencia adatokat a Génbankból töltöttük le. 3. EREDMÉNYEK A Malajziában gyűjtött anyagban természetes vizekből befogott halgazdákról származó Myxospora fajok voltak. Öt új fajnak tekinthető myxozoát jellemeztünk, melyek a Myxobolus tambroides sp. n., Myxobolus sp. I, Myxobolus ophiocarae sp. n., Myxidium sp. I, és Myxidium sp. II fajok közül kerültek ki. Nem sikerült aktinospórákat nyernünk a Malajziában gyűjtött oligochaetákból, illetve polychaetákból. A magyarországi biotópokon tanulmányozott aktinospora fauna tanulmányozásakor a következő eredményeket kaptuk. Spórákat találtunk a fertőzött Isochaetides michaelseni, Branchiura sowerbyi egyedekben és egy Nais sp-ben. Tizenhárom aktinospora típust mutattunk ki, melyek az aurantiactinomyxon (5 típus), neoactinomyxum (1 típus), raabeia (2 típus), synactinomyxon (1 típus), és triactinomyxon (4 típus) gyűjtő csoportokba tartoztak. Tanulmányozva az egyes actinospora típusok és a már ismert myxospora fajok DNS szerkezete közötti hasonlóságát ezen munkánk során 5 myxosporea faj fejlődését illetően kaptunk adatot bizonyítva, hogy az actinosporák megfelelnek az adott myxosporáknak. A tálált actinospórákat és myxospórákat az alábbiakban írom le. 5

6 3.1 Maláj gyüjtés 1. Myxobolus tambroides sp. n. (Figs. 1a, b) A fertőzöttséget 60-ból 36 (60%) T. tambroides (mahseer) halban találtuk meg. Az érett spórákat tartalmazó plazmódiumok intralamelláris helyeződésben voltak megtalálhatók a kopoltyún. Ez az élősködő morfológiailag és DNS szerkezetében is különbözik az ismert fajoktól, ezért mint új faj került leírásra. A digitalizált fotók és a syntípus spórák a Magyar Természettudományi Múzeum, Budapest, Zoológiai Szekciójának gyűjteményében, HNM számon került elhelyezésre. A M. tambroides sp. n.. 18S rdns szekvenciája JX számon került a Génbank-ban elhelyezésre. 2. Myxobolus sp. I (Figs. 1e, f) A fertőzöttséget 15-ből 3 (15%) Labiobarbus sp (Cyprinidae) egyedben találtuk meg. A megnyúlt alakú plazmódiumok a gazda izomsejtjeiben intracellulárisan fejlődtek. A digitalizált fotók és a syntípus spórák a Magyar Tudományos Akadémia Mezőgazdasági Kutatóközpontja Állatorvos-tudományi Intézetének, Budapest gyüjteményében találhatók meg. A Myxobolus sp. 1. szekvenciája 94.6 %-ban hasonlított a M. cyprini 18S rdns szekvenciájára. 3. Myxidium sp. I (Figs. 2a, b) A fertőzöttséget 13-ból 2 (15, 4%) Notopterus notopterus (Notopteridae) egyedben találtuk meg. Az érett spórákat a fertőzött halak epehólyagjából mutattuk ki. A digitalizált fotók és a syntípus spórák a Magyar Tudományos Akadémia Mezőgazdasági Kutatóközpontja Állatorvos-tudományi Intézetének, Budapest gyüjteményében találhatók meg. A Myxidium sp S rdns szekvenciái a legközelebbi hasonlóságot a Myxidium cuneiforme fajjal mutatták (90.6%). 4. Myxidium sp II (Figs 2. c, d) A fertőzöttséget 13-ból 2 (15, 4%) T. tambroides (Notopteridae) egyedben találtuk meg. Az érett spórákat a fertőzött halak epehólyagjábból mutattuk ki. Ez a faj morfológiailag és filogenetikai szekvenciáiban egyaránt különbözik az ismert Myxidium fajoktól. A digitalizált fotók és a syntípus spórák a Magyar Tudományos Akadémia Mezőgazdasági Kutató-központja Állatorvos-tudományi Intézetének, Budapest gyüjteményében találhatók meg. A Myxidium sp. II. 18S rdns szekvenciái a legközelebbi hasonlóságot a Myxidium anatidum fajjal mutatták (87.2%). 5. Myxobolus ophiocarae sp. n. (Figs. 1c, d) Ezt az élősködőt 12 megvizsgált Ophiocara porrocephala példánynak egyetlen egyedéből (8.3%) mutattuk ki. A kopoltyúlemezeken elhelyezkedő plazmódiumok.sztereo- és fénymikroszkóppal egyaránt könnyen észrevehetők voltak. Ez az újonnan izolált faj mind morfológiailag mind genetikailag különbözött a már ismert Myxobolus fajoktól., és M. ophiocarae sp. n. néven került leírásra. A digitalizált fotók és a syntípus spórák a Magyar Természettudományi Múzeum, Budapest, Zoológiai Szekciójának gyűjteményébe HNM számon kerültek elhelyezésre. A M. ophiocarae sp. n.. 18S rdns szekvenciái KF és KF számon kerültek a GénBank-ban elhelyezésre. 6

7 1. ábra. Myxosporákról frontális és oldalnézetből készített tusrajzok. (A, B) Myxobolus tambroides sp. n. ; (C, D) Myxobolus ophiocarae sp. n.; (E, F) Myxobolus sp. I. Bar = 10µm 2. ábra. 1. ábra. Myxosporákról frontális és oldalnézetből készített tusrajzok. (A, B) Myxidium sp. II; (C, D) Myxidium sp. I. Bar = 5µm A szakirodalomban nagyon kevés adat található a malajziai myxosporákról; ezért ez a munka gazdagítja jelenlegi ismereteinket a témát illetően. A korábbi vizsgálatok azt bizonyították, hogy a malajziai tógazdaságokban tenyésztett halaknak (Molnár et al. 2006a, b; Székely et al. 2009b) és az olyan természetes vizekből fogott halaknak, mint a Tasik Kenyir víztározó igen gazdag myxozoa faunája van. A myxozoák általában, pl. a Myxobolus fajok, viszonylag erős 7

8 gazdafajlagossággal rendelkeznek, és Molnár (1994) feltételezte, hogy azok egy halfajon vagy legfeljebb néhány közeli rokon halfajon élősködnek. Elfogadva a fenti tételeket valószínűnek látszik, hogy a malajziai halakon talált halak többsége új, eddig le nem írt fajoknak felel meg. A halakon élő Myxobolus fajokról ismert, hogy azok többnyire szöveti paraziták. 3.2 Magyarországi gyűjtemény (Actinospora) 1. Aurantiactinomyxon Típus 1 (Ábrák. 3a, b; Táblázat 1) A spóratest háromszög alakú apikális nézetben, átmérője 16.1 ( ) μm, a farki nyúlvány 22.4 ( ) μm hosszú és 4.7 ( ) μm széles a bázisnál. A mért legnagyobb kiterjedés 55.5 ( ) μm. A farki nyúlványok egyenlőek, hosszúak és elvékonyodók, végük lekerekített vagy kihegyesedő, lefelé görbülnek. A sarki tok előlnézetből szférikus, μm méretű, mind egyformán elkülönül a spóra rádiusa közepén és kifelé irányul. A poláris filamentumok csavarszáma nem volt megszámolható. A sporoplazma-tömegben több mint 120 csírasejt volt megszámolható. 2. Aurantiactinomyxon Típus 2 (Ábrák. 3c, d; Táblázat 1) A spóratest apikális és oldal nézetben egyaránt lekerekített, átmérője 10.3 ( ) μm, a farki nyúlvány 32.5 ( ) μm hosszú és 5.77 ( ) μm széles a bázisnál. A mért legnagyobb kiterjedés 65.4 ( ) μm. A farki nyúlványok egyenlő hosszúak és elvékonyodók a kihegyesedő vég felé, lefelé görbülnek. A sarki tok előlnézetből szférikus, μm méretű, mindegyik a spóratest közepén helyezkedik el, és kifelé irányul. A sporoplazma-tömegben 16 csírasejt volt megszámolható. 3. Aurantiactinomyxon Típus 3 (Ábrák. 4a, b; Táblázat 1) A spóratest apikális és oldal nézetben egyaránt szubszférikus finom bevágásokkal a spóratest szélén, átmérője ( ) μm. A jellegzetes farki nyúlvány ( ) μm hosszú és 10.0 ( ) μm széles a bázisnál. A legnagyobb kiterjedés ( ) μm. A kaudális nyúlványok egyenlőek, megnyúltak, ujj-szerűek, és hegyesen végződnek. A sarki tok apikális nézetben kerek, μm méretű, oldalnézetben körte alakú. A spóratest középen helyezkedik el. A sporoplasma feltehetően 32 csírasejtből áll. 4. Aurantiactinomyxon Típus 4 (Ábrák. 4c, d; Táblázat 1) A spóratest apikális nézetben kerek a szélein finom bemélyedésekkel, átmérője ( ) μm. A kaudális nyúlványok 23.9 ( ) μm hosszúak és 12.4 ( ) μm szélesek a bázisnál, a legnagyobb kiterjedés 64.2 ( ) μm. A kaudális nyúlványok egyenlőek, levél alakúak, ceruzavég szerűen elvékonyodnak a végükön, és lefelé görbülnek. A sarki tok μm méretű, a spóratest közepén helyezkedik el. Az ellapult sporoplasma testben 28 csirasejtet számoltunk meg (valószínű szám 32). 8

9 1. táblázat. A vizsgálat során gyűjtött aurantiactinomyxon típusok összehasonlító adatai (a méretek mikrométerben vannak megadva). Morfotípus Alternatív féreg. gazda A spóratest mérete Kaudális nyúlvány Hossza Szélessége CP Legnagyobb kiterjedése Sarki tok Csíra sejtek száma Genetikai megjegyzések AUM Típus1 AUM Típus2 AUM TTípus3 AUM Típus4 AUM Típus5 IM IM BS BS N ( ) ( ) ( ) ( ) 10.3 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 4.71 ( ) 5.77 ( ) ( ) ( ) 6.5 ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 36.9 ( ) H: 3.4 Sz: 2.5 > bp ~ Myxobolus cultus (92%) Xi et al. (2013) H 3.4 Sz: Nincs adat H: 3.4 Sz: Nincs adat H: bp ~ Thelohanellus kitauei (99.4%) Sz: 2.8 >26 (32?) Ye et Wang 2012 (nem publikált) H bp ~ T. nikolskii (99.9%) Sz: Eszterbauer et al táblázat. A vizsgálat során gyűjtött raabeia, synactinomyxon, és neoactinomyxum típusok összehasonlító adatai (mikrométerben) Morfotípus Invert. Alternatív féreg gazda Spóratest mérete Kaudális nyúlvány Hossza Szélessége Hossza Szélessége Sarki tok Csíra sejtek száma Genetikai megjegyzések RAB típus 1 I. michaelseni ( ) 8.98 (8-11.4) ( ) 5.44 ( ) H: 6.3 Sz: 3.0 Nincs adar. 1876bp ~ Triactinomyxon sp F. (91%) Kent et al. (2001) RAB ttípus 2 I. michaelseni ( ) 5.3 ( ) ( ) 6.94 ( ) H: 5.2 Sz: Nincs adat SYN típus 1 I. michaelseni ( ) 14.7 ( ) ( ) 6.6 ( ) H: 6.1 Sz: 4.5 Nincs adat 1615bp ~ Syn. Típus EE-2004 (99%) Székely et al. (2005) NEO típus 1 I. michaelseni D: 23.5 ( ) 7.5 ( ) 19.7 ( ) H: 3.8 Sz: Nincs adat 9

10 ábra. Apikális és oldalnézetben lévő actinospórákról készült tusrajzok. A B aurantiactinomyxon típus-1; CD aurantiactinomyxon típus-2. Bar = 10 µm 4. ábra. Apikális és oldalnézetben lévő actinospórákról készült tusrajzok. A,B aurantiactinomyxon típus-3; CD aurantiactinomyxon típus-4; E aurantiactinomyxon típus-5. Bar = 10 µm 5. ábra. Actinospórákról készült tusrajzok. A raabeia típus 1; B raabeia típus-2; C synactinomyxon; D, E synactinomyxon spora teste előlnézetben és apikális nézetben; F, G neoactinomyxum. Bar. Ábrák: A, B, C = 50µm; Ábrák: D, E, F, G = 10µm 10

11 5. Aurantiactinomyxon Típus 5 (Ábra. 4e; Táblázat 1) A spóratest apikális nézetben háromszög alakutól szférikusig változik, mérete 10.3 ( ) μm. A kaudális nyúlvány 14.6 ( ) μm hosszú és 6.5 ( ) μm széles, a legnagyobb kiterjedés 36.9 ( ) μm. A kaudális nyúlványok egyforma hosszúak, ujj alakúak, lekerekített végűek, és lefelé hajlók. A sarki tok kerek apikális nézetben és μm méretű. A sporoplazma 8 sejtből áll. 6. Raabeia Típus 1 (Ábra. 5a; Táblázat 2) A spóra hagyma alakú, szélesebb az alapnál mint a spóra test végén oldalnézetben és lekerekített apikális nézetben ( ) μm hosszú és 8.9 ( ) μm széles. A kaudális nyúlványok ( ) μm hosszúak és 5.44 ( ) μm szélesek az alapnál. A kaudális nyúlványok egyenlő hosszúak, megnyúltak, elkeskenyedők, végük kihegyesedik, és lefelé görbül. A sarki tok apikális nézetben kerek, μm méretű, a spóratesten centrálisan helyezkedik el. A csira sejtek száma nem volt megszámolható. 7. Raabeia Típus 2 (Ábra. 5b; Táblázat 2) A spóratest oldalnézetben megnyúlt és cilindrikus alakú, 63.2 ( ) μm hosszú és 5.3 ( ) μm széles. A kaudális nyúlványok ( ) μm hosszúak és 6.9 ( ) μm szélesek az alapnál. A kaudális nyúlványok felfelé görbülnek, a végük felé elhegyesednek és kihegyesedten végződnek. A sarki tok oldalnézetben körte alakú, μm méretű, és az apex felé irányul. A sporoplasma 16 csírasejtet tartalmaz, melyek egy vagy két oszlopba rendezettek. 8. Neoactinomyxum Típus 1 (Ábrák. 5f, g; Táblázat 2) A spóra (spóratest a kaudális nyúlványokkal együtt) oldalnézetben elliptikus, apikális nézetben háromszögletű. A spóratest gömb alakú, átmérője 23.5 ( ) μm. A kaudális nyúlványok ( ) μm hosszúak és 6.9 ( ) μm szélesek az alapjuknál. A kaudális nyúlványok egyenlő hosszúak, megnyúltak, elkeskenyedők, hegyesen végződők és lefelé görbülők. A három sarki tok oldalnézetben kerek, μm méretű, egyformán a spóratest közepe irányában helyezkednek el. A héjsejt disztálisan és proximálisan is elhelyezkedhet el a kaudális nyúlványban. A másodlagos csírasejtek száma Synactinomyxon Típus 1 (Ábrák. 5c, d, e; Táblázat 2) A spóratest szférikus vagy hagymaszerű oldalnézetben, a bázisnál szélesebb mint az apex-nél, 19.4 ( ) μm hosszú és 14.7 ( ) μm széles. Az érett spórák kaudális nyúlványai egyenlő hosszúak, fokozatosan keskenyednek a bunkós vég felé. A nyúlványok hossza ( ) μm, és a szélessége a bázisnál 6.6 ( ) μm. A három egyenlő méretű, körte alakú sarki tok μm. A csírasejtek nem voltak megszámolhatók. 10. Triactinomyxon Típus 1 (Ábrák 6a, b) A spóratest 41.6 ( ) μm hosszú és μm ( ) széles. A kaudális nyúlványok elkeskenyedők és görbültek, μm ( ) hosszúak és μm ( ) méretűek legnagyobb kiterjedésben. A csírasejtek száma 16. A poláris fonál 5 csavarulatot ír le. 11

12 11. Triactinomyxon Típus 2 (Ábrák. 6c, d) A spóra ( ) hosszú és ( ) μm széles. A kaudális nyúlványok ( ) μm hosszúak és ( ) μm méretűek a legnagyobb kiterjedésben. A csírasejtek száma > 26 (valószínűleg 32). A poláris fonál 4 csavart ír le. A TAM 2 kaudális nyúlványainak vége erősen felfelé görbül. 12. Triactinomyxon Típus 3 (Ábrák. 6e, f) A TAM 3 hossza ( ) μm szélessége ( ) μm. A kaudális nyúlványok μm ( ) hosszúak és ( ) μm méretűek a legnagyobb kiterjedésükben. A sporoplasma több mint 30 csírasejtet tartalmaz. A sarki fonál 4-5 csavarulatot ír le. 13. Triactinomyxon Típus 4 A spóratest 41.9 ( ) μm hosszú és 11.5 ( ) μm széles. A kaudális nyúlványok nem egyenlő hosszúak, egyikük rövidebb. Enyhén hajlanak a hegyesedő végük felé, amely erősen kihegyesedve végződik. A két hosszabbik kaudális nyúlvány mérete ( ) μm. Szélességük a középen 13.6 ( ) μm. A spóroplasma 8 csírasejtet tartalmaz. A sarki fonalak 4-5 csavart írnak le. Jelen közleményt megelőzően Magyarországon hat aktinospora kollektív csoport tagjait ismertették: aurantiactinomyxon, hungactinomyxon, guyenotia, neoactinomyxum, raabeia, és triactinomyxon (El-Mansy et al. 1998a, b; Rácz et al. 2005; Eszterbauer et al. 2006). Közülük El- Mansy et al. (1998b) 5 triactinomyxon típus, két raabeia és három aurantiactinomyxum típus jelenlétét mutatta ki T. tubifex, Limnodrilus sp. és B. sowerbyi férgekből a Balatonban. Egy másik összefoglaló munkában egy halgazdaságban El-Mansy 28 actinosporea típust (4 triactinomyxon típust, 4 raabeia típust, 12 aurantiactinomyxon típust, és 8 neoactinomyxum típust,) talált., ugyanakkor Eszterbauer és mtsai (2006) 14 actinosporea típus (5 triactinomyxon típus, 4 neoactinomyxumon típus, 3 aurantiactinomyxon típus,, 1 guyenotia típus,, and 1 raabeia típus) előfordulásáról számoltak be tógazdaságokból és a Tisza folyóból. A mi adataink legérdekesebb eredménye az, hogy a korábbi szerzők (El-Mansy et al. 1998a, b;) nem ismertettek neoactinomyxumokat a Balatonból, és hogy csak a jelen munkában vannak adatok a synactinomyxon típus előfordulásáról. A fentiek alapján kimondható, hogy az actinosporea fauna Magyarországon igen gazdag típusokban. 3.3 Fejlődési ciklusok feltárása Az AUM-4, AUM-5, TAM-1, TAM-2 and TAM-3 estében amplifikált fragmentumokat nyertünk, melyekből a a Blast kutatással nyert consensus szekvenciák, %-os egyezőséget adtak myxosporea alternative típusokkal, azaz leírt fajokkal. (3. Táblázat). Az AUM-4 fragmentum tanulmányozásával 99.4%-os hasonlóságot találtunk a ponty belében fejlődő Thelohanellus kitauei fajjal. Az AUM-5 rövid DNS szekvenciái 99.8%-os genetikai hasonlóságot mutattak Eszterbauer és mtsai. (2006) aurantiactinomyxon B1 izolátumával, amely a T. nikoskii faj szevenciáinak felel meg. A TAM-1 szekvenciái %-ban egyeztek a koncér (Rutilus rutilus) Myxobolus fundamentalis fajának szekvenciáival. Ugyanakkor a TAM-2 12

13 (2 klón) 100%-os azonosságot mutatott a vörösszárnyú keszeg (Scardinius erythrophthalmus) veseereiben és intersticiumában élősködő M. erythrophthalmi szekvenciáival. 100%-os szekvencia azonosságot találtunk a TAM-3 (3 klón) os a M. shaharomae,között. Ez utóbbi faj a küsz (A. alburnus) veséjében, májában, heréjében és belének propria rétegében képez plazmódiumokat. A jelenlegi munka molekuláris vizsgálatai újabb adatokat szolgáltattak arról, hogy a Myxobolus fajok fejlődése során az aktinospora stádiumban triactinomyxon spórák jönnek létre. Az is világossá vált, hogy a M. fundamentalis, M. eryhtrophthalmi és M. shaharomae fajok azt az általánosan elfogadott fejlődésmenetet követik, melyet Wolf és Markiw (1984) először megállapított, azaz annelida alternatív gazdát igényelnek. Az összes faj, melynek a fejlődésciklusát ismerjük, tubificid férgeket (e.g. Tubifex tubifex, Branchiura sowerbyi, Limnodrilus hoffmeisteri) használ alternatív gazdaként. Egy kisebb számú myxozoa azonban lumbriculid alternatív gazdában (pl. Stylodrilus heringianus, Lumbriculus variegatus) fejlődik. Jóllehet tanulmányainkat megelőzően az Isochaetides michaelseni nem volt említve magyar myxosporea fajok alternatív gazdájaként, az Isochaetides és Limnodrilus genusok szinonimizálása megengedi azt a feltételezést, hogy a mi faj azonosításunk és a hivatkozott szerzők faj azonosítása közötti különbség ebből a tényből adódik. Ez azt sejteti, hogy a balatoni Limndorilus hoffmeisteri- re vonatkozó adatokat Isochaetides fertőzöttségnek lehet tekinteni. 4. KÖVETKEZTETÉSEK Ez a közlemény három új Myxobolus faj, két Myxidium (Myxidiidae) faj, három aurantiactinomyxon, egy neoactinomyxum, két raabeia, egy synactinomyxon és négy triactinomyxon típus előfordulásáról számol be. A munkában pontos értékelés található a malajziai myxosporeák gazdáiról és geográfiai elterjedéséről. Ugyanakkor a munka az adatokat értékelve megállapítja, hogy a minták száma túl kicsi, és a myxosporea fauna valamint a gerinces gazdák köre meglehetősen változó. Tengeri halakból ezideig nem számoltak be myxozoák előfordulásáról, ezért a parazitacsoport megismerését, azok diverzitását, gazdakörét, fejlődési stádiumait valamint az actinospora faunát fokozottan kell vizsgálni. Amellett, hogy a magyar biotópok aktinospora kollekciójának számaránya lényegesen gyarapodott, új kollektív csoportok előfordulásának megállapítására, új morfotípusok leírására került sor, és öt eddig ismeretlen fejlődési ciklust sikerült tisztázni. Ez a munka tisztázta három Myxobolus faj (M. fundamentalis, M. shaharomae, and M. erythrophthalmi) fejlődési ciklusát, és valószínűsítette két Thelohanellus faj. (T. nikolskii and T. kitauei) fejlődési mechanizmusát. Ezideig jónéhány myxospora faj került Magyarország különböző részéről leírásra és kimutatásra, azonban ezek aktinospora fejlődési szakaszáról az ismeretek hiányosak maradtak. A fentiek indokolják, hogy az aktinospóra fázis megismerésére további munkát végezzünk, abból a célból, hogy a nyálkaspórások hiányzó, megfelelő aktinospóráit kimutassuk. Jelen munkafolyamatban a fejlődési ciklus feltárását kísérletes fertőzések végrehajtása nélkül végeztük. A molekuláris analízis egy viszonylag gyors megoldást ígér, és jelentős eredményeket ad, ha a myxospora-actinospora partnerek szekvenciái megegyeznek, azonban ezeket az eredményeket a kísérletes vizsgálatok tovább erősíthetik. Munkám eredményei, hacsak kisebb mértékben is, tovább növelték a myxozoákról eddig meglévő ismereteket, malajziai fajok vonatkozásában, ill. a fejlődési ciklusok tisztázása a magyar biotópok halainak fertőzöttsége vonatkozásában ugyancsak jelentősnek tekinthető eredményeket szolgáltatott. 13

14 3.táblázat. A Balatonból és a Kis Balaton víztározóból izolált triactinomyxon típusok 18S rdns szekvenciáinak genetikai hasonlósága az ugyanezen területről gyűjtött myxospora fajok szekvenciáival Aktinospo ra típus izolátum GenBank nyílvántartási szám (a 18S rdns fragmentum hossza Genetikai hasonlóság Referenciák TAM-1 KF (1625) TAM-2 KF (1606) KF (1158) TAM-3 KF (1618) KF (1243) KF (1499) 100 %, myxospora fázis M. fundamentalis (GU968200) Molnár et al %, myxospora fázis M. erythrophthalmi (EU567311) Molnár et al %, myxospora fázis M. erythrophthalmi (EU567311) Molnár et al %, myxospora fázis M. shaharomae (EU567312) Molnár et al %, myxospora fázis M. shaharomae (EU567312) Molnár et al %, myxospora fázis M. shaharomae (EU567312) Molnár et al AUM-4 Nincs lehelyezett szekvencia 99.4%, myxospora fázis T. kitauei (JQ690367) Ye et Wang 2012 unpublished AUM-5 nincs lehelyezett szekvencia 99.8%, actinospora fázis T. nikolskii (DQ231136) Eszterbauer et al ábra. Triactinomyxon spóráról készült fázis kontraszt mikrofotó és sematikus rajz. (A és B) M. fundamentalis actinospora stádiuma. (C és D) M. erythrophthalmi actinospora stádiuma. (E és F) M. shaharomae actinospora stádiuma. 14

15 5. AZ ÚJ EREDMÉNYEK LISTÁJA 1. Egy új élősködő faj, Myxobolus tambroides sp. n. leírása Tasik Kenyir Víztározóból, Malajzia. Parasitology Research. DOI /s Egy új élősködő faj, Myxobolus ophiocarae sp. n. leírása a Merang folyó torkolatából, Malajzia. Parasitology Research. DOI /s Egy Myxobolus és két Myxidium faj tervezett leírása a Tasik Kenyir Víztározóból, Malajzia. 4. Egy új actinospora kollektív csoport kimutatása, és új actinospora morfotípus (raabeiatípus 2) kimutatása Magyarországon 5. Balatoni és kis balatoni myxosporea fajok fejlődési ciklusának tisztázása Magyarországon a következő fajokat illetően: A. Myxobolus fundamentalis B. Myxobolus erythrophthalmi C. Myxobolus shaharomae D. Thelohanellus kitauei E. Thelohanellus nikolskii 6. PUBLIKÁCIÓK A disszertációhoz tartozó publikációk Tudományos közlemények: 1. Székely Cs, Shaharom F, Cech G, Mohamed K, Zin NA, Borkhanuddin MH, Ostoros G, Molnár K (2012) Myxozoan infection of the Malaysian mahseer, Tor tambroides, of Tasik Kenyir Reservoir, Malaysia: description of a new species Myxobolus tambroides sp.n. Parasitol Res 111(4): IF Borkhanuddin MH, Cech G, Mazelan S, Shaharom-Harrison F, Molnár K, Székely C (2013) Myxobolus ophiocarae sp. n. (Myxozoa: Myxosporea: Bivalvulida) infecting the gill of wild goby, Ophiocara porocephala (Perciformes: Gobioidei) in Malaysia. Parasitol Res. DOI /s x. IF Szorosan kapcsolódó publikációk: 1. Székely C, Borkhanuddin MH, Shaharom F, Molnár K (2012) Description of Goussia kuehae n. sp. (Apicomplexa: Eimeriidae) infecting the gut of the Asian seabass (Lates calcarifer) cultured in Malaysian fish farms. Accepted Systematic Parasitology Journal. IF

16 Tudományos konferenciákon tartott előadások: 1. Borkhanuddin, H., Ostoros, GY., Molnár, K., Székely, CS. (2011): New data on the actinosporean stages of fish-parasitic myxosporeans in oligochaete alternative hosts in Lake Balaton in [Új adatok a halparazita nyálkaspórások oligochaetákban fejlődő alternatív aktinospora stádiumairól a Balatonban (2011)]. Conference Abstracts. p rd. Georgikon Scientific Conference September, 2011, Keszhely, Hungary 2. Borkhanuddin, H., Ostoros, Gy., Molnár, K., Székely, Cs. (2012): Data collected on the actinosporean stages of fish parasitic myxosporeans in annelid alternative hosts in Lake Balaton & Kis-Balaton Reservoir in MTA Állatorvos-tudományi Bizottsága Akadémiai Beszámoló (38.). Parazitológia, Állattan, Halkórtan. Előadás összefoglalók. 6. oldal Január. 18. Budapest. 3. Borkhanuddin, H, Cech, G., Ostoros, Gy., Molnár, K, Székely, Cs. (2012): Morphological and molecular biological investigations on the actinosporean satges of fish parasitic myxosporeans collected in Lake Balaton and Kis-Balaton Reservoir in Az előadások összefoglalói. 