KÖLCSÖNHATÁS ÉS DINAMIKA az NMR spektroszkópia, mint a modern szem Bodor Andrea ELTE Szerkezeti Kémiai és Biológiai Laboratórium A Magyar Tudomány Ünnepe, 2012.11.08.
Edvard Munch: A Nap (1911-1916)
AZ ELEKTROMÁGNESES SUGÁRZÁS hullámhossz: 1nm 1μm 1mm 1m 1km 1GHz 1MHz frekvencia: 10 18 10 15 10 12 10 9 10 6 energia: γ- sugarak X- sugarak UV IR távoli IR mikrohullámok rádióhullámok mag átmenetek belső elektronok külső elektronok rezgések forgások e - - mágneses átmenetek mag - mágneses átmenetek Mössbauer Optikai spektroszkópia ESR NMR
AZ NMR SPEKTROSZKÓPIA ÉS A PERIÓDUSOS RENDSZER
Kémia: szerkezet, konformáció ALKALMAZÁSI TERÜLETEK Gyógyszer kutatás -omika: metabolomika Analitika: eredet, minőség Szerkezeti biológia dinamika MRI
AZ NMR SPEKTROSZKÓPIA A BIOLÓGIAI RENDSZEREK SZOLGÁLATÁBAN OLDAT fiziológiás körülmények ph, ionkoncentráció, (NaCl, Mg 2+, Ca 2+ ) hőmérséklet,... nem invazív módon: atomi szintű információ Fehérje szerkezet: feltekeredés letekeredés denaturáló közegek (8M urea, 6M GdCl) FUNKCIÓ Fehérje dinamika: ps 10 3 s skálán szerteágazó mozgások
AZ NMR MINTA A maximális mérettartomány: kb. 255 kda Izotóp jelölés: fehérje expresszió 13 C, 15 N, 2 D jelölés Térerő: 11,7 23,5 T 500 MHz 1GHz Egyéb NMR aktív magok: 31 P, 19 F szelektív jelölés,... Mérések: 2D, 3D, nd
AZ NMR IDŐSKÁLA vibráció rotáció diffúzió domén mozgás, kinetika feltekeredés ps ns μs ms s 10 3 s NOE, R 1,R 2 R 1ρ,CPMG ZZ, STD, csere
Zotter, Bodor et al. FEBS Lett, (2011), Biochemistry (2011) I) KÉMIAI KINETIKA Enzim-katalizált foszfoészter kötés hidrolízise R O GTP GDP P i O P O O - O P O - O TPPP/P25 O P OH + H 2 O R O O - O P O O - O P OH + H 2 PO 4 O - - ahol R= N N O OH OH O N NH NH 2 TPPP/p25: p20 (2JRF.pdb) - Tubulin Polimerization Promoting Protein - 219 aminosav - rendezett és rendezetlen részek - Zn 2+ kötő helyek - GTP kötő helyek - GTPáz aktivitás
reakcióidő 31 P{ 1 H} NMR, 250 MHz I) KÉMIAI KINETIKA R O O α P O O - O P O - β O O γ P OH O - GMP Pi γ GDP GDP α β 200 μm TPPP/p25; 1,36 mm GTP; 4,0 mm Mg 2+ ; 50 mm Tris; ph= 7,0; 300 K
koncentráció (mm) I) KÉMIAI KINETIKA 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 átlag reakció idő (h) GTP k 1 GDP + P i k 1 = 0.093 ± 0.001 mm h -1 GDP k 2 GMP + P i k 2 = 0.178 ± 0.009 mm h -1 GMP k 3 GMP koord. k 3 = 0.119 ± 0.019 mm h -1
I) KÉMIAI KINETIKA KÖLCSÖNHATÁS - FUNKCIÓ Fehérje k cat (min -1 ) Rac1 H-Ras Rap1A Ran TPPP/p25 0.11 0.028 0.0031 0.0032 0.0155 NMR 0.018 malachitzöld -a TPPP/p25 GTPáz aktivitása: a kis G fehérjék aktivitásához hasonló - 31 P NMR mérések: a reakció teljes útvonala sebességi állandók meghatározása
II) TRANSZLÁCIÓS DIFFÚZIÓ
Intenzitás II) TRANSZLÁCIÓS DIFFÚZIÓ I = I(0) exp[-d (2 π γ G i δ) 2 (Δ δ/3)] 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 Gradiens (G/cm) Stokes Einstein: r H = kt/6 π η D
II) TRANSZLÁCIÓS DIFFÚZIÓ Rendezetlen fehérjék (IUP, IDP) Más módszerekkel nehezen tanulmányozhatók Szerkezeti vonások: NMR - kémiai eltolódás - hidrodinamikai sugár RENDEZETLEN DENATURÁLT FELTEKEREDETT FEHÉRJÉK HIDRODINAMIKAI SUGARA? Tompa et al. FEBS Lett, (2005), Uversky et al. Annu. Rev. Biophys. (2008), Jensen et al. Structure (2009)