26. oldal. XXXVI. Halászati Tudományos Tanácskozás Május Szarvas. 4. Borkhanuddin, H, Cech, G., Ostoros, Gy., Molnár, K, Székely, Cs. (2012): Collection Of The Actinosporean Stages Of Fish-Parasitic Myxosporeans In Annelid Alternative Hosts In Lake Balaton & Kis Balaton Reservoir In Tavaszi Szél (Spring Wind) PhD Konferencia. Győr Május Borkhanuddin, H, Cech, G., Ostoros, Gy., Molnár, K, Székely, Cs. Morphological And Molecular Investigations On The Actinospore Stages Of Myxozoans Infecting Oligochaetes From Lake Balaton And Kis-Balaton Reservoir With Finding Actinospore- Myxospore Pairs Of Three Myxobolus spp. 54th Georgikon Scientific Conference (October ). Keszthely, Hungary. 6. Borkhanuddin, H, Cech, G., Molnár, K, Székely, Cs. A Survey On Myxozoans Infecting Wild Fishes In The Terengganu District, Malaysia. Academic Reports: Parasitology, Zoology, Fish Pathology. (January th).Budapest, Hungary. 7. Borkhanuddin, H, Molnár, K, Székely, Cs.. Marine Biology Study in Malaysia & Sea Turtle Conservation Works. ELTE University. (26th March, 2012) Budapest Hungary 8. Borkhanuddin, H, Cech, G., Molnár, K, Székely, Cs. Studies on Fish Parasitic Myxozoan in Marine & Freshwater Biotopes of Hungary & Malaysia. TEMASEK Life Sciences Laboratory (February th ) Singapore 9. Borkhanuddin, H, Cech, G., Molnár, K, Székely, Cs.. Parasitic Myxozoans. Porto University (May th -31 st ) Porto, Portugal 16

17 10. Borkhanuddin, H, Cech, G., Molnár, K, Székely, Cs. The Life Cycle of Three Myxobolus spp. and Two Thelohanellus spp. (Myxozoa) From Fishes of Lake Balaton and Kis Balaton Reservoir. European Association of Fish Pathologist (EAFP) Conference, in September 2013, in Tampere, Finland Tudományos konferenciákon szereplő poszterek: 1. Borkhanuddin MH, Shaharom-harrison F., Bachok Z. (2011): Infestations of Notchedthreadfin Bream, Nemipterus peronii, with the Paraphilometroides nemipteri, and The Potential Use of This Parasite as Biological Tag for Stock Discrimination; Malaysian Study Case. Az előadások összefoglalói. 42. oldal. XXXV. Halászati Tudományos Tanácskozás Május Szarvas 2. Borkhanuddin, H, Cech, G., Ostoros, Gy., Molnár, K, Székely, Cs. The life cycle of three Myxobolus spp. and two Thelohanellus spp. (Myxozoa) from fishes of lake Balaton and Kis Balaton reservoir. Poster. HAKI NAPOK (May ) Szarvas, Hungary 3. Borkhanuddin, H, Cech, G., Ostoros, Gy., Molnár, K, Székely, Cs. New data of parasitic fish myxozoa (Myxobolidae) of Malaysian biotopes. Poster. HAKI NAPOK (May ) Szarvas, Hungary. 4. Borkhanuddin, H, Cech, G., Molnár, K, Shaharom-harrison F., Székely, Cs. New Data of Parasitic Fish Myxozoa (Myxobolidae) of Malaysian Biotopes. European Association of Fish Pathologist (EAFP) Conference, in September 2013, in Tampere, Finland 5. Csaba Székely, Muhammad Hafiz Borkhanuddin, Gábor Cech, Faizah Shaharom, Kartini Mohamed, Mohd Shukri Adam Embong, Kálmán Molnár. Parasitological Investigations of the Asian Seabass (Lates calcarifer) Cultured in a fish farm in Setiu Lagoon, Malaysia with Special Emphasis on Myxozoan infections and a Goussia sp. (Aicomplexa: Emeriidae) Infecting The Gut. Third International Fisheries Symposium (IFS 2013), in November 2013, Pattaya, Thailand. 17