D (m 2 /s) II) TRANSZLÁCIÓS DIFFÚZIÓ 2.00E-10 TC5B mutánsok rendezetlen 1.70E-10 1.40E-10 MPK szubsztrátok AnTx feltekeredett 8M urea 1.10E-10 8.00E-11 MIIA fragmens Tb4 1500 2500 3500 4500 5500 Molekula tömeg (g/mol)
II) TRANSZLÁCIÓS DIFFÚZIÓ rh (Å) 22 20 18 16 14 12 10 8 MPK szubsztrátok MIIA fragmens TC5B mutánsok AnTx Tb4 rendezetlen feltekeredett 8M urea 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 Molekula tömeg (g/mol) 1 H NMR: r H denaturált > r H rendezetlen > r H feltekeredett
III) A PEPTID GERINC DINAMIKÁJA H 2 O 15 N: R 1, R 2, hetnoe -NH H 2 O csere
A molekulák oldatbeli ún. bukdácsoló mozgása τ c rotációs korrelációs idővel jellemezhető. 1/τ c rotációs frekvencia J(ω) - spektrális sűrűség függvény: J(ω) = 2 τ c / [1 + (ωτ c ) 2 ] Mért dinamikai paraméterek: R 1, R 2, hetnoe = f [J(0), J(ω N ), J(ω H )]
HETNOE cleanex III) A PEPTID GERINC DINAMIKÁJA R1 (s -1 ) 2 1.5 1 0.5 R2 (s -1 ) 6 5 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 0 0 10 20 30 40 50 MIIA: 45 aminosav hosszú IUP 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0-0.1 0 10 20 30 40 50-0.2-0.3-0.4 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 5ms 10ms 0 10 20 30 40 50
III) A PEPTID GERINC DINAMIKÁJA 0.5 Redukált spektrális sűrűség analízis J(ωN) / ns rad -1 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 J(0) / ns rad -1 Középső régió: legkevésbé mozgékony, inherens helicitás N-terminus:K3-D11 C-terminus: D33-K45 Krisova et al. J. Biomol. NMR (2006), Lefèvre et al., Biochemistry (1996)
KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET homodimer G50 T42 G27 E44 N71 E26 S47 S17 S23 L8 F30 V73 N33 L32 E91 K29 D74 1 H- 15 N HSQC, 300 K 15 N:S100A4d - Ca 2+ Gingras et al. FEBS Lett, (2008)
KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET G50 T42 G27 E44 N71 E26 S47 S17 S23 L8 F30 N33 V73 L32 E91 D74 15 N: S100A4d - Ca 2+ K29 MIIA 15 N: S100A4d - Ca 2+ a két monomer nem egyenértékű Kiss et al. PNAS, (2012), Elliot et al. Structure (2012)
KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET D74 Ca 2+ - S100A4 Ca 2+ - S100A4 - MIIA- A Ca 2+ - S100A4 Ca 2+ - S100A4 - MIIA- A Ca 2+ - S100A4
KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET átlagolt kémiai eltolódás: 2 ( HN ) 0.17( N ) 2 0.7 0.6 0.5 Δδ(ppm) A Δδ(ppm) B 0.4 0.3 0.2 0.1 0 G SH M AC P LE K AL D VM V ST F HK Y SG K EG D KF K LN K SE L KE L LT R EL P SF L GK R TD E AA F QK L MS N LD S NR D NE V DF Q EY C VF L SC I A MM C NE
KÖLCSÖNHATÁS - SZERKEZET - FUNKCIÓ MIIA: 1894 YRKLQRELEDATETADAMNREVSSLKNKLR RGDLPFVVPR RMARK 1937 Komplex: filamentum bontó
SZERKEZET DINAMIKA NMR FUNKCIÓ KÖLCSÖNHATÁS
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS SZKBL: Hudáky Ilona Végh Ádám Taricska Nóra Stráner Pál Náray-Szabó Gábor Zsoldosné Mády Virág Dudás Erika Perczel András Papp Dóra Láng András Kovács Bertalan Pálfy Gyula Pintér István Rovó Petra Jákli Imre Farkas Viktor Kiss-Szemán Anna Felméry Anna Vajda Tamás Csordás Barbara Karancsiné Menyhárd Dóra Harmat Veronika Ángyán Annamária GTP: Ovádi Judit (MTA/Enzimológiai Intézet) Bányai István (Debreceni Egyetem) MIIA/S100A: Nyitray László (ELTE, Biokémiai Tszk)
Edvard Munch:Önarckép - fotó KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS